Protocol
Протоколы и использование экспериментальных животных были одобрены институциональных уходу за животными и использование комитетов в университете Яманаси и университета Васэда. Уход за животными проводили в соответствии с ведомственным руководящим принципам.
1. Подготовка КЗЭК
- Подготовьте следующие устройства и материалы: Стерео микроскоп, предпочтительно, способный передавать освещение снизу; пара щипцов часовщик (Дюмон # 3 или # 4), пламя стерилизовать, прямые операционные ножницы, пламя стерилизовать; два стерильных 10 см пластиковой посуды, содержащие 20 мл ледяной Лейбовиц L-15 среды; 35 мм со стеклянным дном блюда, содержащие 2 мл РТ Лейбовиц L-15 среды; 100 мл химический стакан, содержащий 70% этанола; неонатальные щенки мыши.
- Кратко погрузить новорожденных мышь в 70% этанола и быстро усыпить путем обезглавливания с помощью операционной ножницы.
- Сразу же место голову в ледяной Лейбовиц L-15 среды, в стерильной 10 см дишиллинг
- Снимите кожу с использованием свода черепа пару щипцов часовщика, разрезать череп подвергать мозг, а затем разрезать черепные нервы, чтобы изолировать весь мозг.
- Перевести мозг в новое блюдо, содержащей ледяной Лейбовиц L-15 среды и наблюдать под микроскопом стерео, убедившись, что мозг полностью погружен в среду.
- Установите спинной мозг вверх и ориентировать мозг таким образом, что обонятельные луковицы находятся в положении 3:00 (для правшей). Держите мозг осторожно пинцетом в левой руке.
- Использование тонких щипцов (рассечение Дюмон # 3 или # 4) в правой руке, отрезать мозолистого тела и под паренхимы, соединяющий полушария, вдоль продольной трещины головного мозга.
- Аккуратно нажмите полушарий от боковым сторонам и подвергать поперечной мозговой трещину.
- Отделите полушария, зажимая из йе паренхимы между полушарии и таламуса.
- Аккуратно вытащить боковые сосудистое сплетение желудочков, которая крепится к боковой стороне гиппокампа по пластинке affixa.
- Перевести выделенные сосудистое сплетение в 35 мм со стеклянным дном блюдо с свежей Лейбовиц L-15 среды, и накладывать массу (список материалов) мягко, чтобы держать ткань в месте.
2. Живая съемка КЗЭК Cilia
- Подтвердите правильное ультрафиолет (УФ) и вывод (ИК) фильтр отсечки (ы), чтобы заблокировать свет короче 400 нм и длиннее 700 нм, и что нейтральный плотности (ND) фильтры (25% и 6%) вставляются в пути света из инвертированного микроскопа.
- Настройте фокус объектива примерно на глаз, а затем настроить конденсатор, так что центр и фокус, чтобы соответствовать освещения Келера. Вставьте соответствующий дифференциального интерференционного контраста (ДИК) призмы, DIC элементом, а также анализатора и поляризатора элементов в LiGHT путь, чтобы соответствовать оптики DIC.
- Регулировка контрастности зрения положением DIC призмы так, чтобы структура поверхности ткани является самым узнаваемым. Если все реснички клеток-мишеней подвижны, четкое представление о подвижных ресничек не может быть получена на глаз из-за их движением.
- Измените путь света к видеокамере, и удалить нейтральные фильтры, чтобы увеличить световой мощности.
- Используйте камеру в режим фокусировки, чтобы отрегулировать поле зрения и внимания. Во время фокусировки, в которой видео изображения отображаются в режиме реального времени на мониторе, очевидно, вид подвижных ресничек не доступен.
- Используйте камеру на 200 Гц при времени экспозиции 0,1 мс для требуемого периода (от секунд до минут). После приобретения пакета изображений, отдельные кадры будут отображаться четкие цилиарных структур. Если цилиарные края размыты, увеличить частоту кадров или использовать более короткое время экспозиции.
- Запишите движение ресничек КЗЭК в 25-60 мин после эвтаназии в ЛейбовицL-15 среднего.
3. Анализ движения Мерцательная
- Вручную отслеживать избиении модели каждого реснички на мониторе компьютера. Все позиции мерцательная наконечник в каждом кадре с указателем мыши, которые собраны для траекторной информации каждого реснички. Либо проанализировать траекторию информацию, используя то же программное обеспечение или экспорт в другие, более общего применения для дальнейшего анализа. Эффективность этого шага анализа описан в дискуссии.
- Оцените траектории в двух режимах движения, возвратно-поступательный или вращательный, на глазок.
- Вычислить частоту биений цилиарного (CBF) с помощью следующей формулы: [CBF = (количество кадров в секунду) / (среднее число кадров для одного такт)] 14, которые могут быть получены из диаграммы движения цилиарного наконечник (фиг.3 ). Повторите этот расчет для нескольких циклов мерцательная избиение, потому что другие, реснички на той же клетке могут мешать движению каждого ciliuм, в результате неравномерности.
- Для анализа угловой однородность цилиарной избиение осей в пределах одной ячейки, определить угол θ избиение для каждой траектории (рис 4). Для назад и вперед траекторий, соответствовать позиции кончика реснички к прямой линии, и определить θ как угол линии делает с оси х. Для вращающихся траекторий, соответствовать позиции к эллипсу, и определить θ как угол большой оси эллипса составляет с оси х. Подробная информация о фитинга описаны в разделе Результаты представитель.
- Для количественного описания каждой траектории, рассчитать обобщенную пропорции AR. Вкратце, повернуть траекторию - θ и определяют AR как отношение между шириной распределения по х - и у -axes (рис 4б). Подробности приведены в разделе Результаты Представительства и интерпретация, Значимость, и ограничение параметра описаны в дискуссии.
4. Подготовка проб для SEM
Примечание: СЭМ является важным методом для оценки состояния ресничек на CPECs в полном объеме. Для подготовки образцов для РЭМ, стандартная процедура сообщалось ранее 15 используется с небольшими изменениями.
- Перед рассмотрением ткани из мозга, подготовить фиксатор в стеклянный флакон 5 мл с полиэтиленовой крышкой. Фиксатор состоит из 2% параформальдегида, 2,5% глутарового альдегида (половина раствора Карновского в 16) в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,4.
- Рассеките из ткани из мозга, как описано в шаге 1.
- Кратко промыть изолированную ткань с сбалансированный солевой раствор Хенкса (HBSS) в новое блюдо, а затем зафиксировать ткани в фиксаторе в стеклянной пробирке в течение 1 часа при комнатной температуре. Используйте одноразовые пипетки передачи и обработки образцов Gently. После промывки в HBSS, ткань становится липким.
- Для передачи образцов в растворе фиксирующего медленно изгнать небольшое количество раствора, содержащего ткань из пипетки в капли и добавить к фиксатором.
- После фиксации отказаться от фиксатора и промойте ткань с фосфатным буфером три раза.
- Погружают ткань в 10% растворе сахарозы промыть остальные альдегиды. Чтобы обеспечить полное удаление альдегидов, погрузить образцы в растворе в течение 10 мин, а затем повторить два раза со свежим 10% сахарозы. Это важно для достижения надлежащего пост-фиксацию на последующих стадиях.
- Погружают ткань в раствор 1% осмия в фосфатном буфере в течение 30 мин, а затем поместить на льду в течение после фиксации. Судить о степени osmification по цвету образца: когда альдегиды полностью удалены, образец черного цвета.
- Вымойте образцы фиксировали ткани широко с двойным дистиллированнойd воды несколько раз.
- Обезвоживают образцы погружением в переменной концентрации этанола, как правило, 65%, 75%, 85%, 95%, 99% и 100%, в течение 10 мин каждый. Получить безводного этанола путем размещения молекулярных сит в 99,5% этанола из недавно купленного бутылку. Повторите обезвоживание безводным этанолом три раза.
- Поместите обезвоженные образцы в изоамилацетат, замещения реагента для сушка в критической точке, в течение 10 мин. Повторите этот шаг дважды. Этот реагент быстро испаряется, и образец может стать сухой, что приводит к разрушению поверхностным натяжением. Таким образом, не сушить образец полностью.
- После окончательного обмена изоамилацетат, удалить большую часть растворителя, немедленно обернуть открытую стеклянную ампулу с алюминиевой фольгой, и поместить флакон на сухом льду. С помощью иглы или тонкий пинцет, сделать несколько отверстий в фольге, покрывающей рот флакона, так что жидкий диоксид углерода протекает легко в флаконе в критической точке сушилку. Перейдите к следующему шагукак можно быстрее.
- На этом этапе, свести к минимуму вынос изоамилацетат в камеру сушилки, но не позволяйте образец полностью высохнуть, прежде чем сушка в критической точке. Кроме того, не оставляйте пробы на сухом льду для излишне долго, чтобы избежать обмерзания на флаконе.
- Передача стеклянные флаконы обернутого фольгой, содержащие образцы ткани в критической точке сушилку, который обеспечивает поверхностную структуру ткани остается неизменным во время удаления воды, содержащейся в ткани. Подробная информация о работе с критическую точку сушилка может быть получена из инструкций изготовителя.
- Ручка образцы тщательно используя зубочистку, чтобы свести к минимуму механическое повреждение. Полученные высушенные образцы тканей являются хрупкими. Установите образцы на металлических заглушек и пальто с золотой палладия с использованием ионного НАПЫЛЕНИЕМ.
5. Наблюдение с помощью СЭМ
- Соблюдайте СЭМ и записывать изображения с цифровой камерыоборудованы сканирующего электронного микроскопа.
- Передачи данных цифрового изображения на ПК для анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Обзор рабочего процесса показан на рисунке 1, в том числе изображения устройств.
Текущие наблюдения движения CPECs
Фильм 1 показан фильм CPECs, выделенных из мыши перинатальной и фильм 2 показан увеличенный вид изображений в кино 1. Следует отметить, что отдельные советы цилиарных менее ясны в неподвижных изображений по сравнению с теми, в кино. На рисунке 2 показано отслеживание движения двух ресничек с различными режимами движения, назад и вперед и вращательных движений, из данных, приведенных в кино 1 и 2. Рисунок 3 показывает простой анализ траекторий ресничек, в котором разность фаз в двух координатах очевидно во вращательном движении.
Анализ КЗЭК мерцательная наконечник траекторий
Де хвостатые методы количественного анализа каждой траектории показаны на рисунке 4 схематическими иллюстрациями определениями углом θ Избиение (А) и блок-схемы анализа с представительными результатами (B).
Чтобы определить угол θ биться назад и вперед траекторий, соответствовать позиции наконечника мерцательной во множественных циклов прямой у = ах + Ь, и определить направление бьющееся, как по подобранной линии. Определите угол бьющееся здесь θ = Arc загар. Поскольку линия установки часто не извлекать направление в случаях вращательное движение, соответствуют вращательные траектории к эллипсу, и определить направление, что и вдоль длинной оси эллипса подогнанной. Точнее, конец позиции (X, Y) в течение нескольких циклов избиение установлены функции ниже.
1.jpg "ширина =" 310 "/>
где 
Эллипс Место включает пять подходящие параметры: X 0, Y 0, A, B, и θ. Х - и Y -spatial координаты центра эллипса х 0 и у 0, соответственно. Большой и малый радиусы эллипса являются и б соответственно. Угол θ представляет собой угол, что главная ось образует с оси х или угла биений. Схематическое представление этих параметров показано в правой панели фиг.4А. Фитинг осуществляется с помощью Igor Pro программное обеспечение, определяя явный функцию, описанную выше. Затем, гистограмма в избиении угол θ для всех ресничек наблюдатьд в одной камере на графике как круговой гистограммы (рисунок 2 в Нарита и соавт. 8). Частота, нормированная на числа анализируемых цилиарных советы. Следует отметить, что каждая ресничка интерпретируется иметь два значения θ в круговой гистограммы, например π / 4 и 3π / 4, что приводит к симметричным распределением направлении.
Чтобы определить обобщенную соотношение сторон AR, позиции наконечника цилиарной течение нескольких циклов вращаются - θ (фиг.4В). В соответствии с вращением, и обратно-поступательное и вращательное траектории становятся распределены приблизительно параллельно оси х, в которых ширины распределения А и В, вдоль х и у осей, соответственно, определяются как половины Разница между минимумом и максимумом. Таким образом, эти параметры являются более актуальными для большого и малого радиусов эллипса, а и б. АР затем определить как отношение между А и В по AR = В / А.
Наблюдения сосудистое сплетение эпителия по СЭМ
СЭМ позволяет наблюдать тонкую структуру поверхности образцов. Наличие ресничек на CPECs подтверждается всей развития времени, конечно. Появление нескольких ресничек на CPECs наблюдается эмбриональной день (E) 13, вскоре после развития сосудистого сплетения начинается в боковых желудочков вокруг E11. На этой стадии, клетки малы с переменным незрелых внешний вид, и цилиарной подсказки указывая на различных направлениях. В E15, пучок ресничек нескольких устанавливается на верхней части апикальной поверхности, которые выделяясь из окружающих микроворсинок. В послеродовом день (P) 2, многие реснички крепятся на согнутом положении, отражая ресничек моторику наблюдаемый живого изображения. В Р14, большинство клеток обладают несколько ресничек, которые неподвижны, а также микроворсинки W Ith тоньше текстура сравнению с более ранних стадиях. Рисунок 5 показывает SEM изображения CPECs ресничками на этих этапах. На основании фильмов, показанных на рисунке 1 и Movie 1, то очевидно, что подвижные реснички легко узнать по живого изображения. Тем не менее, трудно отличить неподвижные реснички от DIC микроскопии. Следовательно, СЭМ необходимо понять, общие ресничные государства.
Рисунок 1:. Обзор процесса () Стерео микроскоп. (Б) инвертированный микроскоп оснащен зарядовой связью (ПЗС) камеры. (С) Экран компьютера во время анализа. (D) Ион распыления. (Е) Образец для SEM. (Е) сканирующего электронного микроскопа.
Фильм 1.pload / 52991 / Figure_2.mov "цель =" _ пустое "> Фильм о верхнем зрения CPECs и ресничек от щенка Р2 мыши в высокоскоростной видео микроскопии. Из-за неровной поверхности сосудистого сплетения ткани, это снимок содержит . как в фокусе и вне фокуса самолетов площадь в коробке расширяется и показано в фильме 2 Scale бар:. 2 мкм.
Фильм 2. Фильм расширенного зрения образца ткани в кино 1. Избиение ресничек показали либо вращательные или возвратно-поступательный движения. Масштабная линейка: 1 мкм.
Рисунок 2:. Восстановление траектории КЗЭК ресничек из покадровой изображений в кино 2 () Реснички с движением назад и вперед (вверху) и вращательного движения (внизу). ДВС изображения из данных фильмов представлены в 50 мс интервалах (1-8, масштаб бар: 1 мкм). Положение кончика целевой цилиарной обозначено стрелкой. (Б) Траектории (пунктирная линия) и должности цилиарных советы (цветные круги) показаны на изображениях накладываются.
Рисунок 3:. Два режима движения КЗЭК мерцательная наконечника восстановленного из данных фильмов Представительства движения мерцательная наконечник, движение назад и вперед () и вращательное движение (Б), на нескольких циклов представлены как траекторий (сверху, масштабные линейки: 0,5 мкм). Время курсы х и у координаты положения зонда приведены, соответственно (средний). Чтобы продемонстрировать фазовый сдвиг между двумя координатами, х- и у-координаты были нормализованы, чтобы [-1,1] и обложил (дно, красные и синие линии, соответственно).
igure 6 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 52991 / 52991fig6.jpg "/>
Рисунок 4: Схема иллюстрации, описывающие анализ цилиарных наконечник траекторий (A) Определения угла θ биться назад и вперед (слева) и вращательных (правая панель) траекторий.. Параметры в формуле, описывающие оборудованная эллипс, A, B, X 0, Y 0 и показаны на правой панели. (В) блок-схема фитинга анализа траекторий, чтобы определить угол θ биение и Аr. Фактические результаты подгонки представительных траекторий представлены в правой панели.
Рисунок 5: СЭМ изображение ресничек. Типичные SEM микрофотографии CPECs на E13, E15, P2 и P14. Во время хода, CPECs увеличились в размере, и разработали microviЛЛИ и реснички на апикальной поверхности. Пучок ресничек на E13 пока приобрести подвижность. В P2, когда отношение ресничек с подвижности достигли высшей точки, многие изогнутые реснички наблюдается. В Р14, реснички теряют подвижность. Масштабная линейка: 5 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Перспективы этого метода
Хотя способ, описанный здесь, не обеспечивает более точный анализ ресничек, чем ранее опубликованных методов, значение этого метода состоит в простоте системы и экономической эффективности, которые могут быть с легкостью применить для скрининга любые цилиарной подвижности экс виво. В частности, Т. Workbench обеспечивает простой и удобный интерфейс, который позволяет исследователям наблюдать и анализировать ресничек моторику более легко. Эффективные методы автоматизации отслеживания, не были разработаны для низких контрастных объектов, таких как незапятнанной ресничек в видео повышенной контрастности-DIC. Хотя способ, чтобы отслеживать движение ресничек является ручным в этой технике, количество усилий в цилиарной анализа трекинга оптимально уменьшается по сравнению с использованием пакетов программного обеспечения общего назначения для анализа изображений.
Образец рассечение
Чтобы подготовить ех естественных КЗЭК образцы, быстрые и нежные манипуляции необходимы для сохранения жизнеспособности тканей, что обеспечивает подвижность ресничек экс естественных условиях. Потому что загрязнение эритроцитов размывает поле наблюдения, нежный, но сложная полоскание расчлененный ткани с фосфатным буферным солевым раствором рекомендуется. Чтобы избежать кровотечения, необходимо проявлять осторожность, чтобы не порвать заднюю сосудистое артерии, что может быть идентифицирован как выдающийся красновато-нить, как структура придерживался пластинки affixa коллоидной сплетения.
Микроскоп
Инвертированный микроскоп оснащен DIC оптики и высокой мощности передачи источника света имеет важное значение для этого метода. Потому что ртутные лампы, как правило, не в состоянии часто включать и выключать, затвора в передней части корпуса лампы необходимо. Либо ручной или электрической затвора могут быть использованы для этой цели. Чтобы защитить образцы и наблюдательные глаза FRом УФ и ИК света, светофильтры необходимы, чтобы только видимый свет (400-700 полоса пропускания или сочетание УФ и ИК-фильтры). ND фильтры также необходимо изменить власть света, который отличается в зависимости от ситуации: мониторинг на глаз, фокусировка с видеокамерой, и высокоскоростной покадровой записи. Объектив с высокой числовой апертурой необходимо с высоким разрешением. Существует некоторое расстояние между верхней части покровного стекла и координатора из-за морфологии и толщины ткани. Таким образом, погружение в воду, а не линзы объектива масла погружения является предпочтительным для повышения качества изображения. Виброизоляция также необходимо, чтобы получить стабильные стеки изображения. Таблицы воздуха демпфер типа могут быть использованы для этой цели, но проще прокладочного микроскопа, вставив теннисные мячи под основанием микроскопа с постоянной таблицы может также работать.
Видеокамера
ПЗС-камера способна на лугул 200 кадров / сек, необходимо отслеживать движение ресничек. В течение последнего десятилетия, ПЗС-камеры с более быстрыми темпами, чем каркасных стандартная ставка видео (25-30 Гц) стали доступны на гораздо более низкие затраты. Модели камер, способные подвергать коротких времен, чем интервал кадра полезны для уменьшения размытости вследствие движения ресничек без увеличения количества данных. Время экспозиции 0,1 мс и рамы интервал 5 мс (200 Гц) являются минимальные условия для получения ресничные изображения CPECs с достаточным качеством.
Программное обеспечение
Анализ отслеживать движение каждой реснички много времени, особенно, когда общие программные пакеты для назначения анализа изображений используются для отслеживания каждого кончик ресничек. Снижение действия повторных задач, таких как мыши мыши на позиции мерцательная наконечника на мониторе, выбрав меню до записи в момент щелчка, и нажав на кнопку, чтобы перейти к следующему кадру изображения, результаты в значительной Reводство времени и усилий. В этом исследовании, специальный дня был добавлен в заказном ПО TI Workbench. В режиме слежения мерцательная программного обеспечения TI Workbench, пользователь продолжает цикл следующую простую двухступенчатую операцию: перемещение указателя мыши на кончике мерцательной и нажав клавишу со стрелкой на клавиатуре, чтобы перейти рамку, которая не требует перемещения указатель мыши или глаза пользователя, чтобы сдвинуть (с меню и кнопок на экране компьютера) из кончиков ресничек на экране компьютера. Программное обеспечение отслеживает цилиарной позиций наконечник, отображает записанные траекторию, чтобы помочь пользователю, и создает таблицу информации о движении мерцательная для дальнейшего анализа. Большая часть программного обеспечения общего назначения для анализа изображений позволяет программировать макросы для пакетной обработки таких повторных задач. Такой обычай программирование сократить повторяющиеся действия, настоятельно рекомендуется.
Анализ траекторий
Извлечение trajectoriES был проведен с использованием программного обеспечения на заказ TI Workbench, как описано выше. Относительно простой анализ и обработка изображений также осуществляется с помощью того же программного обеспечения. Для подгонки анализов, траектория каждого наконечника мерцательной был переведен Игорь Pro программного обеспечения. Другие программы расширенный анализ таких как MATLAB также могут быть использованы для этой цели.
В текущем исследовании, из-за трудностей в классификации траекторий в спину и вперед или вращательных траекторий, траектории были классифицированы на глаз слепым методом, которые были подтверждены другим наблюдателем, в результате последовательной классификации. Тем не менее, более математически строгое меры по категоризации траектории без возможного произвола бы предпочтительнее. Эллипс Место траекторий, кажется, идеал, который может количественно оценить степень эллиптичности как соотношением подогнанной эллипса () в обоих задних и вперед и вращательных движений. Однако, Попытка использовать распределение пропорции, чтобы определить пороговое значение для классификации было неэффективным. Место часто не для возвратно-поступательное траекторий, параметры часто не сходятся, и сошлись, видимо, уместно призрачны. Таким образом, эллипс Место не было принято, чтобы автоматически классифицировать траектории или количественного эллиптичность каждой траектории. Место было проведено, чтобы извлечь биение направление вращательного перемещения советы, как главной оси эллипса подогнанной.
В текущем исследовании, АР было предложено количественно оценить степень, что траектория отклоняется от идеальной линейной движения назад и вперед. Параметром является отношение ширины распределения, перпендикулярном направлению размола в том, что вдоль направления. Значение должно быть равно нулю, когда траектория прямая, и один, когда траектория круг, напоминающий соотношение эллипса, упомянутых выше.
На практике получение значения AR может быть относительно легко путем поворота траектории, так что направление биение становится параллельной оси х (4В). Это количественное приводит к значительно различные значения для двух режимов движения, предлагая возможность использования параметра не только для количественной оценки характеристик каждой траектории, но и более строго классифицировать траектории. Тем не менее, следует отметить, что само по себе направление биение уже результат различных процессов подгонки двух режимов в текущем методе.
Дальнейшее совершенствование анализа, такие как более продвинутый алгоритм подбора, может решить проблемы возможного произвола.
Аспект относительно эллиптичности траектории, что избиение каждой реснички КЗЭК не может иметь место в плоскости, строго перпендикулярно к х - у
Подготовка к SEM
Во время подготовки к SEM наблюдения, есть несколько важных моментов, которые обеспечивают получение изображений высокого качества. Во-первых, после фиксации осмия должна быть выполнена тщательно, в том числе предварительной промывки 10% раствора сахарозы. Без надлежащего фиксации в соответствии с процедурой osmification, последующие шаги не могут поддерживать или восстанавливать состояние образцов, что приводит к снижению качества препарата. Из альдегидные фиксаторы являются восстановителями, оставшиеся альдегидов в пределах образца ингибировать активность осмия, сильного окислителя. Для обеспечения ликвидации лишних альдегидов в образцах, тщательное мытье с раствором сахарозы является обязательным условием. В случаях субоптимального роСанкт-фиксация, цвет образца не меняется от коричневого до черного. Во-вторых, объем осмия должна быть по крайней мере в 50 раз больше, чем у образца. В противном случае, достаточно фиксации нельзя ожидать. В-третьих, очень важно, чтобы избежать полного высыхания образцов, в частности, в процессе дегидратации, которая использует высоко чистого этанола и изоамилацетат. Сушка образца разрушает тонкие поверхностные структуры, такие как ресничек, что приводит к плохим изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов. Эта статья направлена на отчетности подробную методику наблюдать моторику ресничек в изолированных сосудистое сплетение тканей. Научные новинки были представлены в предыдущих исследованиях 1,8.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Required reagents | |||
| for live cell imaging | |||
| ethanol | Wako Chemicals | 057-00456 | |
| Leibovitz L-15 medium | Life Technologies | 11415-064 | |
| for SEM preparation | |||
| ethanol | Wako Chemicals | 057-00456 | |
| Hank's balanced salt solution | Life Technologies | 14170112 | |
| paraformaldehyde | Merck | 1040051000 | |
| glutaraldehyde | Nacalai tesque | 17003-05 | |
| isoamyl acetate | Nacalai tesque | 02710-95 | |
| Molecular Sieves 4A 1/8 | Wako Chemicals | 130-08655 | for preparation of anhydrous ethanol |
| phosphate buffer saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| phosphate buffer, 0.1 M | To make 100 ml, mix 19.0 ml of 0.1 M NaH2PO4 and 81.0 ml of 0.1 M Na2HPO4 | ||
| monosodium phosphate (dihydrate) | Nacalai tesque | 31718-15 | |
| disodium phosphate (anhydrous) | Nacalai tesque | 31801-05 | |
| suclose | Nacalai tesque | 30406-25 | |
| osmium tetroxide | Nisshin EM | 300 | |
| dry ice | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools and materials for dissection | |||
| for both live imaging and SEM preparation | |||
| stereo microscope | Olympus | SZX7 | |
| flat paper towel | |||
| Φ10 cm plastic dish | |||
| 100 ml beaker | |||
| straight operating scissors | Sansyo | S-2B | |
| watchmaker forceps | Dumont | No.DU-3 or -4, INOX | |
| for live cell imaging | |||
| glass bottom dish | Matsunami Glass | D110300 | |
| for SEM preparation | |||
| alminum foil | |||
| 5 ml glass vial with a polyethylene cap | Nichiden Rika-Glass | PS-5A | |
| transfer pipette | Samco Scientific | SM251-1S | for specimen tranfer |
| toothpick | for specimen transfer | ||
| ion sputter with gold-palladium | Hitachi | E-1030 | |
| critical point dryer | Hitachi | HCP-2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopic equipment and materials | |||
| for live cell imaging | |||
| inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| 100 W mercury lump housing and power supply | Olympus | U-ULH and BH2-RFL-T3 | |
| 100 W mercury lamp | Ushio | USH103D | |
| DIC condenser, n.a. 0.55 | Olympus | IX-LWUCD | |
| electrrical shutter | Vincent Associates | VS35S22M1R3-24 and VMM-D1 | manual shutter can be used. |
| band-pass filter (400-700 nm, Φ45 mm) | Koshin Kagaku | C10-110621-1 | |
| ND filter (Φ45 mm) | Olympus | 45ND6, 45ND25 | combination of 25% and 6% ND filters are used |
| objective lens (water immersion) with DIC element | Olympus | UApo 40XW/340, n.a., 1.15 with IX-DPAO40 | |
| high-speed video camera | Allied Vision Technologies | GE680 | ≥200 Hz frame rate and 1 msec expose time |
| image acquisition / analysis software | in-hous software | TI Workbench | capable of acquisition at high frame rates. |
| PC for camera control / analysis | Apple | Mac Pro | |
| vibration isolation table | Meiritsu Seiki | AD0806 | |
| weight for tissue | Warner Instruments | slice anchor kits | It can be made with nylon mesh glued to a U-shape squashed Φ0.5 mm platinum wire. |
| cover glass (alternative weight for tissue) | Matsunami | made-to-order | A cover glass can be used as a tissue weight. |
| for SEM | |||
| inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| scanning electron microscope | JEOL | JSM-6510 | |
References
- Nonami, Y., Narita, K., Nakamura, H., Inoue, T., Takeda, S. Developmental changes in ciliary motility on choroid plexus epithelial cells during the perinatal period. Cytoskeleton. 70 (12), 797-803 (2013).
- Bisgrove, B. W., Yost, H. J. The roles of cilia in developmental disorders and disease. Development. 133 (21), 4131-4143 (2006).
- Fliegauf, M., Benzing, T., Omran, H. When cilia go bad: cilia defects and ciliopathies. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (11), 880-893 (2007).
- Oh, E. C., Katsanis, N. Cilia in vertebrate development and disease. Development. 139 (3), 443-448 (2012).
- Shah, A. S., Ben-Shahar, Y., Moninger, T. O., Kline, J. N., Welsh, M. J. Motile cilia of human airway epithelia are chemosensory. Science(New York, N.Y). 325 (5944), 1131-1134 (2009).
- Kiprilov, E. N., et al. Human embryonic stem cells in culture possess primary cilia with hedgehog signaling machinery). The Journal of Cell Biology. 180 (5), 897-904 (2008).
- Hirokawa, N., Tanaka, Y., Okada, Y., Takeda, S. Nodal flow and the generation of left-right asymmetry. Cell. 125 (1), 33-45 (2006).
- Narita, K., Kozuka-Hata, H., et al. Proteomic analysis of multiple primary cilia reveals a novel mode of ciliary development in mammals. Biology Open. 1 (8), 815-825 (2012).
- Takeda, S., Narita, K. Structure and function of vertebrate cilia, towards a new taxonomy. Differentiation; Research in Biological Diversity. 83 (2), S4-S11 (2012).
- Ikegami, K., Sato, S., Nakamura, K., Ostrowski, L. E., Setou, M. Tubulin polyglutamylation is essential for airway ciliary function through the regulation of beating asymmetry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (23), 10490-10495 (2010).
- Foster, K. W.
- Lechtreck, K. -F., Sanderson, M. J., Witman, G. B. High-speed digital imaging of ependymal cilia in the murine brain. Methods in Cell Biology. 91, 255-264 (2009).
- Okada, Y., Hirokawa, N. Observation of nodal cilia movement and measurement of nodal flow. Methods in Cell Biology. 91, 265-285 (2009).
- Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).
- Takeda, S., et al. Left-right asymmetry and kinesin superfamily protein KIF3A: new insights in determination of laterality and mesoderm induction by kif3A-/- mice analysis. The Journal of Cell Biology. 145 (4), 825-836 (1999).
- Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy. The Journal of Cell Biology. 27, 137-138A (1965).
