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Summary
Aquí se describe un método para infligir cabeza cerrada lesión cerebral traumática (TBI) en Drosophila. Este método proporciona una puerta de entrada para investigar los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a patologías TBI utilizando la amplia gama de herramientas experimentales y técnicas disponibles para las moscas.
Abstract
La lesión cerebral traumática (TBI) afecta a millones de personas cada año, causando deterioro de la física, cognitiva, y las funciones de comportamiento y de la muerte. Los estudios que utilizan Drosophila han contribuido importantes avances en la comprensión de los procesos neurológicos. Por lo tanto, con el objetivo de entender las bases celulares y moleculares de patologías TBI en los seres humanos, hemos desarrollado el dispositivo de Alto Impacto de Trauma (HIT) para infligir cabeza cerrada TBI en las moscas. Las moscas sometidas a la pantalla fenotipos dispositivo HIT consistentes con TBI humana tales como la incapacidad temporal y la neurodegeneración progresiva. El dispositivo HIT utiliza un mecanismo basado en el resorte para impulsar moscas contra la pared de un vial, causando daño mecánico al cerebro de la mosca. El dispositivo es barato y fácil de construir, su funcionamiento es simple y rápida, y produce resultados reproducibles. En consecuencia, el dispositivo HIT se puede combinar con las herramientas y técnicas para moscas para abordar fundamental experimentales existentespreguntas acerca de TBI que pueden conducir al desarrollo de diagnósticos y tratamientos para TBI. En particular, el dispositivo HIT puede ser utilizado para realizar cribados genéticos a gran escala para entender la base genética de patologías de TBI.
Introduction
La lesión cerebral traumática (TBI) se define como una lesión al cerebro de una fuerza mecánica externa. Por lo general, los resultados de TBI de las fuerzas de cabeza cerradas tales como fuerzas contundentes y aceleración inercial y fuerzas de desaceleración que hacen que el cerebro de huelga el interior del cráneo. En los Estados Unidos, se estima que 50.000 personas mueren cada año a partir de la LCT y 2,5-6.500.000 personas están viviendo con las consecuencias de TBI, incluyendo debilitante físico, cognitivo y problemas de comportamiento 1,2. Las consecuencias de TBI son no sólo debido a lesiones mecánicas primarias al cerebro, sino también a las lesiones celulares y moleculares secundarios en el cerebro, así como otros tejidos que se producen con el tiempo 3-5. El desarrollo de métodos para el diagnóstico y tratamiento de TBI ha demostrado ser difícil porque TBI es un proceso de enfermedad compleja. La naturaleza variable de las lesiones primarias, la fisiología humana y factores ambientales como resultado i secundaria heterogéneanjuries y patologías. Factores variable subyacente incluyen la gravedad de la lesión primaria, el tiempo entre las lesiones primarias repetitivas, y la edad y el genotipo del individuo. La comprensión de cómo cada factor variable contribuye a las consecuencias de la lesión cerebral traumática es probable que ayudar en el desarrollo de métodos para el diagnóstico y tratamiento de TBI 6,7.
Aquí se describe un método para infligir TBI cabeza cerrada en Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) que se puede utilizar para delinear la contribución de factores variables a las consecuencias de TBI. El método se basa en una observación inicial que intensamente golpeando el lateral de un vial cultura mosca contra la palma de una mano hizo de tipo salvaje vuela para convertirse incapacitado temporalmente, una consecuencia probable de la LCT. Por lo tanto, hemos construido el dispositivo de Alto Impacto de Trauma (HIT) para recapitular las fuerzas de aceleración y deceleración de la acción de golpear la mano. Una película de alta velocidad muestra que un solo tiro desde laHIT dispositivo hace que vuela a ponerse en contacto con la pared del vial varias veces con la cabeza y el cuerpo 8. Hasta cierto punto, todos los contactos son susceptibles de causar el cerebro de la mosca a rebotar y deformarse en contra de la cápsula de la cabeza, similar a lo que ocurre con los seres humanos en caídas y accidentes automovilísticos 9. En consecuencia, las moscas tratadas con los fenotipos de visualización de dispositivos HIT consistentes con lesión cerebral, incluyendo la incapacidad temporal seguido de ataxia, la recuperación gradual de la movilidad, los cambios de expresión génica en la cabeza, y la neurodegeneración progresiva en el cerebro 10. Así, el dispositivo HIT hace posible el estudio de TBI utilizando el enorme arsenal de herramientas y técnicas desarrolladas para moscas experimentales.
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Protocol
1. Construcción del Dispositivo HIT
- Conecte el muelle a la placa mediante dos abrazaderas y cuatro tornillos (Figura 1A). Centrar las abrazaderas relativas a la anchura de la junta directiva y Butt ellas una contra otra con el rubor de sujeción exterior con el borde de la placa. Antes de fijar las abrazaderas, doblarlas con unos alicates para encajar firmemente sobre la primavera.
NOTA: Véase la Tabla 1 para las descripciones de los materiales necesarios para la construcción del dispositivo de HIT. El extremo sujeto del muelle debe ser de 1/8 de pulgada (3,2 mm) del borde de la placa, y el extremo libre debe extenderse sobre el tablero por 3/4 pulgadas (19 mm). Ajuste el resorte de manera que quede paralelo con la longitud de la placa. - Envolver el extremo libre del resorte de una vez alrededor de la banda adhesiva de bucles de Velcro. El borde exterior de la Velcro debe estar al ras con el extremo del resorte. El Velcro es importante porque se utiliza para asegurar el vial a la primavera por creCIONES un accesorio de compresión apretado. El Velcro también permite una fácil conexión y remoción de los viales, permitiendo muchos viales para ser procesados en un corto período de tiempo.
- Coloque la tapa cubo de hielo al revés, centrado, apretada contra la tabla de madera. Oriente la región elevada de la cubierta cubo de hielo de forma que el borde largo es paralela a la anchura de la junta. Tenga en cuenta que la región elevada del cubo de hielo es 1/2 pulgadas (13 mm) más alta que la tabla de madera, de modo que cuando un vial se adjunta a la primavera la primavera no se acueste en el tablero.
- Deslice todo el dispositivo contra un objeto fijo, como una pared, por lo que la cubierta cubo de hielo se acuña entre la tarjeta y el objeto y no se mueve.
- Tape el transportador de papel para el fondo de una bandeja de cartón vuela vial y ponte en ventaja frente a la longitud de la junta de modo que la marca de 90 ° está alineado con la primavera, cuando se tira de nuevo a una posición perfectamente vertical.
2.El funcionamiento del dispositivo HIT
- Lugar entre el 1 y el 60 CO 2 -anesthetized vuela en un frasco vacío y el tapón del frasco con un algodón muy ajustada.
- Confinar las moscas a la parte inferior de 1 pulgada (2,5 cm) del vial, empujando la bola de algodón en el vial hasta que es 1 pulgada (2,5 cm) desde la parte inferior. Es útil para dibujar una línea en el vial en la marca de 1 pulgada (2,5 cm). Tenga en cuenta que confinar moscas a las regiones más grandes o más pequeñas del vial puede afectar a la gravedad de fenotipos.
- Espere 5 minutos para las moscas para recuperar la movilidad del CO 2. Nótese que no se sabe si 5 min es suficiente para eliminar completamente los efectos de CO 2.
- Insertar el extremo del resorte en el vial hasta que el borde interior de la Velcro quede al ras con la parte superior del vial (Figura 1B). Cuando la primavera está plana, 1 pulgada (2,5 cm) del vial debe solapar la región elevada de la cubierta cubo de hielo. Los viales se pueden reutilizar mningún veces.
- Mientras está sentado, mantenga el vial en la región de velcro con el pulgar y el dedo índice de su mano izquierda. Sostenga la junta ajustado al sobremesa con la mano derecha. Como alternativa, utilice C-abrazaderas para sostener el tablero ajustado al sobremesa.
- Tire de la primavera perfectamente hacia atrás hasta el ángulo deseado. Suelte la primavera. Deje que la primavera por venir a una parada completa.
- Retire el vial de la primavera y permiten que las moscas se recuperen para ≥5 min. Someter las moscas a otra huelga o transferir las moscas a un vial con la comida de la mosca.
NOTA: Una variedad de ensayos se puede utilizar para evaluar los efectos fenotípicos de huelgas desde el dispositivo HIT. Por ejemplo, los efectos sobre la longevidad se pueden determinar mediante el análisis el porcentaje de moscas que sobreviven a veces después de la lesión, los efectos sobre la morfología del cerebro pueden ser determinados por el análisis histológico de la cabeza, y los efectos sobre la expresión génica pueden ser determinados por análisis cuantitativo de los niveles de mRNA 10. - Determinefectos electrónicos del procedimiento que no se deben a las huelgas por el tratamiento de forma idéntica moscas de control que no están sometidos a las huelgas. Use protección para los oídos debido a que el impacto de la ampolla contra la tapa de cubo de hielo produce un ruido fuerte.
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Representative Results
Estamos interesados en entender por qué las moscas mueren poco después de la lesión primaria. Para cuantificar la muerte, se determinó el Índice de Mortalidad a las 24 horas (MI 24), que es el porcentaje de moscas que murió dentro de las 24 horas de la lesión primaria. Las moscas sometidas a ataques desde el dispositivo de HIT se incubaron a 25 ° C en un vial con la comida de la mosca, y el número de moscas muertas se contó después de 24 horas. Utilizamos este enfoque para identificar los factores que afectan a la MI 24 y encontramos que el MI 24 no se ve afectada por el número de moscas en un vial (10 a 60 moscas se puso a prueba), el tiempo entre ataques repetitivos (1 a 60 min se probó ), o el sexo de la mosca 10. En contraste, se encontró que la edad en el momento de la lesión primaria y el genotipo afectó el MI 24. Moscas de más edad tenían un mayor MI 24 que las moscas más jóvenes, y las moscas de diferentes genotipos tuvieron significativamente diferentes MI 24 s.
En la Figura 2, Hemos probado si la gravedad de la lesión primaria afecta el MI 24. Para alterar la gravedad de la lesión primaria, se desvió el resorte a diferentes ángulos. Para cada ángulo, viales de cualquiera de 0-7 o 20-27 días de edad w 1118 moscas (una cepa estándar de laboratorio) se sometieron a cuatro huelgas con 5 minutos entre las huelgas. Tres frascos de 60 moscas fueron examinados para cada ángulo. Las moscas se transfirieron a viales con melaza de alimentos, se incubaron a 25 ° C, y el número de moscas muertas se contaron después de 24 hr. Se calculó el error promedio MI 24 y estándar de la media para cada ángulo. Estos datos revelan que los ángulos más grandes de desviación, es decir., Lesiones primarias más graves, resultan en una mayor MI 24 de ángulos más pequeños de la desviación, es decir., Lesiones menos graves. Esto se observó tanto para los viejos moscas 0-7 y 20-27 días. Además, de acuerdo con Katzenberger et al. 10, 20-27 días de edad fls tuvieron una mayor MI 24 de 0-7 días de edad moscas en ángulos ≥50 °. Por lo tanto, estos datos indican que en múltiples edades el MI 24 se correlaciona con la gravedad de la lesión primaria.
Figura 1:. Diagrama del dispositivo HIT (A) Ilustración de la vista superior del dispositivo de HIT en la posición de reposo. (B) Ilustración de la vista lateral del dispositivo de HIT. El resorte se muestra en la posición de reposo (rojo oscuro) y desviado a 90 ° (rojo claro).
Figura 2:. Gravedad de la lesión primaria se correlaciona con el MI 24 Se determinó el MI 24 para 0-7 días de edad w
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Discussion
El método HIT dispositivo se distingue de otros métodos que infligen lesión traumática en las moscas por el hecho de que se hace que la cabeza cerrada en lugar de penetrar TBI 11. Además, el método dispositivo HIT toma menos tiempo, esfuerzo y habilidad para infligir TBI en muchas moscas, por lo que el método es más susceptible que otros métodos a las pantallas genéticos a gran escala. Por último, el hecho de que las lesiones primarias infligidas por el dispositivo HIT no se limitan al cerebro es a la vez una limitación y una ventaja. Es una limitación porque se requieren estudios adicionales para evaluar si fenotipos son debido a una lesión traumática al cerebro o a otras partes del cuerpo. Por otro lado, politraumatismos (lesión traumática en múltiples partes del cuerpo) a menudo acompaña TBI y está pensado para modular fenotipos de TBI, por lo que el método HIT dispositivo se puede utilizar para investigar la contribución de politraumatismo a fenotipos de TBI. El modelo de TBI mosca también tiene ventajas sobre los roedores y los modelos de TBI de primates no humanos
Este protocolo describe la construcción y el funcionamiento del dispositivo de HIT, que está diseñado para infligir TBI cerrada en la cabeza en las moscas. Hemos utilizado el dispositivo de HIT en conjunto con el MI 24 </ Sub> ensayo para estudiar la muerte del organismo después de TBI 7. Sin embargo, el modelo de TBI mosca se puede utilizar en muchas otras maneras de entender la muerte, así como otras consecuencias de la TBI. Por ejemplo, consecuencias físicas de TBI se pueden medir utilizando ensayos para parámetros tales como la escalada o del vuelo, y las consecuencias de comportamiento de TBI se puede medir utilizando ensayos para los parámetros tales como el sueño y el aprendizaje y la memoria 10,12-14. Efectos estructurales en el cerebro pueden determinarse utilizando técnicas de imagen tales como microscopía de inmunofluorescencia y microscopía electrónica de transmisión. Efectos moleculares en el cerebro pueden determinarse usando ensayos de genómica, tales como RNA-Seq o ensayos proteómicos tales como espectrometría de masas. Efectos genéticos en el cerebro se pueden determinar mediante métodos como condicional derribo de genes y la sobreexpresión. Efectos ambientales sobre las consecuencias de la LCT se pueden determinar mediante diversos parámetros de pre- o después de la lesión, como la temperatura de incubación y la dieta o los parámetros deel dispositivo HIT tales como el ángulo de deflexión del resorte o el tiempo entre ataques repetitivos. Por último, el dispositivo de HIT puede utilizarse para pantallas genéticos a gran escala para abordar cuestiones fundamentales tales como por qué las consecuencias de TBI son peores en las personas de mayor edad que los individuos más jóvenes, así como para las pantallas de gran escala de medicamentos que se pueden utilizar para identificar tratamientos para las consecuencias de la LCT.
Cuando se utiliza en una manera consistente, hemos encontrado que el dispositivo HIT produce fenotipos reproducible entre experimentos independientes y usuarios. Los parámetros que pueden afectar a la reproducibilidad son la puesta en marcha y el funcionamiento del dispositivo de HIT. Fenotipos pueden verse afectados de manera significativa por los pequeños cambios en la posición de la tapa cubo de hielo con respecto a la placa, la posición de la bola de algodón en el vial mosca, y la posición del vial en relación con la tira de velcro. Además, como se muestra en la Figura 2, los fenotipos pueden ser afectados significativamente por pequeños cambios en elángulo de desviación de la primavera. De este modo, los nuevos usuarios del dispositivo HIT deben ser monitoreados para asegurar que la puesta a punto y operación son idénticas a la de los demás usuarios. Rutinariamente Calibramos nuevos usuarios haciendo que determinan el MI 24 de 0-7 días de edad w 1118 moscas. Por último, el dispositivo HIT no necesita ser idéntica a la descrita en el protocolo. Esperamos que la mayoría de las partes del dispositivo HIT pueden alterarse mientras se mantiene la capacidad de infligir TBI en las moscas.
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Disclosures
No tenemos conflictos de intereses a revelar.
Acknowledgments
Esta labor fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud de subvención, R01 AG033620 (BG) y por Robert Draper Tecnología Financiación Innovación (DAW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zinc plated compression spring | The Hillman Group | 540189 | 9 7/8 inch (length, 2.2 cm), 15/16 inch (outer diameter, 2.4 cm), 0.12 inch (wire size, 0.3 cm) |
| Wooden board | 9 inch (length, 22.9 cm), 6.5 inch (width, 16.5 cm), 0.75 inch (height, 1.9 cm) | ||
| Clamps | Sigma Electrical Manufacturing Corporation | 49822 | 3.10 inch (length, 7.9 cm), 0.68 inch (width, 1.7 cm), 1.11 inch (height, 2.8 cm), EMT Two Hole Straps, click on type for 1 inch (2.5 cm) steel EMT conduit |
| Loop half of self-adhesive velcro | 3 inch (length, 7.6 cm), (3/4 inch width, 1.9 cm) | ||
| Polyurethane ice bucket cover | Fisher Scientific | 02-591-45 | 9 1/8 inch (length, 23.2 cm), 9 1/8 inch (width, 23.2 cm), 1 1/4 inch (height, 3.2 cm) |
| Plastic fly vials | Applied Scientific | AS-510 | 3 11/16 inch (height, 9.4 cm), 1 1/16 inch (inner diameter, 2.7 cm), 1 1/8 inch (outer diameter, 2.9 cm) |
| Large cotton balls | Fisher Scientific | 22-456-883 | |
| Paper protractor | 10 inch (diameter, 25.4 cm) |
References
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Tags
Neurociencia Número 100,Erratum
Formal Correction: Erratum: A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila
Posted by JoVE Editors on 07/14/2015.
Citeable Link.
An author's name was corrected in the publication of A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila. The second to last author's was spelled incorrectly. It has been updated from:
Barry Ganetky
to:
Barry Ganetzky
