Abstract
A型流感病毒（IAV）血细胞凝集素识别在细胞表面上的唾液酸作为功能性受体来获得进入细胞。野生水禽是IAV的自然宿主，但是可以IAV跨越物种屏障家禽，猪，马和人。禽流感病毒识别由α2-3键（禽型受体）附连到倒数第二个半乳糖，而人类病毒优先识别唾液酸与α2-6键（人型受体）唾液酸。并监控如果禽流感病毒正在适应人型受体，可使用几种方法。用合成唾液酸糖苷的多样库聚糖微阵列越来越多地用于评估受体特异性。然而，这种技术不用于测量亲合力。亲合力的测量一般是通过评估系列稀释血凝素或病毒的结合以吸附到常规聚丙烯96孔板聚糖实现。在该测定中，聚糖与α2-3或α2-6唾液酸连接到生物素并吸附到链霉板，或连接到聚丙烯酰胺（PAA），其直接吸附到塑料。我们通过直接印刷的PAA联唾液酸糖苷及其非PAA联的对应于微井载玻片已显著小型化该测定。这种设置，与在单个幻灯片48阵列，使得能够6聚糖8稀释结合蛋白，询问6个不同的聚糖，包括两个非唾液酸化的控制的同时测定。这相当于在传统的平板测定18倍的96孔板。该聚糖阵列格式降低化合物和生物制品的消费，从而大大提高了工作效率。
Introduction
野生水禽是IAV的自然宿主，但是IAV能够跨越物种屏障，禽类和哺乳动物，包括人类。禽流IAVs认识α2-3连接的唾液酸（禽型受体），而人类病毒结合α2-6连接的唾液酸（人型受体）。为了能够有效复制和人类禽类IAV需要绑定到人型受体1之间传递。
IAVs是基于血清学表征其血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）包膜糖蛋白的抗原性划分。 HA结合到唾液酸，而NA是在病毒的生命周期并切割唾液酸2的另一端的受体破坏酶。所有的人感染病毒，包括H1N1，H2N2和H3N2，有禽源3。在过去的二十年中几个禽类到人类交叉的发生，用H5N1，H7N7，和H7N9是最公知的;豪版本，其他亚型传染人类更零星（H6N1，H7N1，H7N2，H9N2，H10N7，H10N8）4。幸运的是，似乎没有这些病毒已经能够完全适应人型α2-6连接的唾液酸受体5-8。禽流感或其他人畜共患的病毒适应，以适应人类宿主复制和传播可能对人体健康产生破坏性的影响。因此，这些病毒是如何发展结合人型受体将有助于新兴流感病毒全球范围内监视的先验知识。
受体偏好的测定采用不同物种的红细胞首次阐明并保持流感研究者9-12之间的青睐检测。即禽流感病毒识别α2-3唾液酸α2-6连接的唾液酸人类病毒的示威最初是基于使用酶设计包含每个李红细胞血凝化验nkages 13,14。虽然读出是血细胞凝集，一个标准测定为病毒学家，底层聚糖结构没有定义，只有终端联系。此外，唾液酸转移酶，用于重新sialylate细胞的有限的可用性，已经限制了使用该测定15-18中。接着，使用连接于聚丙烯酰胺（PAA）或聚谷氨酸（PGA）的结构在基于板的测定法19,20唾液酸化聚糖结构中引入确定受体结合偏好的其他方法。几种变化是在涂覆或聚糖或病毒微量滴定板，其中每一个导致一个健壮的，可靠的和非常敏感的ELISA型测定21-23可能。可替代地，生物素连接的聚糖可以取代的PAA / PGA和可以缀合到链霉抗涂层板2,24。虽然可能需要一些特定的血清，酶联免疫吸附都与PAA标准和几个聚糖容易commercially和非商用（财团为功能糖组学（http://www.functionalglycomics.org））。
聚糖微阵列技术已成为一个宝贵的工具，以确定受体特异性，为多个不同的聚糖发现，并结合到多种不同结构可以在单一实验中25-29评估。 IAV的这些结构的结合提供了更好的理解，即IAV优先识别30-33的聚糖结构。聚糖微阵列需要少量的样本量来进行结合分析，只有使用每点（2 NL）聚糖微量。然而，这些阵列通常仅用于评估聚糖受体特异性。的多种病毒，或血凝素蛋白，在多个浓度范围分析可以望而却步由于所需的幻灯片的数量。此外，迄今为止，没有相对亲合力测定已使用聚糖芳开发射线技术。
结合由聚糖微阵列技术和基于ELISA的测定法的PAA联聚糖的灵敏度，得到低样品要求，我们试图开发一个多井聚糖阵列将允许对具有相似或更好的分辨率高通量分析相比传统的基于ELISA的测定法。同时，我们希望最小化消耗的生物制品和报道的化学品的量。最终的结果是一个小型化的亲合力测定中，专门用于监测IAV特异性开发的，同样适用于评估其他聚糖结合蛋白。使用由聚四氟乙烯面具分为48微孔载玻片，6种不同的聚糖看准每孔6个重复。该芯片平台能提供受体趋势相同绑定看到在宏观ELISA格式几个优点。这些包括（I）中6次重复化合物的印刷，使用最少的样品，与若干行的涂布我呐板，使用每孔100μl; （二）多种不同的化合物在单井，包括控制同时进行分析; （Ⅲ）在培养体积和大规模减少; （IV）使用荧光读出一个较大的动态范围。单个幻灯片可以被计算为等于18倍的96孔板。
用下面的协议，任何实验室能够制造和分析的斑点的微阵列应该能够制造这种小型化的ELISA形式。
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Protocol
注：所有步骤都在室温下进行，除非另有说明。
1.阵列建设
- 多糖制备及板设置
- 准备打印缓冲区的股票。首先使500毫升磷酸氢钠的150mM的储备液。也使50毫升磷酸二氢钠溶液的150毫原液。在烧瓶中，使用磁力搅拌棒和pH计，直到达到pH为8.5缓慢滴定与一元溶液的磷酸氢钠溶液中。添加吐温-20〜0.005％。
- 准备聚糖样品。稀释PAA结合聚糖（diLacNAc（Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA），3SLNLN（Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA）和6SLNLN（Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA（ 图1A ））被以稀释至100μG/ ml，在从step1.1.1。单价聚糖打印缓冲器，diLacNAc（Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-（CH 2）3 NH 2，3SLNLN（Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ - （CH 2）3 NH 2）和6SLNLN（Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1- 4GlcNAcβ - （CH 2）3 NH 2）），以100μM在从步骤1.1.1打印缓冲器。最后，准备胺官能染料，如方格标记/着陆灯使用。染料标记点是在1μM打印。
注：Atto488-NHS染料中的打印使用。然而，任何胺官能染料，由滑动扫描器可读适合此目的。 - 转移10微升每聚糖样品至384孔微量滴定板的，用于印刷的机器人。将未使用的聚糖在在密封管-20°C的打印缓冲溶液。 Tansfer 10微升染料标记印刷板。
- 印花
注意：所有STEps的这种担心触摸或移动必须用手套来完成的幻灯片。- 根据布局的正确配置放置样仪销在打印头。此布局使用一个针打印所有样品和阵列。打印聚糖六块，跳过一个特征（特征被定义为某种化合物的单点），在每一侧，以使得相同样品的斑点不完全打印彼此旁边。
注：最终用户必须决定的配置。 - 从袋，打开箱子除去幻灯片，并除去任何灰尘颗粒或小片的塑料，可能通过在每个滑动吹超高纯度氮气是在其表面上。放置幻灯片的期望数量，涂布面朝上，在点样仪阶段。
- 节目的点样仪，使用的每次访问27点参数的源板，用3“预点”到聚-L-赖氨酸涂覆的载玻片，在打印针的尖端，以除去过量的液体
- 打开MPU（主电源单元）和气候控制单元。打开计算机上平铺分析软件。
- 选择布局打印。选择要用于打印阵列1×1的打印工具选项→针工具 - 1单针。选择目标选项卡→工具数组定义→打印模式与添加的间距（点到点的距离），将要打印的行和容纳样品的列的数量，以及样品的印刷图案（此阵列的8 ×8印刷图案在340微米间距为7总样本）中使用。
- 选择目标→幻灯片版式和编程块到块的距离，让每个重复阵列打印到48孔（4×12）幻灯片模板。选择源和（当使用1针1对每个样品）（此打印7来源皮卡将被用来容纳6样品孔和1个染料标记井）添加源皮卡的数量。
注：源对话应该把绿色，以显示该号码源的访问匹配的印刷图案要打印的样品。 - 选择目标→适配器板和幻灯片布局和调整幻灯片编号（5张幻灯片都是一次打印此打印1预去斑幻灯片）。
- 通过点击T1按钮来激活托盘和添加幻灯片的所需数量的托盘，密切关注点样前滑（蓝色）和“真实的”幻灯片的位置释放托盘。
- 广场上所有剩余的真空端口平原载玻片阻止真空，然后单击确定以激活真空。检查所有幻灯片就位，然后单击确定托盘返回初始位置。
- 装载印版到所述板夹持器，并确保齿条来代替设置正确。点击GO，让打印过程继续进行。
- 打印中，每个阵列6点重复其余24个点（4阵列/源的访问）。
- 加载384孔板装入打印机，开始打印。保持相对湿度，在打印时，在整个打印之间55和65％。打印5张幻灯片后，打印机停止。
注意：虽然在此测定法与微阵列中的特定的8×8图案被印刷，不同的微阵列印刷机器人将需要设备特定的编程来实现所需的布局。它是由最终用户来确定给定的其设备的规格的最适当的模式。
- 根据布局的正确配置放置样仪销在打印头。此布局使用一个针打印所有样品和阵列。打印聚糖六块，跳过一个特征（特征被定义为某种化合物的单点），在每一侧，以使得相同样品的斑点不完全打印彼此旁边。
- 加湿/固定化
注意：一旦幻灯片打印结束后，他们接受一个临时的固定化步骤，也称为加湿。加湿印刷后有助于均匀通过重新润湿斑点，并确保完全阻断样品附件。- 放于100％湿度室玻片一段30分钟印刷后立即。通过将非常湿纸巾平在一个大的玻璃盘的底部，放置幻灯片构造腔室关于某种架上，诸如试管架，打印面朝上的，并用保鲜膜套住中的水分密封。
- 数用酒精/耐溶剂标志着一个干燥盒笔和存储幻灯片。变干过夜。
- 编号，阻塞和存储
- 准备封闭液 - 50毫米乙醇胺在50 mM的硼酸盐缓冲液。首先，溶解硼酸，在DDH 2 O至50mM的终浓度在含有磁搅拌棒的烧瓶中。大力搅拌溶液在搅拌盘，直到所有的固体溶解。同时不断搅拌，从16.54 1M贮存液中添加乙醇胺适量以达到预期的50mM的浓度。添加浓氢氧化钠调整到9.2的最终pH。
- 浸入印刷载玻片在1小时的封闭缓冲液溶液。
- 继1小时，冲洗的幻灯片在DDH 2 O，除去封闭缓冲任何多余的痕迹。配置适当的废物容器封闭液。
- 转移幻灯片玻璃染色持有者和甩干。干阵列通过将它们放置在配备有摆动板持有者离心机，在10 xg的转速为5分钟。
- 一旦载玻片是干的，它们可以立即孵育或存储。储存条件是在一个密封的塑料袋-20℃。
2.分析聚糖结合蛋白
- 制备加湿室，其中待杂交的阵列将适合。一个简单的室由耐热盘，在分层蘸用纸巾和一个机架，在其上的幻灯片将休息底部。
- 使用生物素化凝集素的SNA（ 桑布卡黑凝集素）和ECA（ 刺桐cristagalli凝集素）以10微克/毫升+ 2微克/毫升链霉-555染料，在探测缓冲液（PBS + 0.01％吐温-20）。对于HA（A /越南/ 1203年至1204年的H5N1和A / KY / 07 H1N1，在这个例子中），使用20微克的起始浓度/ ml的预络合，如前所述34。简要地说，使HA：鼠标-α-链球菌：山羊-α-鼠标Alexa647混合物在封闭缓冲液（PBS + 3％BSA + 0.01％吐温-20）中，在4：2：1的摩尔比。
注：该阵列探测与外源凝集素以确定聚糖被固定和可检测（ 图1B）。 - 的20微升聚糖结合蛋白 - 抗体混合溶液转移至384孔板中并在冰上孵育30分钟。连续稀释凝集素和HA样品1：1，在其合适的缓冲液，8倍，通过将10微升的样品与10微升缓冲液中。
- 吸管8微升样品到微孔表面和孵育在90分钟密封加湿（100％RH）下室中。
- 通过保持边缘和浸渍他们四次和0.05％吐温的PBS的混合物洗载玻片一次一个，然后四PBS倍，并在去离子H 2 O最后四次运用在封闭步骤中描述的相同的干燥协议，旋阵列干燥在离心机中在10×g下5分钟。
3.扫描和数据分析
注：聚糖微阵列可以在不同的设置，扫描取决于芯片扫描仪制造商。通过改变激光功率和分辨率，该仪器可以产生与它的动态范围（ 图1C）内尽可能多的信号尽可能的图像。
- 使用荧光滑动扫描器，并与聚糖结合蛋白孵育后，立即扫描阵列。注意确保幻灯片正确插入扫描仪。
- 开扫描软件。单击开始以打开该程序。连接到扫描仪：扫描仪→连接或绿色按钮在扫描仪的导航面板菜单。
- 扫描仪打开门自动加载磁带机。放入插槽幻灯片在特定的顺序自动加载机。关闭自动加载磁带机门。氯ICK“读装载机”中的工具导航面板自动检测扫描仪的幻灯片。
- 设置扫描参数：合适的实验（ 如 635激光功率高，检测增益50％）扫描仪→扫描参数。扫描幻灯片：扫描仪→扫描。通过创建一个文件夹来保存扫描图像和名称单独扫描选择路径。做到这一点之前，实际的扫描。重复每个单独的幻灯片。单击确定开始扫描。
- 使用扫描仪软件来设置仪器和扫描的幻灯片。设置扫描器迭代扫描在低激光功率（5毫瓦）随的25％，50％和75％的增益设置。
注：在设置中进行测试和优化，但要记住，每次扫描可降低可能由于漂白染料的荧光输出。- 开放数据采集和分析软件如MAPIX软件。单击开始以打开该程序。打开扫描图像：文件→打开聊天室年龄。打开GAL文件：分析→开放式网格并选择适当的GAL文件。
- 进入块模式：图像→模式的块移动的网格。使用网格标记到网格设置在滑动的适当位置。调整各个块所必需的印刷阵列相匹配。
- 进入点模式：图像→点模式来调整位置和块内的个别景点的大小。一旦所有的块和斑点调整到位，措施的信号强度通过分析→光度计算。减输出文件。
- 一旦载玻片完成扫描，图像分析用于与安装的（ 图 1D - G）的图像处理程序的结合的信号。对于图像分析，加载在扫描TIFF图像一个GAL（数组列表）文件。
注意：GAL文件包含当场布局模式，每个点的位置的标识。数组GAL文件是CR通过使用包含样品的身份和他们在384孔源板位置的制表符分隔文本文件中的打印机软件eated。 - 使用印在芯片格标记/着陆灯要正确放置GAL网格。个别位置可能需要被单独移动，但一个印刷井阵列通常将允许在网格内的块放置自如。下面的网格布局，由软件收集点强度，并保存为制表符分隔文本文件（.txt）。
- 使用电子表格程序，打开扫描仪的输出文件。从打开的文件夹位置适当的宏文件。点击查看→宏→RunMacro。
注意：预写将复制的原始输出数据，删除不必要的行和列，由试样的数据进行排序，计算平均平均信号减去背景值，并在绘制所得值以包含每个图表的电子数据表的工作表六SAMP的莱斯阵列上进行测试。
- 使用电子表格程序，打开扫描仪的输出文件。从打开的文件夹位置适当的宏文件。点击查看→宏→RunMacro。
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Representative Results
打印，扫描和数据分析
为确保正确打印，至关重要的是有聚四氟乙烯面罩内的斑点网格，它描绘了在幻灯片上的每个阵列的正确对准。在印刷中，由于聚四氟乙烯涂层的性质，点不能由上MPX幻灯片肉眼看到。注意的是然后在聚-L-赖氨酸包被的玻片预斑点的外观。印刷后直接，各滑动应当由眼对每个斑点化合物是可见的存在，由于在现场干燥缓冲区的盐检查。数组检查的特氟隆边框和发现功能正确数内点正确对准。
幻灯片在较低的迭代过程进行扫描，以更高的扫描电源，以避免光漂白，并允许HIG的比较她的亲合力降低亲和力结合蛋白，其具有较高和较低的输出信号，分别。下面扫描，在输出图像中的每个点的荧光强度使用的成像程序进行测定。每个阵列的重叠与印刷阵列表面（ 图1D - G）对要素的数量相匹配的网格文件。使用印刷荧光染料，印刷聚糖的边界被定义并与该印刷样品的身份集成掩模lassoes每个点。成像面具套索将记录成像点的所有方面（大小，信号强度，在网格中，坐标等 ）和输出信息到一个制表符分隔文本文件。使用制表软件（电子表格），将样品由身份排序和平均信号强度减去背景被平均在6点的每个样品的4，留出的最高和最低的信号作为异常值。平均中值信号的线图减去背景作图抵抗施加到所述阵列的八个蛋白浓度，并包含各样品一行。最终输出图形是利用一个非线性回归计算（ 图1I）平滑。
聚糖结合蛋白
在PAA-阵列是用来评估病毒血凝素的流感受体结合特异性。我们的阵列的一个附加特征，不存在于类似板测定中，非唾液酸化的控制，在相同微阱中列入。以评估打印化合物是印刷后目前常用的植物凝集素具有已知特异性使用。 ECA结合联β1-4到N-乙酰基 - 葡糖胺（Galβ1-4GlcNAc或LacNAc）末端半乳糖，并且如果终端的半乳糖与唾液酸封端将不结合。 ECA仅检测对我们的小型化聚糖ARR非唾液酸化聚糖AY（ 图2A）。缺乏结合于任何的唾液酸化聚糖的样品也表明，这些完全用末端唾液酸封端。为α2-6连接的唾液酸，SNA用作凝集素控制（ 图2B）。正如所料，SNA只结合α2-6连接的唾液酸，但对于PAA联非PAA联的二 - LacNAc重复亲和力显着的差别。这种差异反映PAA联聚糖的灵敏度并且允许可与低亲和力结合蛋白质的鉴别。为α2-3连接的唾液酸，从已知识别α2-3连接的唾液酸仅酸的A /越南/ 1203/04病毒衍生的H5血凝素，使用6。所述的H5HA的结合特性的确显示了特异性α2-3连接的唾液酸，与用于PAA联结构（ 图2C）更高的亲合力。最后，使用从人类季节性H1N1病毒的血凝素H1，正如预期的那样，只势必α2-6连接的含唾液酸结构（ 图2D）。
图1：印刷，扫描和图像分析 （A）中的PAA缀合6SLNLN被示为被印在载玻片的代表性多糖结构。 （B）孵育的多井聚糖阵列上的聚糖结合蛋白被示出具有创建该阵列表面上的液滴的8微升的体积。 （C）按照在一个共焦荧光滑动扫描器阵列和扫描的聚糖结合蛋白的孵育时，获得的代表图像。 （D）图像叠加与网格和，使用用于正确对准网格标记，单点进行分析。 （ 五 ）密切了一套完整的8个阵列，的其中一个聚糖结合蛋白1稀释液：使用八个1进行了分析。 （F）的一个单一的阵列，在一个单一的井被表示;该阵列是通过在右上角（3点）和左下（2点）网格标记周围限定，这聚糖结合蛋白结合在阵列上的单一化合物，为六个复制是清晰可见。 （G）网格显示用套索包围特定的具体位置。 （H）成像软件从图像文件计算信号值并输出制表符分隔的数据文件。 （I）中的数据可以在电子表格或stastical软件创建一个代表输出图形被制成表格。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：植物凝集素（ECA，SNA）和IAV HEMA的输出具有不同特异性gglutinins（H5从A /越南/ 1203/04，H1从A /肯塔基州/ 07）。（A）的ECA结合终端LacNAc或Galb1-4GlcNAc具体地说并检测所述非唾液酸化的化合物的存在下，作为对照对于IAV血凝素。 （B）SNA只承认聚糖承载终端α2-6唾液酸。 （C）的H5N1型的重组血凝素（A /越南/ 1203/04）株结合α2-3唾液酸并提供了一种禽类型受体结合特性。 （D）人类季节性H1N1的重组血凝素（A /肯塔基州/ 07） 结合只有人型受体。荧光信号强度测量每个点，平均强度减去平均背景是使用电子表格程序来计算。对于每个聚糖，平均信号强度计算从6个重复的斑点。的6次重复的最高和最低的信号是除去，剩余的4个复制品TES被用来计算所述平均信号，标准偏差（SD），以及标准误差测量（SEM）。图表示每个样品和误差棒平均平均信号减去背景是SEM值。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
评估IAV的受体特异性在分析禽流感病毒大流行潜力的重要一步。由病毒唾液酸识别被链接到几个生物性能如从细胞结合和释放。其中知识氨基酸的突变是必要的禽流感病毒实现α2-6结合和跨越物种屏障使大流行的准备。数测定法用于确定受体特异性;但是，所有有其缺点，包括尺寸仅为亲和力，而不是特异性， 反之亦然 。
这里，我们描述基于广泛使用和接受的ELISA，一种新型的小型化的工具，它使用更多的复杂聚糖的PAA联末端片段。使用4-良好定义的凝集素，植物的2和流感2病毒起源，我们表明，我们维持特异性和相对亲合力。
当我们计算减少化学物质和BIOLOG的量通过小型化ELISA到聚糖阵列芯片使用的iCal，我们到达惊人的巨大差异。第一，生物制品;我们用10倍更少的测定体积，并使用6测试化合物在6个重复;这可以计算为的36倍的行中的96孔板的等价物。其结果是，我们使用360X少生物制品。关键步骤包括正确打印，并使用未纯化聚糖结合剂或较差的检测抗体高背景的风险。
在该试验中所使用的，化合物虽然仍然可用，不容易被化学 - 酶促合成的。使用微阵列的印刷技术，每个点仅2 NL相比，每一个微量滴定板的孔100μl。打印包含48井和6个化合物，在6个重复一张幻灯片，我们消耗大约1152 NL。在96孔板的结果相同的涂布步骤在相同浓度共1842孔用100μl化合物的涂覆。因此，印花T他相比，平板检测法复合，我们达到一个惊人的减少1,500x。因此，在总，生物制剂通过1500倍减少360倍和聚糖消耗。使用机器人液体处理器，我们设想，大多数步骤可以自动化，允许整个测定法中用作高通量筛选。
虽然印刷芯片和后续的图像分析的确需要特殊机械和工具，这些工具并不罕见，是存在许多大学和研究机构。印刷是直接的，不需要化学改变。因此，我们认为，与化合物和简单印刷技术的这个最小量，该测定可以更普遍适用。因为它减少了培养体积，抗体和宝贵的生物制品的成本，这种技术会使其可行的资源有限的实验室评估IAV或高保真其它聚糖结合蛋白的特异性，同时维持较低的成本秒。
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Acknowledgments
这项工作由斯克里普斯芯片核心设施，并从疾病控制中心（JCP）合同的一部分得到了支持。 RPdV是来自荷兰科学研究组织（NWO）一个人Rubicon和VENI授权的收件人。由NIGMS授予GM62116（JCP）资助的财团为功能糖组学（http://www.functionalglycomics.org/）提供在这项研究中使用的几个聚糖。这是来自斯克里普斯研究所的出版物29113。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEXTERION® Slide H MPX-48 | Schott | 1091525 | Microwell slides |
| ProScanArray Plus | PerkinElmer | discontinued | confocal microarray scanner |
| Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software | Innopsys | - | confocal microarray scanner |
| MicroGrid II | Digilab | - | microaray printer |
| SNA | Vector Labs | B-1305 | Plant Lectin |
| ECA | Vector Labs | B-1145 | Plant Lectin |
| Anti-Strep Antibody | IBA | 2-1509-001 | Anitbody for HA binding |
| Anti-Mouse Alexa-647 | Life | A-21235 | Anitbody for HA binding |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | detergent |
| di-basic Sodium Phosphate | Sigma | 255793 | printing buffer component |
| mono-basic Sodium phosphate | Sigma | 229903 | printing buffer component |
| poly-l-lysine solution | Sigma | P8920 | pre-spotting slide component |
| sodium hydroxide | Sigma | 221465 | pre-spotting slide component |
| ethanol | Sigma | 493546 | pre-spotting slide component |
| phosphate buffered saline | Corning | 46-013-CM | incubation/washing buffer |
| SMP4B pins | Telechem | SMP4B | printing pin |
| Compressed Nitrogen (Grade5) | Praxair | UN1066 | general dusting/drying tool |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | Slide blocking reagent |
| ethanolamine | Sigma | E9508-500ML | Slide blocking reagent |
| Atto 488 | AttoTec | AD 488-91 | Gridmarker on array |
| PAA-LNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA368 | Spotted glycans |
| PAA-3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA362 | Spotted glycans |
| PAA-6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA343 | Spotted glycans |
| LNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te98 | Spotted glycans |
| 3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te175 | Spotted glycans |
| 6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te176 | Spotted glycans |
| 384-well microtiter plate | Matrix TechCorp | 4361 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-150 | Slide Numbering |
| Wheaton slide staining dish | Sigma | Z103969-1EA | Blocking and Drying |
References
- Tumpey, T. M., et al. A two-amino acid change in the hemagglutinin of the 1918 influenza virus abolishes transmission. Science. 315 (5812), 655-659 (2007).
- Xu, R., et al. Functional balance of the hemagglutinin and neuraminidase activities accompanies the emergence of the 2009 H1N1 influenza pandemic. J Virol. 86 (17), 9221-9232 (2012).
- Bouvier, N. M., Palese, P.
- Freidl, G. S., et al. Influenza at the animal-human interface: a review of the literature for virological evidence of human infection with swine or avian influenza viruses other than A(H5N1). Euro Surveill. 19 (18), (2014).
- Xu, R., et al. Preferential recognition of avian-like receptors in human influenza A H7N9 viruses. Science. 342 (6163), 1230-1235 (2013).
- Paulson, J. C., de Vries, R. P. H5N1 receptor specificity as a factor in pandemic risk. Virus Res. 178 (1), 99-113 (2013).
- Tzarum, N., et al. Structure and receptor binding of the hemagglutinin from a human H6N1 influenza virus. Cell Host Microbe. 17 (3), 369-376 (2015).
- Zhang, H., et al. A Human-Infecting H10N8 Influenza Virus Retains a Strong Preference for Avian-type Receptors. Cell Host Microbe. 17 (3), 377-384 (2015).
- Carroll, S. M., Higa, H. H., Paulson, J. C. Different cell-surface receptor determinants of antigenically similar influenza virus hemagglutinins. J Biol Chem. 256 (16), 8357-8363 (1981).
- Gambaryan, A. S., et al. Specification of receptor-binding phenotypes of influenza virus isolates from different hosts using synthetic sialylglycopolymers: non-egg-adapted human H1 and H3 influenza A and influenza B viruses share a common high binding affinity for 6'-sialyl(N-acetyllactosamine). Virology. 232 (2), 345-350 (1997).
- Rogers, G. N., D'Souza, B. L. Receptor binding properties of human and animal H1 influenza virus isolates. Virology. 173 (1), 317-322 (1989).
- Rogers, G. N., et al. Single amino acid substitutions in influenza haemagglutinin change receptor binding specificity. Nature. 304 (5921), 76-78 (1983).
- Paulson, J. C., Rogers, G. N. Resialylated erythrocytes for assessment of the specificity of sialyloligosaccharide binding proteins. Methods Enzymol. 138, 162-168 (1987).
- Paulson, J. C., Sadler, J. E., Hill, R. L. Restoration of specific myxovirus receptors to asialoerythrocytes by incorporation of sialic acid with pure sialyltransferases. J Biol Chem. 254 (6), 2120-2124 (1979).
- Chutinimitkul, S., et al. In vitro assessment of attachment pattern and replication efficiency of H5N1 influenza A viruses with altered receptor specificity. J Virol. 84 (13), 6825-6833 (2010).
- Glaser, L., et al. A single amino acid substitution in 1918 influenza virus hemagglutinin changes receptor binding specificity. J Virol. 79 (17), 11533-11536 (2005).
- Herfst, S., et al. Airborne transmission of influenza A/H5N1 virus between ferrets. Science. 336 (6088), 1534-1541 (2012).
- Nobusawa, E., Ishihara, H., Morishita, T., Sato, K., Nakajima, K. Change in receptor-binding specificity of recent human influenza A viruses (H3N2): a single amino acid change in hemagglutinin altered its recognition of sialyloligosaccharides. Virology. 278 (2), 587-596 (2000).
- Gambaryan, A. S., Matrosovich, M. N. A solid-phase enzyme-linked assay for influenza virus receptor-binding activity. J Virol Methods. 39 (1-2), 111-123 (1992).
- Totani, K., et al. Chemoenzymatic synthesis and application of glycopolymers containing multivalent sialyloligosaccharides with a poly(L-glutamic acid) backbone for inhibition of infection by influenza viruses. Glycobiology. 13 (5), 315-326 (2003).
- Gambaryan, A., et al. Receptor specificity of influenza viruses from birds and mammals: new data on involvement of the inner fragments of the carbohydrate chain. Virology. 334 (2), 276-283 (2005).
- Ito, T., et al. Receptor specificity of influenza A viruses correlates with the agglutination of erythrocytes from different animal species. Virology. 227 (2), 493-499 (1997).
- Watanabe, Y., et al. Acquisition of human-type receptor binding specificity by new H5N1 influenza virus sublineages during their emergence in birds in Egypt. PLoS Pathog. 7 (5), e1002068 (2011).
- Chandrasekaran, A., et al. Glycan topology determines human adaptation of avian H5N1 virus hemagglutinin. Nat Biotechnol. 26 (1), 107-113 (2008).
- Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (49), 17033-17038 (2004).
- Childs, R. A., et al. Receptor-binding specificity of pandemic influenza A (H1N1) 2009 virus determined by carbohydrate microarray. Nat Biotechnol. 27 (9), 797-799 (2009).
- Nycholat, C. M., et al. Recognition of Sialylated Poly-N-acetyllactosamine Chains on N- and O-Linked Glycans by Human and Avian Influenza A Virus Hemagglutinins. Angew Chem Int Ed Engl. , (2012).
- Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
- Song, X., et al. A sialylated glycan microarray reveals novel interactions of modified sialic acids with proteins and viruses. J Biol Chem. 286 (36), 31610-31622 (2011).
- Gulati, S., et al. Human H3N2 Influenza Viruses Isolated from 1968 To 2012 Show Varying Preference for Receptor Substructures with No Apparent Consequences for Disease or Spread. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Stevens, J., Blixt, O., Paulson, J. C., Wilson, I. A. Glycan microarray technologies: tools to survey host specificity of influenza viruses. Nat Rev Microbiol. 4 (11), 857-864 (2006).
- de Vries, R. P., et al. Evolution of the hemagglutinin protein of the new pandemic H1N1 influenza virus: maintaining optimal receptor binding by compensatory substitutions. J Virol. 87 (24), 13868-13877 (2013).
- Yang, H., et al. Structure and receptor binding preferences of recombinant human A(H3N2) virus hemagglutinins. Virology. 477, 18-31 (2015).
- de Vries, R. P., et al. The influenza A virus hemagglutinin glycosylation state affects receptor-binding specificity. Virology. 403 (1), 17-25 (2010).
