Protocol
protokoller ve Deney hayvanlarının kullanımı Yamanashi ve Waseda Üniversitesi Üniversitesi'nde kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komiteleri tarafından onaylandı. Hayvan bakımı, kurumsal prensiplere uygun olarak gerçekleştirildi.
1. CPEC Hazırlık
- Aşağıdaki cihazlar ve malzemeleri hazırlayın: alttan aydınlatma iletilmesi tercihen bir stereo mikroskop; saatçi forseps bir çift (Dumont # 3 ya da # 4), alev sterilize düz işletim makas, alev sterilize; 20 ml buz gibi soğuk Leibovitz L-15 ihtiva eden ortam, iki steril 10 cm'lik plastik tabaklar; 2 ml RT Leibovitz L-15 orta içeren 35 mm cam alt yemekler; % 70 etanol içeren 100 ml'lik bir beher; yenidoğan fare yavrular.
- Kısaca% 70 etanol içinde bir yenidoğan fare batırmak ve işletim makas kullanarak kafaları kesilmek suretiyle hızla euthanize.
- Steril 10 cm di buz Leibovitz L-15 orta derhal baş koyunsh.
- Beyin maruz kafatası açmak kesip, saatçi forseps çifti kullanarak calvaria cildi çıkarın ve ardından tüm beyni izole etmek için kranial sinirler kesilir.
- Buz soğukluğunda Leibovitz L-15 ortamı içeren yeni bir çanak beyin aktarın ve beyin tam ortam içinde daldırılır emin, stereo bir mikroskop altında dikkate alınmalıdır.
- Yukarı bakacak şekilde beynin dorsal yönünü ayarlayın ve koku ampuller (sağ-elli kişilik) 03:00 konumundaki ikamet böylece beyin yönlendirmek. Sol elinde forseps ile yavaşça beyin tutun.
- İnce diseksiyon forseps (Dumont # 3 ya da # 4) sağ elinde kullanarak, beyin uzunlamasına fissür boyunca, serebral hemisfer bağlayan korpus kallosum ve parankiminde altında kesti.
- Nazikçe yan taraflarına serebral hemisferlerin itin ve enine serebral fissür maruz kalmaktadır.
- Th dışarı kısma hemisferlerin ayırınhemisfer ve talamus arasındaki e parankim.
- Yavaşça lamina affixa ile hipokampus yan tarafına bağlı olduğu yanal ventriküler koroid pleksus çekin.
- Taze Leibovitz L-15 orta içeren 35 mm cam alt çanak izole koroid pleksus aktarın ve ağırlığı (Malzeme Listesi) yavaşça yerine doku tutun kaplaması.
CPEC Cilia 2. Canlı Görüntüleme
- 400 nm ve daha uzun 700 nm ve bu nötr yoğunluk (ND) filtreleri (% 25 ve% 6) daha kısa ışık ışık yolu eklenir engellemek için uygun ultraviyole (UV) ve anlaşıldığı (IR) kesim filtresi (ler) Onay ters mikroskop.
- Kabaca gözle objektif lens odağını ayarlayın ve merkez ve odak Köhler aydınlatma uyacak, böylece daha sonra yoğuşturucuyu ayarlayın. Uygun bir diferansiyel girişim kontrast kaydedin (DIC) prizma, li bir DIC elemanı, hem de analiz ve polarize elemanlarght yolu DIC optik uymak.
- Doku yüzeyinin yapısı en tanınabilir şekilde DIC prizma pozisyonu ile görüş kontrastını ayarlayın. Hedef hücrelerin her kirpikler hareketli iseniz, hareketli kirpikler net bir görünüm nedeniyle hareket gözle elde edilemez.
- Video kamera ışık yolu değiştirin ve ışık gücünü artırmak için ND filtreleri kaldırabilirsiniz.
- Görünümü ve odak alanını ayarlamak için mod odaklama kamerayı kullanın. Hangi video görüntüleri monitörde gerçek zamanlı olarak gösterilir, odaklama sırasında, hareketli kirpikler net bir görünüm mevcut değildir.
- İstenilen süre (dakika saniye) 0,1 msn bir pozlama süresi ile 200 Hz kamerayı kullanın. Görüntü yığınının kazanılmasından sonra, tek kare net siliyer yapıları gösterecektir. Siliyer kenarları bulanık ise, kare hızını artırmak ya da daha kısa bir pozlama süresi kullanın.
- Leibovitz içinde ötenazi sonra 25-60 dakika içinde CPEC kirpikler hareketini kaydedinL-15 ortamı.
Silier Hareketinin Analizi 3.
- El ile bilgisayar monitöründe her cilium kalıplarını yenerek izleyebilirsiniz. Her cilium yörünge bilgisi için monte edilen fare işaretçisi, her karede Mark silier ucu pozisyonları. Ya daha fazla analiz için diğer daha genel uygulamalara aynı yazılımı veya ihracat kullanarak yörünge bilgileri analiz. Bu analiz, aşama verimi Tartışma tarif edilmektedir.
- Gözle hareket iki mod, geri ve ileri-veya dönme içine yörüngeleri sınıflandırır.
- Aşağıdaki formülü kullanarak siliyer dayak frekansı (CBF) hesaplayın: [CBF = (saniyedeki kare sayısı) / (Tek beat için kare ortalama sayısı)], bir siliyer ucu hareket şemasında elde edilebilir 14, (Şekil 3 ). Aynı hücrede başka kirpikler, her ciliu hareketi engelleyebilir, çünkü, birden fazla siliyer çırpma döngüsü için bu hesaplama tekrarlayınm, düzensizlik ile sonuçlanır.
- Tek bir hücrenin içinde eksenleri yenerek ciliary açısal tekdüzelik analiz etmek, her yörünge (Şekil 4) için dayak açısı θ tanımlar. Geri ve ileri-yörüngeleri için, düz bir çizgi kirpikler ucu pozisyonlarını uygun ve satır x -Axis ile yapar açı olarak θ tanımlar. Rotasyonel yörüngeleri, bir elips pozisyonları uygun ve elipsin büyük eksen x -Axis ile yapar açı olarak θ tanımlar. Fitingin ayrıntıları Örnek Sonuçlar bölümünde tarif edilmektedir.
- Her yörüngenin kantitatif açıklaması için, genelleştirilmiş boy oranı AR hesaplayın. Kısaca, göre yörünge döndürme - θ ve X boyunca dağılımının genişliğine arasındaki oran olarak AR tanımlar - ve y -axes (Şekil 4B). Detaylar Temsilcisi Sonuçlar bölümünde gösterilen ve yorumlama vardır, Önemi ve parametre sınırlama Tartışma açıklanmıştır.
SEM 4. Numune Hazırlama
Not: SEM kapsamlı bir şekilde CPECs üzerinde kirpikler durumunu değerlendirmek için önemli bir yöntemdir. SEM için örnekler hazırlamak için, standart bir prosedür daha önce 15 hafif değişiklikler kullanılmaktadır bildirdi.
- Beyin dokusu kesme önce, bir polietilen bir kap ile 5 ml'lik bir cam şişe içinde fiksatif hazırlar. sabitleyici% 2 paraformaldehid, 0.1 M fosfat tampon maddesi, pH 7.4 içinde% 2.5 glutaraldehid (yarım Karnovsky çözeltisi 16) oluşur.
- 1. adımda anlatıldığı gibi beyin doku parçalara ayır.
- Kısaca, yeni bir tabağına Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile izole edilmiş doku yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında 1 saat boyunca bir cam şişe içinde sabitleyici doku tamir. Tek kullanımlık transferi pipetler kullanın ve örnekleri ge koluntly. HBSS içinde durulama sonra, doku yapışkan hale gelir.
- Sabitleyici çözeltisi içine örnekleri aktarmak için yavaş bir damlacık olarak transfer pipeti doku ihtiva eden bir çözelti, az miktarda dışarı atılması ve sabitleştirici ekleyin.
- Tespit edildikten sonra, Fiksatif atmak ve fosfat tamponu ile üç kez doku durulayın.
- Kalan aldehit yıkamak için% 10 sukroz çözeltisi doku daldırın. Aldehitlerin tamamen ortadan kaldırılmasını sağlamak 10 dakika boyunca çözelti içinde numune sokmak ve daha sonra, taze,% 10 sakaroz ile iki kez tekrarlayın. Bu adım, daha sonraki kademelerde, uygun post-fiksasyon elde etmek için önemlidir.
- 30 dakika boyunca fosfat tamponu içinde% 1 ozmiyum tetroksit çözeltisi içinde doku daldırın ve sonrası sabitleme için buz üzerine yerleştirin. Numune rengine göre osmification derecesini Yargıç: aldehitler tamamen kaldırıldığında, örnek siyahtır.
- Çift damıtılmış ile yoğun sonradan tespit doku örnekleri yıkayınd suyu birkaç kez.
- Kademeli derişimlerde etanol içine daldırma ile örnekleri kurutmak, genellikle,% 65,% 75,% 85,% 95,% 99 ve% 100, 10 dakika her biri için. Yeni satın alınan şişe% 99.5 etanol içine moleküler elekler koyarak susuz etanol elde edilir. Susuz etanol ile üç kez dehidratasyon tekrarlayın.
- 10 dakika boyunca, izoamil asetat, kritik nokta kurutma için bir ikame reaktifine susuz numuneler. İki kez bu adımı yineleyin. Bu reaktif hızla buharlaşır ve örnek yüzey gerilimi tarafından imha sonuçlanan kuru olabilir. Bu nedenle, tamamen kurumasını örnek yok.
- Izoamil asetat nihai değişimi hemen sonra, çözücünün büyük bir kısmının çıkarılması, alüminyum folyo ile açık cam şişe kaydırmak ve kuru buz üzerinde şişe yerleştirin. Sıvı karbon dioksit, kritik nokta kurutma şişenin içine kolay akar, böylece bir iğne ya da ince forseps kullanılarak, şişenin ağzını kapsayan folyo çok delik açmak. Sonraki adıma geçinolabildiğince çabuk.
- Bu adımda, kurutma odasına isoamil asetat taşınmasını en aza indirmek, ancak numune tamamen kritik nokta kurutmadan önce kurumaya izin vermeyin. Buna ek olarak, şişe üzerindeki don oluşumunu önlemek için gereğinden uzun bir süre boyunca kuru buz üzerinde örnek bırakmaz.
- Çıkarmadan su dokusunda bulunan iken doku yüzey yapısı bozulmadan kalır sağlayan kritik nokta kurutucu içine doku örnekleri içeren folyo sarılı cam şişeleri aktarın. Kritik nokta kurutma işletim ile ilgili detaylı bilgiler üreticinin talimatlarına elde edilebilir.
- Dikkatle mekanik zararı en aza indirmek için bir kürdan kullanarak örnekleri taşıyınız. Elde edilen kurutulmuş doku örnekleri kırılgandır. Bir iyon püskürtmeye kullanarak altın paladyum metal taslakları ve ceket örnekleri monte edin.
SEM ile 5. Gözlem
- SEM ile gözlemleyin ve bir dijital kamera ile görüntüleri kaydedebilirsiniztaramalı elektron mikroskobu ile donatılmış.
- Analiz için bir bilgisayara dijital görüntü verilerini aktarın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Iş akışının bir bakış cihazları görüntü dahil olmak üzere Şekil 1 'de gösterilmiştir.
CPECs Canlı hareket gözlemleri
Film 1 Bir perinatal fare izole CPECs bir film gösterir ve Film 2 Film 1 görüntüleri genişletilmiş bir görünümünü gösterir. Bireysel siliyer ipuçları filmlerde kıyasla hareketsiz görüntülerde daha az net olduğunu belirtmek gerekir. 2 gösterileri Şekil Film 1 ve 2 'de gösterilen verilerden hareketinin farklı modları, geri ve ileri-ve rotasyon hareketleri, iki kirpikler hareket izleme. Şekil 3 kirpikler yörüngeleri basit bir analizini göstermektedir, faz farkı bölgesindeki İki koordinat dönme hareketi de aşikardır.
CPEC siliyer ucu yörüngeleri Analizi
De kantitatif her yörüngeyi analiz kuyruklu yöntemler dayak açılı θ tanımları (A) ve Örnek sonuçları (B) ile birlikte bir analiz akış şemasının şematik çizimler, Şekil 4'te gösterilmiştir.
Arka-ve-ileri yörüngeleri için dayak açısı θ tanımlamak düz bir çizgi y = balta + b birden döngüleri sırasında siliyer ucu pozisyonlarını uygun ve hazır hat boyunca bu kadar dayak yönünü tanımlamak için. Θ Bir Arc tan = burada dayak açısını tanımlayın. Genellikle uydurma hattı, dönme hareketi durumlarda yönlendirme ayıklamak bir elips için dönme yörüngeleri uygun ve donanımlı elipsin uzun ekseni boyunca bu kadar yönünü tanımlamak için başarısız çünkü. Daha kesin olarak, birden fazla dayak döngüleri sırasında uç pozisyonları (x, y), aşağıdaki fonksiyona donatılmıştır.
1.jpg "width =" 310 "/>
nerede 
x 0, y 0, A, B ve θ: elips bağlantı beş bağlantı parametrelerini içerir. X - ve elipsin merkezinin y -spatial koordinatları, sırasıyla x ve y 0 0 olan. elipsin büyük ve küçük yarıçapları sırasıyla a ve b. Açı θ ana ekseni X -Axis veya dayak açısı yapar açıdır. Bu parametrelerin şematik bir temsili, Şekil 4A'da sağ panelde gösterilmektedir. uygun, yukarıda tarif edilen açık fonksiyonu ile İgor Pro yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir. Ardından, tüm silya için açı θ yenerek bir histogram gözlemlemekaynı hücrede D (Narita ve ark Şekil 2'de. 8) dairesel bir histogramı olarak çizilmiştir. frekans analiz siliyer ipuçları sayısı normalize edilir. Her kirpik, dairesel bir histogramda, iki θ değerlerine sahip yorumlanır olduğu dikkate alınmalıdır, örneğin π / 4 ve / 4 3π yönünde simetrik dağılımına neden olur.
Θ (Şekil 4B) - genel en-boy oranı AR tanımlamak için, çok sayıda devir boyunca siliyer ucunun pozisyonu ile döndürülmektedir. Dönme göre, geri ve ileri haline dönme yörüngeleri Her iki X -Axis, x ve y eksenleri boyunca dağılımı A ve B genişlikleri, sırasıyla yarısı olarak tanımlandığı hemen hemen paralel olarak dağıtılmış minimum ve maksimum arasındaki fark. Bu nedenle, bu parametreler elips, a ve b büyük ve küçük yarıçapına daha fazla olan. AR o zaman Ar = B / A A arasındaki oran ve Yatak olarak tanımlanır.
SEM ile koroid pleksus epitel Gözlemler
SEM örneklerinin ince yüzey yapısının gözlem izin verir. CPECs üzerinde kirpikler varlığı gelişim süresi boyunca teyit edilir. CPECs birden kirpikler ortaya çıkması koroid pleksus gelişimi E11 etrafında lateral ventrikül başlar kısa bir süre sonra, embriyonik gün (E) 13 tarafından görülmektedir. Bu aşamada, hücreler değişken olgunlaşmamış bir görünüm ile küçük ve siliyer ipuçları çeşitli yönlerde doğru işaret ediyor. E15 anda, birden kirpikler bir tutam çevreleyen mikrovilluslar dışarı ayakta apikal yüzeyinde üstündeki kurulmuştur. Doğum sonrası gün (P) 2, birçok kirpikler canlı görüntüleme tarafından gözlemlenen siliyer motilitesini yansıtan bir bükülmüş pozisyonda sabitlenir. P14, çoğu hücrelerin birden fazla olmayan hareketli olan kirpikler yanı sıra mikrovilluslar w sahip i önceki aşamalarında kıyasla daha ince doku. 5, bu aşamada silya ile CPECs SEM görüntülerini göstermektedir. Şekil 1 ve Film 1'de gösterilen film dayanarak, hareketli kirpikler kolayca canlı görüntüleme tarafından tanınan açıktır. Bununla birlikte, DIC mikroskopi ile kendiliğinden hareketli olmayan kirpikler ayırt etmek zordur. Sonuç olarak, SEM, genel siliyer devletleri anlaşılması için vazgeçilmezdir.
Şekil 1:. Iş akışı Bakış (a) Stereo mikroskop. Bir ücret-birleştiğinde cihaz (CCD) kamera ile donatılmış (b) Ters çevrilmiş mikroskop. Analiz sırasında (c) Bilgisayar ekranı. (D) İyon püskürtme. SEM (e) Numune. (F) Taramalı elektron mikroskobu.
Film 1.pload / 52991 / Figure_2.mov "target =" _ blank "> CPECs üst görünüm ve yüksek hızlı video mikroskopi P2 fare yavru kirpikler film. koroid pleksus dokusu düzensiz yüzey, bu anlık içerdiğinden . hem odaklama ve out-of-odak düzlemleri kutusunda alan genişletilir ve Film 2 Ölçek çubuğunda gösterilir. 2 um.
Film 2. Film 1. doku örneğinin genişletilmiş bakış Film kirpikler Dayak dönme veya geri ve ileri-ya hareketleri gösterdi. Ölçek çubuğu: 1 mikron.
Şekil 2:. Back-ve-ileri hareketi (üstte) ve dönme hareketi (alt) ile Film 2 time-lapse görüntüleri CPEC kirpikler yörünge Sulandırma (A) Cilia. DIC Film verilerinden görüntüleri 50 msn aralıklarla (: 1 mikron 1-8, ölçek bar) sunulmuştur. Hedef siliyer ucunun pozisyonu, bir ok ile belirtilmiştir. (B) yörüngeleri (kırık çizgi) ve resimlerde gösterilen siliyer ipuçları (renkli daireler) pozisyonları üst üste.
Şekil 3:. Film verilerinden sulandırılmış CPEC silyer ucu hareketi iki mod çoklu döngüler üzerinde Temsilcisi siliyer ucu hareketleri, geri ve ileri-hareketi (A) ve dönme hareketi (B), yörüngeleri (üst, ölçek çubukları gibi sunulmuştur: 0.5 um). X- ve uç konumunun y-koordinatlarının zamanlı kurslar, sırasıyla (orta) çizilmiştir. İki koordinatlar arasındaki faz-shift göstermek için, x ve y koordinatları [-1,1] normalize edilmiş ve (sırasıyla, kırmızı ve mavi çizgiler alt) üst üste.
ŞEKIL 6 "src =" / files / ftp_upload / 52991 / 52991fig6.jpg "/>
Şekil 4: siliyer ucu yörüngeleri analizi açıklayan şematik çizimler arka ve ileri-(sol panel) ve dönme (sağ panel) yörüngeleri için dayak açısı θ (A) Tanımlar.. Donatılmış elips, a, b, x, 0, ve y, 0 tarif formül parametreler, sağ panelde gösterilmektedir. (B) dayak açısı θ ve AR tanımlamak için yörünge uydurma analiz akış şeması. Temsilci yörüngeler montaj Gerçek sonuçlar doğru panellerde sunulmuştur.
Şekil 5: silya SEM görüntüsü. E13, E15, P2 ve P14 ile CPECs Temsilcisi SEM mikro. Zaman sırasında, CPECs boyutu arttı ve microvi geliştirdilli ve apikal yüzeyinde kirpikler. E13 de kirpikler bir tutam hareketliliğini kazanmak için henüz. Motilite ile kirpikler oranı en yüksek noktasına ulaştı P2,, pek çok bükülmüş kirpikler gözlenmektedir. P14 anda, silya motilite kaybedersiniz. Ölçek çubuğu: 5 mikron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yöntemin Perspektifler
Burada açıklanan teknik daha önce yayınlanmış yöntemlere göre silya daha ayrıntılı bir analiz sağlamak olmamasına rağmen, bu tekniğin önemi kolayca siliyer hareketlilik ex vivo her türlü tarama uygulanabilir sistem ve maliyet etkinliği, sadeliği bulunur. Özellikle, TI Workbench gözlemlemek ve daha kolay siliyer hareketliliğini analiz araştırmacıları sağlayan basit ve kullanıcı dostu bir arayüz sağlar. Etkili otomatik izleme yöntemleri, video geliştirilmiş kontrast DIC lekesiz kirpikler gibi düşük kontrastlı nesneler için geliştirilmiş değil. Siliyer hareketi izlemek için yöntem manuel bu tekniğin olmasına rağmen, siliyer hareket izleme analizi çaba miktarı optimum görüntü analizi için genel amaçlı yazılım paketleri kullanılarak göre azalmıştır.
Örnek diseksiyonu
E hazırlamakX in vivo CPEC örnekleri, hızlı ve hassas manipülasyonlar kirpikler ex vivo hareketliliğini sağlar doku canlılığını korumak için gereklidir. Eritrositler tarafından kontaminasyon gözlem alanını bulanıklaştırır, çünkü fosfat tamponlu tuzlu su ile disseke doku nazik ama karmaşık durulama şiddetle tavsiye edilir. Kanamayı önlemek için, bakım kolloid pleksus affixa lamina yapıştırılmış önemli bir kırmızımsı iplik benzeri bir yapı olarak tespit edilebilir posterior koroid arter yırtılmasını önlemek için dikkatli olunmalıdır.
Mikroskop
DIC optik ve yüksek güç transmisyon ışığı kaynağı ile donatılmış bir ters mikroskop Bu yöntem için gereklidir. Cıva lambaları genellikle sık sık açılıp kapatılması aciz olduğundan Lamba yuvasının önünde bir deklanşör gereklidir. Her iki durumda da, bir el ya da elektrik deklanşör, bu amaç için kullanılabilir. Örnekleri ve gözlemcinin gözleri fr korumak içinom UV ve IR ışık, optik filtreler yalnızca görünür ışık (400-700 bant geçiş veya UV ve IR kesme filtreleri kombinasyonu) izin gerekmektedir. Bir video kamera ve yüksek hızlı time-lapse kayıt ile odaklanarak, gözle izleme: ND filtreler de duruma göre değişir ışık gücünü değiştirmek için gereklidir. Bir yüksek sayısal açıklık ile objektif lens yüksek çözünürlük için gereklidir. Lamel üst nedeniyle doku morfolojisi ve kalınlığı odak noktası arasındaki bazı mesafe vardır. Bu nedenle, bir suya daldırma objektif yerine Bir yağ batırma objektifi daha iyi görüntü kalitesi için tercih edilir. Titreşim izolasyonu istikrarlı görüntü yığınlarını verim de gereklidir. Hava kamyon tipi tabloları bu amaç için yararlıdır, ama aynı zamanda işe yarayabilir istikrarlı bir tablo ile mikroskop tabanı altındaki tenis topları sokarak mikroskop basit yastıklama.
Video kamera
Lea de yetenekli bir CCD kamerast 200 kare / sn kirpikler hareketini takip etmek için gereklidir. Geçtiğimiz on yıl boyunca, standart video oranı (25-30 Hz) daha hızlı çerçeve oranları ile CCD kameralar çok daha düşük maliyetler kullanılabilir hale gelmiş. Çerçeve aralığından daha açığa kısa zamanlarda yetenekli kamera modelleri veri miktarını artırmadan kirpikler hareketi nedeniyle bulanıklığı azaltmak için yararlıdır. 0.1 msn bir maruz kalma süresi ve 5 milisaniye çerçeve aralığı (200 Hz) yeterli kalitede CPECs siliyer görüntüler elde etmek için asgari şartlardır.
Yazılım
Her cilium hareketini izlemek için analiz görüntü analizi için genel amaçlı yazılım paketleri her siliyer ucu izlemek için kullanılan, özellikle zaman alıcıdır. Böyle monitörde siliyer ucu pozisyon fare tıklayarak olarak tekrarlanan görevlerin adımları azaltılması tıklandığında konumunu kaydetmek için bir menü seçerek ve bir düğmeye tıklayarak bir sonraki görüntü karesi önemli bir yeniden sonuçları taşımak içinzaman ve çaba duction. Bu çalışmada, özel bir rutin ısmarlama TI Workbench yazılımı eklendi. TI Workbench yazılımı siliyer izleme modunda, kullanıcı aşağıdaki basit iki aşamalı operasyon döngü devam: Hareketli gerektirmeyen çerçeve, ilerlemek için siliyer ucuna fare imlecini hareket ve klavyedeki bir ok tuşuna basarak fare işaretçisi veya kullanıcının gözleri bilgisayar ekranında siliyer ipuçları (bilgisayar ekranındaki menüler ve düğmeler için) kaydırmaya. yazılım, siliyer ucu pozisyonları izler kullanıcıya yardımcı olmak için kaydedilen yörüngesini görüntüler ve daha fazla analiz için siliyer hareket bilgilerinin bir tablo oluşturur. Görüntü analizi için çoğu genel amaçlı yazılımı gibi tekrarlanan görevlerin toplu işlem için programlama makroları izin verir. Tekrarlanan adımları azaltmak için böyle bir özel programlama şiddetle tavsiye edilir.
Yörüngelerin analizi
Trajectori çıkarımıyukarıda tarif edildiği gibi es, ısmarlama TI Tezgahı yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi. Nispeten basit bir analiz ve görüntü işleme, aynı zamanda, aynı yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi. Uydurma analizler için, her siliyer ucu yörünge Igor Pro yazılımına aktarılmıştır. MATLAB gibi diğer ileri analiz yazılımı, aynı zamanda bu amaç için kullanılabilir.
Bu çalışmada, arka ve ileri-veya rotasyonel yörüngeleri haline yörüngeleri kategorize zorluklar nedeniyle, yörüngeleri tutarlı klasmanda sonuçlanan, bir başka gözlemci tarafından teyit edildi, bir kör, gözün göre sınıflandırılmıştır. Bununla birlikte, olası keyfi olmadan yörüngeleri kategorize etmek daha matematiksel titiz önlemler tercih olacaktır. Yörünge uydurma arka ve ileri-ve rotasyonel hareketler hem de monte elips () boy oranı olarak ellipticity ölçüde ölçmek hangi ideal gibi görünüyor elips. Ancak, Sınıflandırma için bir eşik değeri tanımlamak için en boy oranı dağılımını kullanmak için bir girişim etkisiz oldu. sık sık ve ileri-yörüngeleri için başarısız uydurma, parametreler sık yakınsama başarısız oldu ve yakınsadı uydurma görünüşte yanıltıcı oldu. Bu nedenle, elips uydurma otomatik yörüngeleri kategorize veya her yörünge elipsliği ölçmek için kabul edilmedi. uydurma takılan elipsin ana ekseni olarak dönel hareketli ipuçları dayak yönünü çıkarmak amacıyla yapılmıştır.
Bu çalışmada, AR, bir yörünge ideal lineer geri ve ileri-motion sapma derecesini ölçmek için önerilmiştir. Parametre dikey yön boyunca edilene dayak yönüne dağılım genişliği oranıdır. yörünge yukarıda belirtilen Elips boy oranı benzeyen bir daire olduğunda yörünge bir düz çizgi, ve ne zaman değer sıfır olmalıdır.
Dayak yönü X -Axis (Şekil 4B) paralel olacak şekilde Uygulamada, AR değeri elde edilmesi, yörünge döndürerek nispeten kolay olabilir. Bu miktar parametre potansiyel kullanımını, her yörüngenin özelliklerini ölçmek için değil, aynı zamanda daha titiz bir şekilde yörüngeleri sınıflandırmak için, sadece öne hareket iki mod için önemli ölçüde farklı değerlere neden olur. Bununla birlikte, bu dayak yönü kendisini zaten mevcut yöntemde iki mod için ayrı bir bağlantı süreçlerin sonucu olduğu göz önünde bulundurulmalıdır.
Analiz daha fazla gelişme, örneğin daha ileri bir uydurma algoritması gibi olası keyfi sorunları çözmek gerekebilir.
Yörünge ellipticity ilgili bir yönü, her CPEC cilium dayak x kesinlikle dik düzlemde yer alan olmayabilir olduğunu - y
SEM Hazırlık
SEM gözlem hazırlanması sırasında, yüksek kaliteli görüntüler elde edilmesini sağlamak birkaç önemli nokta vardır. İlk olarak, osmiyum tetroksit ile sonradan tespit% 10 sukroz çözeltisi ile ön yıkama da dahil olmak üzere, dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Osmification prosedürle uygun fiksasyon olmadan, sonraki adımlar hazırlık düşük kalitede lider, korumak veya örneklerin durumunu geri yükleyemezsiniz. Aldehid sabitleyiciler indirgeyici maddeler olduğundan, numune içinde kalan aldehitler ozmiyum tetroksit, güçlü bir oksidize edici bir reaktif aktivitesini inhibe eder. Örneklerinde gereksiz aldehitlerin eleme sağlamak için, sukroz çözeltisi ile dikkatli yıkanması zorunludur. Suboptimal po durumlardast-sabitleme, numunenin rengi kahverengiden siyaha değişmez. İkinci olarak, ozmiyum tetroksit hacmi en az Numuneninkinden daha büyük bir 50-misli olması gerekir. Aksi takdirde, yeterli fiksasyon beklenemez. Üçüncü olarak, özellikle de yüksek derecede saf etanol ve izoamil asetat kullanan dehidrasyon işlemi sırasında numunelerin tamamen kurumasını önlemek için önemlidir. Numunenin kurutulması yoksul görüntüleri sonuçlanan gibi kirpikler gibi ince yüzey yapıları tahrip eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim. Bu yazıda izole koroid pleksus dokularda kirpikler hareketliliğini gözlemlemek için detaylı metodoloji raporlama amaçlamaktadır. Bilimsel yenilikler önceki çalışmalarda 1,8 olarak bildirilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Required reagents | |||
| for live cell imaging | |||
| ethanol | Wako Chemicals | 057-00456 | |
| Leibovitz L-15 medium | Life Technologies | 11415-064 | |
| for SEM preparation | |||
| ethanol | Wako Chemicals | 057-00456 | |
| Hank's balanced salt solution | Life Technologies | 14170112 | |
| paraformaldehyde | Merck | 1040051000 | |
| glutaraldehyde | Nacalai tesque | 17003-05 | |
| isoamyl acetate | Nacalai tesque | 02710-95 | |
| Molecular Sieves 4A 1/8 | Wako Chemicals | 130-08655 | for preparation of anhydrous ethanol |
| phosphate buffer saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| phosphate buffer, 0.1 M | To make 100 ml, mix 19.0 ml of 0.1 M NaH2PO4 and 81.0 ml of 0.1 M Na2HPO4 | ||
| monosodium phosphate (dihydrate) | Nacalai tesque | 31718-15 | |
| disodium phosphate (anhydrous) | Nacalai tesque | 31801-05 | |
| suclose | Nacalai tesque | 30406-25 | |
| osmium tetroxide | Nisshin EM | 300 | |
| dry ice | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools and materials for dissection | |||
| for both live imaging and SEM preparation | |||
| stereo microscope | Olympus | SZX7 | |
| flat paper towel | |||
| Φ10 cm plastic dish | |||
| 100 ml beaker | |||
| straight operating scissors | Sansyo | S-2B | |
| watchmaker forceps | Dumont | No.DU-3 or -4, INOX | |
| for live cell imaging | |||
| glass bottom dish | Matsunami Glass | D110300 | |
| for SEM preparation | |||
| alminum foil | |||
| 5 ml glass vial with a polyethylene cap | Nichiden Rika-Glass | PS-5A | |
| transfer pipette | Samco Scientific | SM251-1S | for specimen tranfer |
| toothpick | for specimen transfer | ||
| ion sputter with gold-palladium | Hitachi | E-1030 | |
| critical point dryer | Hitachi | HCP-2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopic equipment and materials | |||
| for live cell imaging | |||
| inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| 100 W mercury lump housing and power supply | Olympus | U-ULH and BH2-RFL-T3 | |
| 100 W mercury lamp | Ushio | USH103D | |
| DIC condenser, n.a. 0.55 | Olympus | IX-LWUCD | |
| electrrical shutter | Vincent Associates | VS35S22M1R3-24 and VMM-D1 | manual shutter can be used. |
| band-pass filter (400-700 nm, Φ45 mm) | Koshin Kagaku | C10-110621-1 | |
| ND filter (Φ45 mm) | Olympus | 45ND6, 45ND25 | combination of 25% and 6% ND filters are used |
| objective lens (water immersion) with DIC element | Olympus | UApo 40XW/340, n.a., 1.15 with IX-DPAO40 | |
| high-speed video camera | Allied Vision Technologies | GE680 | ≥200 Hz frame rate and 1 msec expose time |
| image acquisition / analysis software | in-hous software | TI Workbench | capable of acquisition at high frame rates. |
| PC for camera control / analysis | Apple | Mac Pro | |
| vibration isolation table | Meiritsu Seiki | AD0806 | |
| weight for tissue | Warner Instruments | slice anchor kits | It can be made with nylon mesh glued to a U-shape squashed Φ0.5 mm platinum wire. |
| cover glass (alternative weight for tissue) | Matsunami | made-to-order | A cover glass can be used as a tissue weight. |
| for SEM | |||
| inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| scanning electron microscope | JEOL | JSM-6510 | |
References
- Nonami, Y., Narita, K., Nakamura, H., Inoue, T., Takeda, S. Developmental changes in ciliary motility on choroid plexus epithelial cells during the perinatal period. Cytoskeleton. 70 (12), 797-803 (2013).
- Bisgrove, B. W., Yost, H. J. The roles of cilia in developmental disorders and disease. Development. 133 (21), 4131-4143 (2006).
- Fliegauf, M., Benzing, T., Omran, H. When cilia go bad: cilia defects and ciliopathies. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (11), 880-893 (2007).
- Oh, E. C., Katsanis, N. Cilia in vertebrate development and disease. Development. 139 (3), 443-448 (2012).
- Shah, A. S., Ben-Shahar, Y., Moninger, T. O., Kline, J. N., Welsh, M. J. Motile cilia of human airway epithelia are chemosensory. Science(New York, N.Y). 325 (5944), 1131-1134 (2009).
- Kiprilov, E. N., et al. Human embryonic stem cells in culture possess primary cilia with hedgehog signaling machinery). The Journal of Cell Biology. 180 (5), 897-904 (2008).
- Hirokawa, N., Tanaka, Y., Okada, Y., Takeda, S. Nodal flow and the generation of left-right asymmetry. Cell. 125 (1), 33-45 (2006).
- Narita, K., Kozuka-Hata, H., et al. Proteomic analysis of multiple primary cilia reveals a novel mode of ciliary development in mammals. Biology Open. 1 (8), 815-825 (2012).
- Takeda, S., Narita, K. Structure and function of vertebrate cilia, towards a new taxonomy. Differentiation; Research in Biological Diversity. 83 (2), S4-S11 (2012).
- Ikegami, K., Sato, S., Nakamura, K., Ostrowski, L. E., Setou, M. Tubulin polyglutamylation is essential for airway ciliary function through the regulation of beating asymmetry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (23), 10490-10495 (2010).
- Foster, K. W.
- Lechtreck, K. -F., Sanderson, M. J., Witman, G. B. High-speed digital imaging of ependymal cilia in the murine brain. Methods in Cell Biology. 91, 255-264 (2009).
- Okada, Y., Hirokawa, N. Observation of nodal cilia movement and measurement of nodal flow. Methods in Cell Biology. 91, 265-285 (2009).
- Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).
- Takeda, S., et al. Left-right asymmetry and kinesin superfamily protein KIF3A: new insights in determination of laterality and mesoderm induction by kif3A-/- mice analysis. The Journal of Cell Biology. 145 (4), 825-836 (1999).
- Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy. The Journal of Cell Biology. 27, 137-138A (1965).
