Protocol
De protocollen en het gebruik van proefdieren werden goedgekeurd door de institutionele dierlijke zorg en gebruik van commissies aan de Universiteit van Yamanashi en Waseda University. Dierverzorging werd uitgevoerd volgens institutionele richtlijnen.
1. CPEC Voorbereiding
- Bereid de volgende inrichtingen en materialen: een stereomicroscoop, bij voorkeur kunnen overbrengen verlichting van onderen; een paar van horlogemaker pincet (Dumont # 3 en # 4), vlam gesteriliseerd, rechte operationele schaar, vlam gesteriliseerd; twee steriele 10 cm plastic schaaltjes met 20 ml ijskoude Leibovitz L-15-medium; 35 mm glazen bodem gerechten met 2 ml RT Leibovitz L-15-medium; een bekerglas van 100 ml bevattende 70% ethanol; neonatale muis pups.
- Kort dompelen een neonatale muis in 70% ethanol en snel euthanaseren door onthoofding met de operationele schaar.
- Plaats de kop onmiddellijk in ijskoude Leibovitz L-15 medium in steriele 10 cm dish.
- Verwijder het vel van de calvaria met het paar horlogemaker tang, opengesneden de schedel naar de hersenen bloot te leggen, en dan snijd de hersenzenuwen om de hele hersenen te isoleren.
- Breng de hersenen om een nieuwe schotel met ijskoude Leibovitz L-15-medium en observeren onder de stereo-microscoop, om ervoor te zorgen dat de hersenen volledig is ondergedompeld in het medium.
- Stel het dorsale aspect van de hersenen naar boven en oriënteren de hersenen, zodat de olfactorische bollen wonen op de drie uur positie (voor rechtshandige personen). Houd de hersenen voorzichtig met de tang in de linkerhand.
- Met behulp van de fijne dissectie pincet (Dumont # 3 en # 4) in de rechterhand, snijd het corpus callosum en onder de parenchym aansluiten van de hersenhelften, langs de longitudinale spleet van de grote hersenen.
- Duw de hersenhelften weg aan de zijkanten en de dwarse cerebrale spleet bloot te leggen.
- Scheid de hersenhelften door knijpen uit the parenchym tussen de halve bol en thalamus.
- Trek de laterale ventriculaire choroid plexus, dat aan de zijkant van de hippocampus wordt bevestigd door de lamina affixa.
- Breng de geïsoleerde choroid plexus naar de 35 mm glazen onderste schaal met vers Leibovitz L-15 medium, en overtrek gewicht (Materials List) langzaam aan het weefsel op zijn plaats.
2. Live-Imaging van CPEC Cilia
- Bevestig juiste ultraviolet (UV) en afgeleid (IR) cut filter (s) te blokkeren licht korter dan 400 nm en langer dan 700 nm, en dat neutrale dichtheid (ND) filters (25% en 6%) worden in het lichtpad geplaatst van de geïnverteerde microscoop.
- Pas de scherpstelling van het objectief ruwweg op het oog, en pas vervolgens de condensor, zodat het centrum en de focus te voldoen aan de Köhler verlichting. Plaats een passende differentiële interferentie contrast (DIC) prisma, een DIC element, evenals analyzer polarisator elementen in de liGHT weg om te voldoen aan de DIC optiek.
- Pas het contrast gezien door het prisma positie DIC zodat de structuur van het weefsel oppervlak meest herkenbare. Als alle cilia van de doelcellen beweeglijk kan een duidelijk beeld beweeglijke cilia niet worden verkregen op door hun beweging.
- Verander het lichtpad om de video camera, en verwijder de ND filters om het licht macht te vergroten.
- Gebruik de camera in richtmodus het gezichtsveld en scherp te stellen. Tijdens het scherpstellen, waarin videobeelden worden weergegeven op real-time op het scherm, een duidelijk beeld van beweeglijke cilia is niet beschikbaar.
- Gebruik de camera op 200 Hz met een belichtingstijd van 0,1 msec voor de gewenste periode (seconden tot minuten). Na de overname van het beeld stack, zal enkele frames duidelijke trilharen structuren weer te geven. Als ciliary randen zijn vaag, verhoging van de frame rate of gebruik een kortere belichtingstijd.
- Noteer de beweging van CPEC cilia binnen 25-60 minuten na euthanasie in LeibovitzL-15 medium.
3. Analyse van Ciliaire Motion
- Handmatig bijhouden slaan patronen van elk cilium op het computerscherm. Mark ciliary tip posities in elk frame met de muisaanwijzer, die worden geassembleerd voor traject informatie van elk cilium. Ofwel analyseren de baan informatie met behulp van dezelfde software of de uitvoer naar andere, meer algemene toepassingen voor verdere analyse. De efficiëntie van deze analysestap wordt beschreven in de discussie.
- Classificeren de trajecten in twee vormen van beweging, heen-en-weer of rotatie, door het oog.
- Bereken de ciliaire kloppende frequentie (CBF) volgens de volgende formule: [CBF = (het aantal frames per seconde) / (gemiddeld aantal frames voor een enkele slag)] 14, dat kan worden verkregen uit een ciliaire tip motion diagram (Figuur 3 ). Herhaal deze berekening voor meerdere cycli ciliaire slaan, omdat andere cilia op dezelfde cel kan interfereren met de beweging van elk cilium, waardoor onregelmatigheden.
- Om de hoek uniformiteit van de ciliaire slaan assen in één cel te analyseren, definiëren het kloppende hoek θ elke bal (figuur 4). Voor back-en-weer trajecten, past de posities van de trilharen tip om een rechte lijn, en definieer θ als de hoek van de lijn maakt met de x-as. Bij roterende trajecten, past de positie van een ellips, en definieert θ de hoek van de lange as van de ellips maakt met de x-as. Details van de fitting worden beschreven in de sectie Representatieve resultaten.
- Voor kwantitatieve beschrijving van elk traject, berekenen algemene aspect ratio AR. In het kort, roteren het traject van - θ en AR definiëren als de verhouding tussen de breedte van de langsheen x - en y -axes (figuur 4B). Details worden in de representatieve resultaten sectie, en de interpretatie, Significantie en de beperking van de parameter worden beschreven in de discussie.
4. Monstervoorbereiding voor SEM
Let op: SEM is een belangrijke methode om de status van de cilia op CPECs op een alomvattende manier te evalueren. Specimens voor SEM te bereiden, een standaard procedure eerder gerapporteerd 15 wordt gebruikt met lichte wijzigingen.
- Voor ontleden het weefsel uit de hersenen, bereidt het fixeermiddel in een 5 ml glazen flacon met polyethyleen dop. Het fixeermiddel bestaat uit 2% paraformaldehyde, 2,5% glutaraldehyde (half Karnovsky's oplossing 16) in 0,1 M fosfaatbuffer, pH 7,4.
- Ontleden het weefsel van de hersenen zoals beschreven in stap 1.
- Kort spoel de geïsoleerde weefsel met Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) in een nieuwe schaal en bevestig het weefsel in het fixeermiddel in het glazen flesje gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Gebruik wegwerp overdracht pipetten en omgaan met de exemplaren gently. Na spoelen in HBSS, het weefsel kleverig.
- Om de monsters te zetten in de fixeeroplossing langzaam verdrijven een kleine hoeveelheid oplossing die het weefsel van de pipet een druppel en aan het fixeermiddel.
- Na fixatie, gooi het fixeermiddel en spoel het weefsel met fosfaatbuffer driemaal.
- Dompel het weefsel in een 10% sucrose-oplossing te spoelen de resterende aldehyden. Om volledige verwijdering van aldehyden waarborgen, dompel de monsters in de oplossing gedurende 10 minuten en herhaal vervolgens tweemaal met vers 10% sucrose. Deze stap is belangrijk om goede post-fixatie in opeenvolgende stappen.
- Dompel het weefsel in een oplossing van 1% osmiumtetroxide in fosfaatbuffer gedurende 30 min en vervolgens op ijs te plaatsen voor post-fixatie. Oordelen over de mate van osmification door het monster kleur: wanneer aldehyden volledig worden verwijderd, het monster is zwart.
- Was het achteraf vaste weefselmonsters uitgebreid met dubbele distilled water een paar keer.
- Uitdrogen de monsters door onderdompeling in gegradeerde concentraties ethanol, gewoonlijk 65%, 75%, 85%, 95%, 99% en 100%, gedurende 10 minuten elk. Verkrijgen watervrij ethanol door het plaatsen van moleculaire zeven in 99,5% ethanol uit een nieuw aangeschafte fles. Herhaal dehydratie met watervrij ethanol drie keer.
- Plaats de gedehydrateerde monsters in isoamylacetaat, wisselen reagens voor kritische punt gedroogd, gedurende 10 min. Herhaal deze stap twee keer. Dit reagens snel verdampt en het monster kan droog worden, wat resulteert in vernietiging door oppervlaktespanning. Daarom is niet het monster volledig opdrogen.
- Na de laatste uitwisseling van isoamylacetaat, verwijder het grootste deel van het oplosmiddel, onmiddellijk wikkel de open glazen flacon met aluminiumfolie en plaats de flacon op droog ijs. Met behulp van een naald of fijne tang, maken verschillende gaten in de folie die de monding van de fiool, zodat vloeistof koolstofdioxide gemakkelijk stroomt in de injectieflacon in het kritische punt droger. Ga naar de volgende stapzo snel mogelijk.
- In deze stap, het minimaliseren van de overdracht van isoamylacetaat in de kamer van de droger, maar laat het monster uit te drogen voordat kritisch punt drogen. Bovendien, niet het monster op droogijs onnodig lang aan de vorming van ijs op de flacon voorkomen verlaten.
- Breng de folie verpakte glazen flacon met weefselmonsters in het kritische punt droger die zorgt voor de oppervlaktestructuur van het weefsel blijft intact onder verwijdering van water in het weefsel. Gedetailleerde informatie over de bediening van het kritische punt droger is verkrijgbaar bij instructies van de fabrikant.
- Behandel de monsters voorzichtig met een tandenstoker om mechanische schade te minimaliseren. De verkregen gedroogde weefselmonsters zijn kwetsbaar. Monteer de monsters op metalen stompjes en jas met goud-palladium met behulp van een ion sputter.
5. Observation door SEM
- Observeren door SEM en beelden opnemen met een digitale camerauitgerust met scanning elektronenmicroscoop.
- Transfer digitale beeldgegevens naar een PC voor analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een overzicht van de werkstroom wordt getoond in figuur 1, inclusief afbeeldingen van de inrichtingen.
Live beweging observaties van CPECs
Film 1 toont een film van CPECs geïsoleerd uit een perinatale muis en film 2 is een uiteengenomen aanzicht van de beelden in film 1. Opgemerkt wordt dat individuele ciliaire tips zijn minder duidelijk in foto's vergeleken met die van films. Figuur 2 toont volgen van de beweging van twee cilia met verschillende vormen van beweging heen en weer en rotatiebewegingen van de in films 1 en 2 data. Figuur 3 toont een eenvoudige analyse van de trajecten van de cilia, waarbij het faseverschil in beide coördinaten duidelijk in de rotatiebeweging.
Analyse van CPEC ciliary tip trajecten
De tailed methoden kwantitatief analyseren elke baan is getoond in figuur 4 met schematische weergaven van het kloppende hoek θ definities (A) en een stroomschema van de analyse met representatieve resultaten (B).
Om het kloppende hoek θ voor back-en-weer trajecten bepalen, passen de posities van de ciliaire tip tijdens meerdere cycli om een rechte lijn y = ax + b, en bepalen het kloppende richting als die langs de gemonteerde lijn. Definieer het kloppend hoek hier als θ = Arc tan een. Omdat de lijn montage vaak niet in slaagt om de richting in het geval van draaibeweging halen, past de rotatie-trajecten om een ellips, en bepalen de richting als die langs de lange as van de gemonteerde ellips. Preciezer, de punt posities (x, y) bij een herhaalde cycli slaan zijn gemonteerd op de volgende functie.
1.jpg "width =" 310 "/>
waarin 
De ellips fitting omvat vijf fitting parameters: x 0, y 0, a, b, en θ. De x - en y -Ruimtelijke coördinaten van het middelpunt van de ellips zijn x en y 0 0 resp. De grote en kleine radii van de ellips zijn a en b respectievelijk. Hoek θ de hoek is die de hoofdas maakt met de x-as of het slaan hoek. Een schematische weergave van deze parameters is weergegeven in het rechter paneel uit figuur 4A. De montage vindt plaats met Igor Pro software van het definiëren van de expliciete hierboven beschreven functie. Dan, een histogram van het slaan van de hoek θ voor alle cilia observerend in dezelfde cel wordt uitgezet als een cirkelvormig histogram (figuur 2 in Narita et al. 8). De frequentie is genormaliseerd naar het aantal geanalyseerde ciliaire tips. Opgemerkt wordt dat elk cilium geïnterpreteerd twee θ waarden in de circulaire histogram, bijv π / 4 en 3π / 4, waardoor symmetrische verdeling van de richting.
Om gegeneraliseerde aspectverhouding AR bepalen worden de posities van de ciliaire tip tijdens meerdere cycli gedraaid - θ (Figuur 4B). Volgens de rotatie, zowel heen en weer gaande en rotatiebeweging trajecten treedt een ongeveer parallel aan de x-as, waarbij de breedten van de distributie A en B, langs de x- en y-assen respectievelijk worden gedefinieerd als de helft van het verschil tussen de minimum en maximum. Daarom zijn deze parameters zijn meer relevant zijn voor de grote en kleine radii van de ellips, a en b. AR wordt dan gedefinieerd als de verhouding tussen A en B van AR = B / A.
Opmerkingen van choroïdplexus epitheel door SEM
SEM maakt observatie van de fijne oppervlaktestructuur van specimens. De aanwezigheid van cilia op CPECs wordt bevestigd in de hele ontwikkeling tijdsverloop. Het verschijnen van meerdere cilia op CPECs wordt waargenomen door embryonale dag (E) 13, kort na choroid plexus ontwikkeling begint in de laterale ventrikels rond E11. In dit stadium zijn de cellen klein met een variabele onvolwassen uiterlijk en de ciliaire tips zijn gericht naar verschillende richtingen. Bij E15, is een bosje meerdere cilia vastgesteld aan de bovenzijde van het apicale oppervlak, die zich uit de omringende microvilli. Op postnatale dag (P) 2, zijn veel cilia vastgesteld op een gebogen stand, die de ciliaire motiliteit waargenomen live imaging. Op P14 meeste cellen bezitten meerdere cilia die onbeweeglijk en microvilli w et een fijnere structuur opzichte van de vorige fasen. Figuur 5 toont SEM afbeeldingen CPECs met cilia deze fasen. Op basis van de in figuur 1 en film 1 films, is het duidelijk dat beweeglijke cilia gemakkelijk herkend live imaging. Het is echter moeilijk om onbeweeglijk trilharen onderscheiden DIC microscopie. Bijgevolg SEM onmisbaar algehele ciliaire toestanden begrijpen.
Figuur 1:. Overzicht van de werkstroom (a) Stereo microscoop. (B) omgekeerde microscoop uitgerust met een geladen-coupled device (CCD) camera. (C) het scherm van de computer tijdens de analyse. (D) Ion sputter. (E) Specimen voor SEM. (F) Scanning elektronenmicroscoop.
Film 1.Pbelasting / 52.991 / Figure_2.mov "target =" _ blank "> Movie van het bovenaanzicht van CPECs en de trilharen uit een P2 muis pup in high-speed video microscopie. Door het onregelmatige oppervlak van de choroid plexus weefsel, dit snapshot bevat . zowel in-focus en out-of-focus vliegtuigen Het gebied in het vak is uitgebreid en weergegeven in Movie 2 Schaal bar:. 2 micrometer.
Movie 2. Movie van de uitgebreide weergave van het weefselmonster in Film 1. Beating cilia toonde ofwel rotatie of back-en-weer bewegingen. Schaal bar: 1 micrometer.
Figuur 2:. Reconstitutie van het traject van CPEC cilia van de time-lapse beelden in Movie 2 (A) Cilia met heen en weer gaande beweging (boven) en rotatie (onder). DIC beelden uit de film gegevens worden gepresenteerd op 50 msec tussenpozen (1-8, schaal bar: 1 micrometer). De positie van het doel ciliaire uiteinde wordt met een pijlpunt. (B) De trajecten (gebroken lijn) en posities van ciliaire tips (gekleurde cirkels) weergegeven in beelden op elkaar.
Figuur 3:. Twee standen van CPEC ciliaire tip beweging aangemaakt met movie data vertegenwoordiger ciliary tip bewegingen, back-en-weer beweging (A) en rotatie (B), over meerdere cycli worden gepresenteerd als trajecten (top, schaal bars: 0.5 pm). Tijdsverloop van x- en y-coördinaten van de tip positie worden uitgezet, respectievelijk (midden). Om een faseverschuiving tussen de twee coördinaten tonen, x- en y-coördinaten werden genormaliseerd tot [-1,1] en overlay (bottom, rode en blauwe lijnen, respectievelijk).
IGUUR 6 "src =" / files / ftp_upload / 52.991 / 52991fig6.jpg "/>
Figuur 4: schematische illustraties beschrijven de analyse van ciliaire tip trajecten (A) Definities van het kloppende hoek θ voor heen-en-weer (linker paneel) en rotatie (rechterpaneel) trajecten.. Parameters in de formule beschrijft de gemonteerde ellips, a, b, x 0 en y 0, worden in het rechter paneel. (B) Stroomdiagram van de fitting analyse van de trajecten om het kloppend hoek θ en AR definiëren. Werkelijke resultaten van de fitting van de vertegenwoordiger trajecten worden gepresenteerd in de juiste panelen.
Figuur 5: SEM beeld van trilharen. Vertegenwoordiger SEM microfoto van CPECs op E13, E15, P2 en P14. Gedurende het tijdsverloop, CPECs in omvang toegenomen, en ontwikkelde microvilli en cilia op het apicale oppervlak. Een bosje van de cilia op E13 is nog beweeglijkheid te verwerven. Bij P2, wanneer de verhouding van cilia met motiliteit het hoogste punt bereikt, zijn veel gebogen cilia waargenomen. Bij P14, cilia verliest beweeglijkheid. Schaal bar: 5 micrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Perspectieven van deze methode
Hoewel de hier beschreven techniek biedt geen nadere analyse van cilia dan eerder gepubliceerde methoden, het belang van deze techniek ligt in de eenvoud van het systeem en kosteneffectiviteit, die gemakkelijk kan worden toegepast op het screenen van elk soort ciliaire motiliteit ex vivo. In het bijzonder, TI Workbench biedt een eenvoudige en gebruiksvriendelijke interface die de onderzoekers in staat stelt om te observeren en gemakkelijker te analyseren ciliaire beweeglijkheid. Effectieve geautomatiseerde volgen methoden zijn niet ontwikkeld voor laag contrast objecten zoals unstained cilia in-video verbeterde contrast-DIC. Hoewel de werkwijze voor ciliaire beweging volgen wordt manueel in deze techniek, wordt de hoeveelheid inspanning ciliaire bewegingsregistratie analyse optimaal verminderd in vergelijking met het gebruik van algemene software pakketten voor beeldanalyse.
Monster dissectie
Ter voorbereiding ex vivo CPEC samples, snelle en zachte manipulaties noodzakelijk om de levensvatbaarheid van het weefsel, waarbij de beweeglijkheid van de trilharen ex vivo zorgt behouden. Omdat besmetting door erytrocyten vervaagt het gebied van observatie, is zacht maar ingewikkelde spoelen van de ontleed weefsel met fosfaat gebufferde zoutoplossing sterk aanbevolen. Om het bloeden te voorkomen, moet voorzichtigheid worden betracht om te voorkomen dat scheuren van de achterste choroideus slagader die kunnen worden geïdentificeerd als een prominente roodachtige thread-achtige structuur heeft gehouden aan de lamina affixa van de colloïde plexus.
Microscoop
Een omgekeerde microscoop uitgerust met DIC optiek en een high-power transmissie lichtbron essentieel is voor deze methode. Omdat kwiklampen gewoonlijk niet in staat veelvuldig in- en uitschakelen, een sluiter voor het lamphuis noodzakelijk. Ofwel een handmatige of elektrische sluiter kan worden gebruikt voor dit doel. Om monsters en ogen fr de waarnemer te beschermenOM UV- en IR-licht, zijn optische filters nodig om alleen zichtbaar licht (400-700 band pass of een combinatie van UV- en IR-cut filters) mogelijk te maken. ND filters zijn ook nodig om het licht macht die verschilt naar gelang de situatie te veranderen: de controle op het oog, met de nadruk met een videocamera, en high-speed time-lapse-opname. Een objectieflens met een hoge numerieke apertuur is noodzakelijk voor een hoge resolutie. Er enige afstand tussen de bovenkant van het dekglaasje en het brandpunt door de morfologie en de dikte van het weefsel. Derhalve wordt een water immersie objectief plaats van een olie-immersie objectief voorkeur betere beeldkwaliteit. Trillingsisolatie Ook moet stabiel afbeeldingsstapels verkregen. Air dumper-type tafels zijn bruikbaar voor dit doel, maar eenvoudiger demping van de microscoop door het invoegen tennisballen onder de microscoop basis met een vaste tafel mogelijk ook.
Videocamera
Een CCD-camera in staat is op least 200 frames / sec moet de beweging van trilharen volgen. Tijdens de afgelopen tien jaar hebben CCD-camera's met een snellere frame rates dan de standaard video-tarief (25-30 Hz) beschikbaar worden tegen veel lagere kosten. Cameramodellen staat bloot kortere tijd dan de rasterinterval nuttig voor het wazig vanwege de beweging van trilharen zonder de hoeveelheid data. Een belichtingstijd van 0,1 ms en een 5 msec kader interval (200 Hz) zijn minimale voorwaarden voor ciliaire beelden van CPECs met voldoende kwaliteit te verkrijgen.
Software
De analyse om de beweging van elk cilium spoor is tijdrovend, vooral wanneer algemene software pakketten voor beeldanalyse gebruikt om elke ciliaire tip volgen. Het verminderen van de stappen van herhaalde taken, zoals de muis te klikken op de ciliaire tip positie op de monitor, het selecteren van een menu aan de aangeklikte positie vast te leggen, en te klikken op een knop om naar de volgende afbeelding frame, resulteert in een significante reproductie van de tijd en moeite. In deze studie werd een speciale routine toegevoegd aan de op maat gemaakte TI Workbench software. In de ciliaire tracking mode van de TI Workbench software, blijft de gebruiker looping de volgende eenvoudige twee stappen operatie: het verplaatsen van de muisaanwijzer naar het ciliaire tip en op een pijl-toets op het toetsenbord om het frame, die niet vereist dat het verplaatsen van de vooruit muisaanwijzer of de ogen van de gebruiker om over te schakelen (om menu's en knoppen op het computerscherm) van de ciliaire tips op het computerscherm. De software houdt de ciliaire tip posities, geeft de geregistreerde traject om de gebruiker te helpen, en zorgt voor een tafel van ciliaire beweging informatie voor verdere analyse. De meeste algemene doeleinden software voor beeldanalyse maakt programmeren macro's voor batchverwerking van dergelijke herhaalde taken. Dergelijke aangepaste programmering om herhaalde stappen te verminderen wordt sterk aanbevolen.
Analyse van trajecten
Extractie van de trajectories werd uitgevoerd met de op maat gemaakte TI Werkbank software, zoals hierboven beschreven. Relatief eenvoudige analyse en beeldbewerking werden ook uitgevoerd met behulp van dezelfde software. Voor montage analyses, het traject van elk ciliary tip werd overgebracht naar Igor Pro software. Andere geavanceerde analyse software zoals MATLAB kunnen ook worden gebruikt voor dit doel.
In de huidige studie vanwege moeilijkheden in het onderbrengen van de trajecten in heen-en-weer rotatie of trajecten, de trajecten werden ondergebracht oog in een blinde manier, zoals bevestigd door een waarnemer, waardoor dezelfde indeling. Toch zou wiskundig rigoureuze maatregelen om de trajectories categoriseren zonder gevaar willekeur voorkeur. Ellips aanbrengen van de banen lijkt te zijn ideaal, waardoor kwantificeren van ellipticiteit de beeldverhouding van de gemonteerde ellips () zowel heen en weer en rotatiebewegingen. EchterEen poging om de verdeling van de beeldverhouding gebruiken om een drempelwaarde voor indeling definiëren was ondoeltreffend. De montage vaak mislukt om heen-en-weer trajecten, de parameters vaak niet te convergeren, en de geconvergeerde fitting was blijkbaar ongrijpbaar. Daarom werd ellips montage niet aangenomen om automatisch categoriseren van de trajecten of kwantificeren van de ellipticiteit van elk traject. De montage werd uitgevoerd om het slaan richting van rotatie bewegende tips als de hoofdas van de gemonteerde ellips extraheren.
In de huidige studie werd AR voorgesteld kwantificeren die een traject afwijkt van een ideale lineaire heen en weer gaande beweging. De parameter is de verhouding tussen de breedte van de verdeling loodrecht op het kloppende richting die de richting. De waarde moet nul zijn wanneer de baan een rechte lijn, en toen de baan een cirkel, die lijkt op de verhouding van de bovengenoemde ellips.
In de praktijk verkrijgen van de AR waarde kan betrekkelijk gemakkelijk door rotatie van de baan, waardoor het kloppende richting evenwijdig aan x-as (figuur 4B) wordt. Dit kwantificering leidt tot aanzienlijk verschillende waarden voor de twee bewegingsvormen suggereert het mogelijke gebruik van de parameter niet alleen de kwantificeren kenmerken van elk traject, maar ook strikter classificeren trajecten. Er moet echter worden opgemerkt dat het kloppende richting zelf al het resultaat is van verschillende fitting werkwijzen voor beide modi de huidige methode.
Verdere verbetering van de analyse, bijvoorbeeld een geavanceerde fitting algoritme, kan het probleem van mogelijke willekeur lossen.
Een aspect betreffende de ellipticiteit van het traject dat het kloppen van elke CPEC cilium niet kan plaatsvinden in het vlak dat loodrecht op de streng x - y
Voorbereiding voor SEM
Bij de voorbereiding van SEM waarneming, er een aantal belangrijke punten die de overname van hoge kwaliteitsbeelden waarborgen. Ten eerste moet de post-fixatie door osmiumtetroxide zorgvuldig worden uitgevoerd, inclusief pre-wassen met een 10% sucrose-oplossing. Zonder goede binding door de osmification procedure kan de volgende stappen niet handhaven of herstellen van de toestand van de specimens, wat leidt tot een lagere kwaliteit van het preparaat. Omdat aldehyde fixeermiddelen zijn reductiemiddelen resterende aldehyden in het monster remmen de activiteit osmiumtetroxide, een sterk oxidatiemiddel. Om eliminatie van overbodige aldehyden in specimens zorgen, voorzichtig wassen met de sucrose oplossing is noodzakelijk. In geval van suboptimale post-fixatie, ofwel de kleur van het monster niet veranderen van bruin tot zwart. Ten tweede moet het volume van osmiumtetroxide ten minste 50-voudig groter is dan die van het monster. Anders kan onvoldoende fixatie niet te verwachten. Ten derde is het belangrijk om volledige droging van de monsters te voorkomen, met name tijdens het droogproces dat zeer zuiver ethanol en isoamylacetaat telt. Het drogen van het monster vernietigt de fijne oppervlakte structuren zoals cilia, wat resulteert in slechte afbeeldingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen. Dit artikel is gericht op de rapportage uitvoerige methodologie om de beweeglijkheid van de trilharen in acht geïsoleerde choroid plexus weefsels. Wetenschappelijke nieuwigheden zijn gemeld in eerdere studies 1,8.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Required reagents | |||
| for live cell imaging | |||
| ethanol | Wako Chemicals | 057-00456 | |
| Leibovitz L-15 medium | Life Technologies | 11415-064 | |
| for SEM preparation | |||
| ethanol | Wako Chemicals | 057-00456 | |
| Hank's balanced salt solution | Life Technologies | 14170112 | |
| paraformaldehyde | Merck | 1040051000 | |
| glutaraldehyde | Nacalai tesque | 17003-05 | |
| isoamyl acetate | Nacalai tesque | 02710-95 | |
| Molecular Sieves 4A 1/8 | Wako Chemicals | 130-08655 | for preparation of anhydrous ethanol |
| phosphate buffer saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| phosphate buffer, 0.1 M | To make 100 ml, mix 19.0 ml of 0.1 M NaH2PO4 and 81.0 ml of 0.1 M Na2HPO4 | ||
| monosodium phosphate (dihydrate) | Nacalai tesque | 31718-15 | |
| disodium phosphate (anhydrous) | Nacalai tesque | 31801-05 | |
| suclose | Nacalai tesque | 30406-25 | |
| osmium tetroxide | Nisshin EM | 300 | |
| dry ice | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools and materials for dissection | |||
| for both live imaging and SEM preparation | |||
| stereo microscope | Olympus | SZX7 | |
| flat paper towel | |||
| Φ10 cm plastic dish | |||
| 100 ml beaker | |||
| straight operating scissors | Sansyo | S-2B | |
| watchmaker forceps | Dumont | No.DU-3 or -4, INOX | |
| for live cell imaging | |||
| glass bottom dish | Matsunami Glass | D110300 | |
| for SEM preparation | |||
| alminum foil | |||
| 5 ml glass vial with a polyethylene cap | Nichiden Rika-Glass | PS-5A | |
| transfer pipette | Samco Scientific | SM251-1S | for specimen tranfer |
| toothpick | for specimen transfer | ||
| ion sputter with gold-palladium | Hitachi | E-1030 | |
| critical point dryer | Hitachi | HCP-2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopic equipment and materials | |||
| for live cell imaging | |||
| inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| 100 W mercury lump housing and power supply | Olympus | U-ULH and BH2-RFL-T3 | |
| 100 W mercury lamp | Ushio | USH103D | |
| DIC condenser, n.a. 0.55 | Olympus | IX-LWUCD | |
| electrrical shutter | Vincent Associates | VS35S22M1R3-24 and VMM-D1 | manual shutter can be used. |
| band-pass filter (400-700 nm, Φ45 mm) | Koshin Kagaku | C10-110621-1 | |
| ND filter (Φ45 mm) | Olympus | 45ND6, 45ND25 | combination of 25% and 6% ND filters are used |
| objective lens (water immersion) with DIC element | Olympus | UApo 40XW/340, n.a., 1.15 with IX-DPAO40 | |
| high-speed video camera | Allied Vision Technologies | GE680 | ≥200 Hz frame rate and 1 msec expose time |
| image acquisition / analysis software | in-hous software | TI Workbench | capable of acquisition at high frame rates. |
| PC for camera control / analysis | Apple | Mac Pro | |
| vibration isolation table | Meiritsu Seiki | AD0806 | |
| weight for tissue | Warner Instruments | slice anchor kits | It can be made with nylon mesh glued to a U-shape squashed Φ0.5 mm platinum wire. |
| cover glass (alternative weight for tissue) | Matsunami | made-to-order | A cover glass can be used as a tissue weight. |
| for SEM | |||
| inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| scanning electron microscope | JEOL | JSM-6510 | |
References
- Nonami, Y., Narita, K., Nakamura, H., Inoue, T., Takeda, S. Developmental changes in ciliary motility on choroid plexus epithelial cells during the perinatal period. Cytoskeleton. 70 (12), 797-803 (2013).
- Bisgrove, B. W., Yost, H. J. The roles of cilia in developmental disorders and disease. Development. 133 (21), 4131-4143 (2006).
- Fliegauf, M., Benzing, T., Omran, H. When cilia go bad: cilia defects and ciliopathies. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (11), 880-893 (2007).
- Oh, E. C., Katsanis, N. Cilia in vertebrate development and disease. Development. 139 (3), 443-448 (2012).
- Shah, A. S., Ben-Shahar, Y., Moninger, T. O., Kline, J. N., Welsh, M. J. Motile cilia of human airway epithelia are chemosensory. Science(New York, N.Y). 325 (5944), 1131-1134 (2009).
- Kiprilov, E. N., et al. Human embryonic stem cells in culture possess primary cilia with hedgehog signaling machinery). The Journal of Cell Biology. 180 (5), 897-904 (2008).
- Hirokawa, N., Tanaka, Y., Okada, Y., Takeda, S. Nodal flow and the generation of left-right asymmetry. Cell. 125 (1), 33-45 (2006).
- Narita, K., Kozuka-Hata, H., et al. Proteomic analysis of multiple primary cilia reveals a novel mode of ciliary development in mammals. Biology Open. 1 (8), 815-825 (2012).
- Takeda, S., Narita, K. Structure and function of vertebrate cilia, towards a new taxonomy. Differentiation; Research in Biological Diversity. 83 (2), S4-S11 (2012).
- Ikegami, K., Sato, S., Nakamura, K., Ostrowski, L. E., Setou, M. Tubulin polyglutamylation is essential for airway ciliary function through the regulation of beating asymmetry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (23), 10490-10495 (2010).
- Foster, K. W.
- Lechtreck, K. -F., Sanderson, M. J., Witman, G. B. High-speed digital imaging of ependymal cilia in the murine brain. Methods in Cell Biology. 91, 255-264 (2009).
- Okada, Y., Hirokawa, N. Observation of nodal cilia movement and measurement of nodal flow. Methods in Cell Biology. 91, 265-285 (2009).
- Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).
- Takeda, S., et al. Left-right asymmetry and kinesin superfamily protein KIF3A: new insights in determination of laterality and mesoderm induction by kif3A-/- mice analysis. The Journal of Cell Biology. 145 (4), 825-836 (1999).
- Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy. The Journal of Cell Biology. 27, 137-138A (1965).
