Protocol
プロトコルおよび実験動物の使用は、山梨と早稲田大学大学の制度的動物のケアと使用委員会によって承認されました。動物のケアは、機関のガイドラインに従って行いました。
1. CPEC準備
- 次の装置と材料を準備します。実体顕微鏡下から照明を送信できることが好ましいです。時計屋のピンセット（デュモン＃3または＃4）、火炎滅菌し、ストレート操作はさみ、火炎滅菌。 20ミリリットルの氷冷リーボビッツL-15培地を含む2の滅菌10cmのプラスチック皿; 2ミリリットルRTリーボビッツL-15培地を含む35mmのガラスボトムディッシュ。 70％エタノールを含有する100mLのビーカー。新生児仔マウス。
- 簡単に言えば、70％エタノールで新生児マウスを浸すとオペレーティングはさみを使用して断頭により迅速に安楽死させます。
- 滅菌10cmのディで氷冷リーボビッツL-15培地中ですぐに頭を置きSH。
- 脳を露出するために頭蓋骨を開いてカットし、時計屋のピンセットを使用して、頭蓋冠から肌を削除し、全脳を分離するために脳神経をカット。
- 氷冷リーボビッツL-15培地を含む新しい皿に脳を転送し、脳が完全に媒体に浸漬されることを確認して、実体顕微鏡下で観察します。
- 上向きに脳の背側面を設定し、嗅球（右利きの人のために）3時の位置に存在するように脳を向けます。左手にピンセットで軽く脳を持ちます。
- 細かい解剖鉗子（デュモン＃3または＃4）右手にを使用して、大脳の縦裂に沿って、大脳半球をつなぐ脳梁と実質の下をカット。
- 静かに側面への大脳半球を押して横断脳亀裂を公開します。
- 目をつまんで半球を分離半球と視床間の電子の実質。
- ゆっくりラミナaffixaによって海馬の側面に取り付けられている横心室脈絡叢を引き出します。
- 新鮮リーボビッツL-15培地を含む35mmのガラスボトムディッシュに分離された脈絡叢を移し、重量（材料リスト）静かな場所に組織を保持するためにオーバーレイ。
CPEC繊毛の2ライブイメージング
- 適切な紫外線（UV）と推論（IR）を確認して400nmから700nmのより長いより短い光を遮断するフィルタを切断し、その中性濃度（ND）フィルタ（25％および6％）を光路に挿入されています倒立顕微鏡の。
- おおよその目で、対物レンズの焦点を調整し、中心となるよう冷却器を調整し、ケーラー照明に適合するように焦点を当てています。李に適切な微分干渉コントラスト（DIC）プリズム、DICの要素だけでなく、分析器と偏光子の要素を挿入しますDIC光学系に適合するGHTパス。
- 組織表面の構造が最も認識可能であるように、DICプリズム位置によってビューのコントラストを調整します。標的細胞の全ての繊毛運動がある場合は、運動性繊毛のクリアな視界は、その動きを目では得られません。
- ビデオカメラに光路を変更し、光パワーを増大させるためにNDフィルタを削除します。
- ビューとフォーカスのフィールドを調整するフォーカスモードでカメラを使用してください。ビデオ画像をモニタにリアルタイムで表示される、フォーカスの際、運動性繊毛のクリアな視界は使用できません。
- 所望の期間（数秒から数分）、0.1ミリ秒の露光時間で200 Hzでカメラを使用してください。画像スタックを取得した後、単一のフレームが明確な繊毛構造が表示されます。繊毛エッジがぼやけている場合は、フレームレートを増加させるか、より短い露光時間を使用します。
- リーボビッツに安楽死の後、25〜60分以内にCPECの繊毛の動きを記録L-15培地。
毛様体運動の3分析
- 手動でコンピュータのモニタ上の各繊毛のパターンを破って追跡します。各繊毛の軌跡については、組み立てられて、マウスポインタ、各フレーム内のマーク繊毛先端位置。いずれかのさらなる分析のために他のより一般的なアプリケーションに同じソフトウェアまたはエクスポートを使用して軌跡情報を分析。この分析工程の効率を議論に記載されています。
- 目で、前後または回転、運動の二つのモードに軌道を分類します。
- 以下の式を使用して繊毛拍動周波数（CBF）を計算する：[CBF =（秒あたりのフレーム数）/（シングルビート用フレームの平均数）]繊毛先端動作図から得ることができる14（ 図3 ）。同じセル上の他の繊毛は、各ciliuの動きを妨げる可能性があるため、複数の繊毛運動サイクルのため、この計算を繰り返しますM、凹凸が生じます。
- 単一セル内の軸を破って、毛様体の角度均一性を分析するために、各軌道のための鼓動角度θ（ 図4）を定義します。前後の軌道は、直線に繊毛の先端の位置に合わせて、ラインがx軸となす角度としてθを定義します。回転軌跡は、楕円に位置に合わせて、楕円の長軸がx軸となす角度としてθを定義します。フィッティングの詳細は代表的な結果のセクションに記載されています。
- 各軌道の定量的な説明については、一般的なアスペクト比ARを計算します。簡単に言うと、によって軌道を回転させる- θとXに沿っ分布の幅の比率としてARを定義-とy -axes（ 図4B）。詳細は代表的な結果のセクションに示した、と解釈されています、重要性、およびパラメータの制限が議論に記載されています。
SEM 4.サンプル調製
注：SEMは総合的にCPECsに繊毛の状態を評価するための重要な方法です。 SEM用の試料を調製するために、標準的な手順は、以前に15がわずかな修正で採用されていると報告しました。
- 脳から組織を切開する前に、ポリエチレンキャップを5mLのガラスバイアル中で固定液を準備します。固定液を2％パラホルムアルデヒド、0.1Mリン酸緩衝液、pH 7.4中の2.5％グルタルアルデヒド（半Karnovskyの溶液16）からなります。
- ステップ1で説明したように、脳からの組織を解剖。
- 簡単に言えば、新しい皿中ハンクス平衡塩溶液（HBSS）で単離された組織をリンスした後、室温で1時間ガラスバイアルに固定液で組織を固定します。使い捨て転送ピペットを使用し、試験片GEを扱いますntly。 HBSSで洗浄した後、組織がべたつきます。
- 固定液に検体を転送するには、ゆっくりと滴としてトランスファーピペットからの組織を含む少量の溶液を排出し、固定液に加えます。
- 固定後、固定液を廃棄し、リン酸緩衝液で3回組織をすすぎます。
- 残りのアルデヒド類を洗浄するために、10％ショ糖溶液の組織を浸します。アルデヒドの完全な除去を確実にするために、新鮮な10％のスクロースを二回繰り返した後、10分間、溶液中に試料を浸漬し、。このステップは、後の工程で、適切後固定を達成することが重要です。
- 30分間、リン酸緩衝液中の1％四酸化オスミウムの溶液に組織を浸漬した後、ポスト固定氷上に置きます。サンプル色によってオスミウム酸染色法の程度を判断する：アルデヒドが完全に除去されている場合、サンプルは黒です。
- ダブルdistilleで広範囲に後固定した組織試料を洗浄Dの水で数回。
- エタノールの濃度を段階的に浸漬することによって試料を脱水、通常、65％、75％、85％、95％、99％、100％、10分それぞれについて。新しく購入したボトルから99.5％エタノールにモレキュラーシーブを配置することによって無水エタノールを得ます。無水エタノールで3回脱水を繰り返します。
- 10分間、酢酸イソアミル、臨界点乾燥の置換試薬に脱水サンプルを置きます。二回、この手順を繰り返します。この試薬は迅速に蒸発し、試料が表面張力によって破壊をもたらす、ドライになることができます。したがって、試料を完全に乾燥させません。
- 酢酸イソアミルの最終交換の後、直ちにアルミホイルで開放ガラスバイアルをラップし、ドライアイス上にバイアルを置き、大部分の溶媒を除去します。液体二酸化炭素は、臨界点乾燥機にバイアル内に容易に流れるように、針や細かい鉗子を使用して、バイアルの口を覆うホイルにいくつかの穴を作ります。次のステップに進んでください可能な限り迅速に。
- この工程では、乾燥機のチャンバー内に酢酸イソアミルのキャリーオーバーを最小限に抑えるが、サンプルが完全に臨界点乾燥の前に乾燥させてください。また、バイアルに霜の形成を回避するために、不必要に長い時間のために、ドライアイス上のサンプルを放置しないでください。
- 組織に含まれる水分を除去しながら、組織の表面構造は無傷のまま確実に臨界点乾燥機に組織サンプルを含むアルミホイルにくるまれたガラスバイアルを転送します。臨界点乾燥機を動作に関する詳細情報は、製造業者の説明書から得ることができます。
- 慎重に機械的損傷を最小限にするためにつまようじを使用してサンプルを処理します。得られた乾燥組織サンプルが壊れやすいです。イオンスパッタを用いて、金 - パラジウムの金属スタブとコート上のサンプルをマウントします。
SEMによる観察5.
- SEMで観察し、デジタルカメラで画像を記録走査型電子顕微鏡に搭載しました。
- 分析のためにPCにデジタル画像データを転送します。
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Representative Results
ワークフローの概要は、装置の画像を含む、 図1に示されています。
CPECsのライブの動きの観察
映画1は、周産期のマウスから単離したCPECsの映画を示しており、 ムービー2ムービー1の画像の拡大図を示している。それは、個々の繊毛の先端は映画のものと比較して、静止画ではあまり明確であることに留意すべきである。2に示す。図ビデオ1及び2に示されたデータからの移動の異なるモードを有する2つの繊毛の動きの追跡、往復回転運動、 図3は、位相差、繊毛の軌跡の単純な分析を示します二つの座標に回転運動で明らかです。
CPEC繊毛の先端の軌跡の分析
デ定量的に、各軌道を分析する方法は、鼓動尾角θの定義（A）および代表的な結果（B）を用いて解析のフローチャートの概略図で、図4に示されています。
、前後の軌道用の叩解角度θを定義する直線y = AX + Bに複数のサイクル中に繊毛の先端の位置に合わせて、フィットラインに沿っているような拍動する方向を定義します。 θ=アークタンとしてここで鼓動する角度を定義します。多くの場合、フィッティングラインは、回転運動の場合の方向を抽出楕円に回転軌跡に合わせて、当てはめられた楕円の長軸に沿ってそのような方向を定義することができないので。より正確には、複数の拍動サイクル中の先端位置（x、y）は 、以下の機能に取り付けられています。
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どこ
X 0、Y 0、a、bおよびθ：楕円のフィッティングは、5つのフィッティングパラメータを含みます。 X -と楕円の中心のY -spatial座標がそれぞれx 0とy 0です。楕円のメジャーとマイナーの半径はそれぞれ、aとbです。角度θは、長軸がx軸、または叩解角度となす角度です。これらのパラメータの概略を図4（a）の右側のパネルに示されています。フィッティングは、上記の明示的な関数を定義することにより、イゴールProソフトウェアを用いて行われます。そして、すべての繊毛のために角度θを破ってのヒストグラムを観察します同一セル内のDは、円形ヒストグラム（成田で図2 ら 8）としてプロットします。周波数分析繊毛の先端の数に正規化されます。これは、各方向の繊毛が対称な分布をもたらす、 例えば、π/ 4と3π/ 4、円形ヒストグラム二つθの値を持つように解釈されることに留意すべきです。
θ（ 図4B） -一般的なアスペクト比ARを定義するには、複数のサイクル中に繊毛先端の位置は、により回転 されます。回転によれば、前後となって回転軌跡の両方をx軸、x軸とy軸に沿った分布AとBの幅は、それぞれの半分として定義されているとほぼ平行に分布します最小値と最大値との差。したがって、これらのパラメータは、楕円、AとBのメジャーとマイナーの半径に対して、より関連しています。ARは、その後AR = B / AによってAとBとの間の比として定義されます。
SEMによる脈絡叢上皮の観測
SEMは、試料の微細な表面構造の観察を可能にします。 CPECsの繊毛の存在は、発生時の経過を通して確認されました。 CPECs上の複数の繊毛の出現は、脈絡叢の開発はE11の周りの側脳室で開始直後に、胚日（E）13で観察されます。この段階で、細胞は、変数未熟な外観と小さく、繊毛のヒントは、様々な方向に向かって指しています。 E15では、複数の繊毛の房は、周囲の微絨毛から立っている、頂端面の上に確立されています。生後日（P）2では、多くの繊毛は、ライブイメージングによって観測された繊毛運動を反映して、曲がった位置に固定されています。 P14では、ほとんどの細胞は、複数の非運動性である繊毛ならびに微絨毛のwを持っています細かいテクスチャi番目の初期段階と比較した。 図5は、これらの段階で繊毛とCPECsのSEM像を示します。 図1ムービー1に示した映画に基づいて、運動性繊毛が容易にライブイメージングによって認識されることは明らかです。しかし、DIC顕微鏡によって非運動性繊毛を区別することは困難です。その結果、SEMは、全体的な毛様体の状態を理解することが不可欠です。
図1：ワークフローの概要（a）のステレオ顕微鏡。電荷結合素子（CCD）カメラを装備した（b）の倒立顕微鏡。 （c）の解析中にコンピュータの画面を表示します。 （d）のイオンスパッタ。 （e）は 、SEM用試料。 （f）は、走査型電子顕微鏡。
ムービー1。PLOAD / 52991 / Figure_2.mov「ターゲット= "_空白"> CPECsの上面図と高速ビデオ顕微鏡でP2マウス仔から繊毛のムービー。脈絡叢組織の不規則な表面の、このスナップショットが含まれているためフォーカスインとアウトの焦点面の両方のボックス内の領域をムービー2に拡大して示されているスケールバー：2μmです。
ムービー2 ムービー1組織サンプルの拡大図のムービー。繊毛の鼓動は、回転または往復運動のいずれかを示しました。スケールバー：1μmです。
図2：前後の動き（上）と回転運動（下）とムービー2でタイムラプス画像からCPECの繊毛の軌跡の再構成（A）繊毛。 DIC動画データからの画像は50ミリ秒間隔（1ミクロン1-8、スケールバー）で発表されています。ターゲット繊毛先端の位置は矢印で示されています。画像に示す（B）の軌跡（破線）と繊毛の先端の位置（着色円）を重ねています。
図3：ムービーデータから再構成CPEC繊毛の先端の動き代表繊毛の先端の動き、前後の動き（A）と回転運動（B）の2つのモードは、複数のサイクルが軌道（上、スケールバーとして表示されている上に：0.5ミクロン）。 x軸と先端位置のy座標の時間コースは、それぞれ（中央）をプロットしています。二つの座標の間の位相シフトを実証するために、x座標とy座標は[-1,1]に正規化し、（それぞれ、赤と青の線の下）のオーバーレイ。
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図4：繊毛の先端の軌跡の分析を説明する模式図 、前後（左パネル）と回転（右パネル）の軌跡のための鼓動角度θの（A）の定義。。当てはめた楕円を記述式のパラメータA、B、X 0およびY 0が 、右側のパネルに表示されます。 （B）鼓動する角度θとARを定義するために軌道のフィッティング分析のチャートを流れ。代表的な軌道のフィッティングの実際の結果は、右のパネルに示されています。
図5：繊毛のSEM像。 E13、E15、P2、およびP14でCPECsの代表的なSEM顕微鏡写真。時間経過の間に、CPECsのサイズが増加し、microviを開発LLIと頂端表面に繊毛。 E13での繊毛の房は、運動性を獲得するために、まだあります。繊毛運動との比が最高点に達したP2では、多くの屈曲繊毛が観察されます。 P14では、繊毛は運動性を失います。スケールバー：5μmです。
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Discussion
この方法の展望
ここに記載された技術は、以前に公開された方法よりも繊毛のより詳細な分析を提供していませんが、この技術の重要性は、簡単に繊毛運動ex vivoでのあらゆる種類のスクリーニングに適用することができるシステムと費用対効果のシンプルさにあります。具体的には、TI Workbenchは、より簡単に繊毛運動を観察し、分析する研究者を可能にシンプルでユーザーフレンドリーなインターフェイスを提供します。効果的な自動化された追跡方法は、ビデオ増強コントラストDICにおける非染色繊毛のような低コントラスト対象のために開発されていません。繊毛の動きを追跡する方法は、この技術の手動であるが、繊毛運動追跡分析における努力の量を最適に画像解析のための汎用ソフトウェアパッケージを使用して比較して低減されます。
サンプル解剖
Eを調製するためにXインビボCPECサンプル、迅速かつ穏やかな操作は、繊毛ex vivoでの運動性を保証する、組織の生存能力を維持するために必要です。赤血球による汚染が観察視野をあいまいにするので、リン酸緩衝生理食塩水で解剖組織の穏やかが、複雑なすすぎを強くお勧めします。出血を避けるために、注意がコロイド叢のaffixaラミナに付着した著名な赤みを帯びた糸のような構造として同定することができる後部脈絡膜動脈を引き裂く回避するために行使されなければなりません。
顕微鏡
DIC光学系および高電力伝送用光源を備えた倒立顕微鏡は、この方法のために不可欠です。水銀ランプは、通常、頻繁にスイッチオン·オフすることができないので、ランプハウジングの前でシャッターが必要です。手動または電気シャッタのいずれかが、この目的のために使用することができます。標本と観察者の目FRを保護するために、OMのUV及びIR光は、光学フィルタは、可視光のみ（400〜700、バンドパスまたはUVとIRカットフィルタの組合せ）を可能にするために必要とされます。目による監視、ビデオカメラで焦点を当て、高速タイムラプス撮影：NDフィルタも状況に応じて異なり、光パワーを変化させるために必要です。高開口数の対物レンズは、高解像度が必要です。カバーガラスの上部と焦点の間にいくつかの距離があるため、組織の形態及び厚さがあります。したがって、水浸レンズではなく、油浸レンズは、より良い画質のために好ましいです。振動分離を安定した画像スタックを生成するためにも必要です。エアダンパー型のテーブルは、この目的のために有用であるが、安定したテーブルで、顕微鏡ベースの下にテニスボールを挿入することにより、顕微鏡の簡単なクッションも動作する場合があります。
ビデオカメラ
LEAで可能なCCDカメラST 200フレーム/秒では繊毛の動きを追跡することが必要です。過去十年の間に、標準的なビデオレート（25〜30ヘルツ）よりも速いフレームレートでのCCDカメラは、はるかに低いコストで利用できるようになりました。フレーム間隔よりも短い露出時間が可能なカメラのモデルは、データの量を増加させることなく、繊毛の動きによるボケ低減するのに有用です。 0.1ミリ秒の露光時間および5ミリ秒のフレーム間隔（200 Hz）は、十分な品質でCPECsの繊毛画像を得るための最低条件です。
ソフトウェア
各繊毛の動きを追跡するための分析は、画像解析のための汎用のソフトウェアパッケージは、各繊毛先端を追跡するために使用される場合は特に、時間がかかります。 、このようなモニタに繊毛先端位置をマウスでクリックするなどの繰り返し作業の手順を削減クリックした位置を記録するためにメニューを選択し、ボタンをクリックすると、次の画像フレームにかなりの再に結果を移動します時間と労力のduction。本研究では、特別なルーチンは、カスタムメイドのTI Workbenchソフトウェアに加えました。繊毛先端にマウスポインタを移動し、フレームを進めるために、キーボードの矢印キーを押すと、移動を必要としない：TI Workbenchソフトウェアの繊毛トラッキングモードでは、ユーザは以下の単純な2段階の操作をループし続けますマウスポインタまたはユーザの目には、コンピュータ画面上の毛様体の先端から（コンピュータ画面上のメニューやボタンへの）移行します。ソフトウェアは、繊毛先端位置を追跡するユーザを支援するために記録された軌跡を表示し、さらなる分析のための繊毛運動情報のテーブルを作成します。画像解析のための最も一般的な目的のソフトウェアは、反復タスクのバッチ処理のためのプログラミングマクロを可能にします。繰り返しのステップを削減するようなカスタムプログラミングを強くお勧めします。
軌道の解析
trajectoriの抽出上述したように、ES、カスタムメイドTI Workbenchソフトウェアを用いて行きました。比較的簡単な解析及び画像処理は、同じソフトウェアを用いて行きました。フィッティング分析では、それぞれの繊毛の先端の軌跡は、イゴールProソフトウェアに移しました。例えば、MATLABなどの他の高度な解析ソフトウェアは、この目的のために用いることができます。
現在の研究では、前後または回転軌道に軌道を分類する際の困難のため、軌道は一貫した分類で、その結果、他の観測者によって確認された盲検、眼によって分類されました。それにもかかわらず、すべての可能な恣意ずに軌道を分類するために、より数学的に厳密な対策が好ましいであろう。軌道のフィッティングは前後及び回転運動の両方に嵌合楕円（）のアスペクト比と楕円率の程度を定量化する可能性がある、理想的であると思われる楕円。しかしながら、分類のための閾値を定義するために、アスペクト比の分布を使用する試みは効果がなかったです。多くの場合、前後の軌道のために失敗したフィッティングは、パラメータが頻繁に収束に失敗し、収束フィッティングは明らかに錯覚しました。したがって、楕円フィッティングが自動的に軌道を分類または各軌道の楕円率を定量化するために採用されませんでした。フィッティングは、フィッティングさ楕円の長軸として回転移動先端の叩解方向を抽出するために行きました。
現在の研究では、ARは、軌跡は、理想的な線形往復運動から逸脱する程度を定量化するために提案されました。パラメータは、方向と叩解方向に垂直分布の幅の比です。軌道が上記楕円のアスペクト比に似た、円であるとき軌跡が一直線であるとき値はゼロであるべきです。
拍動方向はx軸（ 図4B）と平行になるように、実際には、AR値を得ることは、軌道を回転させることにより、比較的容易であることができます。この定量化は、各軌道の特性を定量化するために、だけでなく、より厳密に軌道を分類するだけでなく、パラメータの使用の可能性を示唆し、運動の二つのモードのためにかなり明確な値をリードしています。しかし、拍動方向自体がすでに現在のメソッド内の2つのモードについて別個の調整プロセスの結果であることに留意すべきです。
分析の更なる改善は、より高度なフィッティングアルゴリズムとして、可能な恣意性の問題を解決することがあります。
軌道の楕円率に関する側面は、各CPECの繊毛の鼓動がxに厳密に垂直な平面内で行われることがないことである- Y
SEMの準備
SEM観察のための準備中に、高品質な画像の取得を保証するいくつかの重要な点があります。まず、四酸化オスミウムによる後固定は、10％スクロース溶液での前洗浄を含め、慎重に行わなければなりません。オスミウム酸染色法手順によって適切な固定せずに、その後の工程は、製剤の低品質につながる、標本の状態を維持または復元することはできません。アルデヒド固定剤は、還元剤ているので、試料内の残りのアルデヒドは、四酸化オスミウム、強力な酸化剤の活性を阻害します。検体中の余分なアルデヒド類の除去を確実にするために、ショ糖溶液で慎重に洗浄が不可欠です。次善の経口の場合のST-固定は、試験片の色は茶色から黒に変更されません。第二に、四酸化オスミウムの量は、少なくとも、試料のそれよりも大きい50倍でなければなりません。そうでない場合は、十分な固定が期待できません。第三に、それは特に高純度のエタノール及び酢酸イソアミルを用いて脱水プロセス中に、試験片の完全な乾燥を避けることが重要です。試料の乾燥は悪いイメージで、その結果、そのような繊毛の微細な表面構造を破壊します。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係がないことを宣言します。本論文では、単離された脈絡叢の組織で繊毛の運動性を観察するための詳細な方法論を報告することを目的とします。科学的なノベルティは、以前の研究1,8で報告されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Required reagents | |||
| for live cell imaging | |||
| ethanol | Wako Chemicals | 057-00456 | |
| Leibovitz L-15 medium | Life Technologies | 11415-064 | |
| for SEM preparation | |||
| ethanol | Wako Chemicals | 057-00456 | |
| Hank's balanced salt solution | Life Technologies | 14170112 | |
| paraformaldehyde | Merck | 1040051000 | |
| glutaraldehyde | Nacalai tesque | 17003-05 | |
| isoamyl acetate | Nacalai tesque | 02710-95 | |
| Molecular Sieves 4A 1/8 | Wako Chemicals | 130-08655 | for preparation of anhydrous ethanol |
| phosphate buffer saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| phosphate buffer, 0.1 M | To make 100 ml, mix 19.0 ml of 0.1 M NaH2PO4 and 81.0 ml of 0.1 M Na2HPO4 | ||
| monosodium phosphate (dihydrate) | Nacalai tesque | 31718-15 | |
| disodium phosphate (anhydrous) | Nacalai tesque | 31801-05 | |
| suclose | Nacalai tesque | 30406-25 | |
| osmium tetroxide | Nisshin EM | 300 | |
| dry ice | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools and materials for dissection | |||
| for both live imaging and SEM preparation | |||
| stereo microscope | Olympus | SZX7 | |
| flat paper towel | |||
| Φ10 cm plastic dish | |||
| 100 ml beaker | |||
| straight operating scissors | Sansyo | S-2B | |
| watchmaker forceps | Dumont | No.DU-3 or -4, INOX | |
| for live cell imaging | |||
| glass bottom dish | Matsunami Glass | D110300 | |
| for SEM preparation | |||
| alminum foil | |||
| 5 ml glass vial with a polyethylene cap | Nichiden Rika-Glass | PS-5A | |
| transfer pipette | Samco Scientific | SM251-1S | for specimen tranfer |
| toothpick | for specimen transfer | ||
| ion sputter with gold-palladium | Hitachi | E-1030 | |
| critical point dryer | Hitachi | HCP-2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopic equipment and materials | |||
| for live cell imaging | |||
| inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| 100 W mercury lump housing and power supply | Olympus | U-ULH and BH2-RFL-T3 | |
| 100 W mercury lamp | Ushio | USH103D | |
| DIC condenser, n.a. 0.55 | Olympus | IX-LWUCD | |
| electrrical shutter | Vincent Associates | VS35S22M1R3-24 and VMM-D1 | manual shutter can be used. |
| band-pass filter (400-700 nm, Φ45 mm) | Koshin Kagaku | C10-110621-1 | |
| ND filter (Φ45 mm) | Olympus | 45ND6, 45ND25 | combination of 25% and 6% ND filters are used |
| objective lens (water immersion) with DIC element | Olympus | UApo 40XW/340, n.a., 1.15 with IX-DPAO40 | |
| high-speed video camera | Allied Vision Technologies | GE680 | ≥200 Hz frame rate and 1 msec expose time |
| image acquisition / analysis software | in-hous software | TI Workbench | capable of acquisition at high frame rates. |
| PC for camera control / analysis | Apple | Mac Pro | |
| vibration isolation table | Meiritsu Seiki | AD0806 | |
| weight for tissue | Warner Instruments | slice anchor kits | It can be made with nylon mesh glued to a U-shape squashed Φ0.5 mm platinum wire. |
| cover glass (alternative weight for tissue) | Matsunami | made-to-order | A cover glass can be used as a tissue weight. |
| for SEM | |||
| inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| scanning electron microscope | JEOL | JSM-6510 | |
References
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