Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Метод Нанесение Закрытое Глава травматическое повреждение мозга в Published: June 30, 2015 doi: 10.3791/52905
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 2, 1
1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Genetics, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Natural Sciences, University of Puerto Rico-Aguadilla

ERRATUM NOTICE

Summary

Здесь мы опишем метод, чтобы нанести закрытая травма головы травматического мозга (TBI) у дрозофилы. Этот метод обеспечивает шлюз для расследования клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе TBi патологий, используя широкий спектр экспериментальных средств и методов, доступных для мух.

Abstract

Черепно-мозговая травма (ЧМТ) затрагивает миллионы людей каждый год, в результате чего ухудшение физического, когнитивного и поведенческих функций и смерти. Исследования с использованием дрозофилы внесли важные прорывы в понимании неврологических процессов. Таким образом, с целью понимания клеточных и молекулярных основ ЧМТ патологий в организме человека, мы разработали Ударопрочный Травма (ХИТ) устройство для противника закрытой ЧМТ головной мух. Мухи подвергают ХИТ устройств отображения фенотипов в соответствии с человеческой ЧМТ, таких как временной нетрудоспособности и прогрессивного нейродегенерацией. ХИТ устройство использует пружинный механизм по продвинуть мух на стене флакона, в результате чего механические повреждения лету мозга. Устройство является недорогим и легко построить, его работа просто и быстро, и это производит воспроизводимые результаты. Следовательно, устройство ХИТ могут быть объединены с существующими экспериментальными инструментов и методов для мух обратиться фундаментальнымвопросы о ЧМТ, которые могут привести к развитию диагностики и лечения ЧМТ. В частности, ХИТ устройство может быть использовано для выполнения масштабных генетических экраны, чтобы понять генетическую основу ЧМТ патологий.

Introduction

Черепно-мозговая травма (ЧМТ) определяется как травмы головного мозга от внешнего механического воздействия. Чаще всего, TBI результаты закрытых сил головы, такие как тупых сил и инерциального ускорения и замедления сил, которые вызывают мозг, чтобы ударить внутри черепа. В Соединенных Штатах, по оценкам, 50 000 лиц ежегодно умирают от ЧМТ и 2.5-6.5 миллионов человек живут с последствиями ЧМТ, в том числе изнурительных физических, познавательных и поведенческих проблем 1,2. Последствия ЧМТ не только из-за первичных механических повреждений головного мозга, но и вторичных клеточных и молекулярных повреждений мозга, а также других тканей, которые происходят с течением времени 3-5. Разработка подходов для диагностики и лечения ЧМТ оказалась трудно, потому что ЧМТ является сложным процессом болезни. Переменный характер первичных травм, физиологии человека и экологических факторов приводит к гетерогенной вторичнаnjuries и патологии. Ключевые переменные факторы включают серьезность первичной травмы, время между повторяющимися первичных травм, и возраст и генотип человека. Понимание того, как каждая переменная фактор способствует последствий ЧМТ, скорее всего, чтобы помочь в разработке подходов диагностики и лечения ЧМТ 6,7.

Здесь мы опишем метод нанесения закрытую ЧМТ головной в дрозофилы (плодовых мушек), которые могут быть использованы, чтобы очертить вклад различных факторов в отношении последствий ЧМТ. Метод основан на наблюдении, что начальный интенсивно удара сторону мухи культуры флакона против ладони, причиненный дикого типа мухи, чтобы стать временно нетрудоспособным, вероятное последствие ЧМТ. Таким образом, мы построили ударопрочного Травма (ХИТ) устройство резюмировать ускорения и замедления силы от ручного удара действий. Высокоскоростной фильм показывает, что один удар отХИТ устройство вызывает летит связаться флакон стену несколько раз с их головы и тела 8. В какой-то степени, все контакты могут вызвать летучую мозг рикошетом и деформировать против головной капсулы, аналогичный тому, что происходит с людьми в падений и ДТП 9. Соответственно, летит обрабатывали ХИТ устройств отображения фенотипов в соответствии с черепно-мозговой травмой, в том числе временной нетрудоспособности с последующей атаксия, постепенное восстановление подвижности, изменения экспрессии генов в голове, и прогрессивного нейродегенерацией в мозге 10. Таким образом, ХИТ устройство позволяет изучать TBI, используя огромный арсенал экспериментальных средств и методов, разработанных для мух.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Строительство HIT устройство

  1. Прикрепите пружину к доске с помощью двух скоб и четыре винта (рис 1а). Центрирование зажимы относительно ширины доски и стыковых их друг против друга с внешней зажимной заподлицо с краю платы. До присоединения зажимов, согнуть их, используя плоскогубцы, чтобы плотно над весной.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В Таблице 1 описание материалов, необходимых для построения HIT устройство. Зажат конец пружины должно быть 1/8 дюйма (3,2 мм) от края доски, а свободный конец должен распространяться на борту 3/4 дюйма (19 мм). Регулировка пружины таким образом, что она лежит параллельно длине доски.
  2. Заверните свободный конец пружины один раз вокруг с клейкой полоски Velcro петли. Наружный край липучки должны быть на одном уровне с концом пружины. Липучки важно, потому что это используется, чтобы обеспечить пузырек с весны по CREтем создания обтягивающей сжатия. Липучки также позволяет легкое соединение и удаление ампулы, позволяя многие флаконы должны быть обработаны в течение короткого периода времени.
  3. Поместите ведро ледяной покров вниз, по центру, плотно прилегает к деревянной доске. Расположите повышенной область ледяного покрова ведро, так что длинная сторона параллельна ширине доски. Обратите внимание, что поднял область ведерко со льдом 1/2 дюйма (13 мм) выше, чем в деревянной доске, так что, когда флакон прилагается к весне весной не будет лежать на столе.
  4. Слайд весь прибор против неподвижного объекта, такие как стены, так что ледяной покров ведро вклинивается между советом и объекта и не двигаться.
  5. Лента бумага транспортира к нижней части картона летать флакона лоток и выдержать на краю против длине доски так, чтобы метка 90 ° совмещен с пружиной, когда она втягивается обратно в идеально вертикальном положении.

2.Эксплуатация устройства HIT

  1. Место между 1 и 60 CO 2 -anesthetized летит в пустой флакон и пробку флакона, используя плотно облегающие ватный шарик.
  2. Ограничить летит к нижней 1 дюйма (2,5 см) флакона, нажав ватный тампон во флакон, пока не будет на 1 дюйм (2,5 см) от дна. Это полезно, чтобы нарисовать линию на флаконе на отметке 1 дюйм (2,5 см). Следует отметить, что ограничивая мух больших или меньших областей флакона может повлиять на тяжесть фенотипов.
  3. Подождите 5 минут для мух, чтобы восстановить подвижность от CO 2. Следует отметить, что не известно, является ли 5 мин достаточно, чтобы полностью удалить эффекты CO 2.
  4. Вставьте конец пружины во флакон до внутренний край липучки не находится на одном уровне с верхней части флакона (Фиг.1В). Когда пружина лежа, 1 дюйм (2,5 см) флакона должна перекрывать повышенной регион ледяного покрова ведро. Флаконы могут быть повторно использованы млюбые времена.
  5. Сидя, держите флакон на липучке области, используя большой палец и указательный палец левой руки. Держите доска плотно прилегает к настольной правой рукой. Кроме того, использование C-зажимы, чтобы держать совет плотно к настольной.
  6. Потяните пружину совершенно прямой спиной на нужный угол. Отпустите пружину. Разрешить весной прийти к полной остановке.
  7. Снимите флакон с весны и позволяют мухи восстановиться в течение ≥5 мин. Тема мух на другой забастовке или передавать мух в пробирку с летучей пищи.
    Примечание: ряд анализов можно использовать, чтобы оценить фенотипических эффектов ударов с HIT устройства. Например, воздействие на долговечность можно определить путем анализа процента мух, которые выживают в моменты времени после травмы, воздействие на морфологию мозга может быть определена с помощью гистологического анализа головы, и воздействие на экспрессию генов может быть определена путем количественного анализа уровней мРНК 10.
  8. Determinе эффекты процедуры, которые не из-за забастовки одинаково лечения управления мух, которые не подвергаются воздействию ударов. Защиты органов слуха из-за воздействия на флаконе с крышкой ведро льда производит громкий шум.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы заинтересованы в понимании того, почему мухи умирают вскоре после первичной травмы. Для количественной оценки гибели, мы определили индекс смертность в 24 ч (MI 24), который является процент мух, которые умерли в течение 24 ч в первичной травмы. Мухи подвергаются ударов от HIT устройства инкубировали при 25 ° С в сосуде с летучей пищи, и количество мертвых мух подсчитывали через 24 часа. Мы использовали этот подход для выявления факторов, влияющих на Ми-24 и обнаружили, что Ми-24 не зависит от количества мух в пробирке (от 10 до 60 мух тестировали), время между повторяющимися ударами (от 1 до 60 мин тестировали ), или пол лету 10. В отличие от этого, мы обнаружили, что возраст на момент первичной травмы и генотип повлияли на MI 24. Старые мухи имели более высокий MI 24, чем молодые мухи, мухи и различных генотипов были значительно различных Ми-24 с.

На рисунке 2Мы протестировали, влияет ли тяжесть первичного повреждения МИ 24. Чтобы изменить тяжесть первичного повреждения, мы отклоняется пружину разными углами. Для каждого угла, флаконы либо 0-7 или 20-27 день старой W 1118 мух (стандартный лабораторный штамм) подвергали четырех ударов с 5 мин между ударами. Три флакона 60 мух были рассмотрены для каждого угла. Мухи были переданы флаконах с патокой пищи, инкубировали при 25 ° С, а количество мертвых мух подсчитывали через 24 часа. Средняя МИ 24, и стандартная ошибка среднего рассчитывали для каждого угла. Эти данные показывают, что более крупные углы отклонения, то есть., Более тяжелые травмы первичные, приведет к более высокой ИМ 24, чем меньше углов отклонения, то есть., Менее серьезных травм. Это наблюдалось как для 0-7 и 20-27-дневных мух. Кроме того, в соответствии с Katzenberger др. 10, 20-27 день от роду FLх годов были значительно выше, чем Ми-24 0-7 день старые мух при углах ≥50 °. Таким образом, эти данные указывают на то, что в нескольких возрастов MI 24 коррелирует с тяжестью первичного повреждения.

Фигура 1
Рисунок 1:. Схема устройства HIT () Иллюстрация вид сверху на HIT устройства в положении покоя. (Б) Иллюстрация боковым видом на HIT устройства. Пружина показано в положении покоя (темно-красный) и отклоняется на 90 ° (светло-красного).

Рисунок 2
Рисунок 2:. Первичная тяжесть травмы коррелирует с ИМ 24 Мы определили Ми-24 для 0-7 дня старого ж 1118 мух (светло-серый) и бары 20-27 дневные W 1118 мухи (темно-серый), что бары были подвергнуты четыре забастовки с HIT устройства с пружиной отклоняется указанных углов в градусах Данные 0 градусов для. мухи не подвергались HIT устройства. Показаны среднем МИ 24 и стандартная ошибка среднего значения. Ми 24 0-7 и 20-27-дневных мух значительно отличается на 50 ° (Р <0,05, один хвост тест) т и углов> 50 ° (Р <0,001, один хвост тест т), но не для углов < 50 ° (Р> 0,1, один хвост тест) т.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Способ ХИТ устройство отличается от других методов, которые наносят травму у мух с тем, что она вызывает закрытую головку, а не проникая TBI 11. Кроме того, метод ХИТ устройство занимает меньше времени, усилий и мастерства, чтобы нанести TBI во многих мух, так метод является более поддаются сравнению с другими методами в крупных генетических экранов. Наконец, тот факт, что первичные повреждения, нанесенные на HIT устройства не ограничиваются мозга и является ограничением, и преимуществом. Это ограничение, потому что необходимы дополнительные исследования, чтобы оценить, являются ли фенотипы из-за травмы головного мозга или других частей тела. С другой стороны, политравма (травматическое повреждение в нескольких частях тела) часто сопровождает TBI и модулирует TBi фенотипы, поэтому метод устройства ХИТ могут быть использованы для исследования вклада политравмой в TBI фенотипов. Муха TBI модель также имеет преимущества по сравнению с грызунами и нечеловеческих приматов TBI моделей анализы, в естественных изображений и т.д..

Этот протокол описывает строительство и функционирование HIT устройство, которое предназначено для совершения закрытого голову TBI в мух. Мы использовали HIT устройство в сочетании с ИМ 24 </ Суб> анализ для изучения организменном смерть следующие ЧМТ 7. Тем не менее, TBI модель муха может быть использован во многих других способов понять смерть, а также других последствий ЧМТ. Например, физические последствия ЧМТ может быть измерена с помощью анализов по таким параметрам, как подъеме или полета, и поведенческих последствий ЧМТ может быть измерена с помощью анализов по таким параметрам, как сон и обучения и памяти 10,12-14. Структурные эффекты на мозг может быть определено с использованием методов визуализации, таких как иммунофлюоресценции микроскопии и просвечивающей электронной микроскопии. Молекулярные воздействие на мозг может быть определена с использованием геномных анализов, такие как РНК-Seq или протеомическим анализов, таких как масс-спектрометрии. Генетические эффекты на мозг может быть определена с помощью таких подходов, как условное нокдаун генов и гиперэкспрессией. Воздействие на окружающую среду по последствий ЧМТ может быть определена с помощью различных до или после травмы параметров, таких как температура инкубации и диеты или параметровХИТ устройство, такое как угол отклонения весны или время между повторяющимися ударами. Наконец, ХИТ устройство может быть использовано для крупномасштабных генетических экранов для решения фундаментальных вопросов, таких как, почему последствия ЧМТ хуже у пожилых людей, чем молодых людей, а также для крупных экранов наркотиков, которые могут быть использованы для идентификации методов лечения последствия ЧМТ.

При использовании в согласованном порядке, мы обнаружили, что устройство производит ХИТ воспроизводимые фенотипы среди независимых экспериментов и пользователей. Параметры, которые могут повлиять на воспроизводимость установка и эксплуатация HIT устройства. Фенотипы может быть существенно затронуты небольшие изменения в положении ведро льда покрова по отношению к плате, в положении ватным тампоном в летучей флакона, и положение флакона по отношению к липучке. Кроме того, как показано на рисунке 2, фенотипы могут быть существенно затронуты небольшие изменения вУгол отклонения весны. Таким образом, новые пользователи HIT устройства должны быть проверены, чтобы гарантировать, что установка и эксплуатация являются идентичными, что других пользователей. Мы регулярно калибровать новых пользователей, имеющих им определить М.И. 24 0-7 день старого ж 1118 мух. Наконец, ХИТ устройство не должны быть идентичными, описанному в протоколе. Мы ожидаем, что большинство частей HIT устройства могут быть изменены при сохранении способности нанести TBI в мух.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У нас нет конфликта интересов раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения гранта, R01 AG033620 (BG) и Роберт Дрейпер инновационных технологий финансирования (DAW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zinc plated compression spring The Hillman  Group 540189 9 7/8 inch (length, 2.2 cm), 15/16 inch (outer diameter, 2.4 cm), 0.12 inch (wire size, 0.3 cm)
Wooden board 9 inch (length, 22.9 cm), 6.5 inch (width, 16.5 cm), 0.75 inch (height, 1.9 cm)
Clamps Sigma Electrical Manufacturing Corporation 49822 3.10 inch (length, 7.9 cm), 0.68 inch (width, 1.7 cm), 1.11 inch (height, 2.8 cm), EMT Two Hole Straps, click on type for 1 inch (2.5 cm) steel EMT conduit
Loop half of self-adhesive velcro 3 inch (length, 7.6 cm), (3/4 inch width, 1.9 cm)
Polyurethane ice bucket cover Fisher Scientific 02-591-45 9 1/8 inch (length, 23.2 cm), 9 1/8 inch (width, 23.2 cm), 1 1/4 inch (height, 3.2 cm)
Plastic fly vials Applied Scientific AS-510 3 11/16 inch (height, 9.4 cm), 1 1/16 inch (inner diameter, 2.7 cm), 1 1/8 inch (outer diameter, 2.9 cm)
Large cotton balls Fisher Scientific 22-456-883
Paper protractor 10 inch (diameter, 25.4 cm)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harrison-Felix, C. L., Whiteneck, G. G., Jha, A., DeVivo, M. J., Hammond, F. M., Hart, D. M. Mortality over four decades after traumatic brain injury rehabilitation: A retrospective cohort study. Arch Phys Med Rehabil. 90, 1506-1513 (2009).
  2. Coronado, V. G., et al. Surveillance for traumatic brain injury-related deaths – United States. MMWR Surveill Summ. 60, 1-32 (1997).
  3. Masel, B., DeWitt, D. S. Traumatic brain injury: A disease process, not an event. J. Neurotrauma. 27, 1529-1540 (2010).
  4. Blennow, K., Hardy, J., Zetterberg, H. The neuropathology and neurobiology of traumatic brain injury. Neuron. 76, 886-899 (2012).
  5. Prins, M., Greco, T., Alexander, D., Giza, C. C. The pathophysiology of traumatic brain injury at a glance. Disease Models Mech. 6, 1307-1315 (2013).
  6. Menon, D. K. Unique challenges in clinical trails in traumatic brain injury. Crit Care Med. 37, S129-S135 (2009).
  7. Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nature Rev Neurosci. 14, 128-142 (2013).
  8. Balsiger, Z., Leudkte, J., Mawer, S., Willey, M. HIT device high speed analysis. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=hkmCXwPacBQ (2014).
  9. Davceva, N., Janevska, V., Illevski, B., Petrushevska, G., Popeska, Z. The occurrence of acute subdural haematoma and diffuse axonal injury as two typical acceleration injuries. J Forensic Leg Med. 19, 480-484 (2012).
  10. Katzenberger, R. J., Loewen, C. A., Wassarman, D. R., Petersen, A. J., Ganetzky, B., Wassarman , D. A. A Drosophila. model of closed head traumatic brain injury. Proc Natl Acad Sci USA. 110, E4152-E4159 (2013).
  11. Fang, Y., Bonini, N. M. Axon degeneration and regeneration: insights from Drosophila .models of nerve injury. Annu Rev Cell Biol. 28, 575-597 (2012).
  12. Babcock, D. T., Ganetzky, B. An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila. J Vis Exp. (84), e51223 (2014).
  13. Tully, T., Preat, T., Boynton, S. C., Vecchio, M. D. Genetic dissection of consolidated memory in Drosophila. Cell. 79, 35-47 (1994).
  14. Andretic, R., Shaw, P. J. Essentials of sleep recordings in Drosophila.: moving beyond sleep time. Methods Enzymol. 393, 759-772 (2005).

Tags

Неврология выпуск 100, смертность черепно-мозговая травма

Erratum

Formal Correction: Erratum: A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila
Posted by JoVE Editors on 07/14/2015. Citeable Link.

An author's name was corrected in the publication of A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila. The second to last author's was spelled incorrectly. It has been updated from:

Barry Ganetky

to:

Barry Ganetzky

Метод Нанесение Закрытое Глава травматическое повреждение мозга в<em&gt; Drosophila</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Katzenberger, R. J., Loewen, C. A.,… More

Katzenberger, R. J., Loewen, C. A., Bockstruck, R. T., Woods, M. A., Ganetzky, B., Wassarman, D. A. A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila. J. Vis. Exp. (100), e52905, doi:10.3791/52905 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter