Protocol
Protokollen och användningen av försöksdjur har godkänts av Institutional Animal Care och använda kommittéer vid University of Yamanashi och Waseda University. Djuromsorg utfördes i enlighet med institutionens riktlinjer.
1. CPEC Framställning
- Förbered följande apparater och material: en stereomikroskop, företrädesvis förmåga att överföra ljus från botten; ett par urmakare pincett (Dumont # 3 eller # 4), brand steriliseras, raka rörelse sax, brand steriliseras; två sterila 10 cm plastskålar innehållande 20 ml iskall Leibovitz L-15-medium; 35 mm glasbottnade rätter som innehåller 2 ml RT Leibovitz L-15-medium; en 100 ml bägare innehållande 70% etanol; neonatal mus valpar.
- Fördjupa korthet en neonatal mus i 70% etanol och avliva snabbt genom halshuggning med drift sax.
- Placera huvudet omedelbart i iskall Leibovitz L-15-medium i sterila 10 cm dish.
- Ta bort skinnet från calvaria använder paret av urmakare pincett, skära upp skallen att exponera hjärnan, och sedan klippa kranialnerver att isolera hela hjärnan.
- Överför hjärnan till en ny maträtt som innehåller iskall Leibovitz L-15-medium och observera under stereomikroskop, och se till att hjärnan är helt nedsänkt i mediet.
- Ställ rygg aspekten av hjärnan uppåt, och orientera hjärnan så att lukt glödlampor bosatta vid klockan tre lägen (för högerhänta personer). Håll hjärnan försiktigt med pincetten i vänster hand.
- Använda fina dissektion pincett (Dumont # 3 eller # 4) i den högra, skär corpus callosum och under parenkymet som förbinder hjärnhalvorna, längs den längsgående spricka i storhjärnan.
- Tryck försiktigt hjärnhalvorna bort till de laterala sidorna och exponera den tvärgående cerebral spricka.
- Separera halvkloten genom att klämma ut the parenkymet mellan halvklotet och thalamus.
- Dra försiktigt ut sidokammar choroid plexus som är knutna till den laterala sidan av hippocampus av lamina affixa.
- Överför isolerade choroid plexus till 35 mm glas botten maträtt som innehåller färsk Leibovitz L-15-medium, och lägga en vikt (Materials List) försiktigt för att hålla vävnaden på plats.
2. Live avbildning av CPEC Cilia
- Bekräfta korrekt ultraviolett (UV) och sluta (IR)-filter (s) för att blockera ljus kortare än 400 nm och längre än 700 nm, och som neutral densitet (ND) filter (25% respektive 6%) är införd i ljusstrålen av den inverterat mikroskop.
- Justera fokus objektiv ungefär med ögat, och sedan justera kondensorn så att centrum och fokus för att överensstämma med Köhler belysning. Sätt en lämplig differential interferens kontrast (DIC) prisma, en DIC element, liksom analysatorn och polarisator element i light väg att uppfylla de DIC optik.
- Justera kontrasten med tanke från DIC prisma läge så att strukturen av vävnadsytan är mest kända. Om alla cilier i målceller är rörliga, kan en tydlig bild av rörliga cilier inte erhållas genom öga på grund av deras rörelse.
- Ändra ljusvägen till videokameran, och ta bort ND-filter för att öka ljuseffekten.
- Använd kameran i fokusläge för att justera synfältet och fokus. Under fokusering, där videobilder visas i realtid på bildskärmen är inte tillgänglig en tydlig bild av rörliga cilier.
- Använd kameran vid 200 Hz med en exponeringstid av 0,1 msek för den önskade perioden (sekunder till minuter). Efter förvärvet av bildstapel, kommer enskilda bildrutor visar tydliga ciliära strukturer. Om ciliära kanter är suddiga, öka bildhastigheten eller använd en kortare exponeringstid.
- Anteckna rörelse CPEC cilier inom 25-60 minuter efter dödshjälp i LeibovitzL-15-medium.
3. Analys av Ciliary Motion
- Spåra manuellt slå mönster av varje cilium på datorskärmen. Markera positioner ciliär tips i varje bildruta med muspekaren, som samlades till banan information varje cilie. Antingen analysera banan information med hjälp av samma program eller exportera till andra mer generella applikationer för vidare analys. Effektiviteten av denna analys steg beskrivs i diskussionen.
- Klassificera banor i två rörelsesätt, back-och-tillbaka eller roterande, med ögat.
- Beräkna ciliära malningsfrekvens (CBF) med användning av följande formel: [CBF = (antal bilder per sekund) / (genomsnittliga antalet bildrutor för en enda takt)] 14, som kan erhållas från en ciliär spetsrörelseschema (Figur 3 ). Upprepa denna beräkning för flera ciliär beating cykler, eftersom andra flimmerhår på samma cell kan störa rörelsen hos varje cilium, vilket resulterar i oegentligheter.
- För att analysera vinkellikformigheten hos ciliära slå axlar inom en enda cell, definiera malningsvinkel θ för varje bana (fig 4). För back-och-tillbaka banor, passar positioner flimmerhåren tips till en rak linje, och definiera θ som vinkeln linjen gör med x-axeln. För roterande banor, passar de ståndpunkter som en ellips, och definiera θ som vinkeln huvudaxel ellipsen gör med x-axeln. Uppgifter om montering beskrivs i avsnittet Resultat representanten.
- För kvantitativ beskrivning av varje bana, beräkna generaliserade bildformat AR. I korthet, rotera banan med - θ och definiera AR som förhållandet mellan bredden av fördelningen längs x - och y -axes (Figur 4B). Detaljer visas i avsnittet Resultat representant, och tolkningen, Betydelse, och begränsningen av parametern beskrivs i diskussionen.
4. Provberedning för SEM
Obs: SEM är en viktig metod för att utvärdera statusen för cilier på CPECs på ett övergripande sätt. För att förbereda prover för SEM, rapporterade en standardprocedur tidigare 15 används med smärre ändringar.
- Innan dissekera den vävnad från hjärnan, förbereda fixativet i en 5 ml glasflaska med lock av polyeten. Fixativet består av 2% paraformaldehyd, 2,5% glutaraldehyd (halv Karnovsky lösning 16) i 0,1 M fosfatbuffert, pH 7,4.
- Dissekera ut vävnad från hjärnan, såsom beskrivits i steg 1.
- Skölj hastigt den isolerade vävnaden med Hanks balanserade saltlösning (HBSS) i en ny skål och sedan fixera vävnad i fixativ i glasflaskan under 1 timme vid rumstemperatur. Använd engångsöverföringspipetter och hantera proverna GEntly. Efter sköljning i HBSS, blir vävnaden klibbig.
- För att överföra exemplar till fixeringslösning, långsamt utvisa en liten mängd lösning innehållande vävnad från överföringspipetten som en droppe och lägga till fixativ.
- Efter fixering, kassera fixativ och skölj vävnaden med fosfatbuffert tre gånger.
- Sänk vävnaden i en 10% sackaroslösning att tvätta bort de kvarvarande aldehyder. För att säkerställa fullständig eliminering av aldehyder, sänk ned proven i lösningen i 10 minuter och sedan upprepa två gånger med färsk 10% sackaros. Detta steg är viktigt för att uppnå rätt efter fixering i efterföljande steg.
- Sänk ned vävnaden i en lösning av 1% osmiumtetroxid i fosfatbuffert under 30 minuter och sedan placera på is under efter fixering. Bedöma graden av osmification av färgprov: när aldehyder är helt bort, är svart provet.
- Tvätta efter-fixerade vävnadsprover de omfattande med dubbel distilled vatten flera gånger.
- Torka proverna med nedsänkning i graderade koncentrationer av etanol, vanligtvis 65%, 75%, 85%, 95%, 99%, och 100%, under 10 min vardera. Skaffa vattenfri etanol genom att placera molekylsiktar i 99,5% etanol från en nyinköpt flaska. Upprepa uttorkning med vattenfri etanol tre gånger.
- Placera de dehydratiserade proverna i isoamylacetat, en substitutions reagens för kritisk punkt torkning, under 10 min. Upprepa detta steg två gånger. Detta reagens avdunstar snabbt och provet kan bli torr, vilket resulterar i förstörelse av ytspänning. Därför inte torkar provet fullständigt.
- Efter det slutliga utbytet av isoamylacetat, avlägsna det mesta av lösningsmedlet, omedelbart linda den öppna glasflaska med aluminiumfolie och placera flaskan på torris. Med användning av en nål eller fin pincett, göra flera hål i folien som täcker mynningen av flaskan, så att flytande koldioxid strömmar lätt in i flaskan i den kritiska punkten torktumlare. Gå vidare till nästa stegså snabbt som möjligt.
- I detta steg, minimera överföring av isoamylacetat in i kammaren av torken, men låt inte provet torka ut helt innan kritiska punkten torkning. Dessutom, inte lämna provet på torris för en onödigt lång tid för att undvika bildandet av frost på flaskan.
- Överför folie förpackade glasvialer innehållande vävnadsproverna in i den kritiska punkten hårtork som säkerställer ytstrukturen hos vävnaden förblir intakt under avlägsnande av vatten som finns i vävnaden. Detaljerad information om drift den kritiska punkten torken kan erhållas från tillverkarens anvisningar.
- Hantera proverna försiktigt med en tandpetare för att minimera mekaniska skador. De erhållna torkade vävnadsprover är ömtåliga. Montera proverna på metall stubbar och kappa med guld-palladium med hjälp av en jon spotta.
5. Observation av SEM
- Beakta av SEM och spela in bilder med en digitalkamerautrustad med svepelektronmikroskop.
- Överför digitala bilddata till en dator för analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En översikt av arbetsflödet visas i fig 1, inklusive bilder av anordningarna.
Live rörelse observationer av CPECs
Film 1 visar en film av CPECs isolerade från en perinatal mus och Film 2 visar en expanderad vy av bilderna i filmen 1. Det bör noteras att enskilda ciliära tips är mindre tydliga i stillbilder jämfört med dem i filmer. Figur 2 visar spårning av rörelsen hos två cilier med olika verk rörelse, fram-och-tillbaka och rotationsrörelser, från de data som visas i filmer 1 och 2, fig. 3 visar en enkel analys av banorna för flimmerhåren, där fasskillnaden i de två koordinaterna är uppenbar i rotationsrörelsen.
Analys av CPEC ciliär tips banor
De tailed metoder för att kvantitativt analysera varje bana visas i Figur 4 med schematiska illustrationer av misshandeln vinkeln θ definitioner (A) och ett flödesschema av analysen med representativa resultat (B).
För att definiera misshandeln vinkeln θ för fram-och-tillbaka banor, passar positioner strålkroppen spetsen under flera cykler till en rak linje y = ax + b, och definiera stryk riktning som längs den anpassade linjen. Definiera misshandeln vinkeln här som θ = Arc tan a. Eftersom linjen montering ofta misslyckas med att extrahera riktningen i fall av rotationsrörelse, passa rotations banor till en ellips, och definiera den riktning som den längs längdaxeln av den anpassade ellips. Närmare bestämt är spets positionerna (x, y) under flera malningscykler monterad till funktionen nedan.
1.jpg "width =" 310 "/>
var 
Ellipsen montering innebär fem passande parametrar: x 0, y 0, a, b, och θ. X - och y -spatial koordinaterna för centrum hos ellipsen är x 0 och y 0, respektive. Den större och mindre radier hos ellipsen är a och b, respektive. Vinkel θ är den vinkel som huvudaxeln bildar med x-axeln, eller malningsvinkel. En schematisk representation av dessa parametrar visas i den högra panelen av figur 4A. Beslaget utförs med användning av Igor Pro genom att definiera explicit funktion som beskrivits ovan. Sedan ett histogram över slå vinkel θ för alla cilier observerad i samma cell plottas som en cirkulär histogram (fig 2 i Narita et al., 8). Frekvensen är normaliserade till antalet analyserade ciliära spetsar. Det bör noteras att varje cilie tolkas ha två θ värden i den cirkulära histogrammet, t.ex. π / 4 och 3π / 4, vilket leder till symmetrisk fördelning av riktningen.
För att definiera generaliserad bildformat AR, är positionerna för strålkroppen spetsen under flera cykler roteras - θ (Figur 4B). Enligt rotationen, både fram-och-tillbaka och rotationsbanor blir distribueras ungefär parallellt med x-axeln, där bredderna för fördelning A och B, längs x- och y-axlarna, respektive, definieras som hälften av skillnaden mellan lägsta och högsta. Därför är dessa parametrar är mer relevanta för större och mindre radier hos ellipsen, a och b. AR definieras då som förhållandet mellan A och B av AR = B / A.
Observationer av koroidea plexus epitel av SEM
SEM tillåter observation av den fina ytstruktur exemplar. Närvaron av cilier på CPECs bekräftas hela utvecklings tidsförloppet. Framväxten av flera cilier på CPECs observeras av embryonala dag (E) 13, strax efter choroid plexus utveckling börjar i de laterala ventriklama runt E11. Vid detta stadium är cellerna små med en variabel omogen utseende, och de ciliära spetsar pekar mot olika riktningar. Vid E15, är en tofs av multipel cilier etablerad på toppen av den apikala ytan, som står ut från de omgivande mikrovilli. Vid postnatal dag (P) 2, många cilier fastställas till en böjd position, vilket återspeglar strålkroppen rörlighet följs av levande avbildning. Vid P14, de flesta celler har multipla cilier som är icke-motila samt mikrovilli w ed en finare textur jämfört med de tidigare stadierna. Figur 5 visar SEM bilder av CPECs med cilier vid dessa stadier. Baserat på de filmer som visas i figur 1 och film 1, är det uppenbart att rörliga cilier är lätta att känna igen av levande avbildning. Det är dock svårt att skilja icke-rörliga cilier från DIC mikroskopi. Följaktligen är SEM nödvändig för att förstå övergripande ciliära stater.
Figur 1:. Översikt av arbetsflödet (a) Stereomikroskop. (B) inverterat mikroskop utrustat med en laddad-kopplad anordning (CCD) kamera. (C) Datorskärmen under analysen. (D) lon sputter. (E) Prov för SEM. (F) svepelektronmikroskop.
Film 1.pload / 52991 / Figure_2.mov "target =" _ blank "> film av uppifrån av CPECs och cilier från en P2 mus valp i höghastighetsvideo mikroskopi. På grund av den oregelbundna ytan av koroidea plexus vävnad, innehåller denna ögonblicksbild . både i-fokus och out-of-fokus plan Området i rutan expanderas och visas i Movie 2 Skala bar:. 2 pm.
Film 2. Film av expanderad vy av vävnadsprovet i Movie 1. Seger cilier visade antingen roterande eller fram-och-tillbaka rörelser. Skala bar: 1 pm.
Figur 2:. Beredning av banan för CPEC cilier från tidsförlopp bilder i Movie 2 (A) Cilia med fram- och återgående rörelse (överst) och vridrörelse (botten). DIC bilder från filmdata presenteras på 50 msek intervall (1-8, skala bar: 1 pm). Placeringen av målet ciliära spetsen indikeras med en pilspets. (B) De banor (streckad linje) och ståndpunkter ciliära tips (färgade cirklar) som visas i bilder överlagras.
Figur 3:. Två typer av CPEC ciliär spets rörelse rekonstituerad från filmdata Representativa ciliär spets rörelser, fram- och återgående rörelse (A) och vridrörelse (B), över flera cykler presenteras som banor (topp, skal barer: 0,5 im). Tidsförlopp för x- och y-koordinaterna för spetspositionen plottas, respektive (i mitten). För att visa en fasförskjutning mellan de två koordinater, x- och y-koordinater normaliserades till [-1,1] och över (botten, röda och blå linjer, respektive).
igure 6 "src =" / filer / ftp_upload / 52991 / 52991fig6.jpg "/>
Figur 4: schematiska illustrationer som beskriver analysen av strålkroppen tips banor (A) Definitioner av misshandeln vinkeln θ för fram-och-tillbaka (till vänster) och rotations (höger panel) banor.. Parametrar i formeln som beskriver den monterade ellips, a, b, x 0, och y 0, visas i den högra panelen. (B) Flödesschema av kopplingen analys av banorna för att definiera malningsvinkel θ och AR. Faktiska resultat av montering av de representativa banor presenteras i högra panelerna.
Figur 5: SEM-bild av cilier. Representativa SEM mikrofotografier av CPECs på E13, E15, P2 och P14. Under tidsförloppet, ökade CPECs i storlek, och utvecklade microviLLI och cilier på apikalytan. En tofs av cilier på E13 är ännu förvärva rörlighet. I P2, när förhållandet mellan cilier med rörlighet nått den högsta punkten, många böjda cilier observerats. Vid P14, cilier förlorar rörlighet. Skala bar: 5 pm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Perspektiv av denna metod
Även den teknik som beskrivs här inte ger en mer detaljerad analys av cilier än tidigare publicerade metoder, betydelsen av denna teknik ligger i enkelheten i systemet och kostnadseffektivitet, som lätt kan appliceras på screening någon form av ciliär rörlighet ex vivo. I synnerhet tillhandahåller TI Workbench ett enkelt och användarvänligt gränssnitt som gör det möjligt för forskarna att observera och analysera ciliär rörlighet lättare. Effektiva automatiserade spårningsmetoder har inte utvecklats för låg kontrast objekt såsom ofärgade flimmerhår i video-förstärkt kontrast DIC. Även om metoden för att spåra ciliär rörelse är manuell i denna teknik är hur mycket arbete i ciliär rörelse spårning analys optimalt reduceras jämfört med att använda allmänna ändamål programpaket för bildanalys.
Prov dissektion
För att förbereda ex vivo CPEC prover, snabba och mjuka manipulationer är nödvändiga för att bevara livskraften hos de vävnader, som säkerställer rörlighet av flimmerhåren ex vivo. Eftersom förorening av erytrocyter suddar området observation, är mild men intrikata sköljning av dissekerade vävnaden med fosfatbuffrad koksaltlösning rekommenderas starkt. För att undvika blödning, måste försiktighet vidtas för att undvika att riva den bakre åderhinnan artären som kan identifieras som en framträdande rödaktig trådliknande struktur anslutit sig till lamina affixa av kolloid plexus.
Mikroskop
Ett inverterat mikroskop utrustat med DIC optik och en hög kraftöverföring ljuskälla är avgörande för detta förfarande. Eftersom kvicksilverlampor är oftast oförmögna att ofta byta på och av, är det nödvändigt med en slutare framför lamphuset. Antingen en manuell eller elektrisk slutare kan användas för detta ändamål. För att skydda prover och betraktarens ögon frOm UV- och IR-ljus, är optiska filter som krävs för att tillåta endast synligt ljus (400-700 bandpass eller en kombination av UV- och IR-cut filter). ND-filter är också nödvändigt att ändra ljuseffekt som varierar beroende på situationen: övervakning med ögat, fokus med en videokamera, och höghastighets time-lapse inspelning. En objektivlins med en hög numerisk öppning är nödvändig för en hög upplösning. Det finns ett visst avstånd mellan toppen av täckglas och fokalpunkten grund av morfologin och tjockleken av vävnaden. Därför är en vattenimmersionslins snarare än en oljeimmersionslins föredrages för bättre bildkvalitet. Vibrationsisolering är också nödvändigt för att ge stabila bildstaplar. Luft dumper-typ tabeller är användbara för detta ändamål, men enklare dämpning av mikroskopet genom att sätta in tennisbollar under mikroskopet basen med en stadigt bord kan också fungera.
Videokamera
En CCD-kamera kan på least 200 bilder / sek är nödvändigt att följa utvecklingen av cilier. Under det senaste decenniet har CCD-kameror med snabbare frame rates än standardvideohastighet (25-30 Hz) blir tillgängliga till mycket lägre kostnader. Kameramodeller kan kortare utsätta gånger än ramintervallet är användbara för att förminska suddighet på grund av förflyttning av cilier utan att öka mängden data. En exponeringstid av 0,1 ms och en 5 ms ramintervall (200 Hz) är minimivillkor för att få ciliära bilder av CPECs med tillräcklig kvalitet.
Programvara
Analysen för att spåra rörelsen hos varje cilie är tidskrävande, särskilt när allmänna ändamål mjukvarupaket för bildanalys används för att spåra varje ciliär spets. Minska stegen upprepade uppgifter, såsom mus klicka på strålkroppen spets position på skärmen, välja en meny för att spela in det klickade positionen, och klicka på en knapp för att gå till nästa bildruta, resulterar i en signifikant reproduktion av tid och ansträngning. I denna studie var en särskild rutin läggas till skräddarsydda TI Workbench programvara. I strålkroppen spårningsläget av TI Workbench programvara, håller användaren looping följande enkla två steg: att flytta muspekaren till ciliär spetsen och trycker på en piltangent på tangentbordet för att gå vidare i ramen, som inte kräver att flytta muspekaren eller användarens ögon att flytta (till menyer och knappar på datorskärmen) från ciliära tips på datorskärmen. Programmet håller reda på de ciliära spetspositioner, visar den inspelade bana för att hjälpa användaren och skapar en tabell med ciliär rörelseinformation för vidare analys. Mest generell mjukvara för bildanalys medger programing makron för batch-bearbetning av sådana upprepade uppgifter. En sådan anpassad programmering för att minska upprepade steg rekommenderas starkt.
Analys av banor
Extraktion av trajectories utfördes med användning av skräddarsydd TI Workbench mjukvaran används, såsom beskrivits ovan. Relativt enkla analys och bildbehandling utfördes också med användning av samma mjukvara. För montering analyser, var banan för varje ciliära spets överförs till Igor Pro. Annan avancerad analys programvara såsom MATLAB kan också användas för detta ändamål.
I den aktuella studien, på grund av svårigheter i att kategorisera banor i fram-och-tillbaka eller roterande banor, var banor klassificerats av ögat i en blindad sätt, vilket bekräftades av en annan observatör, vilket resulterar i en konsekvent klassificering. Ändå skulle mer matematiskt rigorösa åtgärder för att kategorisera de banor utan eventuella godtycke vara att föredra. Ellipse montering av banorna verkar vara perfekt, vilket skulle kunna kvantifiera omfattningen av ellipticiteten som förhållandet aspekten av monterade ellipsen () i både back-och-tillbaka och roterande rörelser. Emellertid, Ett försök att använda fördelningen av bildförhållande för att definiera ett tröskelvärde för klassificeringen var ineffektiva. Beslaget ofta misslyckats för fram-och-tillbaka banor, de parametrar misslyckades ofta att konvergera, och konvergerade montering var tydligen illusoriska. Därför var ellips montering inte antagits för att automatiskt kategorisera banor eller kvantifiera ellipticiteten varje bana. Beslaget utfördes för att extrahera malningsriktningen för rotations flyttar tips som storaxeln av den anpassade ellips.
I den aktuella studien, var AR föreslog att kvantifiera den utsträckning som en bana avviker från en perfekt linjär fram- och återgående rörelse. Parametern är förhållandet mellan bredden av fördelningen vinkelrät mot malnings riktning mot den längs riktningen. Värdet bör vara noll när banan är en rak linje, och en när banan är en cirkel, som liknar förhållandet av ellipsen som nämns ovan.
I praktiken kan erhålla AR värdet vara relativt lätt genom att rotera bana, så att malningsriktningen blir parallell med x -axeln (Figur 4B). Denna kvantifiering leder till avsevärt olika värden för de två typer av rörelse, vilket tyder på den potentiella användningen av parametern inte bara att kvantifiera egenskaperna hos varje bana, men också för att mer noggrant klassificera banor. Det bör dock noteras att slå riktningen sig är redan ett resultat av olika monteringsprocesser för de två lägena i den aktuella metoden.
Ytterligare förbättringar av analysen, såsom en mer avancerad passande algoritm kan lösa problemen med möjliga godtycke.
En aspekt när det gäller ellipticiteten av banan är att slå varje CPEC cilie inte kan äga rum i planet som är strikt vinkelrät mot x - y
Förberedelse för SEM
Under förberedelserna för SEM observation, det finns flera viktiga punkter som säkerställer förvärv av högkvalitativa bilder. Först måste efter fixering av osmiumtetroxid utföras noggrant, inklusive fördisk med en 10% sackaroslösning. Utan ordentlig fixering av osmification förfarande, kan de efterföljande stegen inte bibehålla eller återställa tillståndet av proverna, vilket leder till en lägre kvalitet av preparatet. Eftersom aldehyd fixativ är reduktionsmedel, eventuella återstående aldehyder inom provet hämmar aktiviteten av osmiumtetroxid, en stark oxiderande reagens. För att säkerställa eliminering av överflödiga aldehyder i prov, är noggrann tvättning med sackaroslösningen absolut nödvändigt. Vid suboptimal post-fixering, inte färgen av provet inte att ändras från brunt till svart. För det andra, måste volymen av osmiumtetroxid vara minst 50-faldigt större än den hos provet. Annars kan inte förväntas tillräcklig fixering. För det tredje är det viktigt att undvika fullständig torkning av proverna, särskilt under dehydratiseringsprocessen som sysselsätter mycket ren etanol och isoamylacetat. Torkning av provet förstör de fina ytstrukturer såsom cilier, vilket resulterar i dåliga bilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen. Detta dokument syftar till att rapportera detaljerad metod att observera motilitet flimmerhår i isolerade choroid plexus vävnader. Vetenskapliga nyheter har rapporterats i tidigare studier 1,8.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Required reagents | |||
| for live cell imaging | |||
| ethanol | Wako Chemicals | 057-00456 | |
| Leibovitz L-15 medium | Life Technologies | 11415-064 | |
| for SEM preparation | |||
| ethanol | Wako Chemicals | 057-00456 | |
| Hank's balanced salt solution | Life Technologies | 14170112 | |
| paraformaldehyde | Merck | 1040051000 | |
| glutaraldehyde | Nacalai tesque | 17003-05 | |
| isoamyl acetate | Nacalai tesque | 02710-95 | |
| Molecular Sieves 4A 1/8 | Wako Chemicals | 130-08655 | for preparation of anhydrous ethanol |
| phosphate buffer saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| phosphate buffer, 0.1 M | To make 100 ml, mix 19.0 ml of 0.1 M NaH2PO4 and 81.0 ml of 0.1 M Na2HPO4 | ||
| monosodium phosphate (dihydrate) | Nacalai tesque | 31718-15 | |
| disodium phosphate (anhydrous) | Nacalai tesque | 31801-05 | |
| suclose | Nacalai tesque | 30406-25 | |
| osmium tetroxide | Nisshin EM | 300 | |
| dry ice | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools and materials for dissection | |||
| for both live imaging and SEM preparation | |||
| stereo microscope | Olympus | SZX7 | |
| flat paper towel | |||
| Φ10 cm plastic dish | |||
| 100 ml beaker | |||
| straight operating scissors | Sansyo | S-2B | |
| watchmaker forceps | Dumont | No.DU-3 or -4, INOX | |
| for live cell imaging | |||
| glass bottom dish | Matsunami Glass | D110300 | |
| for SEM preparation | |||
| alminum foil | |||
| 5 ml glass vial with a polyethylene cap | Nichiden Rika-Glass | PS-5A | |
| transfer pipette | Samco Scientific | SM251-1S | for specimen tranfer |
| toothpick | for specimen transfer | ||
| ion sputter with gold-palladium | Hitachi | E-1030 | |
| critical point dryer | Hitachi | HCP-2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopic equipment and materials | |||
| for live cell imaging | |||
| inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| 100 W mercury lump housing and power supply | Olympus | U-ULH and BH2-RFL-T3 | |
| 100 W mercury lamp | Ushio | USH103D | |
| DIC condenser, n.a. 0.55 | Olympus | IX-LWUCD | |
| electrrical shutter | Vincent Associates | VS35S22M1R3-24 and VMM-D1 | manual shutter can be used. |
| band-pass filter (400-700 nm, Φ45 mm) | Koshin Kagaku | C10-110621-1 | |
| ND filter (Φ45 mm) | Olympus | 45ND6, 45ND25 | combination of 25% and 6% ND filters are used |
| objective lens (water immersion) with DIC element | Olympus | UApo 40XW/340, n.a., 1.15 with IX-DPAO40 | |
| high-speed video camera | Allied Vision Technologies | GE680 | ≥200 Hz frame rate and 1 msec expose time |
| image acquisition / analysis software | in-hous software | TI Workbench | capable of acquisition at high frame rates. |
| PC for camera control / analysis | Apple | Mac Pro | |
| vibration isolation table | Meiritsu Seiki | AD0806 | |
| weight for tissue | Warner Instruments | slice anchor kits | It can be made with nylon mesh glued to a U-shape squashed Φ0.5 mm platinum wire. |
| cover glass (alternative weight for tissue) | Matsunami | made-to-order | A cover glass can be used as a tissue weight. |
| for SEM | |||
| inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| scanning electron microscope | JEOL | JSM-6510 | |
References
- Nonami, Y., Narita, K., Nakamura, H., Inoue, T., Takeda, S. Developmental changes in ciliary motility on choroid plexus epithelial cells during the perinatal period. Cytoskeleton. 70 (12), 797-803 (2013).
- Bisgrove, B. W., Yost, H. J. The roles of cilia in developmental disorders and disease. Development. 133 (21), 4131-4143 (2006).
- Fliegauf, M., Benzing, T., Omran, H. When cilia go bad: cilia defects and ciliopathies. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (11), 880-893 (2007).
- Oh, E. C., Katsanis, N. Cilia in vertebrate development and disease. Development. 139 (3), 443-448 (2012).
- Shah, A. S., Ben-Shahar, Y., Moninger, T. O., Kline, J. N., Welsh, M. J. Motile cilia of human airway epithelia are chemosensory. Science(New York, N.Y). 325 (5944), 1131-1134 (2009).
- Kiprilov, E. N., et al. Human embryonic stem cells in culture possess primary cilia with hedgehog signaling machinery). The Journal of Cell Biology. 180 (5), 897-904 (2008).
- Hirokawa, N., Tanaka, Y., Okada, Y., Takeda, S. Nodal flow and the generation of left-right asymmetry. Cell. 125 (1), 33-45 (2006).
- Narita, K., Kozuka-Hata, H., et al. Proteomic analysis of multiple primary cilia reveals a novel mode of ciliary development in mammals. Biology Open. 1 (8), 815-825 (2012).
- Takeda, S., Narita, K. Structure and function of vertebrate cilia, towards a new taxonomy. Differentiation; Research in Biological Diversity. 83 (2), S4-S11 (2012).
- Ikegami, K., Sato, S., Nakamura, K., Ostrowski, L. E., Setou, M. Tubulin polyglutamylation is essential for airway ciliary function through the regulation of beating asymmetry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (23), 10490-10495 (2010).
- Foster, K. W.
- Lechtreck, K. -F., Sanderson, M. J., Witman, G. B. High-speed digital imaging of ependymal cilia in the murine brain. Methods in Cell Biology. 91, 255-264 (2009).
- Okada, Y., Hirokawa, N. Observation of nodal cilia movement and measurement of nodal flow. Methods in Cell Biology. 91, 265-285 (2009).
- Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).
- Takeda, S., et al. Left-right asymmetry and kinesin superfamily protein KIF3A: new insights in determination of laterality and mesoderm induction by kif3A-/- mice analysis. The Journal of Cell Biology. 145 (4), 825-836 (1999).
- Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy. The Journal of Cell Biology. 27, 137-138A (1965).
