Protocol
1 Preparação de Meios de Cultura, Citocinas e placas gelatinizado
- Preparar meios celulares ES utilizando Modificação de Meio de Eagle (DMEM) da Dulbecco com glucose elevada e piruvato de sódio. Adicionar 20% CES qualificado de Soro Fetal Bovino (FBS), 1% Penicilina / Estreptomicina, 1% de L-glutamina, 1% de HEPES, 1% de não-aminoácidos essenciais, 0,1% de gentamicina (50 mg / ml) e 0,1% ( 55 uM) β-mercaptoetanol. Esterilizar meios de células ES por filtração.
- Prepare mídia OP9, fazendo 1 L de alfa Meio Essencial Mínimo (MEM-α) de pó de acordo com as instruções do fabricante. Adicionar 20% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de Penicilina / Estreptomicina. Inverta para misturar. Esterilizar por filtração em duas aliquotas de 500 ml.
NOTA: O uso de meios feitos de pó é recomendado e susceptível de produzir a manutenção das células OP9 melhorado e em resultados de diferenciação in vitro. Esta abordagem tornou-se o nosso procedimento padrão. No entanto, notamos também that que ter, por vezes, utilizados de líquidos pré-fabricados α-MEM com sucesso adequada. - Prepare a meio de congelação por adição de 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) a 90% de FBS. Agitar suavemente e esterilizar por filtração. Armazenar a 4 ° C.
- Prepare 2,000x Flt-3 ligando (10 pg / ml) por dissolução humana recombinante Flt-3 ligando (Flt-3L), em meio completo OP9 a 10 ug / ml. Alíquota em 1,5 ml tubos de microcentrífuga e armazenar a -80 ° C. Siga as recomendações do fornecedor sobre a estabilidade e armazenamento.
NOTA: A estabilidade de Flt-3L é curto (1 mês a 4 ° C ou 3 meses a -80 ° C). - Prepare 1.000x IL-7 (1 ug / ml), utilizando meios de OP9 completa. Alíquota em 1,5 ml tubos de microcentrífuga e armazenar a -80 ° C. Seguir as recomendações do fornecedor e na estabilidade de armazenamento (IL-7 é estável durante até 12 meses a -80 ° C).
- Prepare 1.000x Factor Inibidor da Leucemia (LIF) (10 ng / ml) por uma diluição de 10 7 unidades de LIF i 01:10n meios de células ES. Alíquota da loja a 4 ° C. Certifique-se de observar a data de validade fornecido pelo fabricante nos frascos alíquotas.
NOTA: O produto é estável em concentrados e diluídos formar pelo menos 18 meses a partir da data de fabricação. - Prepare a placas de 6 poços gelatinizados por adicionar 1,5 ml de solução de gelatina a 0,1% em cada cavidade de uma placa de 6 poços. Deixar pratos na capa estéril à temperatura ambiente com tampas, o que permite, pelo menos, 30 minutos para o revestimento. Os pratos podem também ser deixado durante a noite numa incubadora humidificada. Remova qualquer solução de gelatina sobra pouco antes de semeadura de células. Não deixe que a solução de gelatina a secar completamente para fora do poço.
2 Preparação e Manutenção de células alimentadoras e mouse Células-Tronco Embrionárias (MESC)
NOTA: Incubar todas as células numa atmosfera humidificada a 37 ° C incubadora com 5% de CO 2.
- Descongelamento embrionárias de camundongos fibroblastos (MEF)
- Quick-descongelar um frasco congelado (~ 5 x 10 6
- Adicionar 8 mL de meio de células ES para células descongeladas, de uma forma gota a gota, para diluir gradualmente o DMSO a partir do meio de congelamento.
- Células de centrifugação a 400 x g a 4 ° C durante 5 min. Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 3 ml de meio de células ES.
- Preparar um tubo de centrífuga de 50 ml com 33 ml de meio de células pré-aquecida ES. Adicionar os 3 ml de MEFs ressuspensos para levar o volume final para 36 ml.
- Distribuir 3 ml das MEFs ressuspensos em cada poço de placas de dois gelatinizado 6 poços. Colocar as placas na incubadora durante pelo menos seis horas para permitir que as células se fixem e se espalhar para fora antes de semear as mESCs sobre eles. Essas camadas alimentadoras mitoticamente pode ser usado por vários dias após a semeadura inicial, se seus meios de comunicação é trocada a cada 2-3 dias.
NOTA: MEFs recentemente presas podem também ser utilizados. </ Ol>
- MESCs Sementeira
- Quick-descongelar um frasco com um clone MESC congelado no 37 ° C banho de água e preparar células, conforme descrito no 2.1.1-2.1.3.
NOTA: congelar 2 frascos de MESC de um poço de uma placa confluente de 6 poços. - Retirar mídia de um poço (MESC por clone) da placa de 6 poços com monocamadas de MEF presos (preparado no passo 2.1.5) e semear a 3 ml de mESCs em cima da monocamada de MEF. Adicione 3 mL de 1.000x LIF (10 ng / ml). Voltar pratos na incubadora.
- Quick-descongelar um frasco com um clone MESC congelado no 37 ° C banho de água e preparar células, conforme descrito no 2.1.1-2.1.3.
- Manutenção de células ES e tripsina mediada passagem
Nota: A alteração de mídia diariamente, ou divisão com base em confluência dos MESC. Idealmente, colheita e dividir / re-placa das células a cada dois dias.- Remova a mídia de células ES e lavar mESCs com 2 ml de PBS. Remover PBS. Adicionar 1 ml de 0,25% de tripsina e incubação a 37 ° C durante 3-5 min.
- Recolher as células tratadas com tripsina e transferi-los para um tubo de centrífuga de 15 ml. Vigorosamente pipete a suspensão de células para quebrar aglomerados de mCES. Adicionar 2 ml de meio completo de células ES para a suspensão de células para neutralizar a tripsina.
- Células de rotação a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 3 ml de mídia célula ES.
- Remova a mídia da placas de 6 poços contendo monocamadas MEF presos preparados. Adicionar a quantidade adequada de suspensão de células (com base na razão de separação desejado) em 3 ml de meio de células ES para cada cavidade a ser semeadas. Adicione 3 mL de 1.000x LIF. A confluente MESC bem dividida 1: 6 estará pronto para a passagem em 2 dias.
- OP9 / manutenção de células OP9-DL1
- Descongelar um frasco de células OP9 (siga os passos 2.1.1-2.1.3 usando a mídia OP9)
- Adicionar 7 ml de meio OP9 10 cm de prato de cultura de tecidos. Adicionar os 3 ml de células ressuspensas em um modo gota a gota, a distribuição de células ao longo da placa. Colocar as células durante a noite na incubadora.
- Verifique a confluência das células OP9 no dia seguinte. Se o prato contém muitas células flutuantes mortos, remove os meios de comunicação e adicionar 10 ml de meio OP9 fresco. Retorne o prato para a incubadora se confluência quase cheio não é observado. Split (usando tripsina) 1: 4 a quase monocamada confluente OP9.
NOTA: As placas devem chegar mesmo nível confluência novamente em cerca de 2 dias. Tome cuidado para não deixar que as células se tornam mais OP9-confluentes. - Congelar as passagens iniciais de células OP9 como ações de expansão.
NOTA: Nós congelamos 2 frascos de células OP9 de um próximo confluente prato de 10 cm. Cada frasco de estoque de expansão pode ser ainda mais propagada para criar estoques de trabalho que são posteriormente utilizados na Mesc experimentos de co-cultura. Mantenha todas as ações OP9 congelados em nitrogênio líquido e não no freezer -80 ° C, uma vez que temperaturas flutuantes podem influenciar negativamente a qualidade dos congelamentos.
3. OP9-DL1 Co-cultura Procedimento
- Preparações co-cultura
- Cerca de uma semana antes do início de um co-cultura, descongelar MEFs, mESCs e sto celular OP9 trabalhocks. Como as células OP9-DL1 não são necessários até que co-cultura dia 8, descongelar as células OP9-DL1 durante os três primeiros dias após o início co-cultura. Manter ou congelar todas as células, conforme necessário.
- Determinar o número inicial de placas de 10 cm com monocamadas de células OP9 preparados para atingir 80% de confluência em co-cultura dia 0 com base na escala da experiência (por exemplo, número de clones a serem diferenciados Mesc e número de pontos no tempo de co-cultura para ser analisada). Para se preparar para uma co-cultura, dividida próximo confluente prato de OP9 células entre 1: 4 e 1: 6 dois dias antes de quando serão necessários os monocamadas.
NOTA: Será necessário pelo menos uma placa por ESC clone. Tipicamente, um único clone CES semeadas numa única placa (como descrito abaixo), no dia 0 devem produzir células suficientes para semear placas de seis no dia 5 de passagem. Cada dia 5 chapa vai permitir que um ponto de tempo posterior análise. - Desde monocamadas OP9 será continuamente necessário para co-cultura passagem, ter o cuidado de sempre maintaem um número adequado de placas de cultura de OP9 adicionais em paralelo com a co-cultura.
- Dia 0: Iniciação de co-cultura
- Recolhe MESC como em 2.3.1-2.3.4. Contar as células.
- Para cada clone MESC preparar 5 x 10 4 MESC em 10 ml de meio OP9 por placa.
NOTA: Apesar de não tê-lo usado, notamos que um meio alternativo que consiste em α-MEM, 10% de FBS, e 5 x 10 -5 M β-mercaptoetanol também foi relatado para o uso em diferenciação co-culturas 10. - Remova a mídia velha de OP9 pratos e adicione os 10 ml de suspensão MESC aos pratos tendo o cuidado de distribuir as células de maneira uniforme em toda a placa. Coloque os pratos no 37 ° C incubadora.
- Dia 3: Troca de mídia
- Retirar pratos da incubadora e observar ao microscópio. Colônias deve começar a perder brilho e parecem achatadas.
- Remova a mídia da pratos e adicione delicadamente 10 ml de fresco OP9mídia.
- Retorne os pratos co-cultura para a incubadora. Monitorar visualmente a formação de colónias mesoderme semelhante diária para informar o tempo de preparação OP9 alimentador de monocamada para a próxima passagem (dia 5), a qual não deve ser realizada até que ~ 80-90% das colónias apresentar visualmente a morfologia mesoderme semelhante. Adiamento máxima do dia 5 passo transferência de células é de 2 dias.
- Dia 5: tripsina passagem mediado com pré-galvanização.
NOTA: Prepare com antecedência um número adequado de placas de 10 cm com células OP9 otimamente confluentes. Prossiga com os próximos passos somente se as co-culturas exibir visualmente os recursos descritos na etapa 3.3.3 (ver resultados também representativos).- Remova a mídia dos pratos co-cultura. Adicionar 4 ml de PBS para lavar. Agitar o PBS e remover. Adicione 4 ml de tripsina a 0,25% e colocar os pratos na incubadora para ~ 5 min.
- Romper a camada de células tripsinizados por pipetagem vigorosa, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar excessiva, até que um, a suspensão de célula única principalmente homogénea é atingida.
- Adicione 4 ml de meio OP9 completos e misture por pipetagem. Transferência de células para um novo, vazio placa de 10 cm e lugar na incubadora durante 30 minutos para permitir que as células OP9 a aderir ao prato. Este "pré-plaqueamento" passo reduz o número de células OP9 transferidos para o próximo passo de co-cultura.
- Prepare 50 ml tubos de centrífuga com coadores de células de 40 m.
- Recolher as células não-aderentes, a partir da placa pré-preparada e passá-los através do filtro celular para dentro do tubo. Lavar o prato gentilmente com 6 ml de PBS e passá-lo através do mesmo filtro, deixando as células OP9 ligados atrás.
- Células de centrifugação a 400 x g 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender as células peletizadas em 3 ml de meio completo OP9. Contar as células.
- Remova a mídia de placas de 10 cm com células OP9 otimamente confluentes.
- Para cada ponto de tempo de análise, de semente de 5 x 10 5 células em mono OP9camada de 10 ml volume final.
- Adicionar 5 ng / ml humana recombinante Flt-3L e colocar os pratos na incubadora.
- Dia 8: células progenitoras hematopoéticas (HPC) coleção
NOTA: Prepara-se previamente uma quantidade adequada de placas de 6 poços com monocamadas OP9 ou OP9-DL1 células de modo a que eles vão ser ~ 80% confluentes em tempo para este passo.- Prepare 50 ml tubos de centrífuga com 40 mM filtros.
- Retirar as placas do incubador e observa ao microscópio. Cachos brilhantes de HPCs deve ser frouxamente ligado à monocamada OP9. Recolher o maior número dessas células quanto possível, lavando (mas não excessivamente interromper) a monocamada OP9 com uma pipeta e os meios de comunicação existente no prato. Para evitar a formação de espuma, sempre deixar pelo menos 1 ml da mídia na ponta da pipeta durante esta coleção HPC / etapa de lavagem.
- Passar as células através do filtro de 40 um para um tubo. Adicione 8 ml de PBS para a mesma placa e verifique sob o microscópio, se todos nós HPCsre colhido. Repetir o passo de lavagem / recolha com PBS e (se necessário) com uma lavagem mais forte. Estirpe das células no interior do tubo que já contém as células a partir da mesma placa.
- Células de centrifugação a 400 x g durante 5 min a 4 ° C.
- Prepare uma mistura de mestre de 3 ml (por placa semeada no dia 5) de mídia OP9 com 5 ng / ml Flt-3L e 1 ng / ml de IL-7.
- Remover o sobrenadante e ressuspender pellet em media OP9 com Flt-3L + IL-7 mix master (3 ml para cada 10 centímetros prato processado). Transferir as células recolhidas a partir de cada placa para um poço de uma placa de 6 poços com células OP9.
- Para dirigir as células para monocítica, B ou célula linhagens eritróide, semear as células coletadas em OP9 células. Para obter células T, semear as células em monocamadas de células OP9-DL1.
- Colocar as placas de 6 poços em incubadora.
- Dia 10: Troca de mídia
- Prepare um tubo de centrífuga de 15 ml para cada distinta MESC clone-alimentador tipo de célula Combinação em co-cultura.
- Prepara-se uma mistura principal de meios OP9 com 5 ng / ml de Flt-3L e 1 ng / ml de IL-7. Preparar 3 ml para cada poço.
- Suavemente recolher meio de cada poço da placa de 6 poços, combinando meios de comunicação de múltiplos poços que contêm o mesmo clone de alimentador combinação tipo de célula ESC.
- Adicionar 2 ml de mistura principal mídia OP9 (ver 3.6.2) em cada poço.
- Centrifugar os meios recolhidos a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender cada pellet (muito pequena se visível) em 1 ml de OP9 master mix de mídia (ver 3.6.2) por poço originalmente coletados na etapa 3.6.3.
- Distribuir 1 mL de células para cada poço de volta a partir do qual os meios foram inicialmente recolhidos elevando o volume de cada poço a 3 ml. Retorne os pratos para a incubadora.
- Dia 12: Nenhuma passagem de tripsina
NOTA: Prepare com antecedência um número adequado de pratos 6 poços com células OP9 ou OP9-DL1 para que possam ser perfeitamente confluentes a tempo para este step. Dia 12 é ideal para análise de citometria de fluxo de desenvolvimento eritróide, monocítica, e as células T da fase inicial.- Prepara-se uma mistura principal (3 ml para cada poço que continuará em co-cultura) de meios de OP9 com 5 ng / ml de Flt-3L e 1 ng / ml de IL-7.
- Prepare 50 ml tubos de centrífuga com 40 mM filtros (um para cada clone-alimentador combinação tipo de célula ESC em co-cultura).
- Vigorosamente pipetar os meios de comunicação existentes em cada cavidade para desagregar todas as células (incluindo a monocamada) no poço. Continue com pipetagem vigorosa até que um estado semelhante a uma suspensão de células individuais é alcançado.
- Passe as células coletadas através do filtro para dentro do tubo. Adicionar 3 ml de PBS em cada poço para lavar e recolher todas as células restantes. Passa através de células do mesmo filtro. Combine as células de vários poços contendo o mesmo clone-alimentador combinação tipo de célula ESC.
- Descartar o coador de células utilizadas e remover uma alíquota equivalente a uma cavidade (~ 6 ml) para qualquer pretendidacitometria de fluxo (ou outro) analisa a ser realizado no mesmo dia. Armazenar essas aliquotas sobre gelo antes da utilização.
- Células de centrifugação a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante. Ressuspender o sedimento dos tubos de centrífuga de 50 ml em 3 ml de mistura principal por poço para ser re-semeadas. Adicionar 3 ml por cavidade de cada suspensão de célula para o tipo de células de alimentação apropriada e colocar os pratos na incubadora.
- Dia 14: Troca de mídia
- Siga as etapas descritas na seção 3.6.
- Dia 16: No trecho de tripsina
NOTA: Prepara-se por avanço pratos de 6 poços de células OP9 ou OP9-DL1 optimamente confluentes para este passo.
NOTA: Dia 16 é ideal para análise de citometria de fluxo de linfócitos B e células T fase secundária.- Siga as etapas descritas na seção 3.7.
- Dia 18: Troca de mídia
- Siga as etapas descritas na seção 3.6.
- Dia 20: Nenhuma passagem de tripsina
NOTA: 20 i Dias ideal para citometria de fluxo análises de médio a fase final de desenvolvimento de células T.- Siga as etapas descritas na seção 3.7. Se desejar, levar diferenciar células passado dia 20 de mudança media alternada e sem tripsina passagens a cada dois dias, com acompanhamento diário da taxa de expansão dos linfócitos.
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Representative Results
Quando cultivado em MEFs na presença de LIF, mESCs pode ser mantido num estado indiferenciado. Em condições ideais, eles aparecem como colônias compactas de células rodeadas por um halo brilhante em microscopia de contraste de fase (Figura 1). Estas culturas devem ser monitorizados diariamente. Dependendo da confluência das células, a mídia pode ser alterado ou células podem ser divididos. Vizinhas colônias Mesc não deve vir para o ponto de contato com o outro. Uma cultura normal, saudável de mESCs indiferenciadas é um ponto de partida essencial para a diferenciação in vitro de células T. Mediante iniciada a co-cultura, recomenda-se que as células confluentes ser totalmente sem ser lotados. Isto é de modo que a maioria das células colhidas para semear as células em monocamadas OP9 são MESC (em vez de células de alimentação). Se grandes diferenças na confluência são observadas entre os vários clones Mesc ser diferenciados no dia 0, então seria melhor remover MEFs por pré-adesão ao tisplacas de cultura de sue (como na etapa 3.4.3-3.4.6 usando a mídia completa de células ES) antes de contar os mESCs para co-cultura de semeadura.
OP9 células deve ser bem conservado antes do início co-cultura (como descrito na seção 2.4). Além disso, pensa-se que as células OP9 perder algumas das suas propriedades com a cultura prolongada e / ou aumentos pronunciados na sua taxa de proliferação 7 Evitando rácios de divisão para além de 1: 5. Durante a manutenção de células OP9 e descartando culturas OP9 contínuas após seis semanas, vai ajudar a evitar essas armadilhas.
Na célula de sementeira e de transferência de célula etapas iniciais da co-cultura (dia 0, 5, 8, 12, 16), as monocamadas OP9 deve estar dentro de um intervalo óptimo de confluência. Figura 2 mostra o baixo (Figura 2A) e alta (figura 2B) termina o intervalo de OP9 confluência celular aconselhável para uso como monocamadas em co-cultura. Um exemplo de uma placa sobre-confluente é mostrado na Fig2C ure. A falha em manter confluência ideal pode induzir a formação de adipócitos (Figura 2D) que, em grandes quantidades, podem afetar negativamente a co-cultura.
No dia 0, o co-cultura é iniciado em OP9 células, em vez de OP9-DL1 células desde a formação mesoderme é favorecido em OP9 células. As células são colocadas em OP9-DL1 células monocamadas que começam no dia 8 de induzir a produção de células T. Enquanto alguns clones Mesc exibirá visualmente (~ 90%) a formação de sólido e quantitativa de colónias mesoderme semelhante por dia 5 de co-cultura (Figura 3A-B), enquanto outros podem exibir atrasos neste passo (Figura 3C-F). Sob o microscópio, as colônias mesoderme-like derivados neste ensaio foram variavelmente descrita como semelhante a rodas de carroça ou crateras (Figura 4A) ou, starbursts ou florzinhas (Figura 4B).
Enquanto o protocolo OP9-DL1 publicado reflete uma norma de forma quantitativa mesodermeção de dia 5 de co-cultura, 7 vemos que nem todos os clones do CES alcançar essa norma dentro deste prazo. Nesses casos, nós mudamos o meio no dia 5 e esperar mais 1-2 dias antes de realizar o protocolo "dia 5" colheita de células / transferência. O objetivo desse atraso é permitir ~ 80-90% das colônias de células ES de mesodermal visualmente se tornar antes da transferência. É importante deixar claro que este valor de 80-90% reflete uma discernível critério estritamente visual, contraste de fase inspeção microscópica simples da morfologia da colônia nos pratos co-cultura. Refere-se apenas à proporção de colónias que se assemelham ESC os mostrados na Figura 4. É possível que alguns clones ESC não atingirá este critério visual, mesmo depois de um atraso de dois dias. Em tal caso, é possível enriquecer para formar precursores de sangue utilizando citometria de fluxo mesodérmicos classificação celular para um Flk-células +, como foi anteriormente descrito. 6,11 Em qualquer caso, para a sake de nomenclatura conveniência, "acertar o relógio" e referem-se ao dia da transferência colônia mesoderme-como "dia 5"
Quando vários clones do CES estão sendo diferenciada em paralelo, é possível que alguns co-culturas estarão prontos para o dia 5 passagem no tempo, enquanto outros ficam para trás. Neste caso, é aconselhável para atrasar a passagem de todos os co-culturas, até os clones mais lentos para apanhar os outros. O atraso parece não fazer nenhum mal aos "on time" co-culturas, mas beneficia o subseqüente diferenciação dos clones mais lentos um ótimo negócio.
Dia 8 (ou seja, três dias após a transferência colônia mesodermal) vê o surgimento e acúmulo de HPCs. HPCs são visíveis como aglomerados de células brilhantes que são fracamente aderidas às células alimentadoras OP9 (Figura 5). Um procedimento de lavagem cuidadosa, com uma pipeta e da mídia sobre o prato, irá separar e recolher os HPCs, deixandoa monocamada OP9 quase intacto (Figura 6A-C). Este é talvez o passo mais sensíveis à técnica do protocolo. É preciso alguma prática para encontrar os movimentos adequados e pressão de ejeção de mídia para alcançar o equilíbrio desejado de colheita máxima de HPCs com o mínimo de interrupção da camada de alimentação. É aceitável que alguns da monocamada OP9 tira, uma vez que a maior parte de qualquer monocamada estática será capturado na malha de nylon de 40 um, após a filtragem. Figura 6D mostra uma monocamada após pipetagem excesso levando a uma maior perturbação monocamada do que o necessário. Durante este passo de lavagem, é importante verificar ao microscópio ou não todos os HPCs foram recolhidos, e ajustar a pressão de lavagem em conformidade.
O progresso do processo de co-cultura pode ser monitorizada por citometria de fluxo. Para analisar especificamente a progênie hematopoiéticas não-eritróides do CES, é importante primeiro portão CD45 + células vivo.Este passo telas fora das células OP9 das análises, enquanto o uso de DAPI ou outro corante coloração nuclear permite a exclusão de células não viáveis. Durante o dia 12, muitos clusters de células brilhantes pequenas, redondas devem ser visíveis. Não é necessário contar as células nesta fase. Mas observou-se que vive, as contagens de eventos fechado de citometria de fluxo estão tipicamente na gama de 1-3 x 10 5 por dia 12 de co-cultura bem. Análises de citometria de fluxo de células vivas fechado diferenciadas sobre a monocamada OP9 produzirá eritróide (neg CD45, Ter119 +) e monócitos (CD45 +, CD11b oi) linhagens (Figura 7A). Análises de CD45 +, células vivas de diferenciação em OP9-DL1 monocamadas deve revelar marcadores característicos de CD4 / CD8 dupla negativa (DN) -1 (CD44 +, CD25 neg, neg CD4, CD8 neg) e DN2 (CD44 +, CD25 +, CD4 neg, CD8 neg) células fase T (Figura 7B ng>). Ao dia 16, não há um aumento significativo na quantidade de células pequenas, redondas brilhantes nas culturas. Em OP9-DL1s, T produtos de diferenciação celular progresso para o (neg CD44, CD25 +, CD4 neg, CD8 neg) DN3 e DN4 (neg CD44, CD25 neg, neg CD4, CD8 NEG) etapas. Algumas células T DP (CD4 +, CD8 +), também pode começar a surgir pelo dia 16 (Figura 7B). HPCs semeado em OP9 células produzir células B (CD19 +) por dia 16 por dia 20 de co-cultura OP9-DL1-MESC, haverá grandes quantidades de células T e DP positivo único (SP), as células T CD8 + presentes ( Figura 7B). Figura 8 fornece um diagrama que resume as principais etapas dos procedimentos acima, e os momentos de análise sugeridas durante a co-cultura.
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Figura imagem microscopia de contraste de fase 1 de mESCs indiferenciadas (colônias afiadas) que crescem no topo de uma monocamada de MEF (aumento de 100X).
Figura 2:. Fase imagens de microscopia de contraste de OP9 monocamada de confluência (A) mais baixo e (b) maiores níveis confluência aconselháveis para co-cultura passagem / semeadura (aumento de 40 vezes) (C) Exemplo de um (ampliação over-monocamada confluente OP9 40X. ). (D) Over-monocamada confluente OP9 (aumento de 200X) com a formação de adipócitos (grande, vesícula contendo as células).
Figura 3: Fase microscop contrasteimagens y de formação de colônias mesoderme-como em "dia 5" de co-cultura. (A) vista 40X e (B) 100X de placas de co-cultura com> 90% diferenciação mesodermal colônia. Estas placas estão prontas para o dia 5 passagem. (CF) Exemplos de placas Dia 5 co-cultura que requerem 1-2 dias adiamento antes da transferência (C & E, aumento de 40 vezes, D & F, aumento de 100X).
Figura 4: Fase de imagens de microscopia de contraste da variedade de formações de colônias mesoderme-como no dia 5 de co-cultura (A) A morfologia da colônia conhecida como "crateras" ou (B) A morfologia da colônia referido. "Roda de carroça". como "Starburst" ou "florzinhas" (aumento de 200X).
Figura imagem microscopia de contraste de fase 5 do dia 8 placa co-cultura com aglomerados de pequenas, redondas, HPCs brilhantes em uma monocamada OP9 (aumento de 40 vezes).
Figura 6.:. OP9 monocamada após a coleta HPCs em co-cultura dia 8 (AC) conjunto adequado de rompimento de OP9 monocamada após a lavagem cuidadosa para colher HPCs (D) Um exemplo de uma monocamada OP9 que tem sido o excesso de interrompido por dia 8 procedimento de colheita de HPC.
Figura 7: Representante citometria de fluxo (FACS) analisa em determinados momentos duranteMESC diferenciação in vitro. (A) A coloração para eritróide (esquerda), monocíticas (meio) e células B (direita) de produtos MESC-OP9 co-cultura no dia 12 ou 16, tal como indicado. (B) Coloração para o desenvolvimento de células T, nos pontos de tempo indicados -MESC-OP9 DL1 co-cultura. Por favor, veja o texto para descrições detalhadas dos imunofenótipos.
Figura 8 diagrama das etapas do processo MESC-OP9 co-cultura. (A) As etapas principais dos primeiros oito dias de co-cultura de transferência de célula. O número aproximado de células semeadas em células OP9 em dias são indicados zero e cinco. (B) No dia 8, o passo de transferência, e os produtos de diferenciação celular esperados detectados por citometria de fluxo, nos momentos chave de co-cultura. Por favor, veja o texto para descrições detalhadas dos imunofenótipos.
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Discussion
O sistema OP9-DL1 co-cultura foi utilizada para estudar o papel de vários produtos de genes durante o desenvolvimento de tipos de células do sangue a partir de células estaminais. 8,12,13 Provou também um modelo eficaz para estudar a função de genes de DNA regulador durante a diferenciação celular 9,14. Usando essa abordagem como uma alternativa aos modelos inteiros rato pode render uma considerável economia de tempo e custo de experimentos que abordam muitas questões básicas na hematopoiese. No entanto, a adaptação deste protocolo para estes propósitos requer conhecimento do potencial variabilidade entre clones MESC que seriam utilizados nestes procedimentos. A linha do tempo do protocolo publicado é expectável a partir da média, bem conservado, linha MESC não-manipulado. 7 Além disso, clones Mesc selecionado para a geração de camundongos quiméricos são geralmente de maior qualidade e vai funcionar muito robusta em OP9 co-cultura . Por outro lado, os clones Mesc emergir directamente a partir de estáveistransfecção com um transgene integrado ectopically irá exibir vários graus de eficiência diferenciação inicial que varia de média a média abaixo. O protocolo descrito aqui, prevê um atraso estratégico 1-2 dia do dia passo 5 passagem para uniformizar estas diferenças de potencial antes da indução da hematopoiese in vitro.
No dia 8 de passagem é a etapa em que a execução deste protocolo tem o maior potencial de erro. Paciência, prática e observação cuidadosa permitirá a pessoa a desenvolver a técnica que otimiza a colheita HPC, minimizando OP9 monocamada interrupções. Para além das principais dia 5 e dia 8 etapas, os parâmetros críticos de manutenção envolvem meticulosa cultura celular (particularmente células OP9, como descrito acima) e uma atenção especial para os reagentes usados no protocolo. O reagente mais crítico é o FBS. Lotes distintos de FBS irá variar significativamente em sua capacidade para suportar este procedimento. Vários lotes devem ser testados em order para determinar qual irá produzir diferenciação forte neste ensaio.
Este sistema de co-cultura tem suas limitações. Por exemplo, este modelo não oferece suporte a diferenciação de células CD4 positivas individuais. Uma razão para isso é a falta de expressão do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de Classe II infra-estrutura de apresentação de antigénio em células OP9. Uma célula de apresentação de antigénios de superfície por MHC Classe II é necessária para o desenvolvimento adequado de células T CD4 SP. As células CD8 SP que fazem emergir representam uma mistura de fases de timócitos CD8 SP maduros e imaturos. 1 Além disso, o transplante bem sucedido do MESC progenitores derivados de células T em um rato requer passagem prévia por meio de cultura de órgãos do timo fetal. 1 No entanto, esta tecnologia tem provado a sua prometer como uma abordagem investigativa poderosa para ambas as perguntas celulares e moleculares do sangue e do sistema imunitário desenvolvimento que antes eram apenas possível explorar em vivo. Assim, além de proporcionar uma nova maneira de progredir rapidamente mais sobre estas questões, a adoção mais ampla do sistema de co-cultura OP9-ESC terá o impacto mais amplo de redução do uso de animais de experimentação.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 15-013-CV | |
| Stem cell qualified FBS | Gemini | 100-125 | Heat inactivated |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| L-alanyl L-glutamine | Corning | 25-015-CI | |
| HEPES buffer | Millipore | TMS-003-C | |
| Non-Essential Amino Acids | ThermoScientific | SH30853.01 | |
| Gentamicin Regent Solution (50 mg/ml) | Life Technologies | 15750-060 | |
| β-mercaptoethanol (55 mM) in DPBS | Life Technologies | 21985-023 | |
| Filter Unit | Millipore | SCGPU05RE | 0.22 μm PES membrane |
| Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CM | |
| α-MEM | Life Technologies | 12000-022 | Powder, reconstitute per manufacture recommendation |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| FBS | ThermoScientific | SH 30396.03 | Testing of individual lots required |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma | D2650 | |
| Recombinant Human Flt-3 Ligand | R&D Systems | 308-FK | |
| Recombinant Murine IL-7 | PeproTech | 217-17 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | |
| Utrapure water with 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| MEFs mitomycin C treated | Millipore | PMEF-CF | Any mitotically arresteded MEFs can be used |
| DPBS | Corning | 21-031-CV | |
| Cell strainer (40 μm) | Fisher | 22363547 | |
| Tissue culture dish 100 x 20 mm | BD Falcon | 353003 | |
| Multiwell 6-well | BD Falcon | 353046 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | Tubes for FACS |
| ES R1 cells | ATCC | SCRC-1011 | |
| OP9 cells | Cells can be obtained from the Riken Laboratory Cell Repository (Japan). | ||
| OP9-DL1 cells | Cells can be requested from the Zúñiga-Pflücker laboratory. | ||
| FlowJo software | Tree Star | FACS data analyses | |
| Flow Cytometer | BD | FACScan, FACSCalibur and FACSVantage have been used in our lab |
References
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