Précis et phénol libre ADN sexage des embryons de porcins Jour 30 par PCR

Summary

Ce protocole décrit une méthode précise, peu coûteuse, rapide et non toxique pour déterminer le sexe d’un embryon porcin au jour 30 à l’aide d’une méthode PCR après broyage d’un embryon en poudre sans extraction au phénol chloroforme et purification de la colonne d’ADN.

Abstract

La recherche sur la programmation prénatale chez le porc a montré que le sexe de l'embryon ou du foetus peut influencer le résultat du développement. Par conséquent, la capacité de déterminer le sexe d'un embryon est nécessaire dans de nombreuses expériences en particulier en ce qui concerne le développement des jeunes. Le présent protocole démontre une préparation peu coûteuse, rapide et non-toxique de l'ADN génomique de porc pour une utilisation avec la PCR. Jour 30 embryons doivent être humainement collectées selon les lignes directrices établies par des institutions politiques relatives aux animaux et comités de protection pour le présent protocole. La préparation de l'embryon entier de cette technique basée sur la PCR de sexage consiste simplement en broyant le embryons congelés en une poudre fine en utilisant un mortier pré-refroidi et un pilon. ADN par PCR qualité est libéré à partir d'une petite quantité de poudre d'embryons par application d'une incubation à chaud dans un réactif de lyse alcaline. Ensuite, la solution d'ADN est mélangé avec un tampon de neutralisation et utilisé directement pour la PCR. Deux paires d'amorces sont générés pour DETECSexospécifiques t déterminer région du chromosome Y (SRY) et la région ZFX du chromosome X avec une grande précision et de spécificité. Le même protocole peut être appliqué à d'autres embryons allongés (de jour 10 et le jour 14) jours au plus tôt 30. En outre, ce protocole peut être réalisée avec des plaques de 96 jailli lors de la sélection d'un grand nombre d'embryons, ce qui rend possible pour l'automatisation et la haute débit typage sexe.

Introduction

Le porc domestique est devenue un sujet de recherche fondamentale dans le développement, la génétique et de la nutrition dans les deux secteurs de l'homme et le bétail. Le potentiel de porcs comme modèles biomédicaux pour la recherche humaine peut être attribuée à leurs similitudes physiologiques. Dans l'élevage, la manipulation de la sex-ratio peut améliorer l'efficacité de sélection et d'amélioration génétique des programmes ^1. Sexage des embryons individuels est un outil fondamental utilisé dans de nombreuses études expérimentales, y compris, mais sans s'y limiter, le génotype, l'épigénétique et X inactivation du dimorphisme sexuel au début du développement embryonnaire ^2.

Études chez la souris suggèrent que le régime alimentaire de la mère et d'autres facteurs peuvent entraîner un déséquilibre entre les sexes ^3. Chez les porcs, les causes de sex-ratio déséquilibre comprennent race paternelle ^4, la capacité de l'utérus ^5, et l'état métabolique de la truie ^6. Étant donné que les différences observées dans les embryons et les portées peuvent être influencés par soixual dimorphisme, les chercheurs doivent être conscients de l'embryon de sexe et les rapports sexuels avant de tirer des conclusions au sujet de leur recherche. Le développement d'outils et de protocoles efficaces pour le sexage des embryons de porcs au jour 30 du développement sera discuté ici.

Diverses méthodes de typage du sexe ont été développés pour les études génétiques chez les organismes modèles et le bétail. En particulier dans l'élevage, l'identification des embryons précoces, hommes et femmes est une pratique très courante pour améliorer la sélection génétique pour les programmes de sélection. Embryons précoces caryotype chez le porc en utilisant Giemsa ^{7 ou} la fluorescence intense ^8,9 techniques ont été utilisées pour le typage de sexe. Cependant, ces méthodes prennent beaucoup de temps et ne conviennent pas pour le criblage de grands nombres d'embryons rapidement et avec précision.

Le procédé de typage de sexe le plus efficace est l'amplification d'ADN en utilisant une ADN polymérase stable à la chaleur et une paire d'amorces. ADN sexage par la méthode PCR est plus spécifique, rapide et sensible, onécessitant eul une infime quantité de matériaux cellulaires. La première sexage des embryons par PCR a été effectuée sur des êtres humains ^10, et plus tard chez la souris ^11, les bovins, les buffles ^{12 13 et 14} moutons embryons pré-implantatoire. Chez le porc, la méthode de typage de l'ADN du sexe plus tôt a été établi pour les embryons de pré-implantation par une seule paire de chromosome Y amorces d'ADN spécifiques ^15. Cependant, des amorces de PCR les plus courantes pour la détermination du sexe ont été choisis dans le chromosome Y du gène SRY spécifique mâle ^{16 et la} non-sex région discriminante d'un gène à doigt de zinc située à la fois X et Y ^{chromosome 17.} Par la suite, ces amorces ont été appliqués pour déterminer le sexe d'embryons du jour 30 dans la présente étude avec une meilleure spécificité des amorces pour détecter uniquement le chromosome X d'un gène à doigt de zinc.

L'ADN génomique de porc embryons pré-implantation peut être extraite par l'exposition d'un blastocyste intact pour tamponner avec proteinase K ¹⁶ ou en prenant une biopsie de quelques cellules de la coupure rapide individuelle embryons de ¹⁵ et de les utiliser pour la PCR directe. Cependant, la libération de l'ADN à partir de sang de porc, les cheveux, les tissus ou une grande conceptus sur quelques centimètres dans la taille est pas effectivement fait en utilisant la méthode protéinase K. Méthodes d'extraction de l'ADN de ces matériaux ont été créés en utilisant soit chronophages protocoles phénol / chloroforme ^{6 ou} des kits basés colonne coûteuse ^18. Afin d'éviter l'utilisation de produits chimiques potentiellement toxiques, il y a une tendance à développer des méthodes d'extraction d'ADN faciles et sans phénol peu coûteux. Ce type de protocole pour l'isolement de l'ADN génomique par PCR qualité de la souris ^{19 et} de poisson zèbre ²⁰ tissus a été établie à l'aide d'hydroxyde de sodium chaud et Tris (champion). Cette étude fournit un protocole pour obtenir de l'ADN avec des paires d'amorces duplex modifiés champion et redessinés pour le sexe PCR tapant directement à partir de lysats cellulaires de Jour 30 embryons de porc avechaute précision.

Protocol

En accord avec le Conseil canadien sur les directives de protection des animaux et avec l'approbation de la politique animale Faculté Comité social et - l'élevage de l'Université de l'Alberta, les truies gestantes ont été euthanasiés par le personnel formé à environ 30 jours de la grossesse et embryons ont été collectés. Utilisez des gants d'examen à tout moment pendant les procédures.

1. Prélèvement et stockage des échantillons

1. Euthanasier truie par cheville percutante suivi par exsanguination. Porter des gants d'examen pour recueillir l'appareil reproducteur et des embryons de chaque truie euthanasiés.
   Remarque: la collecte rapide d'échantillons et d'embryons de transfert à la glace sèche ou l'azote liquide se traduira dans les tissus de qualité supérieure pour les autres œuvres moléculaires tels que microarray et qPCR.
2. Disséquer l'utérus et on sépare doucement toutes les embryons dans leurs membranes extra-embryonnaires placentaires de la paroi de l'utérus ²¹ sous-jacent. Assurez-vous qu'il n'y a pas de contamination des tissus maternels.
3. Réla longueur du cordon et le poids de tous les embryons viables avant la congélation.
4. Recueillir chaque embryon individuel et immédiatement l'envelopper dans une feuille d'aluminium avant pression de congélation à l'azote liquide.
5. Transférer les embryons congelés de l'azote liquide directement à un -80 ° C congélateur.

2. Grinding embryons

1. Étiqueter tous les tubes échantillons (15 ml) avec l'ID de l'échantillon nécessaire pour le nombre d'échantillons à analyser.
2. Remplissez le réservoir thermique avec de la glace sèche à moitié plein et insérer le tube pré-étiquetés échantillon dans la glace sèche.
3. Porter des gants d'hiver avec une autre paire de gants d'examen sur le dessus pour transférer les mortiers et pilons pré-réfrigéré de -80 ° C congélateur pour sécher le bac à glaçons.
4. Placez l'embryon congelé à l'intérieur du mortier sur la glace sèche.
5. Verser de l'azote liquide suffisante pour couvrir l'embryon et le moudre avec le pilon en une poudre fine.
6. Transférer la poudre d'embryon à un tube pré-étiquetés échantillon avec une MICRospatula (Figure 1) et placer le tube dans un congélateur à -80 ° C.
7. Utiliser un mortier et un pilon pré-réfrigérés propre pour chaque embryon et changer les gants d'examen après broyage chaque embryon pour éviter la contamination croisée entre les échantillons.

3. L'ADN génomique préparation à l'aide d'hydroxyde de sodium de modification Méthode

1. tous les tubes de microcentrifugation d'étiquetage (1,5 ml) nécessaires pour le nombre d'échantillons à analyser.
2. Transférer les tubes d'échantillons contenant de la poudre d'embryon de -80 ° C congélateur dans un récipient avec de la glace sèche avant de commencer.
3. Introduire à la pipette 180 pi de NaOH 50 mM (hydroxyde de sodium) dans chaque tube pré-étiquetés microcentrifugeuse.
4. Activer un incubateur et de pré-chauffage à 95 ° C.
5. Utiliser un cure-dent pour transférer la quantité correcte de poudre d'embryons (environ 5-10 mg) (figure 2) à partir du tube d'échantillon dans un tube de microcentrifugation de pré-marqué contenant la solution de NaOH 50 mM.
6. tirez up la même cure-dent lentement pour visualiser le lysat d'ADN comme un collant, gluant, substance transparente comme blanc (Figure 3).
7. Transférer les microtubes avec de l'ADN du lysat dans l'incubateur préchauffé à 95 ° C pendant cinq minutes. Transférer immédiatement le tube à une boîte de styromousse rempli de glace.
8. Ajouter 20 pi de 1 M Tris-HCl directement dans le tube à centrifuger et mélanger en tapotant doucement le tube. Utiliser un papier indicateur de pH pour s'assurer que le pH est d'environ 8,0 (Figure 4) avant la centrifugation.
   Remarque: Lorsque vous traitez avec un grand nombre de préparations d'échantillons, il est acceptable de choisir au hasard quelques échantillons pour vérifier le pH.
9. Centrifuger le tube avec le lysat d'ADN à 2000 x g dans une microcentrifugeuse pendant deux minutes à température ambiante pour éliminer les débris de tissu non dissous.
10. Transfert 150 pi de haut surnageant clair dans un nouveau tube ou plaques à 96 puits.
    Remarque: Le lysat d'ADN limpide est prête à utiliser comme modèle dans le PCR réactionnel et il est stable à 4 ° C pendant deux semaines, ou bien il peut être conservé à -20 ° C pendant un an.

Les amorces de PCR 4. Design Sex-spécifiques

1. Obtenir les numéros d'accès pour le sexe porcin région de détermination de Y (SRY) (de NM_214452.3) et et (ZFX) gènes liés à l'X protéine à doigt de zinc (XM_005673501.1) de site NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov /.
2. Copier et coller ces numéros d'accession NCBI à un outil de conception d'amorce en ligne.
   Note: La meilleure information des amorces dont la longueur, Tm et GC% ainsi que la taille du produit PCR (pb) sera généré sur l'écran de l'ordinateur (Figure 5).
3. Valider la spécificité de ces amorces en utilisant le programme Blast nucléotidique (Blastn) contre la base de données génomique porcin courant 104 de sorte que ces séquences ne sont situés sur le chromosome X et Y pour SRY et ZFX respectivement (figure 6).

5. L'ADN génomique par PCR Directement à partir de l'ADN lysats

1. Utilisationuniquement 1 ul du lysat de l'ADN comme matrice pour une réaction PCR de 15 ul.
   Remarque: Une méthode de criblage à haut débit pour des plaques à 96 puits PCR peut être réalisée de manière similaire à l'aide d'une pipette multicanaux.
2. Ne le suivant juste pour la première PCR: préparer un tube PCR pour le pas de modèle contrôle négatif et deux tubes supplémentaires pour les contrôles positifs en ajoutant 1 pi (0,5 ng) d'ADN génomique porcine sexuel connu obtenue dans le commerce. Plus tard, inclure un échantillon du dernier succès l'analyse de sexage de contrôle positif et courir avec la nouvelle réaction de PCR pour la détermination du sexe.
3. Utiliser tout mélange prêt enzyme PCR HotStart et préparer un mélange maître par des amorces ajout et la nucléase l'eau libre en fonction du nombre total de réactions PCR. Ajouter 1 pi de lysat de l'ADN dans un tube PCR préexistant avec 14 ul du mélange maître PCR. Ajouter des amorces de telle sorte que la concentration finale des amorces à partir de deux gènes spécifiques au sexe est de 0,3 uM dans 15 ul total de PCR reaction.
4. Configurer le programme de PCR suivant dans un cycleur thermique: 95 ° C pendant 3 min, 35 cycles chacun avec une masse fondue à l'étape 20 sec 98 ° C, suivie d'une étape de recuit de 15 secondes à 65 ° C, suivie d'une étape d'élongation 15 sec à 72 ° C. Dans une dernière étape, incuber les réactions pendant 1 min à 72 ° C et continuer à incuber à 4 ° C jusqu'à ce que le retrait du tube de PCR pour la vérification de l'électrophorèse sur gel pour déterminer le sexe.
   Remarque: Les conditions de PCR et l'optimisation sont selon le manuel du kit PCR mentionnée dans le tableau des matériaux.
5. Ajouter la quantité appropriée de non toxique serre SYBR fluorescent gel d'ADN tache lors de la préparation d'un gel agarose à 2% TBE.
   Remarque: Le bromure d'éthidium peut être substitué à colorant fluorescent serre si elle ne sont pas disponibles.
6. Ajouter 1,5 ul du colorant de chargement (10x) dans le tube PCR et bien mélanger par pipetage le tampon de réaction PCR up-and-down.
7. Charge 10 pi de l'échantillon dans le puits et rnon le gel d'agarose avec réglages de tension appropriées (de petits appareils de gel à 100 V, 96 puits appareil de gel à 150 V jusqu'à ce que la bande de colorant fonctionne à mi-chemin à travers le gel).
8. Observer et ajuster les bandes intensités sous le réglage de l'éclairage fluorescent à l'aide d'un scanner laser et capturer une image du gel. Remarque: imageur gel commune peut être remplacé par du gel au bromure d'éthidium.
9. Déterminer le sexe des embryons de porc en identifiant les embryons avec une bande en tant que femme et deux bandes comme un mâle (figure 7).

Results

Un résultat représentatif de la détermination du sexe de l'ADN des lysats 345 criblage par PCR est montrée à la figure 7 et résumées dans le tableau 1.

Comme on peut le voir sur la figure 7, la température d'annelage des amorces à 65 ° C est la condition optimale dans ce protocole PCR générer la même intensité et la taille des amplicons prédites (Figure 5) ent...

Discussion

La plupart des protocoles existants en matière de sexe porcine typage de l'ADN des embryons ne conviennent qu'aux stade précoce stade pré-implantatoire ^15,16. Nous avons développé avec succès un protocole approprié pour le dépistage des embryons de porc en fin de gestation. Basé sur des études avec des stades de développement similaires d'embryons provenant d'études précédentes ^6,18, le présent protocole est considéré comme plus sûr et à faible coût.

Ce ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit  ;	KAPABiosystems	KR0370	d’autres Hot Start Taq polymérase peuvent être utilisés après optimisation
SYBR Safe DNA Gel Stain	Life Technologies	S33102	Le bromure d’éthidium peut être substitué à SYBR Safe
Pig ADN génomique femelle et mâle	Zyagen	GP-160-F1 & GP-160-M5	Des contrôles postifs à partir de tissus d’ADN sexuel connu peuvent être utilisés.
Typhoon FLA 9500 scanner laser	GE Healthcare Life Sciences	28-9969-43	autre système d’imagerie peut être utilisé
Gants d’examen en nitrile souple gratuits	WWR	89038-270	tout autre gant d’examen peut être utilisé
Hydroxyde de sodium, solide  ;	Fisher	BP 359 -212	Biologie moléculaire
Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1,5 ml, PCR clean	Eppendorff	0030 108.051	résistant à la chaleur
ThermoStat plus	Eppendorff	22670204	Utiliser comme incubateur pour 95 ° ; C, pas besoin d’utiliser le radiateur
Cure-dents	Bunzl Plc	75200815	Tous les cure-dents ronds en bois peuvent être utilisés - bois de qualité
Microcentrifugeuse 5417R / 5417C	Eppendorff	22621807	Ce modèle a été abandonné. Mais un autre modèle plus récent peut être utilisé
: Microspatula	Fisher	SDI28540115	Autoclavé avant utilisation à chaque fois.