रंजित जाल उपकला कोशिकाओं के रोमक आंदोलन का अवलोकन Published: July 13, 2015 doi: 10.3791/52991

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Takafumi Inoue¹, Keishi Narita², Yuta Nonami¹, Hideki Nakamura¹, Sen Takeda²

¹Department of Life Science and Medical Bioscience, Faculty of Science and Engineering, Waseda University, ²Department of Anatomy and Cell Biology, Interdisciplinary Graduate School of Medicine & Engineering, University of Yamanashi

Protocol

प्रोटोकॉल और प्रायोगिक पशुओं के उपयोग के यामानाशी और Waseda विश्वविद्यालय के विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया। पशु की देखभाल संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया था।

1. CPEC तैयारी

1. निम्नलिखित apparatuses और सामग्री तैयार: नीचे से रोशनी प्रसारित करने में सक्षम अधिमानतः एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप,; घड़ीसाज़ संदंश की एक जोड़ी (ड्यूमॉन्ट # 3 या # 4), ज्योति निष्फल, सीधे ऑपरेटिंग कैंची, लौ निष्फल; 20 मिलीलीटर ठंडा लेबोविट्ज़ एल 15 मध्यम युक्त दो बाँझ 10 सेमी प्लास्टिक के बर्तन; 2 मिलीलीटर आरटी लेबोविट्ज़ एल 15 मध्यम युक्त 35 मिमी गिलास नीचे व्यंजन; 70% इथेनॉल युक्त 100 मिलीलीटर बीकर; नवजात माउस पिल्ले।
2. संक्षेप में 70% इथेनॉल में एक नवजात माउस विसर्जित और ऑपरेटिंग कैंची का उपयोग कत्ल करके जल्दी euthanize।
3. बाँझ 10 सेमी डि में ठंडा लेबोविट्ज़ एल 15 के माध्यम में तुरंत सिर जगहश।
4. मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए खोपड़ी को खोलने में कटौती, घड़ीसाज़ संदंश की जोड़ी का उपयोग calvaria से त्वचा निकालें, और फिर पूरे मस्तिष्क को अलग करने के कपाल नसों में कटौती।
5. ठंडा लेबोविट्ज़ एल 15 मध्यम युक्त एक नई डिश के लिए मस्तिष्क हस्तांतरण और मस्तिष्क पूरी तरह से मध्यम में डूब जाता है, यकीन है कि स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करते हैं।
6. सामना करना पड़ रहा मस्तिष्क के पृष्ठीय पहलू सेट, और घ्राण बल्ब (दाएं हाथ के व्यक्तियों के लिए) तीन बजे की स्थिति में रहते हैं तो यह है कि मस्तिष्क पूरबी। बाएं हाथ में संदंश के साथ धीरे मस्तिष्क पकड़ो।
7. ठीक विच्छेदन संदंश (ड्यूमॉन्ट # 3 या # 4) दाहिने हाथ में उपयोग करना है, मस्तिष्क के अनुदैर्ध्य विदर साथ, मस्तिष्क गोलार्द्धों जोड़ने महासंयोजिका और पैरेन्काइमा नीचे काटा।
8. धीरे दूर पार्श्व पक्षों के लिए मस्तिष्क गोलार्द्धों धक्का और अनुप्रस्थ मस्तिष्क विदर बेनकाब।
9. बाहर वें बन्द रखो द्वारा गोलार्द्धों अलगगोलार्द्ध और चेतक के बीच ई पैरेन्काइमा।
10. धीरे पटल affixa द्वारा हिप्पोकैम्पस के पार्श्व की ओर से जुड़ा हुआ है कि पार्श्व निलय रंजित जाल से बाहर खींच।
11. ताजा लेबोविट्ज़ एल 15 मध्यम युक्त 35 मिमी गिलास नीचे डिश के लिए पृथक रंजित जाल स्थानांतरण, और एक वजन (सामग्री की सूची) धीरे जगह में ऊतक धारण करने के लिए उपरिशायी।

CPEC पक्ष्माभिका का 2. लाइव इमेजिंग

1. 400 एनएम और अब से 700 समुद्री मील दूर है, और उस तटस्थ घनत्व (एनडी) फिल्टर (25% और 6%) की तुलना में कम प्रकाश प्रकाश पथ में डाला जाता है ब्लॉक करने के लिए उचित पराबैंगनी (यूवी) और अनुमानित (आईआर) कट फिल्टर (एस) की पुष्टि औंधा माइक्रोस्कोप की।
2. मोटे तौर पर आंखों से ऑब्जेक्टिव लेंस का फोकस समायोजित करें, और केंद्र और फोकस कोहलर रोशनी के अनुरूप करने के लिए इतना है कि तब कंडेनसर समायोजित करें। एक उपयुक्त अंतर हस्तक्षेप विपरीत डालें (डीआईसी) चश्मे, ली में एक डीआईसी तत्व है, साथ ही विश्लेषक और polarizer के तत्वोंght पथ डीआईसी प्रकाशिकी के अनुरूप करने के लिए।
3. ऊतक सतह की संरचना सबसे पहचानने इतना है कि डीआईसी चश्मे स्थिति से देखने के विपरीत समायोजित करें। लक्ष्य कोशिकाओं के सभी सिलिया गतिशील होते हैं, तो गतिशील सिलिया की एक स्पष्ट दृष्टिकोण की वजह से उनके आंदोलन की आंखों से प्राप्त नहीं किया जा सकता है।
4. वीडियो कैमरे के लिए प्रकाश पथ परिवर्तित करें, और प्रकाश की शक्ति को बढ़ाने के लिए एन डी फिल्टर हटा दें।
5. देखें और ध्यान केंद्रित करने के क्षेत्र को समायोजित करने के मोड ध्यान केंद्रित में कैमरा का उपयोग करें। जिसमें वीडियो चित्र मॉनीटर पर वास्तविक समय में प्रदर्शित कर रहे हैं, ध्यान केंद्रित के दौरान, गतिशील सिलिया की एक स्पष्ट दृष्टिकोण उपलब्ध नहीं है।
6. वांछित अवधि (सेकंड मिनट) के लिए 0.1 मिसे के एक जोखिम समय के साथ 200 हर्ट्ज पर कैमरे का उपयोग करें। छवि ढेर के अधिग्रहण के बाद, एकल फ्रेम स्पष्ट सिलिअरी संरचनाओं को प्रदर्शित करेगा। सिलिअरी किनारों धुंधला कर रहे हैं, फ्रेम दर में वृद्धि या एक कम जोखिम समय का उपयोग करें।
7. लेबोविट्ज़ में इच्छामृत्यु के बाद 25-60 मिनट के भीतर CPEC सिलिया की गति का रिकॉर्डएल 15 मध्यम।

रोमक मोशन 3. विश्लेषण

1. मैन्युअल रूप से कंप्यूटर मॉनीटर पर प्रत्येक पपनी के पैटर्न की धड़कन को ट्रैक। प्रत्येक पपनी की गति के बारे में जानकारी के लिए इकट्ठा कर रहे हैं, जो माउस सूचक के साथ प्रत्येक फ्रेम में मार्क सिलिअरी टिप पदों। या तो आगे के विश्लेषण के लिए अन्य अधिक सामान्य आवेदन करने के लिए एक ही सॉफ्टवेयर या निर्यात का उपयोग प्रक्षेपवक्र जानकारी का विश्लेषण। इस विश्लेषण के कदम की दक्षता चर्चा में वर्णित है।
2. आंखों से गति के दो तरीके, पीछे और आगे या घूर्णी में प्रक्षेप पथ वर्गीकृत।
3. निम्न सूत्र का उपयोग सिलिअरी पिटाई आवृत्ति (CBF) की गणना: [CBF = (फ्रेम प्रति सेकंड की संख्या) / (एक भी हरा के लिए फ्रेम की औसत संख्या)] एक सिलिअरी टिप गति आरेख से प्राप्त किया जा सकता है, जो ¹⁴ (चित्रा 3 )। एक ही सेल पर अन्य सिलिया प्रत्येक ciliu की गति के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, क्योंकि कई सिलिअरी पिटाई चक्र के लिए इस गणना को दोहराएँमी, अनियमितता में जिसके परिणामस्वरूप।
4. एक एकल कोशिका के भीतर कुल्हाड़ियों की धड़कन सिलिअरी की कोणीय एकरूपता का विश्लेषण करने के लिए, प्रत्येक प्रक्षेपवक्र (चित्रा 4) के लिए पिटाई कोण θ परिभाषित करते हैं। पीछे और आगे trajectories के लिए, एक सीधी रेखा को सिलिया टिप के पदों पर फिट है, और लाइन एक्स धुरी के साथ बनाता है कोण के रूप में θ परिभाषित करते हैं। बारी-बारी से trajectories के लिए, एक अंडाकार करने के पदों पर फिट है, और दीर्घवृत्त की प्रमुख धुरी एक्स धुरी के साथ बनाता है कोण के रूप में θ परिभाषित करते हैं। फिटिंग का विवरण प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में वर्णित हैं।
5. प्रत्येक प्रक्षेपवक्र की मात्रात्मक वर्णन के लिए, सामान्यीकृत पहलू अनुपात एआर गणना। संक्षेप में, द्वारा प्रक्षेपवक्र बारी बारी से - θ और एक्स-साथ वितरण की चौड़ाई के बीच अनुपात के रूप में एआर परिभाषित - और y -axes (4B चित्रा)। विवरण प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में दिखाया गया है, और व्याख्या कर रहे हैं, महत्व, और पैरामीटर की सीमा चर्चा में वर्णित हैं।

SEM के लिए 4. नमूना तैयार

नोट: SEM के लिए एक व्यापक तरीके से CPECs पर सिलिया की स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका है। SEM के लिए नमूनों को तैयार करने के लिए, एक मानक प्रक्रिया पहले से ¹⁵ मामूली संशोधनों के साथ कार्यरत है की सूचना दी।

1. मस्तिष्क से ऊतक विदारक से पहले, एक पॉलीथीन टोपी के साथ एक 5 मिलीलीटर कांच की शीशी में लगानेवाला तैयार करते हैं। लगानेवाला 2% paraformaldehyde, 0.1 एम फॉस्फेट बफर, पीएच 7.4 में 2.5% glutaraldehyde (आधा Karnovsky का समाधान ¹⁶⁾ के होते हैं।
2. चरण 1 में वर्णित के रूप में मस्तिष्क से ऊतक काटना।
3. संक्षेप में एक नई डिश में हांक संतुलित नमक समाधान (HbSS) के साथ अलग ऊतक कुल्ला और फिर कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए कांच की शीशी में लगानेवाला में ऊतक तय कर लो। डिस्पोजेबल हस्तांतरण pipettes का उपयोग और नमूनों जीई संभालntly। HBSS में rinsing के बाद, ऊतक चिपचिपा हो जाता है।
   1. लगानेवाला समाधान में नमूनों को हस्तांतरण करने के लिए, धीरे धीरे एक छोटी बूंद के रूप में स्थानांतरण पिपेट से ऊतक युक्त समाधान की एक छोटी राशि निष्कासित और लगानेवाला में जोड़ें।
4. निर्धारण के बाद, लगानेवाला त्यागने और फॉस्फेट बफर तीन बार के साथ ऊतक कुल्ला।
5. शेष एल्डीहाइड बाहर धोने के लिए एक 10% sucrose के समाधान में ऊतक विसर्जित कर दिया। , एल्डीहाइड के पूर्ण उन्मूलन सुनिश्चित 10 मिनट के लिए समाधान में नमूने विसर्जित और फिर नए सिरे से 10% sucrose के साथ दो बार दोहराने के लिए। इस कदम के बाद के चरणों में उचित पद के निर्धारण को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है।
6. 30 मिनट के लिए फॉस्फेट बफर में 1% आज़मियम tetroxide के समाधान में ऊतक को विसर्जित कर दिया और फिर बाद के निर्धारण के लिए बर्फ पर जगह है। नमूना रंग से osmification की डिग्री जज: एल्डीहाइड पूरी तरह से हटा रहे हैं, नमूना काला है।
7. डबल डिस्टीलियरीज के साथ बड़े पैमाने के बाद तय ऊतकों के नमूनों धो लेंडी पानी में कई बार।
8. इथेनॉल के वर्गीकृत सांद्रता में विसर्जन से नमूने निर्जलीकरण, आमतौर पर 65%, 75%, 85%, 95%, 99%, और 100%, 10 मिनट प्रत्येक के लिए। एक नए खरीदे बोतल से 99.5% इथेनॉल में आणविक चलनी रखकर निर्जल इथेनॉल प्राप्त करते हैं। निर्जल इथेनॉल तीन बार के साथ निर्जलीकरण को दोहराएँ।
9. 10 मिनट के लिए, isoamyl एसीटेट, महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने के लिए एक प्रतिस्थापन अभिकर्मक में निर्जलित नमूने रखें। दो बार इस चरण को दोहराएँ। यह अभिकर्मक तेजी से वाष्पित हो और नमूना की सतह तनाव से विनाश में जिसके परिणामस्वरूप, शुष्क बन सकता है। इसलिए, पूरी तरह से नमूना सूखी नहीं है।
10. Isoamyl एसीटेट के अंतिम विनिमय के बाद, तुरंत, विलायक से अधिकांश को दूर एल्यूमीनियम पन्नी के साथ खुले कांच की शीशी को कपड़े में लपेटकर, और सूखी बर्फ पर शीशी जगह है। तरल कार्बन डाइऑक्साइड महत्वपूर्ण बिंदु ड्रायर में शीशी में आसानी से बहती है तो एक सुई या ठीक संदंश का प्रयोग, शीशी के मुंह को कवर पन्नी में कई छेद करते हैं। अगले कदम के लिए आगे बढ़ेंजितना जल्दी हो सके।
11. इस चरण में, ड्रायर के चेंबर में isoamyl एसीटेट का भार कम से कम, लेकिन नमूना पूरी तरह से महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने से पहले बाहर सूखा नहीं है। इसके अलावा, शीशी पर ठंढ के गठन से बचने के लिए एक अनावश्यक रूप से लंबे समय के लिए सूखी बर्फ पर नमूना मत छोड़ो।
12. हटाने के पानी के ऊतकों में निहित है, जबकि ऊतक की सतह की संरचना बरकरार सुनिश्चित करता है कि महत्वपूर्ण बिंदु ड्रायर में ऊतकों के नमूनों युक्त पन्नी लिपटे कांच की शीशियों स्थानांतरण। महत्वपूर्ण बिंदु ड्रायर के संचालन के बारे में विस्तृत जानकारी के निर्माता के निर्देशों से प्राप्त किया जा सकता है।
13. ध्यान से यांत्रिक क्षति को कम करने के लिए एक दन्तखुदनी का उपयोग कर नमूने संभाल लेना। जिसके परिणामस्वरूप सूख ऊतकों के नमूनों कमजोर कर रहे हैं। एक आयन धूम का उपयोग कर सोने पैलेडियम के साथ धातु स्टब्स और कोट पर नमूने माउंट।

SEM के द्वारा 5. अवलोकन

1. SEM के द्वारा निरीक्षण और एक डिजिटल कैमरा के साथ छवियों को रिकार्डस्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के लिए सुसज्जित।
2. विश्लेषण के लिए एक पीसी के लिए डिजिटल छवि डेटा स्थानांतरण।

Representative Results

कार्यप्रवाह का एक सिंहावलोकन उपकरणों की छवियों सहित, चित्र 1 में दिखाया गया है।

CPECs की ताज़ा प्रस्ताव टिप्पणियों

मूवी 1 एक प्रसवकालीन माउस से अलग CPECs की एक फिल्म से पता चलता है, और मूवी 2 1 मूवी में छवियों की एक विस्तारित दृश्य दिखाता है। यह व्यक्ति सिलिअरी सुझावों फिल्मों में उन लोगों के साथ तुलना में अभी भी चित्र में कम स्पष्ट कर रहे हैं कि ध्यान दिया जाना चाहिए। 2 से पता चलता है सिनेमा 1 और 2 में दिखाया गया डेटा से आंदोलन के विभिन्न तरीकों, पीछे और आगे और बारी-बारी से आंदोलनों के साथ दो सिलिया की गति की ट्रैकिंग। 3 चित्रा सिलिया के trajectories का एक सरल विश्लेषण से पता चलता है जो अंतर चरण में दो निर्देशांक में घूर्णी आंदोलन में स्पष्ट है।

CPEC सिलिअरी टिप trajectories के विश्लेषण

डे मात्रात्मक प्रत्येक प्रक्षेपवक्र का विश्लेषण करने की पूंछ के तरीकों पिटाई कोण θ परिभाषाओं (ए) और प्रतिनिधि परिणाम (बी) के साथ विश्लेषण का प्रवाह चार्ट के योजनाबद्ध चित्र के साथ 4 चित्र में दिखाए जाते हैं।

, पीछे और आगे trajectories के लिए पिटाई कोण θ को परिभाषित एक सीधी रेखा Y = कुल्हाड़ी + बी करने के लिए कई चक्र के दौरान रोमक टिप के पदों पर फिट है, और फिट रेखा के साथ उस के रूप में पिटाई दिशा को परिभाषित करने के लिए। Θ एक आर्क तन = के रूप में यहाँ पिटाई कोण को परिभाषित करें। अक्सर ढाले लाइन, घूर्णी आंदोलन के मामलों में दिशा निकालने के लिए एक अंडाकार करने के लिए बारी-बारी से प्रक्षेप पथ से फिट है, और सज्जित दीर्घवृत्त की लंबी अक्ष के साथ उस के रूप में दिशा को परिभाषित करने में विफल रहता है। अधिक संक्षेप में, कई पिटाई चक्र के दौरान टिप पदों (एक्स, वाई) के नीचे समारोह के लिए फिट हैं।
1.jpg "चौड़ाई =" 310 "/>

जहाँ

एक्स _0, वाई _0, ए, बी, और θ: अंडाकार फिटिंग पांच फिटिंग पैरामीटर शामिल है। एक्स - और अंडाकार के केंद्र के y -spatial निर्देशांक क्रमशः, एक्स ₀ और y ₀ कर रहे हैं। दीर्घवृत्त की बड़ी और छोटी त्रिज्या क्रमश: ए और बी कर रहे हैं। कोण θ प्रमुख धुरी एक्स धुरी, या पिटाई कोण के साथ आता है कि कोण है। इन मानकों में से एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्रा -4 ए की सही पैनल में दिखाया गया है। फिटिंग ऊपर वर्णित स्पष्ट समारोह को परिभाषित द्वारा इगोर प्रो सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जाता है। फिर, सब सिलिया के लिए कोण θ पिटाई की एक हिस्टोग्राम का निरीक्षणएक ही सेल में डी (नारिता एट अल में चित्रा 2। ⁸⁾ एक परिपत्र हिस्टोग्राम के रूप में साजिश रची है। आवृत्ति विश्लेषण किया सिलिअरी सुझावों की संख्या सामान्यीकृत है। यह प्रत्येक पपनी, परिपत्र हिस्टोग्राम में दो θ मूल्यों है व्याख्या की है कि ध्यान दिया जाना चाहिए जैसे π / 4 और / 4 3π, दिशा के सममित वितरण के लिए अग्रणी।

Θ (चित्रा 4 बी) - सामान्यीकृत पहलू अनुपात एआर को परिभाषित करने के लिए, कई चक्र के दौरान रोमक टिप के पदों से घुमाया जाता है। रोटेशन के अनुसार, पीछे और आगे और बन घूर्णी trajectories के दोनों एक्स धुरी, एक्स और वाई axes साथ वितरण ए और बी की चौड़ाई, क्रमशः के आधे के रूप में परिभाषित कर रहे हैं, जिसमें समानांतर लगभग वितरित न्यूनतम और अधिकतम के बीच का अंतर। इसलिए, इन मापदंडों अंडाकार, ए और बी की बड़ी और छोटी त्रिज्या से अधिक प्रासंगिक हो। एआर तो एआर = बी / ए से एक के बीच का अनुपात और बी के रूप में परिभाषित किया गया है।

SEM के द्वारा रंजित जाल उपकला की टिप्पणियों

SEM के नमूनों के ठीक सतह की संरचना का अवलोकन की अनुमति देता है। CPECs पर सिलिया की उपस्थिति विकास समय पाठ्यक्रम में पुष्टि की है। CPECs पर कई सिलिया के उद्भव रंजित जाल विकास E11 के आसपास पार्श्व निलय में शुरू होता है के बाद शीघ्र ही, भ्रूण दिन (ई) 13 से मनाया जाता है। इस स्तर पर, कोशिकाओं एक चर अपरिपक्व उपस्थिति के साथ छोटे हैं, और रोमक सुझावों विभिन्न दिशाओं की ओर इशारा कर रहे हैं। E15, कई सिलिया का एक गुच्छा आसपास के माइक्रोविली से बाहर खड़ा कर रहे हैं, जो शिखर सतह के शीर्ष पर स्थापित है। प्रसव के बाद दिन (पी) 2, कई सिलिया रहते इमेजिंग द्वारा मनाया सिलिअरी गतिशीलता को दर्शाती है, एक तुला स्थिति पर तय कर रहे हैं। P14 पर, सबसे कोशिकाएं कई गैर गतिशील होते हैं कि सिलिया के साथ-साथ माइक्रोविली डब्ल्यू अधिकारी ith पहले चरण के साथ तुलना में एक बेहतर बनावट। 5 इन चरणों में सिलिया के साथ CPECs के SEM छवियों से पता चलता है। चित्रा 1 और 1 मूवी में दिखाया फिल्में के आधार पर यह गतिशील सिलिया आसानी से रहते इमेजिंग द्वारा मान्यता प्राप्त हैं कि स्पष्ट है। हालांकि, यह डीआईसी माइक्रोस्कोपी द्वारा गैर गतिशील सिलिया भेद करना मुश्किल है। नतीजतन, SEM के समग्र सिलिअरी राज्यों को समझने के लिए अपरिहार्य है।

चित्रा 1:। कार्यप्रवाह का अवलोकन (क) स्टीरियो माइक्रोस्कोप। एक आरोप युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरा से सुसज्जित (ख) औंधा माइक्रोस्कोप। विश्लेषण के दौरान (ग) कंप्यूटर स्क्रीन। (घ) आयन धूम। SEM के लिए (ई) नमूना। (च) स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप।

मूवी 1।pload / 52,991 / Figure_2.mov "लक्ष्य =" _blank "> CPECs के शीर्ष दृश्य और उच्च गति वीडियो माइक्रोस्कोपी में एक p2 माउस पिल्ला से सिलिया की मूवी। रंजित जाल ऊतक के अनियमित सतह का, इस स्नैपशॉट होता है क्योंकि । दोनों में फोकस और बाहर का ध्यान केंद्रित विमानों बॉक्स में क्षेत्र का विस्तार किया है और फिल्म 2 स्केल बार में दिखाया गया है। 2 माइक्रोन।

मूवी 2. 1 मूवी। में ऊतक के नमूने की विस्तृत दृश्य की मूवी सिलिया बैरंग बारी-बारी से या पीछे और आगे या तो आंदोलनों दिखाया। स्केल बार: 1 माइक्रोन।

चित्रा 2:। पीछे और आगे आंदोलन (ऊपर) और घूर्णी आंदोलन (नीचे) के साथ मूवी 2 में समय चूक छवियों से CPEC सिलिया की गति के पुनर्गठन (ए) Cilia। डीआईसी फिल्म डेटा से छवियों 50 मिसे के अंतराल (1 माइक्रोन 1-8, पैमाने पर पट्टी) पर प्रस्तुत कर रहे हैं। लक्ष्य सिलिअरी टिप की स्थिति एक नोक ने संकेत दिया है। (बी) के प्रक्षेप पथ (टूटी हुई लाइन) और छवियों में दिखाया गया सिलिअरी युक्तियाँ (रंग हलकों) के पदों पर मढ़ा जाता है।

चित्रा 3:। फिल्म डेटा से पुनर्गठित CPEC सिलिअरी टिप आंदोलन के दो तरीके कई चक्र से अधिक प्रतिनिधि सिलिअरी टिप आंदोलनों, पीछे और आगे आंदोलन (ए) और घूर्णी आंदोलन (बी), प्रक्षेप पथ (ऊपर, पैमाने सलाखों के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं: 0.5 माइक्रोन)। X- और टिप स्थिति के वाई-निर्देशांक के समय पाठ्यक्रम, क्रमशः (मध्य) प्लॉट किए जाते हैं। दो निर्देशांक के बीच एक चरण पारी का प्रदर्शन करने के लिए, एक्स और वाई निर्देशांक [-1,1] के लिए सामान्यीकृत थे और (क्रमशः, लाल और नीले रंग की लाइनों के नीचे) मढ़ा।

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चित्रा 4: सिलिअरी टिप trajectories के विश्लेषण का वर्णन योजनाबद्ध चित्र पीछे और आगे (बाएं पैनल) और बारी-बारी से (सही पैनल) trajectories के लिए पिटाई कोण θ (ए) परिभाषाएं।। सज्जित अंडाकार, ए, बी, एक्स _0, और y ₀ का वर्णन सूत्र में पैरामीटर, सही पैनल में दिखाया जाता है। (बी) की धड़कन कोण θ और ए.आर. परिभाषित करने के लिए trajectories के फिटिंग के विश्लेषण के चार्ट प्रवाह। प्रतिनिधि trajectories के फिटिंग के वास्तविक परिणाम सही पैनल में प्रस्तुत कर रहे हैं।

चित्रा 5: सिलिया की SEM छवि। E13, E15, P2, और P14 पर CPECs के प्रतिनिधि SEM के micrographs। समय के पाठ्यक्रम के दौरान, CPECs आकार में वृद्धि हुई है, और microvi विकसितLLI और शिखर सतह पर सिलिया। E13 पर सिलिया का एक गुच्छा गतिशीलता हासिल करने के लिए अभी तक है। गतिशीलता के साथ सिलिया के अनुपात उच्चतम बिंदु पर पहुंच गया जब p2, पर, कई तुला सिलिया मनाया जाता है। P14 पर, सिलिया गतिशीलता खो देते हैं। स्केल बार: 5 माइक्रोन।

Discussion

इस विधि के परिप्रेक्ष्य

यहाँ वर्णित तकनीक पहले प्रकाशित तरीकों की तुलना में सिलिया के एक अधिक विस्तृत विश्लेषण प्रदान नहीं करता है, इस तकनीक के महत्व को आसानी से सिलिअरी गतिशीलता पूर्व vivo किसी भी तरह की स्क्रीनिंग के लिए लागू किया जा सकता है, जो प्रणाली और लागत प्रभावशीलता, की सादगी में रहता है। विशेष रूप से, तिवारी कार्यक्षेत्र का पालन और अधिक आसानी से सिलिअरी गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए शोधकर्ताओं सक्षम बनाता है एक सरल और उपयोगकर्ता के अनुकूल इंटरफेस प्रदान करता है। प्रभावी स्वचालित ट्रैकिंग तरीकों जैसे वीडियो-बढ़ाया विपरीत डीआईसी में बेदाग सिलिया के रूप में कम विपरीत वस्तुओं के लिए विकसित नहीं किया गया है। सिलिअरी गति को ट्रैक करने की विधि का मार्गदर्शन इस तकनीक में है, सिलिअरी प्रस्ताव पर नज़र रखने के विश्लेषण में प्रयास की राशि बेहतर छवि विश्लेषण के लिए सामान्य प्रयोजन सॉफ्टवेयर संकुल का उपयोग के साथ तुलना में कम है।

नमूना विच्छेदन

ई तैयार करने के लिएएक्स विवो CPEC नमूने, तेजी से और कोमल जोड़तोड़ सिलिया पूर्व vivo की गतिशीलता जो यह सुनिश्चित करता ऊतकों की व्यवहार्यता को बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं। एरिथ्रोसाइट्स द्वारा संदूषण अवलोकन के क्षेत्र blurs क्योंकि, फॉस्फेट बफर खारा साथ विच्छेदित ऊतक के कोमल, लेकिन जटिल rinsing के पुरजोर सिफारिश की है। खून बह रहा से बचने के लिए, देखभाल कोलाइड जाल की affixa लामिना का पालन एक प्रमुख लाल धागे जैसी संरचना के रूप में पहचाना जा सकता है कि पीछे रंजित धमनी फाड़ से बचने के लिए प्रयोग किया जाना चाहिए।

माइक्रोस्कोप

डीआईसी प्रकाशिकी और एक उच्च विद्युत पारेषण प्रकाश स्रोत के साथ सुसज्जित एक औंधा माइक्रोस्कोप इस विधि के लिए आवश्यक है। पारा दीपक आमतौर पर अक्सर चालू और बंद करने में असमर्थ होते हैं, क्योंकि दीपक आवास के सामने एक शटर आवश्यक है। या तो एक मैनुअल या बिजली के शटर इस उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। नमूनों और पर्यवेक्षक की आँखों fr रक्षा करने के लिएओम यूवी और IR प्रकाश, ऑप्टिकल फिल्टर केवल दृश्य प्रकाश (400-700 बैंड पास या यूवी और IR कट फिल्टर का एक संयोजन) की अनुमति देने के लिए आवश्यक हैं। एक वीडियो कैमरा, और उच्च गति समय चूक रिकॉर्डिंग के साथ ध्यान केंद्रित है, आंखों से निगरानी: एन डी फिल्टर भी स्थिति के अनुसार अलग है कि प्रकाश की शक्ति को बदलने के लिए जरूरी हैं। एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक उद्देश्य लेंस एक उच्च संकल्प के लिए आवश्यक है। Coverslip के ऊपर और क्योंकि ऊतक की आकृति विज्ञान और मोटाई का केन्द्र बिन्दु के बीच कुछ दूरी है। इसलिए, एक पानी विसर्जन लेंस के बजाय एक तेल विसर्जन लेंस बेहतर छवि गुणवत्ता के लिए पसंद किया जाता है। कंपन अलगाव स्थिर छवि के ढेर उपज के लिए भी आवश्यक है। एयर डम्पर-प्रकार टेबल इस उद्देश्य के लिए उपयोगी होते हैं, लेकिन यह भी काम कर सकते हैं एक स्थिर तालिका के साथ माइक्रोस्कोप बेस के नीचे टेनिस गेंदों डालने से माइक्रोस्कोप के सरल cushioning के।

वीडियो कैमरा

घास का मैदान में करने में सक्षम एक सीसीडी कैमरासेंट 200 फ्रेम / सेक सिलिया के आंदोलन को ट्रैक करने के लिए आवश्यक है। पिछले एक दशक के दौरान, मानक वीडियो दर (25-30 हर्ट्ज) की तुलना में तेजी फ्रेम दर के साथ सीसीडी कैमरों में बहुत कम लागत उपलब्ध हो गए हैं। फ्रेम अंतराल से अधिक का पर्दाफाश कम समय में सक्षम कैमरा मॉडल डेटा की मात्रा में वृद्धि के बिना सिलिया के आंदोलन की वजह से धुंधला कम करने के लिए उपयोगी होते हैं। 0.1 मिसे के एक जोखिम समय और एक 5 मिसे फ्रेम अंतराल (200 हर्ट्ज) पर्याप्त गुणवत्ता के साथ CPECs की सिलिअरी छवियों को प्राप्त करने के लिए न्यूनतम शर्तों रहे हैं।

सॉफ्टवेयर

प्रत्येक पपनी की गति को ट्रैक करने के लिए विश्लेषण छवि विश्लेषण के लिए सामान्य प्रयोजन सॉफ्टवेयर संकुल प्रत्येक सिलिअरी टिप ट्रैक करने के लिए उपयोग किया जाता है, खासकर जब समय लगता है। , इस तरह के मॉनीटर पर सिलिअरी टिप स्थिति पर माउस क्लिक करने के रूप में दोहराया कार्यों के इस कदम को कम क्लिक किया स्थिति को रिकॉर्ड करने के लिए एक मेनू का चयन, और एक बटन पर क्लिक करके, अगले छवि फ्रेम करने के लिए एक महत्वपूर्ण पुनः में परिणाम स्थानांतरित करने के लिएसमय और प्रयास की duction। इस अध्ययन में, एक विशेष दिनचर्या कस्टम बनाया तिवारी कार्यक्षेत्र सॉफ्टवेयर करने के लिए जोड़ा गया है। तिवारी कार्यक्षेत्र सॉफ्टवेयर की सिलिअरी पर नज़र रखने के मोड में, उपयोगकर्ता निम्न साधारण दो कदम आपरेशन पाशन रहता है: चलती आवश्यकता नहीं है फ्रेम, जो अग्रिम करने के लिए सिलिअरी टिप करने के लिए माउस सूचक चलती है और कीबोर्ड पर एक तीर कुंजी दबाने माउस सूचक या उपयोगकर्ता की आँखों कंप्यूटर स्क्रीन पर सिलिअरी सुझावों से (कंप्यूटर स्क्रीन पर मेनू और बटन के लिए) शिफ्ट करने के लिए। सॉफ्टवेयर, रोमक टिप पदों का ट्रैक रखता है उपयोगकर्ता की सहायता करने के लिए रिकॉर्ड प्रक्षेपवक्र को प्रदर्शित करता है, और आगे के विश्लेषण के लिए सिलिअरी गति जानकारी की एक तालिका बनाता है। छवि विश्लेषण के लिए सबसे सामान्य प्रयोजन सॉफ्टवेयर ऐसी दोहराया कार्यों के बैच प्रोसेसिंग के लिए programing के मैक्रो को परमिट। दोहराया चरणों कम करने के लिए इस तरह के कस्टम programing के पुरजोर सिफारिश की है।

Trajectories के विश्लेषण

Trajectori का निष्कर्षणजैसा कि ऊपर वर्णित तों, कस्टम निर्मित तिवारी कार्यक्षेत्र सॉफ्टवेयर का उपयोग कर बाहर किया गया था। अपेक्षाकृत सरल विश्लेषण और छवि प्रसंस्करण भी एक ही सॉफ्टवेयर का उपयोग किया गया था। फिटिंग विश्लेषण के लिए, प्रत्येक सिलिअरी टिप की गति इगोर प्रो सॉफ्टवेयर करने के लिए स्थानांतरित किया गया था। ऐसे में MATLAB के रूप में अन्य उन्नत विश्लेषण सॉफ्टवेयर भी इस उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

वर्तमान अध्ययन में, पीछे और आगे या घूर्णी प्रक्षेप पथ में प्रक्षेप पथ categorizing में कठिनाइयों की वजह से, trajectories के अनुरूप वर्गीकरण, जिसके परिणामस्वरूप एक और पर्यवेक्षक द्वारा पुष्टि की गई है, जो एक अंधा फैशन में आंखों से वर्गीकृत किया गया। फिर भी, किसी भी संभव मनमानापन बिना प्रक्षेप पथ वर्गीकृत करने के लिए और अधिक गणितीय कठोर उपायों को बेहतर होगा। Trajectories के फिटिंग पीछे और आगे और घूर्णी आंदोलनों दोनों में लगे दीर्घवृत्त () के पहलू अनुपात के रूप में दीर्घवृत्तता की हद तक यों सकता है, जो आदर्श प्रतीत होता है अंडाकार। लेकिनवर्गीकरण के लिए एक मूल्य सीमा को परिभाषित करने के पहलू अनुपात के वितरण का उपयोग करने का एक प्रयास अप्रभावी था। अक्सर पीछे और आगे trajectories के लिए विफल फिटिंग, मापदंडों अक्सर एकाग्र करने में विफल रहा है, और जुटे फिटिंग जाहिरा तौर पर बाजीगर था। इसलिए, अंडाकार फिटिंग स्वचालित रूप से प्रक्षेप पथ को वर्गीकृत या प्रत्येक प्रक्षेपवक्र की दीर्घवृत्तता यों को नहीं अपनाया गया था। फिटिंग सज्जित दीर्घवृत्त की प्रमुख धुरी के रूप में rotationally चलती सुझावों की पिटाई दिशा निकालने के लिए बाहर किया गया था।

वर्तमान अध्ययन में, एआर एक प्रक्षेपवक्र एक आदर्श रैखिक पीछे और आगे गति से भटक हद तक है कि यों के लिए प्रस्तावित किया गया था। पैरामीटर सीधा दिशा के साथ करने के लिए कि पिटाई दिशा करने के लिए वितरण की चौड़ाई का अनुपात है। प्रक्षेपवक्र ऊपर उल्लेख किया दीर्घवृत्त का पहलू अनुपात जैसी एक चक्र है जब प्रक्षेपवक्र एक एक सीधी रेखा है, और जब मूल्य शून्य होना चाहिए।

पिटाई दिशा एक्स धुरी (चित्रा 4 बी) के समानांतर हो जाता है इतना है कि अभ्यास में, एआर मूल्य प्राप्त करने, प्रक्षेपवक्र घूर्णन द्वारा अपेक्षाकृत आसान हो सकता है। यह मात्रा का ठहराव पैरामीटर की क्षमता का उपयोग प्रत्येक प्रक्षेपवक्र की विशेषताओं यों, लेकिन यह भी अधिक कड़ाई से प्रक्षेप पथ वर्गीकृत करने के लिए न केवल सुझाव दे, गति की दो मोड के लिए काफी अलग मूल्यों की ओर जाता है। हालांकि, यह पिटाई दिशा ही पहले से ही वर्तमान पद्धति में दो मोड के लिए अलग फिटिंग प्रक्रियाओं का परिणाम है कि ध्यान दिया जाना चाहिए।

विश्लेषण के आगे सुधार, इस तरह के एक और अधिक उन्नत फिटिंग कलन विधि के रूप में संभव है, मनमानापन की समस्याओं का समाधान हो सकता है।

प्रक्षेपवक्र की दीर्घवृत्तता के बारे में एक पहलू प्रत्येक CPEC पपनी की पिटाई एक्स के लिए सख्ती से सीधा है कि विमान में जगह लेने नहीं किया जा सकता है - Y

SEM के लिए तैयारी

SEM के अवलोकन के लिए तैयार करने के दौरान, उच्च गुणवत्ता के चित्र के अधिग्रहण सुनिश्चित करना है कि कई महत्वपूर्ण अंक हैं। सबसे पहले, आज़मियम tetroxide द्वारा पोस्ट-निर्धारण एक 10% sucrose के समाधान के साथ पूर्व धोने सहित, सावधानी से किया जाना चाहिए। Osmification प्रक्रिया द्वारा उचित निर्धारण के बिना, बाद के चरणों तैयारी का एक कम गुणवत्ता के लिए अग्रणी बनाए रखने या नमूनों की हालत बहाल नहीं कर सकते। एल्डिहाइड fixatives के एजेंटों को कम कर रहे हैं, नमूना के भीतर किसी भी शेष एल्डीहाइड आज़मियम tetroxide, एक मजबूत ऑक्सीकरण अभिकर्मक की गतिविधि को बाधित। नमूनों में ज़रूरत से ज़्यादा एल्डीहाइड के उन्मूलन सुनिश्चित करने के लिए, sucrose के समाधान के साथ सावधान धोने के लिए आवश्यक है। उपअनुकूलित पुलिस के मामलों मेंसेंट-निर्धारण, नमूना के रंग ब्राउन से काला करने के लिए बदल नहीं है। दूसरा, आज़मियम tetroxide की मात्रा कम से कम नमूना की तुलना में बड़ा 50 गुना होना चाहिए। अन्यथा, पर्याप्त निर्धारण की उम्मीद नहीं की जा सकती। तीसरा, यह विशेष रूप से अत्यधिक शुद्ध इथेनॉल और isoamyl एसीटेट कार्यरत हैं कि निर्जलीकरण की प्रक्रिया के दौरान, नमूनों की पूरी सुखाने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। नमूना के सूखने गरीब छवियों में जिसके परिणामस्वरूप, इस तरह के सिलिया के रूप में ठीक सतह संरचनाओं नष्ट कर देता है।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Required reagents
for live cell imaging
ethanol	Wako Chemicals	057-00456
Leibovitz L-15 medium	Life Technologies	11415-064
for SEM preparation
ethanol	Wako Chemicals	057-00456
Hank's balanced salt solution	Life Technologies	14170112
paraformaldehyde	Merck	1040051000
glutaraldehyde	Nacalai tesque	17003-05
isoamyl acetate	Nacalai tesque	02710-95
Molecular Sieves 4A 1/8	Wako Chemicals	130-08655	for preparation of anhydrous ethanol
phosphate buffer saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408
phosphate buffer, 0.1 M			To make 100 ml, mix 19.0 ml of 0.1 M NaH2PO4 and 81.0 ml of 0.1 M Na2HPO4
monosodium phosphate (dihydrate)	Nacalai tesque	31718-15
disodium phosphate (anhydrous)	Nacalai tesque	31801-05
suclose	Nacalai tesque	30406-25
osmium tetroxide	Nisshin EM	300
dry ice

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tools and materials for dissection
for both live imaging and SEM preparation
stereo microscope	Olympus	SZX7
flat paper towel
Φ10 cm plastic dish
100 ml beaker
straight operating scissors	Sansyo	S-2B
watchmaker forceps	Dumont	No.DU-3 or -4, INOX
for live cell imaging
glass bottom dish	Matsunami Glass	D110300
for SEM preparation
alminum foil
5 ml glass vial with a polyethylene cap	Nichiden Rika-Glass	PS-5A
transfer pipette	Samco Scientific	SM251-1S	for specimen tranfer
toothpick			for specimen transfer
ion sputter with gold-palladium	Hitachi	E-1030
critical point dryer	Hitachi	HCP-2

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopic equipment and materials
for live cell imaging
inverted microscope	Olympus	IX81
100 W mercury lump housing and power supply	Olympus	U-ULH and BH2-RFL-T3
100 W mercury lamp	Ushio	USH103D
DIC condenser, n.a. 0.55	Olympus	IX-LWUCD
electrrical shutter	Vincent Associates	VS35S22M1R3-24 and VMM-D1	manual shutter can be used.
band-pass filter (400-700 nm, Φ45 mm)	Koshin Kagaku	C10-110621-1
ND filter (Φ45 mm)	Olympus	45ND6, 45ND25	combination of 25% and 6% ND filters are used
objective lens (water immersion) with DIC element	Olympus	UApo 40XW/340, n.a., 1.15 with IX-DPAO40
high-speed video camera	Allied Vision Technologies	GE680	≥200 Hz frame rate and 1 msec expose time
image acquisition / analysis software	in-hous software	TI Workbench	capable of acquisition at high frame rates.
PC for camera control / analysis	Apple	Mac Pro
vibration isolation table	Meiritsu Seiki	AD0806
weight for tissue	Warner Instruments	slice anchor kits	It can be made with nylon mesh glued to a U-shape squashed Φ0.5 mm platinum wire.
cover glass (alternative weight for tissue)	Matsunami	made-to-order	A cover glass can be used as a tissue weight.
for SEM
inverted microscope	Olympus	IX81
scanning electron microscope	JEOL	JSM-6510