Beobachtung der Flimmerbewegung von Plexus Epithelzellen Published: July 13, 2015 doi: 10.3791/52991

DOI

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Takafumi Inoue¹, Keishi Narita², Yuta Nonami¹, Hideki Nakamura¹, Sen Takeda²

¹Department of Life Science and Medical Bioscience, Faculty of Science and Engineering, Waseda University, ²Department of Anatomy and Cell Biology, Interdisciplinary Graduate School of Medicine & Engineering, University of Yamanashi

Protocol

Die Protokolle und die Verwendung von Versuchstieren wurden von den institutionellen Tierpflege und Verwendung Ausschüsse an der University of Yamanashi und Waseda University zugelassen. Tierpflege wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts durchgeführt.

1. CPEC Vorbereitung

1. Bereiten Sie die folgenden Vorrichtungen und Materialien: ein Stereo-Mikroskop, vorzugsweise geeignet zur Übertragung von Beleuchtung von unten; ein Paar von Uhrmacher Pinzette (Dumont # 3 oder # 4), flammsterilisiert, gerade Betriebs Schere, flamm sterilisiert; zwei sterile 10 cm Plastikschalen mit 20 ml eiskaltem Leibovitz L-15-Medium; 35 mm Glasbodenschalen mit 2 ml RT Leibovitz L-15-Medium; ein 100 ml Becherglas, das 70% Ethanol; neonatalen Maus Welpen.
2. Kurz eintauchen eine neonatale Maus in 70% Ethanol und schnell einschläfern durch Enthauptung mit dem Betriebs Schere.
3. Platzieren Sie den Kopf sofort in eiskaltem Leibovitz L-15-Medium in das sterile 10 cm dish.
4. Entfernen Sie die Haut von den Schädeldecke mit Hilfe der beiden Uhrmacher Zangen, schnitt den Schädel, um das Gehirn freizulegen, und dann schneiden Sie die Hirnnerven, die ganze Gehirn zu isolieren.
5. Übertragen Sie das Gehirn zu einem neuen Schale mit eiskaltem Leibovitz L-15-Medium und beobachten unter dem Stereomikroskop, um sicherzustellen, dass das Gehirn vollständig in das Medium eingetaucht.
6. Stellen Sie die Dorsalseite des Gehirns nach oben ein, und richten Sie das Gehirn, so dass die Riechkolben wohnen an der Drei-Uhr-Position (für Rechtshänder). Halten Sie das Gehirn vorsichtig mit der Pinzette in die linke Hand.
7. Mit den feinen Pinzette Dissektion (Dumont # 3 oder # 4) in der rechten Hand, schneiden Sie den Balken und unterhalb des Parenchyms Verbinden der Gehirnhälften, die entlang der Längsspalte des Großhirns.
8. Schieben Sie die Gehirnhälften entfernt an den Seiten und setzen die Querhirnspalte.
9. Trennen Sie die Hemisphären durch Kneifen out the Parenchym zwischen der Hemisphäre und Thalamus.
10. Ziehen Sie vorsichtig die seitlichen Ventrikel Plexus, die auf der lateralen Seite des Hippocampus durch die Lamina affixa angebracht ist.
11. Übertragen Sie die isolierten Plexus auf die 35 mm Glasbodenschale mit frischen Leibovitz L-15-Medium, und überlagern ein Gewicht (Materialliste) leicht, um das Gewebe in Position zu halten.

2. Live-Imaging von CPEC Cilia

1. Überprüfen Sie die ordnungsgemäße ultraviolette (UV) und geschlossen (IR) Cut-Filter (n) zu sperren Licht kürzer als 400 nm und länger als 700 nm, und das Neutraldichtefilter (ND) (25% bzw. 6%) in den Strahlengang eingelegt des invertierten Mikroskops.
2. Stellen Sie den Fokus des Objektivs grob durch Auge und stellen Sie dann den Kondensator, so dass das Zentrum und Fokus auf die Köhler-Beleuchtung entsprechen. Legen Sie eine geeignete Differentialinterferenzkontrast (DIC) Prisma, ein DIC-Element sowie Analysator und Polarisator Elemente in der liGHT PATH um das DIC Optik entsprechen.
3. Stellen Sie den Kontrast der Blick von der DIC-Prisma Position, so dass die Struktur der Gewebeoberfläche ist besonders erkennbar. Wenn alle Zilien der Zielzellen sind beweglich, eine klare Sicht auf bewegliche Zilien kann nicht mit dem Auge wegen ihrer Bewegung erreicht werden.
4. Ändern Sie den Lichtweg zu der Videokamera und der ND-Filter zu entfernen, um die Lichtleistung zu erhöhen.
5. Verwenden Sie die Kamera in Fokusmodus, um das Sichtfeld und Fokus einzustellen. Während der Fokussierung, bei der Videobilder in Echtzeit auf dem Monitor angezeigt wird, ist eine klare Sicht auf bewegliche Zilien nicht verfügbar.
6. Mit der Kamera bei 200 Hz mit einer Belichtungszeit von 0,1 ms für den gewünschten Zeitraum (Sekunden bis Minuten). Nach der Übernahme des Bildstapels wird Einzelbilder klar ciliary Strukturen anzuzeigen. Wenn ciliary Kanten sind unscharf, erhöht die Bildrate oder verwenden Sie eine kürzere Belichtungszeit.
7. Nehmen Sie die Bewegung der Flimmerhärchen CPEC innerhalb 25-60 Minuten nach der Euthanasie in LeibovitzL-15-Medium.

3. Analyse der Flimmerbewegung

1. Manuell verfolgen schlagen Muster jedes cilium auf dem Computermonitor. Filter ciliary Spitzenpositionen in jedem Rahmen mit dem Mauszeiger, die Flugbahn-Informationen jedes cilium zusammengesetzt werden. Entweder analysieren die Flugbahn Daten mit der gleichen Software oder den Export in andere allgemeinere Anwendungen für die weitere Analyse. Die Effizienz dieses Analyseschritt auch in der Diskussion beschrieben.
2. Klassifizierung der Bahnen in zwei Bewegungsarten, hin- und her bzw. Dreh, mit dem Auge.
3. Berechnen Sie die Zilienschlag Frequenz (CBF) mit der folgenden Formel: [CBF = (Anzahl der Bilder pro Sekunde) / (durchschnittliche Anzahl der Bilder für einen einzelnen Schlag)] ^14, die aus einer ciliary Spitze Bewegungsdiagramm erhalten werden können (Abbildung 3 ). Wiederhole diese Berechnung für mehrere Zilienschlag Zyklen, weil andere Zilien auf der gleichen Zelle kann mit der Bewegung jedes ciliu interferierenm, was zu Unregelmäßigkeiten.
4. Um die Winkel Gleichmäßigkeit der Zilienschlag Achsen innerhalb einer einzelnen Zelle zu analysieren, definieren das Schlagen Winkel θ für jede Flugbahn (Abbildung 4). Für Hin-und-her-Trajektorien, passen die Positionen der Zilien Spitze auf eine gerade Linie, und definieren θ als Winkel der Linie macht mit x-Achse. Für Dreh Trajektorien, passen die Positionen zu einer Ellipse und definieren θ als Winkel der Hauptachse der Ellipse macht mit x-Achse. Details der Armatur sind im Repräsentative Ergebnisse beschrieben.
5. Zur quantitativen Beschreibung der einzelnen Flugbahn berechnen verallgemeinerte Seitenverhältnis AR. Kurz gesagt, dreht die Trajektorie durch - θ und AR definieren als das Verhältnis zwischen der Breite der Verteilung entlang x - und y-Achsen (4B). Einzelheiten sind in der Repräsentative Ergebnisse Schnitt gezeigt, und die Interpretation, Bedeutung, und die Begrenzung der Parameter sind in der Diskussion beschrieben.

4. Probenvorbereitung für die SEM

Anmerkung: SEM ist ein wichtiges Verfahren, um den Status der Zilien auf CPECs in umfassender Weise auszuwerten. Um Proben für SEM vorzubereiten, berichtete ein Standardverfahren zuvor ¹⁵ mit geringen Modifikationen verwendet.

1. Vor der Zerlegung der Gewebe aus dem Gehirn, bereiten Sie die Fixiermittel in einer 5 ml-Glasgefäß mit einer Polyethylenkappe. Das Fixiermittel besteht aus 2% Paraformaldehyd, 2,5% Glutaraldehyd (Halb Karnovsky-Lösung ¹⁶⁾ in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4.
2. Präparieren Sie das Gewebe aus dem Gehirn, wie in Schritt 1 beschrieben.
3. Kurz abspülen isolierten Gewebes mit ausgewogener Hank-Salzlösung (HBSS) in ein neues Gericht und dann fix das Gewebe in der Fixiermittel in dem Glasfläschchen für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Verwenden Sie Einweg-Transferpipetten und behandeln die Proben gently. Nach Spülen in HBSS, wird das Gewebe klebrig.
   1. Um die Proben in die Fixierungslösung zu übertragen, zu vertreiben langsam eine kleine Menge der Lösung, die das Gewebe von der Transferpipette als ein Tröpfchen und zu dem Fixiermittel.
4. Nach der Fixierung, entsorgen Sie die Fixierungsmittel und spülen Sie das Gewebe mit Phosphatpuffer dreimal.
5. Tauchen Sie das Gewebe in einer 10% igen Saccharoselösung zum Auswaschen der verbleibenden Aldehyde. Um vollständige Beseitigung von Aldehyden zu gewährleisten, tauchen Sie die Proben in der Lösung für 10 Minuten und wiederholen Sie dann zweimal mit frischem 10% Saccharose. Dieser Schritt ist wichtig, die richtige Postfixierung in den nachfolgenden Schritten zu erreichen.
6. Tauchen des Gewebes in einer Lösung von 1% Osmiumtetroxid in Phosphatpuffer für 30 min und dann auf Eis für Postfixierung. Beurteilen Sie den Grad der osmification von der Probe Farbe: wenn Aldehyde vollständig entfernt ist die Probe schwarz.
7. Die post-fixierten Gewebeproben umfassend Waschen mit Doppel destilliertd Wasser mehrmals.
8. Dehydratisieren die Proben durch Eintauchen in abgestufte Konzentrationen von Ethanol, in der Regel 65%, 75%, 85%, 95%, 99% und 100%, für jeweils 10 min. Erhalten wasserfreiem Ethanol, indem Molekularsiebe in 99,5% Ethanol aus einer neu gekauften Flasche. Wiederholen Dehydratisierung mit wasserfreiem Ethanol dreimal.
9. Legen Sie die dehydrierten Proben in Isoamylacetat, einem Substitutions Reagenz zum Trocknen am kritischen Punkt, für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. Dieses Reagenz schnell verdampft und die Probe kann trocken werden, was zu einer Zerstörung durch die Oberflächenspannung. Daher nicht die Probe vollständig trocknen.
10. Nach dem letzten Austausch von Isoamylacetat, entfernen Sie das meiste Lösungsmittel, sofort wickeln Sie das offene Glas mit Aluminiumfolie, und legen Sie das Fläschchen auf Trockeneis. Mittels einer Nadel oder einer feinen Pinzette, stellen mehrere Löcher in die Folie für den Mund des Fläschchens, so daß flüssiges Kohlendioxid fließt leicht in die Phiole in dem kritischen Punkt Trockner. Fahren Sie mit dem nächsten Schrittso schnell wie möglich.
11. In diesem Schritt minimieren die Übertragung von Isoamylacetat in die Kammer des Trockners, aber lassen Sie die Probe vollständig austrocknen, bevor Trocknen am kritischen Punkt. Hinzu kommt, dass die Probe nicht auf Trockeneis verlassen unnötig lange Zeit, um die Bildung von Frost auf dem Fläschchen zu vermeiden.
12. Übertragen Sie die Folie eingeGlasFläschchen, die die Gewebeproben in den kritischen Punkt Trockner, dass die Oberflächenstruktur des Gewebes bleibt erhalten, während das Wasser im Gewebe enthaltenen gewährleistet. Detaillierte Informationen über den Betrieb der kritischen Punkt Trockner können aus den Anweisungen des Herstellers bezogen werden.
13. Behandeln Sie die Proben vorsichtig mit einem Zahnstocher, um mechanische Schäden zu minimieren. Das resultierende getrocknete Gewebeproben sind zerbrechlich. Montieren Sie die Proben auf Metall Stubs und Mantel mit Gold-Palladium unter Verwendung eines Ionen Sputter.

5. Beobachtung durch SEM

1. Beobachten von SEM und Bilder aufnehmen mit einer Digitalkamerazu Rasterelektronenmikroskop ausgestattet.
2. Übertragen digitaler Bilddaten auf einen PC zur Auswertung.

Representative Results

Ein Überblick über den Arbeitsablauf ist in Figur 1 dargestellt ist, einschließlich der Bilder der Geräte.

Live Motion Beobachtungen CPECs

Film 1 zeigt ein Film von CPECs aus einer perinatalen Maus isoliert und Movie 2 zeigt eine vergrößerte Ansicht der Bilder in Film 1. Es wird darauf hingewiesen, dass einzelne ciliary Tipps sind in Vergleich mit denen in Filmen Einzelbilder weniger klar werden. Abbildung 2 zeigt Nachführen der Bewegung zweier Zilien mit unterschiedlichen Bewegungsarten, hin- und hergehende und Drehbewegungen der Filme 1 und 2 gezeigten Daten. 3 zeigt eine einfache Analyse der Trajektorien der Wimpern, in dem die Phasendifferenz in den beiden Koordinaten ist in die Drehbewegung der Hand.

Analyse CPEC ciliary Spitze Trajektorien

De tailed Methoden, um quantitativ zu analysieren jede Flugbahn sind in Abbildung 4 mit schematischen Darstellungen des schlagenden Winkel θ Definitionen (A) und einem Flussdiagramm der Analyse mit repräsentativen Ergebnisse (B) gezeigt.

Um das Schlagen Winkel θ für Hin-und-Her-Trajektorien definieren, passen Sie die Positionen der ciliary Spitze während mehrere Zyklen zu einer geraden Linie y = ax + b und definieren das Schlagen Richtung wie die entlang der angepassten Linie. Definieren Sie den schlagenden Winkel hier als θ = arc tan a. Da Linienanpassungs oft nicht die Richtung, in Fällen von Drehbewegung zu extrahieren, passen die Drehbewegungsbahnen zu einer Ellipse, und die Richtung zu definieren wie die entlang der langen Achse der angepassten Ellipse. Genauer gesagt werden die Spitzenpositionen (x, y) während mehrfacher Zyklen Schlagen an die unten Funktion ausgestattet.
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wo

Die Ellipse Fitting umfasst fünf Anpassungsparameter: x _0, y _0, a, b und θ. Die x - und y -Räumliche Koordinaten des Zentrums der Ellipse sind x ₀ und y _{0 sind.} Die großen und kleinen Radien der Ellipse sind a und b jeweils. Winkel θ ist der Winkel, den die Hauptachse zur x-Achse oder das schlagWinkel. Eine schematische Darstellung dieser Parameter wird auf der rechten Seite der 4A gezeigt. Die Armatur wird mit Igor Pro-Software durch die oben beschriebene explizite Funktion definiert, durchgeführt. Dann wird ein Histogramm des Schlagens Winkel θ für alle Zilien beachtend in der gleichen Zelle als Kreis Histogramms (Figur 2 in Narita et al. ⁸⁾ aufgetragen. Die Frequenz normiert auf die Anzahl der analysierten ciliary Spitzen. Es sei darauf hingewiesen, dass jede cilium wird interpretiert, um zwei θ-Werte in der kreisförmigen Histogramms, werden beispielsweise π / 4 und 3π / 4, was zu einer symmetrischen Verteilung der Richtung.

Θ (4B) - zu verallgemeinerte Seitenverhältnis AR definieren, werden die Positionen der ciliare Spitze während multiple Zyklen rotiert. Entsprechend der Drehung sowohl hin- und hergehende und Dreh Trajektorien werden verteilt in etwa parallel zur x-Achse, wobei die Breiten der Verteilungs A und B, entlang der x- und y-Achse sind, werden als die Hälfte der festgelegten die Differenz zwischen dem Minimum und Maximum. Daher sind diese Parameter mehr, die für die großen und kleinen Radien der Ellipse, a und b. AR wird dann als das Verhältnis zwischen A und B durch AR = B / A definiert.

Beobachtungen des Plexus Epithel von SEM

SEM ermöglicht die Beobachtung der feinen Oberflächenstruktur der Proben. Die Anwesenheit von Zilien auf CPECs wird in der gesamten Entwicklungszeitverlauf bestätigt. Die Entstehung von mehreren Zilien auf CPECs wird von embryonalen Tag (E) 13 beobachtet, kurz nach Plexus Entwicklung beginnt in der Seitenventrikel um E11. In diesem Stadium werden die Zellen mit einem kleinen variablen unreifen Aussehen und ciliare Spitzen gegenüber verschiedenen Richtungen zeigen. Bei E15 wird ein Büschel von mehreren Härchen auf der Oberseite der apikalen Oberfläche, die von den umgebenden Mikrovilli stehend sind etabliert. Am Tag nach der Geburt (P) 2, sind viele Härchen an einem gebogenen Position fixiert, was die Live-Bildgebung beobachtet Zilienmotilitätsstörungen. Bei P14, die meisten Zellen besitzen mehrere Zilien, die unbeweglich sind und Mikrovilli w ith eine feinere Struktur im Vergleich zu den früheren Stadien. 5 zeigt REM-Aufnahmen von CPECs mit Zilien in diesen Phasen. Auf der Grundlage der in Abbildung 1 und Film 1 gezeigten Filmen, ist es offensichtlich, dass bewegliche Zilien sind leicht durch Live-Bildgebung erfasst. Es ist jedoch schwierig, nicht-motile Zilien von DIC-Mikroskopie zu unterscheiden. Folglich ist SEM unentbehrlich Gesamt ciliary Staaten zu verstehen.

Abb. 1: Übersicht über den Workflow (a) Stereomikroskop. (B) Inverses Mikroskop mit einer ladungsgekoppelten Vorrichtung (CCD) Kamera ausgestattet. (C) Computer-Bildschirm während der Analyse. (D) Ion Sputter. (E) Specimen für SEM. (F) Rasterelektronenmikroskop.

Film 1.pload / 52991 / Figure_2.mov "target =" _ blank "> Film der Draufsicht CPECs und der Zilien von einer P2-Maus pup in High-Speed-Video-Mikroskopie. Wegen der unregelmäßigen Oberfläche des Plexus Gewebe enthält diese Momentaufnahme . sowohl in-Fokus und out-of-Fokusebenen Der Bereich in dem Feld wird erweitert und in Movie 2 Maßstabsbalken angezeigt:. 2 um.

Film 2. Film der vergrößerten Ansicht der Gewebeprobe in Film 1. Beating Zilien waren, entweder Dreh- oder hin- und hergehende Bewegungen. Maßstab: 1 um.

Abb. 2: Die Rekonstitution der Flugbahn des CPEC Zilien aus den Zeitraffer-Bilder in Movie 2 (A) Cilia mit Hin- und Her-Bewegung (oben) und eine Drehbewegung (unten). DIC Bilder von der Filmdaten werden bei 50 msec Intervallen (1 & mgr; m 1-8, Skala bar) vorgestellt. Die Position des Ziel ciliary Spitze wird durch eine Pfeilspitze angezeigt. (B) Die Trajektorien (gestrichelte Linie) und die Positionen der ciliary Spitzen (farbige Kreise) in Bildern gezeigt werden überlagert.

Abb. 3: Zwei Modi der CPEC ciliary Spitzenbewegung von Filmdaten wiederhergestellt Vertreter ciliary Spitze Bewegungen, Hin- und Her-Bewegung (A) und eine Drehbewegung (B), über mehrere Zyklen werden als Trajektorien (oben, Maßstabsbalken dargestellt: 0,5 um). Zeitverläufe der x- und y-Koordinaten der Spitzenposition aufgetragen sind, bzw. (mittel). Um eine Phasenverschiebung zwischen den beiden Koordinaten zeigen, x- und y-Koordinaten wurden normalisiert auf [-1,1] und überzog (unten, roten und blauen Linien, respectively).

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Abbildung 4: Schematische Darstellungen der Analyse ciliary Spitze Trajektorien beschreiben (A) Definitionen des schlagenden Winkel θ für Hin-und-Her (linkes Bild) und Dreh (rechtes Bild) Flugbahnen.. Parameter in der Formel der Beschreibung der ausgleichenden Ellipse, a, b, x ₀ und y _0, werden im rechten Bereich angezeigt. (B) Flussdiagramm der Armatur Analyse der Trajektorien, um das Schlagen Winkel θ und AR definieren. Die tatsächlichen Ergebnisse der Anpassung der repräsentativen Trajektorien in den richtigen Platten präsentiert.

Abbildung 5: REM-Aufnahme der Zilien. Repräsentative SEM-Aufnahmen von CPECs bei E13, E15, P2 und P14. Während der Zeit natürlich erhöht CPECs groß und entwickelt microvilli und Flimmerhärchen auf der apikalen Oberfläche. Ein Büschel von Zilien bei E13 ist noch nicht Motilität erwerben. Bei P2, wenn das Verhältnis von Zilien mit Beweglichkeit erreicht den höchsten Punkt, viele gebogene Wimpern beobachtet. Bei P14, Zilien verlieren Motilität. Maßstab: 5 um.

Discussion

Perspektiven dieser Methode

Obwohl die hier beschriebene Technik ist eine detailliertere Analyse der Zilien als bisher veröffentlichten Verfahren liefern, die Bedeutung dieser Technik besteht in der Einfachheit des Systems und Kosteneffizienz, die leicht an jede Art von Screening Zilienmotilitätsstörungen ex vivo angewendet werden kann. Insbesondere stellt TI Workbench eine einfache und benutzerfreundliche Schnittstelle, die Forschern die Beobachtung und leichter analysieren Zilienmotilitätsstörungen. Effektive automatisierte Tracking-Methoden sind nicht für geringen Kontrast Objekte wie ungefärbten Zilien in Video verbesserten Kontrast-DIC entwickelt. Obwohl das Verfahren zur Flimmerbewegung verfolgen manuell in dieser Technik wird der Aufwand in ciliary Motion-Tracking-Analyse optimal reduziert im Vergleich mit der Verwendung von Allzweck-Software-Pakete für die Bildanalyse.

Probe Dissektion

So bereiten Sie ex vivo CPEC Proben, schnelle und schonende Manipulationen sind notwendig, um die Lebensfähigkeit der Gewebe, die die Beweglichkeit der Zilien ex vivo stellt sicher bewahren. Da Verunreinigungen durch Erythrozyten verwischt die Beobachtungsfeld wird sanft, aber komplizierte Spülen des sezierten Gewebes mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung empfohlen. Um Blutungen zu vermeiden, muss darauf geachtet werden, nicht zu zerreißen das hintere Aderarterie, die als prominente rötlich fadenförmige Struktur der Lamina affixa der Kolloid Plexus eingehalten identifiziert werden können.

Mikroskop

Ein invertiertes Mikroskop mit DIC Optik und einem Hochleistungsübertragungslichtquelle ausgestattet ist für diese Methode. Weil Quecksilberlampen sind in der Regel nicht in der Lage häufiges Ein- und Ausschalten ist ein Verschluß vor dem Lampengehäuse notwendig. Entweder eine manuelle oder elektrische Blende kann für diesen Zweck verwendet werden. Um Proben und die Augen fr des Betrachters zu schützenom UV- und IR-Licht, sind optische Filter benötigt, um nur sichtbares Licht (400-700 Bandpass oder eine Kombination von UV- und IR-Cut-Filter) zu ermöglichen. ND-Filter sind auch notwendig, um die Lichtleistung, die je nach Situation unterschiedlich verändern: Überwachung durch Auge, die sich mit einer Videokamera, und High-Speed ​​Zeitraffer-Aufnahme. Eine Objektivlinse mit einer hohen numerischen Apertur für eine hohe Auflösung erforderlich. Es besteht eine gewisse Distanz zwischen der Oberseite des Deckglases und dem Brennpunkt aufgrund der Morphologie und Dicke des Gewebes. Deshalb wird ein Wasserimmersionslinse anstatt ein Ölimmersionslinse für bessere Bildqualität bevorzugt. Schwingungsisolierung ist auch notwendig, um eine stabile Bildstapel ergeben. Air dumper-type-Tabellen sind für diesen Zweck geeignet, aber einfacher Dämpfung des Mikroskops durch Einfügen Tennisbälle unter dem Mikroskop Basis mit einem stabilen Tisch kann auch arbeiten.

Videokamera

Eine CCD-Kamera in der Lage, bei least 200 Bildern / s ist erforderlich, um die Bewegung der Flimmerhärchen verfolgen. Während des letzten Jahrzehnts, CCD-Kameras mit schnelleren Bildraten als die Standard-Videorate (25-30 Hz) verfügbar geworden, bei viel niedrigeren Kosten. Kameramodelle in der Lage ist kürzer aussetzen Zeiten als die Rahmenintervalls sind nützlich Unschärfe durch die Bewegung der Zilien zu reduzieren, ohne die Erhöhung der Menge von Daten. Eine Belichtungszeit von 0,1 ms und 5 ms Rahmenintervalls (200 Hz) sind Mindestbedingungen ciliary Bilder CPECs mit ausreichender Qualität zu erhalten.

Software

Die Analyse, um die Bewegung jedes cilium verfolgen ist zeitaufwendig, vor allem, wenn Allzweck-Software-Pakete für die Bildanalyse verwendet werden, um jedes ciliary Spitze zu verfolgen. Die Reduzierung der Schritte wiederholt Aufgaben, wie zB Maus Klick auf das ciliary Spitzenposition auf dem Monitor, der Auswahl eines Menü, um die angeklickte Position aufzeichnen, und klicken Sie auf eine Schaltfläche, um zum nächsten Bildfeld bewegen, führt zu einer deutlichen WiederHerstellung von Zeit und Mühe. In dieser Studie wurde eine spezielle Routine, um die maßgeschneiderte TI Workbench-Software aufgenommen. Im ciliary Tracking-Modus des TI-Workbench-Software, hält der Benutzer Schleifen des folgenden einfachen zweistufigen Vorgang: Bewegen Sie den Mauszeiger auf die Spitze und ciliary Drücken einer Pfeiltaste auf der Tastatur, um den Rahmen, der sich nicht bewegt das erfordert voran Mauszeiger oder die Augen des Benutzers zu verschieben (zu Menüs und Schaltflächen auf dem Computer-Bildschirm) aus den ciliary Tipps auf dem Computerbildschirm. Die Software verfolgt die Ciliar Spitzenpositionen, zeigt die aufgezeichnete Kurve, um den Benutzer zu unterstützen, und erzeugt eine Tabelle von ziliaren Bewegungsinformation für eine weitere Analyse. Die meisten Allzweck-Software zur Bildanalyse ermöglicht Programmierung von Makros für die Stapelverarbeitung von solchen wiederholten Aufgaben. Eine solche kundenspezifische Programmierung wiederholt Schritte reduzieren wird dringend empfohlen.

Analyse Trajektorien

Die Extraktion des trajectories wurde mit dem maßgeschneiderten TI Workbench-Software durchgeführt, wie oben beschrieben. Relativ einfache Analyse und Bildverarbeitung wurden ebenfalls unter Verwendung der gleichen Software. Zur Montage Analysen wurde die Flugbahn jedes ciliary Spitze zu Igor Pro-Software übertragen. Andere erweiterte Analyse-Software wie MATLAB kann auch für diesen Zweck verwendet werden.

In der aktuellen Studie, aufgrund von Schwierigkeiten bei der Kategorisierung der Trajektorien in hin- und her oder Rotationsflugbahnen, die Flugbahnen wurden von Augen verblindet, die von einem anderen Beobachter bestätigt wurden, was zu einer konsistenten Klassifizierung klassifiziert. Dennoch wäre mehr mathematisch strenge Maßnahmen, um die Flugbahnen ohne mögliche Willkür kategorisieren vorzuziehen. Ellipse Einpassen der Trajektorien zu sein scheint ideal, die das Ausmaß der Elliptizität, wenn das Seitenverhältnis der ausgleichenden Ellipse () sowohl hin- und hergehende und Drehbewegungen zu quantifizieren kann. JedochEin Versuch, um die Verteilung des Aspektverhältnisses zu verwenden, um einen Schwellenwert für die Klassifizierung zu definieren war unwirksam. Die Armatur oft hin- und her Trajektorien gescheitert, häufig nicht die Parameter, die konvergieren und die konvergente passend war offenbar illusorisch. Daher wurde Ellipse Pass nicht angenommen, um automatisch zu kategorisieren die Flugbahnen oder zu quantifizieren, die Elliptizität eines jeden Flugbahn. Der Beschlag wurde ausgeführt, um das schlagende Richtung drehend bewegenden Spitzen als die große Achse der ausgleichenden Ellipse extrahieren.

In der vorliegenden Studie, AR wurde vorgeschlagen, um das Ausmaß, das eine Trajektorie von einer idealen linearen Bewegung hin- und her abweicht quantifizieren. Der Parameter ist das Verhältnis der Breite der Verteilung senkrecht zum Schlagen Richtung zu der Richtung. Der Wert Null sein, wenn die Trajektorie einer geraden Linie, und man, wenn die Bahnkurve ein Kreis ist, ähnlich dem Seitenverhältnis der oben genannten Ellipse.

In der Praxis kann Erhalten der AR-Wert durch Drehen der Bewegungsbahn relativ einfach sein, so dass die Schlagrichtung parallel zur x-Achse (4B) wird. Diese Quantifizierung führt zu deutlich unterschiedliche Werte für die beiden Bewegungsarten, was auf die potentielle Verwendung des Parameters nicht nur auf die Merkmale der einzelnen Bahn zu quantifizieren, sondern auch konsequenter klassifizieren die Trajektorien. Es sollte jedoch beachtet werden, dass die Schlagrichtung sich ist schon das Ergebnis von unterschiedlichen Fügevorgänge für die beiden Moden in der aktuellen Methode.

Eine weitere Verbesserung der Analyse, beispielsweise eine erweiterte Anpassungsalgorithmus, kann die Probleme möglicher Willkür lösen.

Ein Aspekt in Bezug auf die Elliptizität der Bahn ist, dass das Schlagen jeder CPEC cilium möglicherweise nicht in der Ebene, die genau senkrecht zur x stattfinden werden - y

Vorbereitung für SEM

Während der Vorbereitung der SEM-Beobachtung gibt es mehrere wichtige Punkte, die die Übernahme von Bildern hoher Qualität zu gewährleisten. Erstens müssen Postfixierung durch Osmiumtetroxid sorgfältig durchgeführt werden, einschließlich Vorwaschen mit einer 10% igen Saccharoselösung. Ohne die richtige Fixierung der osmification Verfahren können die nachfolgenden Schritte nicht erhalten oder wieder herzustellen, den Zustand der Proben, was zu einer geringeren Qualität der Zubereitung. Da Aldehyd Fixiermittel sind Reduktionsmittel, alle verbleibenden Aldehyde innerhalb der Probe hemmen die Aktivität von Osmiumtetroxid, einem starken Oxidationsmittel. Um Eliminierung von überflüssigen Aldehyde in Proben zu gewährleisten, ist sorgfältiges Waschen mit der Saccharoselösung zwingend erforderlich. In Fällen suboptimal post-Fixierung, die Farbe der Probe nicht von braun bis schwarz zu ändern. Zweitens muss das Volumen Osmiumtetroxid mindestens 50-fach größer als die der Probe. Ansonsten kann eine ausreichende Fixierung nicht erwartet werden. Drittens ist es wichtig, eine vollständige Trocknung der Proben zu vermeiden, besonders während des Entwässerungsprozesses, die hochreines Ethanol und Isoamylacetat verwendet. Trocknen der Probe zerstört die feinen Oberflächenstrukturen wie Zilien, was zu schlechten Bildern.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Required reagents
for live cell imaging
ethanol	Wako Chemicals	057-00456
Leibovitz L-15 medium	Life Technologies	11415-064
for SEM preparation
ethanol	Wako Chemicals	057-00456
Hank's balanced salt solution	Life Technologies	14170112
paraformaldehyde	Merck	1040051000
glutaraldehyde	Nacalai tesque	17003-05
isoamyl acetate	Nacalai tesque	02710-95
Molecular Sieves 4A 1/8	Wako Chemicals	130-08655	for preparation of anhydrous ethanol
phosphate buffer saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408
phosphate buffer, 0.1 M			To make 100 ml, mix 19.0 ml of 0.1 M NaH2PO4 and 81.0 ml of 0.1 M Na2HPO4
monosodium phosphate (dihydrate)	Nacalai tesque	31718-15
disodium phosphate (anhydrous)	Nacalai tesque	31801-05
suclose	Nacalai tesque	30406-25
osmium tetroxide	Nisshin EM	300
dry ice

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tools and materials for dissection
for both live imaging and SEM preparation
stereo microscope	Olympus	SZX7
flat paper towel
Φ10 cm plastic dish
100 ml beaker
straight operating scissors	Sansyo	S-2B
watchmaker forceps	Dumont	No.DU-3 or -4, INOX
for live cell imaging
glass bottom dish	Matsunami Glass	D110300
for SEM preparation
alminum foil
5 ml glass vial with a polyethylene cap	Nichiden Rika-Glass	PS-5A
transfer pipette	Samco Scientific	SM251-1S	for specimen tranfer
toothpick			for specimen transfer
ion sputter with gold-palladium	Hitachi	E-1030
critical point dryer	Hitachi	HCP-2

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopic equipment and materials
for live cell imaging
inverted microscope	Olympus	IX81
100 W mercury lump housing and power supply	Olympus	U-ULH and BH2-RFL-T3
100 W mercury lamp	Ushio	USH103D
DIC condenser, n.a. 0.55	Olympus	IX-LWUCD
electrrical shutter	Vincent Associates	VS35S22M1R3-24 and VMM-D1	manual shutter can be used.
band-pass filter (400-700 nm, Φ45 mm)	Koshin Kagaku	C10-110621-1
ND filter (Φ45 mm)	Olympus	45ND6, 45ND25	combination of 25% and 6% ND filters are used
objective lens (water immersion) with DIC element	Olympus	UApo 40XW/340, n.a., 1.15 with IX-DPAO40
high-speed video camera	Allied Vision Technologies	GE680	≥200 Hz frame rate and 1 msec expose time
image acquisition / analysis software	in-hous software	TI Workbench	capable of acquisition at high frame rates.
PC for camera control / analysis	Apple	Mac Pro
vibration isolation table	Meiritsu Seiki	AD0806
weight for tissue	Warner Instruments	slice anchor kits	It can be made with nylon mesh glued to a U-shape squashed Φ0.5 mm platinum wire.
cover glass (alternative weight for tissue)	Matsunami	made-to-order	A cover glass can be used as a tissue weight.
for SEM
inverted microscope	Olympus	IX81
scanning electron microscope	JEOL	JSM-6510