Protocol
De protokoller og brug af forsøgsdyr blev godkendt af de institutionelle dyr pleje og brug udvalg på universitetet i Yamanashi og Waseda University. Animal omhu blev udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer.
1. CPEC Forberedelse
- Fremstille følgende apparater og materialer: et stereomikroskop, fortrinsvis i stand til at transmittere lys fra bunden; et par urmager pincet (Dumont # 3 eller # 4), flamme-steriliseret, lige drift saks, flamme-steriliseret; to sterile 10 cm plast skåle indeholdende 20 ml iskold Leibovitz L-15-medium; 35 mm glas-bottom skåle indeholdende 2 ml RT Leibovitz L-15-medium; et 100 ml bægerglas indeholdende 70% ethanol; neonatale mus hvalpe.
- Kortvarigt nedsænkes en neonatal mus i 70% ethanol og aflive hurtigt ved halshugning hjælp af operativsystemer saks.
- Placer hovedet umiddelbart i iskoldt Leibovitz L-15-medium i sterile 10 cm dish.
- Fjerne huden fra calvaria ved hjælp af parret af urmager pincet, skar kraniet for at blotlægge hjernen, og derefter skære kranienerverne at isolere hele hjernen.
- Overfør hjernen til en ny skål indeholdende iskold Leibovitz L-15 mellemstore og observere under stereomikroskop, og sørg for, at hjernen er helt nedsænket i mediet.
- Indstil dorsale aspekt af hjernen opad, og orientere hjernen, så de olfaktoriske pærer bor på 3:00 position (for højrehåndede personer). Hold hjernen forsigtigt med pincet i venstre hånd.
- Brug af fine dissektion pincet (Dumont # 3 eller # 4) i højre hånd, skære hjernebjælken og under parenkym forbinder de cerebrale halvkugler langs langsgående revne af cerebrum.
- Skub forsigtigt hjernehalvdele væk til de laterale sider og afsløre den tværgående cerebral revne.
- Adskil halvkugler ved at klemme ud the parenkym mellem halvkugle og thalamus.
- Træk forsigtigt de laterale ventrikulære choroid plexus, som er fastgjort til den laterale side af hippocampus ved hinden affixa.
- Overfør de isolerede chorioideus plexus til 35 mm glas-bund skål indeholdende frisk Leibovitz L-15 medium og overlay en vægt (Materialer List) forsigtigt for at holde vævet på plads.
2. Levende Imaging af CPEC Cilia
- Bekræft ordentlig ultraviolet (UV) og udledes (IR) cut filter (er) for at blokere lys kortere end 400 nm og længere end 700 nm, og at neutral density (ND) filtre (25% og 6%) indsættes i lysbanen af omvendt mikroskop.
- Juster fokus objektivlinsen nogenlunde med det blotte øje, og derefter justere kondensatoren så midten og fokus i overensstemmelse med den Köhler belysning. Indsæt et kontrast passende differential interferens (DIC) prisme, en DIC element, samt analysator og polarisator elementer i light vej at opfylde DIC optik.
- Justere kontrasten i betragtning af DIC prisme position, således at strukturen af vævsoverfladen er mest genkendelige. Hvis alle cilier af målcellerne er bevægelige, kan et klart overblik over motile cilier ikke udvindes ved øjet på grund af deres bevægelse.
- Skift strålegangen til videokameraet, og fjern ND-filtre til at øge lyset magt.
- Bruger kameraet i at fokusere tilstand for at justere synsfeltet og fokus. Under fokusering, hvor videobilleder vises på real-time på skærmen, et klart overblik over bevægelige cilier er ikke tilgængelig.
- Brug kameraet ved 200 Hz med en eksponeringstid på 0,1 ms for den ønskede periode (sekunder til minutter). Efter erhvervelsen af billedstak vil enkeltbilleder vise klare ciliære strukturer. Hvis ciliære kanter er sløret, øge billedhastigheden eller bruge en kortere eksponeringstid.
- Optag bevægelse CPEC cilier inden 25-60 min efter eutanasi i LeibovitzL-15-medium.
3. Analyse af Ciliaere Motion
- Manuelt spore slå mønstre af hver cilium på computerskærmen. Mark ciliaere tip positioner i hver ramme med musemarkøren, som er samlet til bane information af hver cilium. Enten analysere bane oplysninger ved hjælp af samme software eller eksport til andre mere generelle applikationer til yderligere analyse. Effektiviteten af denne analyse trin er beskrevet i diskussionen.
- Klassificere baner i to former for motion, back-og-tilbage eller roterende, ved øjet.
- Beregn ciliære bankende frekvens (CBF) ved hjælp af følgende formel: [CBF = (antal billeder per sekund) / (gennemsnitlig antal billeder for en enkelt slag)] 14, som kan fås fra en ciliaere spids bevægelse diagram (Figur 3 ). Gentag denne beregning for flere ciliære bankende cyklusser, fordi andre cilier på den samme celle kan forstyrre bevægelsen af hver cilium, hvilket resulterer i uregelmæssigheder.
- For at analysere den vinkelmæssige ensartethed af ciliære slå akser inden for en enkelt celle, definerer det bankende vinkel θ for hver bane (figur 4). Til back-og-tilbage baner, passer positioner cilia tip til en lige linje, og definere θ som vinklen linjen gør med x aksen. For roterende baner, passer de holdninger en ellipse, og definere θ som vinklen hovedakse ellipsen gør med x aksen. Nærmere oplysninger om montering er beskrevet i repræsentative resultater sektion.
- For kvantitativ beskrivelse af hver bane, beregner generaliseret skærmformat AR. Kort fortalt dreje bane ved - θ og definere AR som forholdet mellem bredden af fordelingen langs x - og y -axes (figur 4B). Detaljer er vist i repræsentative resultater sektionen, og fortolkningen, Betydning og begrænsning af parameteren er beskrevet i Discussion.
4. Prøve Forberedelse til SEM
Bemærk: SEM er en vigtig metode til at vurdere status for cilier på CPECs på en omfattende måde. For at forberede prøver til SEM, en standardprocedure rapporteret tidligere 15 er ansat med mindre ændringer.
- Før dissekere væv fra hjerne, forberede fiksativ i et 5 ml hætteglas med en polyethylen-hætte. Fiksativet består af 2% paraformaldehyd, 2,5% glutaraldehyd (halv Karnovsky opløsning 16) i 0,1 M phosphatbuffer, pH 7,4.
- Dissekere ud vævet fra hjernen som beskrevet i trin 1.
- Kortvarigt skyl isoleret væv med Hanks balancerede saltopløsning (HBSS) i en ny skål og derefter fiksere vævet i fiksativ i hætteglasset i 1 time ved stuetemperatur. Brug engangs overførselspipetter og håndtere prøverne gently. Efter skylning i HBSS, bliver vævet klistret.
- At overføre enheder i fikseringsopløsning, langsomt udvise en lille mængde opløsning indeholdende væv fra overførselspipetten som en dråbe og tilføje til fiksativ.
- Efter fiksering, kasseres fiksativ og skyl vævet med fosfatbuffer tre gange.
- Fordybe vævet i en saccharoseopløsning på 10% til udvaskning af de resterende aldehyder. For at sikre fuldstændig fjernelse af aldehyder, nedsænke prøverne i opløsningen i 10 minutter og derefter gentage to gange med frisk 10% saccharose. Dette trin er vigtigt for at opnå ordentlig post-fiksering i efterfølgende trin.
- Fordybe vævet i en opløsning af 1% osmiumtetroxid i phosphatbuffer i 30 minutter og derefter placere på is i post-fiksering. Bedømme graden af osmification af prøven farve: når aldehyder er fuldstændigt fjernet, er prøven sort.
- Vask den post-fikseret vævsprøver indgående med dobbelt distilled vand flere gange.
- Dehydrere prøverne ved nedsænkning i graduerede koncentrationer af ethanol, sædvanligvis 65%, 75%, 85%, 95%, 99% og 100%, i 10 min hver. Opnå vandfri ethanol ved at placere molekylsigter i 99,5% ethanol fra en nyindkøbt flaske. Gentag dehydrering med vandfri ethanol tre gange.
- Placer dehydrerede prøver til isoamylacetat, en udskiftning reagens til kritisk punkt tørring i 10 minutter. Gentag dette trin to gange. Dette reagens fordamper hurtigt, og prøven kan blive tør, hvilket resulterer i ødelæggelse af overfladespænding. Derfor skal du ikke tørre prøven helt.
- Efter den sidste udveksling af isoamylacetat, fjerne det meste af opløsningsmidlet, straks wrap det åbne hætteglas med aluminiumsfolie, og placere hætteglasset på tøris. Under anvendelse af en nål eller fin pincet, foretage flere huller i folien, der dækker mundingen af hætteglasset, så at flydende carbondioxid flyder let ind i hætteglasset i det kritiske punkt tørretumbler. Fortsæt til næste trinså hurtigt som muligt.
- I dette trin minimere fremførsel af isoamylacetat ind i kammeret af tørretumbler, men lad ikke prøven tørre helt, før kritiske punkt tørring. Hertil kommer, at prøven på tøris ingen i unødig lang tid for at undgå dannelse af rim på hætteglasset.
- Overfør folie-indpakkede hætteglas med vævsprøverne i det kritiske punkt tørretumbler, der sikrer overfladestrukturen af vævet forbliver intakt samtidig fjerne vand indeholdt i vævet. Kan fås detaljerede oplysninger om betjening af kritiske punkt tørretumbler fra producentens anvisninger.
- Håndter prøver forsigtigt at bruge en tandstik til at minimere mekanisk skade. De resulterende tørrede vævsprøver er skrøbelige. Monter prøverne på metal stumper og pels med guld-palladium bruger en ion sputter.
5. Observation af SEM
- Observere ved SEM og optage billeder med et digitalt kameraudstyret til at scanningselektronmikroskop.
- Overfør digitale billeddata til en pc til analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En oversigt over arbejdsgangen er vist i figur 1, herunder billeder af enhederne.
Levende bevægelse observationer af CPECs
Movie 1 viser en film af CPECs isoleret fra en perinatale mus, og Movie 2 viser en udvidet visning af billederne i Movie 1. Det skal bemærkes, at de enkelte ciliære tips er mindre klar i stillbilleder sammenlignet med dem i film. Figur 2 viser sporing af bevægelsen af to cilier med forskellige former for bevægelse, back-og-tilbage og roterende bevægelser, fra dataene vist på film 1 og 2. Figur 3 viser en simpel analyse af baner cilia, hvor faseforskellen i de to koordinater er indlysende i den roterende bevægelse.
Analyse af CPEC ciliær tip baner
De tailed metoder til kvantitativt analysere hver bane er vist i figur 4 med skematiske illustrationer af det bankende vinkel θ definitioner (A) og et flowdiagram af analysen med repræsentative resultater (B).
For at definere det bankende vinkel θ for back-og-tilbage baner, så det passer til positioner af ciliære spids under flere cyklusser til en lige linje y = ax + b, og definere det bankende retning som langs monteret linje. Definer det bankende vinkel her som θ = Arc tan a. Fordi line montering ofte undlader at udtrække den retning, i tilfælde af roterende bevægelse, så det passer til rotations baner til en ellipse, og definere den retning som langs den lange akse monteret ellipse. Mere præcist er spidsen positioner (x, y) i flere bankende cyklusser monteret på funktionen nedenfor.
1.jpg "width =" 310 "/>
hvor 
Den ellipse fitting omfatter fem montering parametre: x 0, y 0, a, b, og θ. X- og y - -spatial koordinater for centrum af ellipsen er x 0 og y 0, hhv. Den større og mindre radier i ellipsen er a og b, hhv. Vinkel θ er vinklen at storakse får med x-aksen, eller slå vinkel. En skematisk fremstilling af disse parametre er illustreret i det højre panel i figur 4A. Beslaget udføres under anvendelse Igor Pro software ved at definere eksplicit funktion beskrevet ovenfor. Derefter et histogram over bankende vinkel θ for alle cilier observered i den samme celle er afbildet som en cirkulær histogram (figur 2 i Narita et al. 8). Frekvensen er normaliseret til antallet af analyserede ciliære tips. Det skal bemærkes, at hver cilium tolkes at have to θ værdier i den cirkulære histogram, f.eks π / 4 og 3π / 4, hvilket fører til symmetrisk fordeling af retningen.
For at definere generaliseret formatforhold AR, er positionerne af ciliære spidsen under flere cyklusser roteres - θ (figur 4B). Ifølge rotation, både frem og tilbage og rotations baner bliver fordelt omtrent parallelt med x-aksen, i hvilken bredden af fordelingen A og B, langs x- og y-akserne henholdsvis er defineret som halvdelen af forskellen mellem minimum og maksimum. Derfor er disse parametre er mere relevante for større og mindre radier af ellipsen, a og b. AR derefter defineret som forholdet mellem A og B ved AR = B / A.
Observationer af chorioideus plexus epitel af SEM
SEM tillader observation af den fine overfladestruktur af eksemplarer. Tilstedeværelsen af cilier på CPECs bekræftes hele udviklingsmæssige tidsforløb. Fremkomsten af flere cilier på CPECs overholdes af embryonale dag (E) 13, kort efter choroid plexus udvikling begynder i de laterale ventrikler omkring E11. På dette trin er cellerne små med en variabel umodne udseende, og de ciliære tip peger mod forskellige retninger. På E15, er en tot af multipel cilier fastsat på toppen af den apikale overflade, som står ud fra de omgivende mikrovilli. Ved postnatal dag (P) 2, er mange cilier fastsættes på et bøjet position, hvilket afspejler den ciliære motilitet observeret af levende billeddannelse. Ved P14, de fleste celler besidder flere cilier, som er ikke-motile samt mikrovilli w ed en finere tekstur sammenlignet med de tidligere stadier. Figur 5 viser SEM billeder af CPECs med cilier på disse stadier. Baseret på de film, der er vist i figur 1 og Movie 1, er det indlysende, at motile cilier let genkendes af levende billeddannelse. Det er imidlertid vanskeligt at skelne mellem ikke-motile cilier ved DIC mikroskopi. SEM er derfor nødvendig for at forstå den samlede ciliære stater.
Figur 1:. Oversigt over arbejdsgangen (a) stereomikroskop. (B) omvendt mikroskop udstyret med en ladet koblet anordning (CCD) kamera. (C) Computer skærmen under analysen. (D) Ion sputter. (E) Prøve for SEM. (F) scanningselektronmikroskop.
Movie 1.pload / 52991 / Figure_2.mov "target =" _ blank "> Movie af ovenfra af CPECs og cilier fra en P2 mus hvalp i high-speed video mikroskopi. På grund af den uregelmæssige overflade choroid plexus væv, dette øjebliksbillede indeholder . både i fokus og ud af fokus fly Området i kassen er udvidet og vist i Movie 2 Målestok:. 2 um.
Movie 2. Film af den udvidede visning af vævsprøven i Movie 1. Beating cilier viste enten roterende eller back-og-tilbage bevægelser. Målestok: 1 um.
Figur 2:. Rekonstituering af bane CPEC cilier fra time-lapse billeder i Movie 2 (A) Cilia med back-og-tilbage bevægelse (øverst) og roterende bevægelse (nederst). DIC billeder fra filmen data præsenteres på 50 ms intervaller (1-8, skala bar: 1 pm). Positionen af mål-ciliære spids er angivet med en pilespids. (B) De baner (brudt linje) og positioner ciliære tips (farvede cirkler) vist i billeder er overlejret.
Figur 3:. To former for CPEC ciliære tip bevægelse rekonstitueret fra filmdata Repræsentative ciliære tip bevægelser, back-og-tilbage bevægelse (A) og roterende bevægelse (B), over flere cykler præsenteres som baner (top, skala barer: 0,5 um). Tidsforløbet af x- og y-koordinaterne for spidsen position er plottet henholdsvis (i midten). For at demonstrere en fase-skift mellem de to koordinater, x- og y-koordinaterne blev normaliseret til [-1,1], og overlejret (nederst, røde og blå linjer henholdsvis).
igur 6 "src =" / files / ftp_upload / 52991 / 52991fig6.jpg "/>
Figur 4: Skematiske illustrationer beskriver analysen af ciliære tip baner (A) Definitioner af det bankende vinkel θ for back-og-tilbage (venstre panel) og roterende (højre panel) baner.. Parametre i formlen beskriver monteret ellipse, a, b, x 0, og y 0, er vist i højre panel. (B) rutediagram for montering analyse af de baner at definere bankende vinkel θ og AR. Faktiske resultater af montering af de repræsentative baner præsenteres i de rigtige paneler.
Figur 5: SEM billede af cilier. Repræsentative SEM mikrografier af CPECs på E13, E15, P2 og P14. I den tid naturligvis CPECs øges i omfang, og udviklet microviLLI og cilier på den apikale overflade. En tot cilier på E13 er endnu at erhverve motilitet. Hos P2, når forholdet mellem cilier med motilitet nået det højeste punkt, er mange bøjede cilier observeret. Ved P14, cilia mister motilitet. Målestok: 5 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Perspektiver ved denne metode
Selvom teknikken beskrevet her ikke giver en mere detaljeret analyse af cilier end tidligere offentliggjorte metoder, betydningen af denne teknik ligger i enkeltheden i systemet og omkostningseffektivitet, som let kan anvendes på screening nogen form for ciliær motilitet ex vivo. Især TI Workbench giver en enkel og brugervenlig grænseflade, der gør det muligt for forskerne at observere og analysere ciliær motilitet lettere. Er ikke blevet udviklet effektive automatiske tracking metoder for lav kontrast genstande såsom ufarvet cilier i video-forstærket kontrast-DIC. Selv om fremgangsmåden til at spore ciliær bevægelse er manuel i denne teknik, er den indsats i ciliære bevægelsessporing analyse optimalt reduceret sammenlignet med anvendelse af generelle formål softwarepakker til billedanalyse.
Sample dissektion
For at fremstille ex vivo CPEC prøver, hurtige og blide manipulationer er nødvendige for at bevare levedygtigheden af væv, som sikrer motilitet af cilier ex vivo. Fordi forurening med erythrocytter udvisker området observation, er blid, men indviklet skylning af dissekerede væv med phosphatbufret saltvand anbefales kraftigt. At undgå blødning, skal der udvises omhu for at undgå at rive den posteriore choroid arterie, der kan identificeres som en fremtrædende rødlig trådlignende struktur klæbet til lamina affixa af kolloid plexus.
Mikroskop
Et omvendt mikroskop udstyret med DIC optik og en high-power transmission lyskilde er afgørende for denne metode. Fordi kviksølvlamper er normalt ude af stand til hyppigt at skifte til og fra, er det nødvendigt med en lukkertid foran lampehuset. Enten en manuel eller elektrisk Lukkeren kan anvendes til dette formål. For at beskytte prøver og iagttagerens øjne from UV- og IR-lys, er optiske filtre forpligtet til at give kun synligt lys (400-700 band pass eller en kombination af UV og IR cut filtre). ND filtre er også nødvendigt at ændre lyset magt, varierer afhængigt af situationen: overvågning med øjet fokus med et videokamera, og high-speed tidsforskudt optagelse. En objektivlinse med en høj numerisk apertur er nødvendigt for en høj opløsning. Der er en vis afstand mellem toppen af dækglasset og omdrejningspunktet grund af morfologi og tykkelse af vævet. Derfor er en vand nedsænkning linse i stedet for en olie nedsænkning linse foretrækkes til bedre billedkvalitet. Vibrationsisolering er også nødvendigt at give stabilt image stakke. Air dumper-type tabeller er nyttige til dette formål, men enklere dæmpning af mikroskopet ved at indsætte tennisbolde under mikroskop base med en konstant tabel kan også virke.
Videokamera
En CCD-kamera er i stand til mindsst 200 billeder / sek er nødvendig for at spore flytning af cilia. I det seneste årti er CCD-kameraer med hurtigere frame rates end standard video sats (25-30 Hz) bliver tilgængelige ved meget lavere omkostninger. Kameramodeller stand til kortere udsætte gange end enkeltbilledintervallet er nyttige til at reducere sløring som følge af flytning af cilia uden at øge mængden af data. En eksponeringstid på 0,1 ms og en 5 ms ramme interval (200 Hz) er minimumsbetingelser for at opnå ciliære billeder af CPECs med tilstrækkelig kvalitet.
Software
Analysen at spore bevægelsen af hvert cilium er tidskrævende, især når generelle formål softwarepakker til billedanalyse bruges til at spore hver ciliær spids. Reduktion trinene gentagne opgaver, såsom mus klikke på ciliære spids position på skærmen, vælge en menu for at registrere klikket position, og klikke på en knap for at flytte til næste billedramme, resulterer i en betydelig reduktion af tid og kræfter. I denne undersøgelse blev en særlig rutine tilføjet til skræddersyet TI Workbench softwaren. I ciliære sporing form for TI Workbench softwaren holder brugeren looping følgende enkle to-trins operation: flytte musemarkøren til ciliære spids og trykke på en piletast på tastaturet for at rykke rammen, som ikke kræver at flytte pointer eller brugerens øjne mus til at flytte (til menuer og knapper på computerskærmen) fra ciliære tips på computerskærmen. Den software holder styr på de ciliære tip holdninger, viser indspillet bane for at hjælpe brugeren, og skaber en tabel med ciliær bevægelse oplysninger til yderligere analyse. Mest generelle formål software til billedanalyse tillader programing makroer for batch behandling af sådanne gentagne opgaver. Sådan skik programmering for at reducere gentagne trin anbefales kraftigt.
Analyse af baner
Ekstraktion af trajectories blev udført ved hjælp af skræddersyet TI Workbench software, som beskrevet ovenfor. Relativt enkle analyse og billedbehandling blev også udført under anvendelse af samme software. For montering analyser blev bane hver ciliære spids overført til Igor Pro-softwaren. Andre avancerede analyse software såsom MATLAB kan også bruges til dette formål.
I den aktuelle undersøgelse, på grund af vanskeligheder i kategorisere baner i back-og-tilbage eller roterende baner blev baner klassificeret af øjet i en blindet mode, som blev bekræftet af en anden iagttager, hvilket resulterer i ensartet klassificering. Ikke desto mindre ville mere matematisk stringent foranstaltninger for at kategorisere baner uden nogen mulig vilkårlighed være at foretrække. Ellipse montering af banerne synes at være ideel, hvilket kunne kvantificere omfanget af ellipticitet som aspektforholdet for den tilpassede ellipse () i både frem og tilbage og roterende bevægelser. Dog, Et forsøg på at anvende fordelingen af formatforholdet til at definere en tærskelværdi for klassificering var ineffektiv. Beslaget ofte mislykkedes for back-og-tilbage baner, parametrene ofte undladt at konvergere, og konvergerede montering tilsyneladende var uvirkelig. Derfor blev ellipse montering ikke vedtaget til automatisk at kategorisere baner eller kvantificere ellipseform af hver bane. Beslaget blev udført for at udtrække det bankende retning drejeligt bevægelige tip som storakse monteret ellipse.
I den aktuelle undersøgelse blev AR foreslået at kvantificere det omfang, at en bane afviger fra en ideel lineær frem og tilbagegående bevægelse. Parameteren er forholdet af bredden af fordelingen vinkelret på bankende retning til, at der langs retningen. Værdien skal være nul, når den bane er en lige linje, og en når den bane er en cirkel, der ligner aspektforholdet for ellipsen nævnt ovenfor.
I praksis kan opnå AR værdien være relativt let ved at dreje bane, således at det bankende retningen bliver parallel med x-aksen (figur 4B). Denne kvantificering fører til betydeligt forskellige værdier for de to former for bevægelse, hvilket tyder på den potentielle anvendelse af parameteren ikke blot at kvantificere de særlige kendetegn ved hver enkelt bane, men også til mere konsekvent klassificere baner. Imidlertid bør det bemærkes, at det bankende retning selv er allerede et resultat af særskilte montering processerne for de to tilstande i den nuværende metode.
Yderligere forbedring af analysen, såsom en mere avanceret fitting algoritme, kan løse problemerne med mulig vilkårlighed.
Et aspekt vedrørende ellipticiteten af banen er, at slå af hver CPEC cilium måske ikke finder sted i det plan, der er strengt vinkelret på x - y
Forberedelse til SEM
Under forberedelsen af SEM observation, er der flere vigtige punkter, der sikrer køb af billeder af høj kvalitet. For det første skal post-fiksering ved osmiumtetroxid udføres omhyggeligt, herunder pre-vask med en saccharoseopløsning 10%. Uden ordentlig fiksering ved osmification procedure, kan de efterfølgende trin ikke opretholde eller genoprette tilstanden af prøverne, hvilket fører til en lavere kvalitet af præparatet. Fordi aldehyd fikseringsmidler er reduktionsmidler, eventuelle resterende aldehyder inden prøven inhiberer aktiviteten af osmiumtetroxid, en stærk oxiderende reagens. At sikre fjernelse af overflødige aldehyder i prøver, omhyggelig vask med saccharoseopløsningen er bydende nødvendigt. I tilfælde af suboptimal post-fiksering, er farven af prøven ikke skifte fra brun til sort. For det andet skal den mængde osmiumtetroxid være mindst 50 gange større end den for prøven. Ellers kan der ikke forventes tilstrækkelig fiksering. For det tredje er det vigtigt at undgå fuldstændig tørring af prøverne, især under tørringen, der beskæftiger højt ren ethanol og isoamylacetat. Tørring af prøven ødelægger de fine overfladestrukturer såsom cilier, hvilket resulterer i dårlige billeder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser. Dette papir har til formål at rapportere detaljeret metode til at observere motilitet cilier i isolerede chorioideus plexus væv. Videnskabelige nyheder er blevet rapporteret i tidligere studier 1,8.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Required reagents | |||
| for live cell imaging | |||
| ethanol | Wako Chemicals | 057-00456 | |
| Leibovitz L-15 medium | Life Technologies | 11415-064 | |
| for SEM preparation | |||
| ethanol | Wako Chemicals | 057-00456 | |
| Hank's balanced salt solution | Life Technologies | 14170112 | |
| paraformaldehyde | Merck | 1040051000 | |
| glutaraldehyde | Nacalai tesque | 17003-05 | |
| isoamyl acetate | Nacalai tesque | 02710-95 | |
| Molecular Sieves 4A 1/8 | Wako Chemicals | 130-08655 | for preparation of anhydrous ethanol |
| phosphate buffer saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| phosphate buffer, 0.1 M | To make 100 ml, mix 19.0 ml of 0.1 M NaH2PO4 and 81.0 ml of 0.1 M Na2HPO4 | ||
| monosodium phosphate (dihydrate) | Nacalai tesque | 31718-15 | |
| disodium phosphate (anhydrous) | Nacalai tesque | 31801-05 | |
| suclose | Nacalai tesque | 30406-25 | |
| osmium tetroxide | Nisshin EM | 300 | |
| dry ice | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools and materials for dissection | |||
| for both live imaging and SEM preparation | |||
| stereo microscope | Olympus | SZX7 | |
| flat paper towel | |||
| Φ10 cm plastic dish | |||
| 100 ml beaker | |||
| straight operating scissors | Sansyo | S-2B | |
| watchmaker forceps | Dumont | No.DU-3 or -4, INOX | |
| for live cell imaging | |||
| glass bottom dish | Matsunami Glass | D110300 | |
| for SEM preparation | |||
| alminum foil | |||
| 5 ml glass vial with a polyethylene cap | Nichiden Rika-Glass | PS-5A | |
| transfer pipette | Samco Scientific | SM251-1S | for specimen tranfer |
| toothpick | for specimen transfer | ||
| ion sputter with gold-palladium | Hitachi | E-1030 | |
| critical point dryer | Hitachi | HCP-2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopic equipment and materials | |||
| for live cell imaging | |||
| inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| 100 W mercury lump housing and power supply | Olympus | U-ULH and BH2-RFL-T3 | |
| 100 W mercury lamp | Ushio | USH103D | |
| DIC condenser, n.a. 0.55 | Olympus | IX-LWUCD | |
| electrrical shutter | Vincent Associates | VS35S22M1R3-24 and VMM-D1 | manual shutter can be used. |
| band-pass filter (400-700 nm, Φ45 mm) | Koshin Kagaku | C10-110621-1 | |
| ND filter (Φ45 mm) | Olympus | 45ND6, 45ND25 | combination of 25% and 6% ND filters are used |
| objective lens (water immersion) with DIC element | Olympus | UApo 40XW/340, n.a., 1.15 with IX-DPAO40 | |
| high-speed video camera | Allied Vision Technologies | GE680 | ≥200 Hz frame rate and 1 msec expose time |
| image acquisition / analysis software | in-hous software | TI Workbench | capable of acquisition at high frame rates. |
| PC for camera control / analysis | Apple | Mac Pro | |
| vibration isolation table | Meiritsu Seiki | AD0806 | |
| weight for tissue | Warner Instruments | slice anchor kits | It can be made with nylon mesh glued to a U-shape squashed Φ0.5 mm platinum wire. |
| cover glass (alternative weight for tissue) | Matsunami | made-to-order | A cover glass can be used as a tissue weight. |
| for SEM | |||
| inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| scanning electron microscope | JEOL | JSM-6510 | |
References
- Nonami, Y., Narita, K., Nakamura, H., Inoue, T., Takeda, S. Developmental changes in ciliary motility on choroid plexus epithelial cells during the perinatal period. Cytoskeleton. 70 (12), 797-803 (2013).
- Bisgrove, B. W., Yost, H. J. The roles of cilia in developmental disorders and disease. Development. 133 (21), 4131-4143 (2006).
- Fliegauf, M., Benzing, T., Omran, H. When cilia go bad: cilia defects and ciliopathies. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (11), 880-893 (2007).
- Oh, E. C., Katsanis, N. Cilia in vertebrate development and disease. Development. 139 (3), 443-448 (2012).
- Shah, A. S., Ben-Shahar, Y., Moninger, T. O., Kline, J. N., Welsh, M. J. Motile cilia of human airway epithelia are chemosensory. Science(New York, N.Y). 325 (5944), 1131-1134 (2009).
- Kiprilov, E. N., et al. Human embryonic stem cells in culture possess primary cilia with hedgehog signaling machinery). The Journal of Cell Biology. 180 (5), 897-904 (2008).
- Hirokawa, N., Tanaka, Y., Okada, Y., Takeda, S. Nodal flow and the generation of left-right asymmetry. Cell. 125 (1), 33-45 (2006).
- Narita, K., Kozuka-Hata, H., et al. Proteomic analysis of multiple primary cilia reveals a novel mode of ciliary development in mammals. Biology Open. 1 (8), 815-825 (2012).
- Takeda, S., Narita, K. Structure and function of vertebrate cilia, towards a new taxonomy. Differentiation; Research in Biological Diversity. 83 (2), S4-S11 (2012).
- Ikegami, K., Sato, S., Nakamura, K., Ostrowski, L. E., Setou, M. Tubulin polyglutamylation is essential for airway ciliary function through the regulation of beating asymmetry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (23), 10490-10495 (2010).
- Foster, K. W.
- Lechtreck, K. -F., Sanderson, M. J., Witman, G. B. High-speed digital imaging of ependymal cilia in the murine brain. Methods in Cell Biology. 91, 255-264 (2009).
- Okada, Y., Hirokawa, N. Observation of nodal cilia movement and measurement of nodal flow. Methods in Cell Biology. 91, 265-285 (2009).
- Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).
- Takeda, S., et al. Left-right asymmetry and kinesin superfamily protein KIF3A: new insights in determination of laterality and mesoderm induction by kif3A-/- mice analysis. The Journal of Cell Biology. 145 (4), 825-836 (1999).
- Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy. The Journal of Cell Biology. 27, 137-138A (1965).
