Introduction
La ricerca medica ha beneficiato immensamente dallo studio di entrambe le linee cellulari umane e modelli animali. Linee cellulari consentono un migliore controllo dei componenti in un sistema, così come l'uso di cellule dalla corretta organismo. Lavorare con le cellule umane, mentre più rappresentativo, presenta un'istantanea drasticamente semplificata di meccanismi che potrebbero essere responsabili per la salute e la malattia, perché le linee di cellule non potrebbero riassumere l'impatto di altre cellule, componenti stromali e gli organi che possono influenzare le risposte 1. D'altra parte, i modelli animali, anche se non del tutto accurata nel riprodurre malattie umane e eterogeneità genetica, offrono ulteriore comprensione, consentendo per l'introduzione di sistemi animali interi nella maggior parte dei modelli 2,3.
Carenze a parte, entrambi i metodi hanno i loro vantaggi e sono complementari. Tuttavia, l'obiettivo principale rimane per studiare le cellule e organi umani, in un corpo pieno, sistema multi-organo. Di conseguenza, la ricerca traslazionale ha takit grandi passi avanti nel facilitare lo studio di organi e tessuti umani estratti da pazienti, al fine di cogliere meglio i meccanismi della malattia di base. Ricerca traslazionale offre il vantaggio di studiare il risultato di trattamenti e malattie in tutto il corpo e in cellule opportune, fornendo in tal modo il meglio dei due mondi tra cellula animale e di lavoro 4.
Ricerca traslazionale inoltre, non è esente da difetti. Campioni raccolti da pazienti umani, dopo la rimozione dal padrone di casa, sono immediatamente sottoposti a ischemia e altri fattori esterni, da cui sarebbero stati altrimenti protetti. Ciò può causare cambiamenti molecolari e genetiche indotte dallo stress, e causare pregiudizi in studi successivi. Pertanto, molto sforzo è stato messo in estrarre e trattare i tessuti con metodi rigorosi per conservare meglio organo e l'integrità delle cellule per gli studi a valle 5. È importante sottolineare che le future applicazioni devono essere considerate attentamente quando si seleziona i metodi of elaborazione campioni umani, come certi metodi possono essere dannosa per i componenti cellulari e vie di segnalazione, risparmiando altri.
Per ogni ricerca che coinvolge i tessuti umani, questioni normative devono essere affrontate. Dopo le relazioni di Tuskegee e Belmont, c'è stata una crescente accettazione del fatto che la ricerca biomedica è risultato associato a rischi spesso con conseguente dilemmi etici inevitabili 6. La necessità di norme nazionali è stata riconosciuta e il governo federale ha creato Institutional Review Boards (IRB) come un mezzo per sostenere i principi del Rapporto Belmont (rispetto delle persone, la beneficenza, la giustizia).
IRB di ogni istituzione è un comitato di medici, ricercatori e membri della comunità che sono responsabili per la protezione dei partecipanti alla ricerca. Si richiede che il consenso volontario presso tutti i partecipanti di studi di ricerca biomedica, e che tale consenso documentato in un consenso informato fo rm. Il processo di consenso informato si propone di fornire informazioni adeguate a un partecipante, in modo che una decisione informata può essere fatta o meno di iscriversi in uno studio, o di continuare la partecipazione. A questo proposito, il documento di consenso informato deve avere una buona leggibilità e dovrebbe essere scritto in un linguaggio che può essere facilmente compreso (6 all'8 livello di lettura grado) da parte della popolazione bersaglio. La possibilità di coercizione o indebito condizionamento deve essere ridotto al minimo, e il soggetto deve essere dato tempo sufficiente per prendere in considerazione la partecipazione. Il partecipante deve essere consentito di esercitare il diritto di revocare il consenso in qualsiasi momento durante il corso dello studio senza penalità. Consenso informato volontario è un pre-requisito obbligatorio per la partecipazione di un soggetto nel campo della ricerca ed è anche giuridicamente efficace 7.
Come da regolamento per la protezione dei diritti umani assoggetta 21 CFR 50.25 (/45cfr46.html">http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html 8), partecipanti allo studio devono essere informati dello scopo della ricerca, le procedure coinvolti nella ricerca, alternative alla partecipazione, tutti i rischi prevedibili e disagi (tra cui non solo danni fisici, ma anche possibile danni psicologici, sociali o economiche, disagio o disagio), i benefici della ricerca per la società e, eventualmente, per l'individuo, tempo in cui il soggetto si aspetta di partecipare, persona da contattare per le risposte alle domande o in caso di un infortunio connesse alla ricerca o di emergenza, dichiarazione che indichi che la partecipazione è volontaria e che il rifiuto di partecipare non comporterà alcuna conseguenza o qualsiasi perdita di benefici, come un compromesso in una regolare cura clinica che il partecipante ha comunque diritto a ricevere come risultato dei suoi / sue diagnosi, e, infine, una dichiarazione per quanto riguarda il diritto del soggetto alla riservatezza e diritto di recedere dalstudio in qualsiasi momento senza conseguenze. I campioni di tessuto da partecipanti che si ritirano consenso nel corso dello studio non devono essere inclinate e devono essere immediatamente esauriti. Rinuncia di uno o più elementi di consenso informato possono essere ottenute presso la IRB per alcuni progetti di ricerca che non possono praticamente essere fatto senza una modifica gli elementi necessari o per studi in cui gli elementi richiesti non sono applicabili. Grande cura deve essere presa per garantire la riservatezza dei dati. La Health Insurance Portability e Accountability Act (HIPAA) è una legge federale che impedisce di utilizzo o la divulgazione "Protected Health Information" (PHI) senza il consenso scritto da parte dei partecipanti. PHI include ma non si limita alle informazioni sulla salute trasmesse o mantenuti in qualsiasi forma o mezzo e comprende campi che potrebbero essere utilizzate per identificare un individuo 9.
Attraverso questo lavoro, ci proponiamo di delineare il protocollo da seguire durante tissue trattamento - compresi gli appalti, e lo stoccaggio e sottolineano l'importanza di queste linee guida rigorose seguente, in modo da ridurre al minimo le distorsioni che possono derivare a causa delle sollecitazioni un tessuto è sottoposto al momento dell'estrazione. Abbiamo anche sforziamo di fornire una breve panoramica dei saggi a valle o analisi (Figura 1) che possono essere eseguite su tali esemplari modo che i lettori possano esprimere un giudizio qualificato su quale dosaggio (s) più adatta alle loro esigenze.
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Protocol
Dichiarazione Etica: Questo protocollo è approvato dalla University of Texas MD Anderson Cancer Center.
1. Procurement campioni
- Raccogliere campioni di tessuto tumorale ricerca da surplus e relativo tessuto normale 10-12. Conservare i campioni sul ghiaccio bagnato per evitare autolisi.
- Invia tutti i tessuti, dispositivi medici e corpi estranei rimossi durante una procedura chirurgica per il Dipartimento di Patologia all'esame necessario per facilitare una diagnosi patologica.
- Maniglia tessuto assegnato per la ricerca in conformità con la ricerca applicabili e le politiche bancarie dei tessuti e delle procedure.
NOTA: collezione Biospecimen richiede un coordinamento delle patologi, patologi 'assistenti, histotechnologists e specialisti di approvvigionamento dei tessuti.
2. Patologia Quality Assurance (QA)
- Completare e verificare i dati dei pazienti come misura QA precoce e consultare un patologo a rivedere pa diagnosticorecord di degenza per (rapporti di patologia, scivoli di tessuto, ecc) e campioni di tessuto. Campioni di tessuto giudice caratteristiche morfologiche di interesse come la percentuale di tumori, necrosi, l'interfaccia del tessuto tumorale, ecc Questo è in linea con le best practice biorepository 10-12.
- A seguito di revisione iniziale, condurre revisioni periodiche dei dati biorepository e campioni di ricerca durante l'intera durata del soggiorno dei biospecimen.
- Risultati di link e annotazioni di istopatologici e altre indagini ai campioni e fornire questi dati ai ricercatori attraverso un sistema di software biorepository proprietario.
NOTA: i processi QA assicurare l'integrità di entrambi gli aspetti clinici e tecnici delle operazioni biorepository. - Eseguire i test genetici e molecolari per verificare e caratterizzare i campioni per uso clinico.
- Raccogliere e analizzare i dati in base al feedback da parte dei ricercatori che hanno utilizzato i campioni per esperimenti di laboratorio. Tracciacampioni che utilizzano la tecnologia del codice a barre. Questo sistema di monitoraggio elettronico è anche sostenuto in best practice biorespository 10-12.
3. campioni / Tissue Processing
- Conservare sempre campioni di tessuto fresco in ghiaccio, e procedimenti più rapidamente possibile, al fine di limitare i cambiamenti indotti da estrazione del campione di tessuto dal suo ambiente naturale. Processo normale tumore abbinato e campioni di tessuto tumorale separatamente per evitare la contaminazione incrociata.
NOTA: In base a protocolli di ricerca, elaborazione biospecimen può comportare la raccolta di esemplari in uno o più tipi di media. - Prima di iniziare il processo, preparare una piastra di Petri sterile cultura, un bisturi, così come un ago o pinze per la lavorazione del tessuto. Accertarsi che i tubi sono stati preparati, etichettati, e disposti al fine di limitare il tempo di trattamento del campione (Figura 2).
- Tutte le informazioni pertinenti dei tessuti, come ad esempio il nome del paziente, il numero, il trattamento, la data dichirurgia, e altre informazioni pertinenti come può essere adatto per lo studio, dovrebbero essere resi facilmente accessibili in un database del tessuto istituzionale. Informazioni per il paziente limitata dovrebbe essere tenuto in laboratorio in formato cartaceo o foglio di calcolo.
NOTA:. Raccogliere solo le informazioni biospecimen pertinenti alla natura del cioè ricerca, la ricerca di base biomedica, la ricerca clinica, la ricerca traslazionale, ecc Per informazioni malattia-specifica, il personale biorepository dovrebbe raccogliere dati ritenuti necessari per la letteratura e le organizzazioni che governano a assicurare una corretta diagnosi e la ricerca di significato. Questo include ma non si limita ai gradi tumorali e cancro informazioni stadiazione. - Piano tutti gli esperimenti successivi desiderati in anticipo, per decidere la dimensione delle sezioni di tessuto necessari per ogni tipo di analisi, così come la posizione di escissioni. Idealmente, anche se impossibile, tutte le analisi devono essere rappresentativi di tutta la sezione di tessuto al fine di tenere conto di heterogenei tessutoty e il limite di polarizzazione delle analisi a valle. Disporre tutti gli elementi richiesti in anticipo come illustrato nella Figura 2.
- Posizionare il campione di tessuto del piatto di coltura di Petri aperta, piatto contro la superficie.
NOTA: Consenti solo personale autorizzato biorepository per gestire i campioni individuati e per consultare i dati sanitari identificati. Gli investigatori dovrebbero accedere solo quelle identificazione del paziente, come consentito dalle consensi informati firmati e come regolato dalla IRB. Tutti i campioni devono essere adeguatamente etichettati e dovrebbero comprendere come minimo, un numero di identificazione dei tessuti e tessuti tipo unico. Non includere qualsiasi PHI nelle etichette, in conformità alla normativa HIPAA. - Controllare il campione da tutti gli angoli, per ottenere una migliore comprensione della struttura e dimensioni. Pin il campione al fondo del piatto con l'ago, e procedere alla bisettrice del tessuto lungo il suo asse maggiore e migliore rappresentante.
- Tagliare un piccolo pezzo di tessuto e metterlo in una sterile 1,5 ml micrtubo ocentrifuge contenente 1 ml di soluzione-RNA stabilizzante. Questo esempio può essere collocato sul ghiaccio per il resto del processo e conservata a 4 ° C fino al momento dell'uso.
NOTA: Quando si lavora con l'RNA, guanti deve sempre essere indossato, e puntali con filtro RNasi-free dovrebbe essere usato per limitare le possibilità di degradazione e la contaminazione di RNA. - Disporre una cassetta biopsia aperta e pre-marcato nel coperchio del piatto cultura Petri. Tagliare una fettina di tessuto di spessore non superiore a 5 mm 3 e trasferirlo alla cassetta. Mettere la cassetta nel 10% neutra tamponata formalina (NBF) per un minimo di 72 ore. Trasferire la cassetta in etanolo al 70% per l'archiviazione a lungo termine prima di paraffina-embedding.
NOTA: Labeling di cassette deve essere effettuata a matita o con marcatori raccomandati come uso di xilene durante la lavorazione si altrimenti cancellerà etichette. - Tagliare un pezzo di tessuto e metterlo in uno stampo di tessuto. Coprire la sezione di tessuto in temperatura ottimale di taglio (OCT) composto, e congelare immediatamentea -20 ° C per criosezionamento. Questa sezione di tessuto può essere conservato a -20 ° C fino al momento criosezionamento.
- Tagliare uno o più pezzi di tessuto e di trasferirli in un tubo da 50 ml contenente tampone MACS (1x tampone fosfato salino (PBS), siero fetale bovino 0,5% (FBS), 2 l'acido etilendiamminotetracetico mm (EDTA)) per la successiva citometria a flusso di analisi . Per la citometria a flusso, i campioni più grandi possono essere preferibile in quanto le cellule potrebbero essere persi durante dissociazione tumore, la fissazione delle cellule e permeabilizzazione quando richiesto. Generalmente, questa sezione può essere presa alla fine, una volta che tutte le altre parti sono state elaborate. Leftover campione del tumore rappresentante può essere utilizzato per la citometria a flusso. Opzionalmente, questo tubo può essere conservato a 4 ° CO / N o utilizzati per la colorazione di citometria di flusso immediatamente dopo la digestione in una sospensione cellulare (vedere il punto 4 - citometria a flusso colorazione).
- Tagliare resto del tessuto in pezzi non più grandi di una dimensione massima di 0,5 mm x 0,5 mm e trasferirli criogenicofiale per immediatamente congelati in azoto liquido. Questi campioni a scatto congelati possono essere utilizzati per analisi future e le finalità di collaborazione.
NOTA: La cura supplementare dovrebbe essere presa quando si lavora con l'azoto liquido come il contatto diretto può provocare gravi lesioni. Gli occhi devono essere protetti con occhiali di sicurezza con protezioni laterali o con una visiera. Guanti criogenici dovrebbero anche essere indossati per proteggere dalle scottature azoto liquido causati da spruzzi e il contatto diretto. I guanti devono misura giusta ma essere abbastanza largo da rimuovere rapidamente dovrebbe azoto liquido spruzzata in loro.
4. citometria a flusso Colorazione
- Tissue omogeneizzazione
- Preparare medio digestione con DMEM (40 ml), DNasi I (50 U / ml) e collagenasi I (2 mg / ml). Luogo fresco o tumore O / N-memorizzato in tampone MACS nel coperchio di una piastra di Petri e sommergere con mezzo di digestione.
NOTA:. Esistono diversi metodi di digestione, ciascuno con vantaggi (per esempio, superficie cellulare proteina expressione, vitalità). Assicurarsi di avere il metodo corretto per l'applicazione a valle desiderata. - Tumore bottone al fondo del piatto con un ago, e taglio dall'esterno per centrare con un bisturi, fino a quando il tumore ha una consistenza pastosa. Trasferimento mix tumore ad un tubo da 50 ml, sigillo e mettere in un sacchetto di plastica per evitare perdite. Trasferire tubo un'incubatrice, e ruotare a 225 RPM, 37 ° C, 1 ora.
- Filtro sospensione delle cellule tumorali attraverso un colino cellula 70μm. Sospensione cellulare a 250 xg Centrifugare, 4 ° C, 5 min. Risospendere pellet di cellule in 1 ml di tampone di FACS (500 ml di PBS, 1 ml di 0,5 m stock EDTA, 10 ml FCS o FBS).
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro e risospendere alla concentrazione di 1x10 7 cellule / ml. Trasferire 100 microlitri per pozzetto (10 6 celle) in una piastra di fondo pozzo rotondo 96 per la colorazione.
- Preparare medio digestione con DMEM (40 ml), DNasi I (50 U / ml) e collagenasi I (2 mg / ml). Luogo fresco o tumore O / N-memorizzato in tampone MACS nel coperchio di una piastra di Petri e sommergere con mezzo di digestione.
- Viabilità e anticorpi colorazione
- Aggiungere 200 ml di soluzione colorante vitalità in ogni pozzetto e mescolare. Incubate per 30 minuti, a 4 ° C, al buio. Spin le cellule a 250 xg, 4 ° C, 5 min, e aspirare il surnatante.
- Aggiungi miscela di anticorpi a raccomandato / concentrazione titolato (secondo produttore) per antigeni di superficie in 200 ml di tampone FACS. Incubare le cellule a 4 ° C, 30 min, al buio. Spin le cellule a 250 xg, 4 ° C, 5 min, e aspirare il surnatante.
- Lavare con 200 ml di tampone FACS, centrifugare le cellule a 250 xg, 4 ° C, 5 min, e aspirare il surnatante. Risospendere le cellule in 200 ml di buffer di FACS e procedere al citofluorimetro per l'acquisizione e l'analisi.
NOTA: Se si effettuano intracellulare citometria a flusso colorazione, eseguire fissazione e passi permeabilizzazione e colorazione intracellulare tra i passaggi 4.2.2 e 4.2.3. Se si esegue citochine colorazione, le cellule devono essere pre-attivato colorazione precedente come raccomandato, e un inibitore del trasporto della proteina intracellulare e la secrezione quali monensin dovrebbero essere utilizzati durante l'attivazione perassicurare il mantenimento di fattori solubili. Cellule fisse possono essere conservate a breve termine (una settimana) a 4 ° C al buio prima di acquisizione su un citometro a flusso.
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Representative Results
I risultati visualizzati rappresentano il flusso di strategia citometria gating per un'ampia fenotipizzazione immunitario un tumore melanoma trattati. Il giorno di colorazione, campione di tessuto è stato digerito con collagenasi e omogeneizzato I e DNasi I incubazione per 60 min a 37 ° C sotto 225 rotazione RPM. A seguito di digestione, sospensione cellulare è stata filtrata attraverso un colino cella 70 micron per eliminare i detriti e le cellule sono state colorate con il flusso di fluorescenza marcata citometria anticorpi per fenotipizzazione delle cellule immunitarie. Sotto (Figura 3) è indicata la strategia di gating e colorazione per più marcatori sul tessuto memorizzato O / N a 4 ° C in tampone MACS. Come mostrato, campioni trattati come descritto e immagazzinato O / N in tampone MACS a 4 ° C mostrano mortalità estremamente limitata. Inoltre, questo dato dimostra che il tessuto trattamento come sopra descritto consente multicolore ampia fenotipizzazione di sottoinsiemi di cellule immunitarie nei tumori melanoma.
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Figura 1. Le analisi che possono essere effettuate da campioni di sangue e tessuti umani. Panoramica dei test che possono essere effettuate dopo la trasformazione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Componenti necessari per l'elaborazione del tessuto ed uno stoccaggio. Esempio di configurazione per la lavorazione dei tessuti. Tissue può essere sezionato nella cultura piatto Petri (A) con l'ago e bisturi. Pezzi rappresentativi di tessuto devono essere trasferiti alla cassetta biopsia (B), che dovrebbe poi essere trasferito in un contenitore NBF (C) per tre giorni la fissazione a temperatura ambiente. Un altro pezzo di tessuto deve essere posto in un cryomold (D) e coperto in soluzione PTOM prima della being congelato a -20 ° C. Un grande pezzo di tessuto deve essere trasferito in un tubo da 50 ml (E) per citometria a flusso colorazione e può essere conservato a 4 ° C in tampone MACS O / N. Un piccolo pezzo di tessuto deve essere trasferito in una provetta da 1,5 ml con soluzione stabilizzante RNA (F) e conservato a 4 ° C fino al momento dell'estrazione dell'RNA. Infine, il tessuto residuo deve essere tagliato in pezzi e trasferito cryotubes (G) per snap-congelamento in azoto liquido e conservazione a lungo termine. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Flusso strategia di gating citometria di ampio fenotipizzazione immunitario. Esempio di un'ampia strategia fenotipizzazione gating immunitario mediante citometria a flusso sul tumore melanoma memorizzato O / N a 4 °;. C in tampone MACS 13 Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Infine, i metodi di lavorazione devono essere dettate dalla ipotesi desiderata e previsti saggi tecnici da eseguire (Figura 1). La sezione seguente serve come una panoramica di descrivere eventuali saggi che possono essere eseguite su tali sezioni di tessuto. E non è affatto un quadro esaustivo, ma ha lo scopo di aiutare i metodi di lavorazione campione di guida e scelta di saggi a valle con tecniche descrivere ed elencare i loro punti di forza e di debolezza.
Citometria a flusso colorazione può essere eseguita su sezioni di tessuto appena sezionati, o frammenti archiviati O / N in tampone MACS a 4 ° C. Facilita flusso citometria fenotipizzazione e analisi di popolazioni di cellule estratte da campioni di tessuto altamente specifico e consente la colorazione dei marcatori fino a 17 cellule superficiali e proteine intracellulari, citochine e proteasi in una singola cella. Inoltre, alcuni citometri permettono ingrandimento singola cella, per determinare localizatione di proteine all'interno della cellula piuttosto che esclusivamente positività e intensità dei segnali. Infine, la massa permette citometria per la quantificazione di oltre 35 proteine nello stesso campione, con il rovescio della medaglia è che le cellule devono essere lisati e, pertanto, non può essere ulteriormente coltivate, scelte, o analizzato nel suo complesso 14. Questa tecnica consente di analizzare molti marcatori e proteine e caratterizzazione dettagliata a livello di singola cellula. Tuttavia, il flusso richiede citometria omogeneizzazione tessuti e perdita di architettura del tessuto e deve essere eseguita su tessuto fresco per minimizzare variazioni fenotipo cellulare. È importante sottolineare che, in ritardo di stoccaggio dei tessuti destinati alla citometria a flusso può avere un impatto contenuto delle celle, come alcuni sottogruppi di cellule possono essere più vulnerabili all'ischemia. Fosfoproteine possono essere scarsamente rilevata anche mediante citometria di flusso se la cinetica di trasformazione sono ottimali 15.
Formalina fissazione e inclusione in paraffina (FFPE) di sezioni di tessuto può essere la scelta migliore in caso diincertezza riguardo future analisi, perché permette elevata flessibilità nei tipi di saggi che possono essere effettuate. Tradizionalmente, le sezioni FFPE sono sezionate su un microtomo in 5 sezioni micron per immunoistochimica (IHC) o immunofluorescenza (IF) colorazione. Tuttavia, i tessuti FFPE sono ben conservati, e possono quindi essere utilizzati per diversi scopi. Infatti, il taglio di sezioni più spesse da blocchi FFPE DNA e consente sia l'estrazione dell'RNA con kit disponibili in commercio, così come protein array a fase inversa (RPPA) analisi 16-18. Pertanto, campioni di tessuto trasformazione in FFPE possono offrire il vantaggio di flessibilità, così come il vantaggio di mantenere la struttura del tessuto per immunostaining e quindi fornire una più accurata in vivo -come rappresentazione delle strutture tissutali e popolazioni cellulari. FFPE permette di sezioni di tessuto da conservare per lunghi periodi di tempo. Questa tecnica, tuttavia, hanno alcuni svantaggi. Sezioni sottili utilizzati per FFPE farenon rappresentino eterogeneità tessuto da tagli sequenziali e sezioni di tessuto cominciano a ossidare una volta esposto all'aria ambiente compromettendo RNA e DNA qualità. Infine, grazie alla reticolazione, co-colorazione delle proteine, da IHC su sezioni FFPE richiede ottimizzazione.
Quando si desidera microscopia tramite IHC o IF, uso di un OCT è preferibile. Sezioni OCT-memorizzati devono essere tagliati con un cryotome prima di essere immessi su vetrini e utilizzati per IHC e IF. Ottobre conserva antigenicità e minimizza sfondo che rende la tecnica ottimale per la microscopia. Ottobre permette anche il congelamento immediato e taglio rispetto al FFPE che richiede parecchi giorni in NBF. Nonostante questi vantaggi, ottobre è generalmente meno stabile e meno flessibile di FFPE perché solo IHC e IF possono essere eseguite da sezioni di tessuto OCT-embedded.
Per quanto riguarda l'analisi dell'RNA, i campioni conservati a 4 ° C in soluzione RNA stabilizzante indurire nel tempo, permettendo una migliore e RNAxtraction attraverso kit di estrazione disponibili in commercio e TRIzol, tra gli altri. RNA permessi estrazione analisi a valle come la reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa (RT-PCR) per quantificare l'espressione di geni trascritti RNA, analisi di sequenza, e un'ampia analisi spettro di geni modulati da microarray o analisi nanoString. Di conseguenza, l'RNA isolamento da tessuti può essere estremamente alto rendimento, fornendo informazioni dettagliate su espressione genica e percorsi interessati dalle terapie e malattie. È importante sottolineare, tuttavia, espressione di RNA può variare drasticamente in base alla struttura del tessuto e le dimensioni di campionamento, cura in modo dovrebbe essere presa per evitare di polarizzazione analisi a causa della posizione di campionamento. Inoltre, la natura di RNA suggerisce che si possono verificare cambiamenti dinamici nei livelli di espressione, in modo da più attenzione deve inoltre essere adottate per garantire la cinetica adeguate sono seguite per studiare i geni e percorsi di interesse 19,20; trattamento dovrebbe essere limitata a seguito di estrazione da-RNA stabilizzazione sOLUZIONE per garantire la stabilità. Di conseguenza, lo stoccaggio di DNA complementare (cDNA) di maggiore stabilità preferisce RNA (se in linea con l'analisi a valle) 21. Infine, perché RNA può spesso essere amplificato in analisi a valle, frazioni minute di cellule contaminanti possono provocare grandi distorsioni nei risultati ottenuti.
Analisi del DNA può essere eseguita su campioni di tessuto precedentemente snap-congelati o su sezioni di tessuto FFPE. Questi metodi consentono successiva exome intero o intero sequenziamento del genoma, due tecniche che hanno dimostrato immensa promessa attraverso l'identificazione di mutazioni e polimorfismi legati alla risposta del paziente e la prognosi in molteplici contesti di malattia. Estrazione del DNA può consentire ulteriore identificazione di cellule T e cellule B recettore (TCR e BCR) sequenze presenti nei campioni, al fine di acquisire conoscenze relative agli antigeni e risposta immunitaria nella terapia e malattie 20,21. Rispetto a RNA, DNA è altamente stabile una volta estratto, tuttaviaessa tiene conto trascrizionale e traslazionale regolazione dei geni, così come modificazioni post-traslazionali e regolazione 22.
Proteina può essere estratto direttamente da scatto congelato sezioni di tessuto, o da campioni FFPE al fine di eseguire il western blot, co-immunoprecipitazione per identificare interazioni e reti proteiche, nonché RPPA, una tecnica ad alto rendimento permettendo la quantificazione relativa di centinaia di proteine in un unico campione di 23. Tuttavia, questa tecnica consente l'identificazione di proteine note solo attraverso la sua esigenza di anticorpi specifici. È importante sottolineare che ulteriori analisi modificazioni post-traduzionali, come la fosforilazione di proteine, richiede un rapido trattamento dei tessuti a causa di instabilità 15.
Snap-congelamento dei campioni è semplice e non richiede risorse limitate. Consente inoltre di memorizzazione a lungo termine dei campioni quando non sono ancora stati definiti analisi a valle, tranne nelcaso di citometria a flusso che deve essere eseguita su campioni freschi. Snap-campioni congelati possono essere facilmente condivise per scopi collaborativi.
In definitiva, la quantità di dati che può essere estratta da un unico pezzo di tessuto è infinita. Non esiste una risposta giusta universale a cui test devono essere eseguiti in ogni studio. Ogni ricercatore deve quindi garantire che lui / lei prende in considerazione tutte le ipotesi, gli esperimenti desiderati così come le risorse disponibili prima di assumere i pazienti e la lavorazione dei tessuti, in quanto ciò potrebbe influenzare notevolmente la progettazione degli studi e delle risposte che si ottengono.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dai contributi filantropici della John G. e Marie Stella Kenedy Memorial Foundation (Grant # 0.727.033) e il Melanoma Research Alliance. Gli autori desiderano ringraziare l'Università del Tissue Texas MD Anderson Cancer Center Institutional Bank (ITB) di coordinare la distribuzione di tessuti e di raccolta e facilitare la ricerca traslazionale, così come il dottor Ignacio Wistuba, il dottor Victor Prieto, il Dipartimento MD Anderson Cancer Center di Patologia e il Programma di Tiro Melanoma Luna. Infine, gli autori desiderano ringraziare tutti i pazienti e le famiglie colpite da melanoma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Needles | BD | 305167 | |
| Stainless steel disposable scalpels | Miltex | 4-410 | |
| Tissue culture dish | Corning | 353003 | |
| Biopsy Cassettes | Thermo Fisher | 58931 | |
| RNA-stabilizing solution | Ambion | AM7021 | |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Phenix | MAX-815 | |
| 50 ml tubes | Corning | 430290 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | StatLab Medical Products | 28600-5 | |
| Formalin Containers | Fisher Scientific | 23-032-059 | |
| Optimal cutting temperature solution (OCT) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura Finetek | 4557 | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Collagenase I | Roche | 11088793001 | |
| 70μm cell strainers | BD Bioscience | 352350 | |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3799 | |
| Live/Dead stain solution | Life Technologies | L34957 |
References
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