Abstract
작용 성 수용체는 세포 내로 진입하는로서 인플루엔자 바이러스 (IAV) hemagglutinins는 세포 표면의 시알 산을 인식한다. 야생 물새는 IAV의 자연 저수지하지만, IAV는 가금류, 돼지, 말과 인간 종의 장벽을 통과 할 수 있습니다. 조류 바이러스가 사람 바이러스는 우선적 α2-6 결합 (인간 형 수용체)와 시알 산을 인식하는 반면 α2-3 결합 (조류 형 수용체)에 의해 끝에서 두 번째 갈락토스에 첨부 된 시알 산을 인식한다. 조류 바이러스가 인간 형 수용체에 적응하는 경우 모니터하기 위해 여러 가지 방법을 사용할 수있다. 합성 sialosides의 다양한 라이브러리와 글리 칸 마이크로 어레이는 점점 수용체 특이성을 평가하는 데 사용됩니다. 그러나,이 기술은 avidities 측정에 사용되지 않는다. 결합력의 측정은 통상적으로, 종래의 폴리 프로필렌 96 웰 플레이트에 흡착 글리 칸으로 희석 한 바이러스 헤 마글 루티 닌 또는 결합을 평가함으로써 달성된다. α이 분석에서, 글리 칸2-3 또는 α2-6 시알 산은 비오틴에 결합 스트렙 타비 딘 판에 흡착 또는 직접 플라스틱에 흡착 폴리 아크릴 아미드 (PAA)에 연결되어있다. 우리는 크게 직접 마이크로 웰 유리 슬라이드에 PAA 링크 sialosides과 비 PAA 연결된 대응을 인쇄하여이 분석을 소형화했다. 하나의 슬라이드에 48 배열이 셋업은, 6 글리 칸은이 비 시알 릴화 통제를 포함한 6 개의 글리 칸을 심문, 8 희석에 결합 단백질의 동시 분석 할 수 있습니다. 이는 기존의 플레이트 분석에서 18 배 96 웰 플레이트에 해당합니다. 글리 칸 배열 형식은 화합물 및 생물학적 제제의 소비를 감소함으로써 효율성을 크게 향상시킨다.
Introduction
야생 물새 IAV위한 자연 저장고 있지만 IAV 가금류 인간을 포함한 포유 동물에 종 장벽을 통과 할 수있다. 인간 바이러스 α2-6 결합 시알 산 (사람 형 수용체)에 결합하는 반면 조류 IAVs은 α2-3 결합 시알 산 (조류 형 수용체)를 인식한다. 효율적으로 복제 및 조류 IAV 인간 형 수용체 1에 결합 할 필요가 인간 사이에 전송 할 수 있습니다.
IAVs는 자신의 헤 마글 루티 닌 (HA)과 뉴 라미니다 아제 (NA) 엔벨로프 당 단백질의 항원 성을 특징 혈청에 따라 구분된다. NA는 바이러스 라이프 사이클 및 절단 시알 산 (2)의 타단 수용체 - 파괴 효소 인 반면, HA는, 시알 산에 결합한다. H1N1, H2N2 및 H3N2을 포함한 모든 인간 감염 바이러스는 조류 기원 3 있습니다. 인간의 크로스 오버에 여러 조류 수십 년의 마지막 두 이상 H5N1, H7N7 및 H7N9으로 발생되는 가장 잘 알려진; 하우버전이 다른 아형보다 산발적으로 인간을 감염 한 (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. 다행스럽게도, 이러한 바이러스 중 어느 것도 완전한 인간 형 α2-6 결합 시알 산 수용체 5-8에 적응할 수 없었을 것 같다. 조류 또는 기타 동물 매개 바이러스의 적응은 인간의 건강에 치명적인 영향을 미칠 수있는 인간의 호스트에 복제 및 전송을 수용합니다. 따라서,이 바이러스는 새로운 인플루엔자 바이러스의 전세계 감시 도움이 될 것입니다 인간 형 수용체에 결합하는 발전 방법에 대한 사전 지식.
수용체 환경 설정의 결정은 처음으로 서로 다른 종의 적혈구를 사용하여 밝혀와 독감 연구자 9-12 중 선호 분석 유지했다. 조류 바이러스가 α2-3 시알 산 및 시알 산을 연결 α2-6 인간의 바이러스를 인식 데모는 원래 효소 리를 각각 포함하도록 설계 적혈구의 혈구 응집을 사용하여 분석에 근거했다13, 14을 nkages. 판독은 혈구 응집, 바이러스 학자 표준 분석되지만, 기본 글리 칸 구조는 단지 단말기 결합을 정의하지 않는다. 또한, 셀을 재 sialylate하는 데 사용 sialyltransferases의 제한된 유용성이 15-18 분석법의 사용을 제한하고있다. 이어서, 수용체 - 결합 선호도를 결정하는 다른 방법이 플레이트 - 기반 분석법 (19, 20)의 폴리 아크릴 아미드 (PAA) 또는 폴리 글루탐산 (PGA) 구조로 연결된 시알 릴화 된 글리 칸 구조를 사용하여 도입되었다. 여러 변형은, 견고하고 신뢰할 민감 형 ELISA 분석 결과 21-23, 각각의 마이크로 타이 터 플레이트로 글리 칸 또는 바이러스를 도포 가능하다. 대안 적으로, 비오틴 연결 글리 칸은 PAA / PGA를 대체하고 스트렙 타비 딘 - 코팅 된 플레이트 2,24에 접합 될 수있다. 일부 특정 혈청이 요구 될 수 있지만, ELISA를가 PAA에 연결 표준 및 여러 글리 칸 쉽게되어 있습니다 commerciallY와 비 시판 (기능 글리코 믹스를위한 컨소시엄 (http://www.functionalglycomics.org)).
글리 칸 마이크로 어레이 기술은 여러 다른 글리 칸이 발견 될 때, 수용체 특이성을 결정하는 매우 중요한 도구로 등장, 서로 다른 구조의 다양한 결합하면 하나의 분석 25-29에서 평가 될 수있다. 이러한 구조 IAV의 결합은 IAV 우선적 30-33을 인식 글리 칸 구조의 더 나은 이해를 제공한다. 당쇄 마이크로 어레이는 결합 분석을 수행하기위한 샘플 량을 소량 만 필요로 스폿 (2 NL) 당 당쇄 분의 양을 사용한다. 그러나, 이러한 배열은 일반적으로 글리 칸 수용체의 특이성을 평가하는 데에만 사용됩니다. 여러 농도 범위에서 여러 바이러스 또는 헤 마글 루티 닌 단백질의 분석이 요구되기 때문에 슬라이드의 개수를 금지 할 수있다. 또한, 지금까지 상대적인 결합력 분석은 당쇄 AR을 이용하여 개발되지 않았다선 기술.
비교 당쇄 마이크로 어레이 기술 및 ELISA 기반 분석법에서 PAA 연결된 글리 칸의 감도에 의해 제공되는 낮은 샘플 조건을 결합하기 위해 유사하거나 더 나은 해상도 높은 처리량 분석을 허용하는 멀티 - 웰 당쇄 어레이를 개발하기 위해 노력 기존의 ELISA 기반 분석한다. 동시에, 우리는 소비 생물학적 및 기자 화학 물질의 양을 최소화하고 싶었다. 궁극적 인 결과는 구체적 IAV 특이성을 모니터링하기 위해 개발 된 소형 결합력 분석이고, 다른 글리 칸 결합 단백질을 평가하기 위해 동일하게 적용 가능하다. 테프론 마스크 48 마이크로 웰에 분리 된 유리 슬라이드를 사용하여, 글리 칸은 6 개 웰 당 6 회 반복에서 발견된다. 마이크로 어레이 플랫폼 수용체에서 동일한 경향 여러 장점 매크로 ELISA 포맷에서 본 바인딩 제공한다. 이러한 여러 행의 코팅에 비해 최소한의 샘플을 사용하여 (I)의 화합물을 6 회 반복 인쇄를 포함 I물론 당 100 μl를 사용하여 NA 판; (II) 여러 다른 화합물은 컨트롤을 포함하는 단일 아니라, 동시에 분석; (III) 배양 볼륨과의 대규모 감소; (IV), 형광 판독을 사용하여 더 큰 다이나믹 레인지. 하나의 슬라이드는 18 배, 96 웰 플레이트에 상응하는 것으로 계산 될 수있다.
다음 프로토콜, 제조 및 분석의 실험실 할 수와 함께 마이크로 어레이이 소형화 ELISA 형식을 제조 할 수 있어야한다 발견했다.
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Protocol
주 : 달리 지시되지 않는 한 모든 단계가 실온에서 수행된다.
1. 배열 건설
- 글리 칸 준비 및 플레이트 설치
- 인쇄 버퍼의 재고를 준비합니다. 우선 인산 나트륨을 150 mM의 스톡 용액을 500 mL로 만든다. 또한, 인산이 수소 나트륨 용액을 150 mM의 스톡 용액을 50 mL로 만든다. 플라스크에서, pH가 8.5에 도달 할 때까지 서서히 용액으로 염기성 인산 나트륨 용액을 적정 교반 막대 및 pH 미터를 사용하여 자기. 0.005 %의 트윈 20을 추가합니다.
- 글리 칸 샘플을 준비합니다. PAA에게 복합 글리 칸, (diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA), 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA) 및 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA (그림 1A 희석 )) 100 ㎍로 희석되어야한다 / step1.1.1. 가의 글리 칸에서 버퍼를 인쇄에서 ml의diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ- (CH 2) 3 NH 2, 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2) 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1- 4GlcNAcβ - 단계 1.1.1에서 인쇄 버퍼 100μM에 (CH 2) 3 NH 2)). 마지막으로, 그리드 마커 / 방문 등으로 사용, 아민 기능화 염료를 준비합니다. 염료 마커 명소 1 μM에 인쇄됩니다.
참고 : Atto488-NHS 염료는 우리의 인쇄에 사용됩니다. 그러나, 상기 슬라이드 스캐너에 의해 판독 가능한 임의의 아민 - 작용 염료는이 목적에 적합하다. - 전사 인쇄에 사용되는 로봇 384- 웰 마이크로 타이 터 플레이트의 각 당쇄 시료 10 μL. 밀폐 된 튜브에서 -20 ° C에서 인쇄 완충 용액에 보관하지 않는 글리 칸. Tansfer 판면에 염료 마커의 10 μL.
- 인쇄
참고 : 모든 인트ps의 관심은 만지거나 장갑 수행해야합니다 슬라이드를 이동하는 것이다.- 레이아웃의 올바른 구성에 따라 프린트 헤드에 Arrayer에 핀을 배치합니다. 이 레이아웃의 모든 샘플과 배열을 인쇄 한 핀을 사용합니다. 동일한 샘플의 관광 명소가 서로 옆에 정확히 인쇄되지되도록, 각 측면에 하나의 기능을 건너 뛰는 (기능은 특정 화합물의 단일 지점으로 정의된다), 여섯 블록에 글리 칸을 인쇄합니다.
주 : 최종 사용자가 설정을 결정해야한다. - 가방, 오픈 상자에서 슬라이드를 제거하고 각 슬라이드에 초 고순도 질소 가스를 불어 그 표면에있을 수있는 먼지 입자 또는 플라스틱의 작은 조각을 제거합니다. Arrayer에 무대 위로 슬라이드 원하는 번호, 코팅면을 놓습니다.
- 프로그램은 Arrayer에이 인쇄 핀의 선단에 과잉의 액체를 제거하고, 폴리 -L- 라이신 코팅 된 슬라이드 상에 "프리 반점"3을 사용하여 소스 플레이트 구경 당 27 점의 파라미터를 사용하여
- MPU (메인 전원 장치) 및 기후 제어 장치의 전원을 켭니다. 컴퓨터에서 열려 기와 분석 소프트웨어.
- 인쇄를 선택 레이아웃입니다. 1 싱글 핀 - 옵션 → 핀 도구 배열 1 × 1 인쇄 도구를 인쇄에 사용되는 선택합니다. 대상 탭 → 도구 배열 정의 → 인쇄 패턴을 선택하고 (지점 - 대 - 지점 거리), 행과 샘플을 수용 할 수있는 열 수를 인쇄 할 피치를 추가하고이 배열 8에 대한 샘플의 인쇄 패턴 ( × 8 인쇄 패턴은 7 총 샘플 340 μm의 피치)에 사용된다.
- 대상 → 슬라이드 레이아웃을 선택하고 48 웰 (4 × 12) 슬라이드 템플릿에 각 복제 배열의 인쇄 할 수 있도록 블록에 블록 거리를 프로그램. 소스를 선택하고 (6 샘플 우물과 1 염료 마커 잘 수용하기 위해 사용되는이 인쇄 7 소스 픽업 용) (1 핀을 사용하는 경우 각 샘플에 대해 1) 소스 픽업의 수를 추가 할 수 있습니다.
참고 : GREEN을 설정해야 소스 대화가 수 있음을 보여소스 방문 인쇄 패턴으로 인쇄 할 수있는 샘플은 일치한다. - 대상 → 어댑터 플레이트를 선택하고 레이아웃을 밀어 슬라이드 수를 조정 (5 슬라이드 1 미리 안보 슬라이드이 인쇄를 위해 한 번에 인쇄됩니다).
- 사전 스포팅 슬라이드 (BLUE)와 "진짜"슬라이드의 위치에주의를 기울이고, 트레이를 활성화하고 트레이에 슬라이드의 수를 추가 할 수 T1 버튼을 클릭하여 트레이를 놓습니다.
- 진공을 차단하고 진공을 활성화하기 위해 OK를 클릭하여 남아있는 모든 진공 포트에 일반 유리 슬라이드를 놓습니다. 모든 슬라이드가 위치에 고정되어 있는지 확인하고 홈 위치로 트레이를 반환 확인을 클릭합니다.
- 판 홀더에 인쇄판을로드하고 랙이 자리에 올바르게 설정되어 있는지 확인합니다. GO를 클릭하고 인쇄 과정을 진행 할 수 있습니다.
- 어레이 당 6 점의 복제의 나머지 24 점 (4 배열 / 소스 방문)을 인쇄합니다.
- 384 웰 플레이트를로드프린터로 인쇄를 시작합니다. (55)와 65 % 사이에 인쇄 전반에 걸쳐, 인쇄하는 동안, 상대 습도를 유지한다. 프린터는 5 슬라이드를 인쇄 한 후 정지합니다.
주 :이 분석에서 마이크로 어레이는 특정 8 × 8의 패턴으로 인쇄되지만, 다른 마이크로 어레이 인쇄 로봇이 원하는 배치를 달성하기 위해 장치 특정 프로그래밍을 필요로한다. 그것은 자신의 기기의 사양 주어진 최적 패턴을 결정하기 위해 최종 사용자에게 달려있다.
- 레이아웃의 올바른 구성에 따라 프린트 헤드에 Arrayer에 핀을 배치합니다. 이 레이아웃의 모든 샘플과 배열을 인쇄 한 핀을 사용합니다. 동일한 샘플의 관광 명소가 서로 옆에 정확히 인쇄되지되도록, 각 측면에 하나의 기능을 건너 뛰는 (기능은 특정 화합물의 단일 지점으로 정의된다), 여섯 블록에 글리 칸을 인쇄합니다.
- 가습 / 움직이지
참고 : 슬라이드 인쇄가 완료되면, 그들은 임시 고정 단계라고도 가습을받을. 후 인쇄를 가습하는 재 습윤 반점을하고 완전한 차단을 보장함으로써 샘플 첨부 파일을 균일화하는 데 도움이됩니다.- 바로 30 분 동안 인쇄 한 후 100 %의 습도 챔버에 슬라이드를 넣는다. 슬라이드를 큰 유리 접시의 바닥에 평평 매우 젖은 종이 타월을 배치 배치하여 챔버를 구축일부 이러한 테스트 튜브 랙, 인쇄면을 위로 같은 랙의 종류 및 수분의 함정에 플라스틱 포장으로 밀봉합니다.
- 번호는 탈수 상자에 알코올 / 용제에 강한 마킹 펜 저장소와 슬라이드. 밤새 건조하는.
- 번호, 차단 및 저장
- 50 mM의 붕산 버퍼의 50 mM 에탄올 아민 - 블로킹 버퍼를 준비합니다. 첫째, 자기 교반 막대를 함유하는 플라스크에 50 mM의 최종 농도로 DDH 2 O에 붕산을 녹인다. 모든 고체가 용해 될 때까지 교반 접시에 적극적으로 솔루션을 저어. 지속적으로 교반하면서, 목적하는 50 mM의 농도에 도달하는 16.54 M 스톡 용액으로부터 에탄올 적당량을 추가한다. 9.2의 최종 pH를 조정 진한 수산화 나트륨을 추가합니다.
- 1 시간 동안 블로킹 완충액에 인쇄 된 슬라이드를 담근다.
- 1 시간 이후, 블로킹 완충액 중 과량의 흔적을 제거하기 DDH 2 O에 슬라이드를 헹군다.적절한 폐기 용기에 버퍼를 차단 폐기 할 것.
- 유리 염색 홀더에 슬라이드를 전송하고 건조 스핀. 5 분 동안 10 XG의 속도로 요동 판 홀더를 구비 한 원심 분리기에 배치하여 드라이 어레이.
- 슬라이드가 건조되면, 그들은 즉시 배양하거나 저장할 수 있습니다. 보관 조건은 밀봉 된 비닐 봉지에 -20 ° C이다.
2. 분석 글리 칸 결합 단백질
- 배열이 맞는 하이브리드 될 수있는 가습 실을 준비합니다. 간단한 챔버는 적신 종이 타월 및 슬라이드 휴식 할 때 랙과 바닥에 적층 파이렉스 접시로 구성되어 있습니다.
- 바이오틴 렉틴을 사용하여 SNA (삼부 카 파괴 해의 응집소) 및 버퍼를 프로빙 10 μg의 스트렙 타비 딘 - 555 염료 / ㎖ + 2 μg의 / ㎖에서 ECA (하는 Erythrina cristagalli 응집소), (PBS + 0.01 % 트윈 20). HA (이 예에서는 A / 베트남 / 1203년부터 1204년까지 H5N1과 A / KY가 / 07 H1N1), 사용앞서 설명한 바와 같이 34 μg의 20의 출발 농도는 ㎖, 미리 복합화 /. 마우스-α-연쇄상 구균 : 간단하게하는 HA 할 버퍼를 차단에서 염소-α-마우스 Alexa647 혼합물 (PBS + 3 % BSA + 0.01 % 트윈 20), 4시 : 2 : 1 몰비.
주 : 배열 렉틴과 프로브되어 글리 칸이 고정 및 검출 (그림 1B)되어 있는지 확인합니다. - 384 웰 플레이트에 20 μL의 당쇄 결합 단백질 항체 혼합 용액을 옮기고, 30 분 동안 얼음 위에서 배양한다. 버퍼의 10 μL로 샘플의 10 μl를 혼합하여, 자신의 적절한 버퍼, 8 배에, 1 : 직렬 렉틴과 HA 샘플 1을 희석.
- 피펫 8 마이크로 웰 표면에 시료 μL, 90 분간 가습 밀봉 (100 % RH) 실에서 배양한다.
- 탈 H 2 O의 가장자리를 잡고 PBS의 혼합물 0.05 % 트윈 그들에게 네 번 찍기로 한 번에 슬라이드를 하나씩 씻어 PBS에서 다음 네 번, 그리고 마지막으로 네 번 사용블로킹 단계에 기재된 방법과 동일한 건조 프로토콜은 10 x g에서 5 분 동안 원심 분리기에 배열 건조 스핀.
3. 스캔 및 데이터 분석
주 : 글리 칸 마이크로 어레이는 마이크로 어레이 스캐너 제조업체에 따라 다른 설정으로 스캔 할 수 있습니다. 레이저 출력 해상도를 변화시킴으로써, 장비가 그 동적 범위 (도 1C) 내의 가능한 많은 신호에 의한 이미지를 생성 할 수있다.
- 형광 슬라이드 스캐너를 사용하여 즉시 당쇄 결합 단백질과 배양 한 후 배열을 검사합니다. 슬라이드가 제대로 스캔 기기에 삽입되어 있는지 확인하기 위해주의하십시오.
- 열기 검색 소프트웨어. 프로그램을 열려면 시작을 클릭합니다. 스캐너 탐색 패널 메뉴에서 [스캐너 → 연결 또는 녹색 버튼 : 스캐너에 연결합니다.
- 스캐너의 열기 오토로더 문입니다. 특정 순서로 자동 로더의 슬롯에 슬라이드를 놓습니다. 닫기 자동 로더 문입니다. CL자동으로 도구 탐색 패널에서 ICK "읽기 로더는"스캐너에서 슬라이드를 감지합니다.
- 설정 스캔 매개 변수 : 실험 (예를 들어 635 레이저 파워 높은 검출 이득 50 %)에 적합한 스캐너 → 검색 매개 변수를 설정합니다. 스캔 슬라이드 : 스캐너 → 스캔. 스캔 이미지와 이름 개별 검사를 저장할 폴더를 생성하여 경로를 선택합니다. 실제 검색이 사전 작업을 수행합니다. 각 개별 슬라이드에 대해 반복합니다. 스캔을 시작하려면 확인을 클릭합니다.
- 슬라이드를 악기를 설정하고 스캔하는 스캐너 소프트웨어를 사용합니다. 설정 스캐너 반복적 25 %, 50 % 및 75 %의 게인 설정을 증가 낮은 레이저 파워 (5 MW)로 스캔한다.
참고 : 설정을 테스트하고 최적화 있지만, 각 검색이 가능 photobleaching에에 의한 염료의 형광 출력을 낮출 수 염두에 두어야 할 수 있습니다.- 오픈 데이터 수집 및 MAPIX 소프트웨어와 같은 분석 소프트웨어. 프로그램을 열려면 시작을 클릭합니다. 오픈 스캔 이미지 : 오픈 메신저 → 파일나이. 열기 GAL 파일 : → 오픈 그리드를 분석하고 적절한 GAL 파일을 선택합니다.
- 블록 모드를 입력 : 이미지 → 블록 모드를 그리드를 이동합니다. 슬라이드에 적절한 위치에 그리드를 설정하는 그리드 마커를 사용합니다. 인쇄 된 배열에 맞게 필요에 따라 개별 블록을 조정합니다.
- 스팟 모드를 입력 : 이미지를 스팟 모드 → 위치 및 블록 내 각 지점의 크기를 조정합니다. 일단 모든 블록과 장소를 조정하고 장소에서 측정 신호 강도에 의해 → 광도 계산을 분석합니다. 출력 파일을 저장합니다.
- 슬라이드 스캔을 완료 한 후, 이미지 (- G 그림 1D)를 설치 이미지 처리 프로그램으로 신호를 결합에 대해 분석한다. 이미지 분석을 위해, 스캔 된 TIFF 이미지를 통해 GAL (배열 목록) 파일을로드합니다.
참고 : GAL 파일이 자리 레이아웃 패턴과 각 지점 위치의 신원 모두 포함되어 있습니다. 배열에 대한 GAL 파일 이러다 있습니다상기 샘플의 정체성과 384 잘 소스 판에서의 위치를 포함하는 탭으로 구분 된 텍스트 파일을 사용하여 프린터 소프트웨어 어갈. - 제대로 GAL 그리드를 배치 할 마이크로 어레이에 인쇄 된 격자 마커 / 방문 등을 사용합니다. 개별 반점이 개별적으로 이동 될 필요가있다, 그러나 잘 인쇄 어레이는 일반적으로 그리드 내의 블록을 용이하게 배치 할 수있게된다. 그리드 배치에 따라, 소프트웨어에 의해 스폿 강도를 수집하고 탭으로 구분 된 텍스트 파일 (.txt)로 저장.
- 스프레드 시트 프로그램을 이용하여, 스캐너의 출력 파일을 연다. 폴더 위치에서 해당 매크로 파일을 엽니 다. 보기 → 매크로 → RunMacro을 클릭합니다.
참고 : 미리 작성된 원시 출력 데이터를 복사 불필요한 행과 열을 제거, 샘플로 데이터를 정렬, 평균, 평균 신호 마이너스 배경 값을 계산하고 각각에 대한 그래프를 포함하는 스프레드 시트 워크 시트에 결과 값을 플롯합니다 여섯 SAMP의레 배열에서 테스트.
- 스프레드 시트 프로그램을 이용하여, 스캐너의 출력 파일을 연다. 폴더 위치에서 해당 매크로 파일을 엽니 다. 보기 → 매크로 → RunMacro을 클릭합니다.
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Representative Results
인쇄, 스캔 및 데이터 분석
적절한 인쇄를 보장하기 위해, 상기 슬라이드 각 어레이를 묘사 테플론 마스크 내에서 발견 된 격자의 정확한 정렬을하는 것이 중요하다. 인해 테프론 코팅의 성질, 인쇄 도중, 스폿은 MPX 슬라이드에 육안으로 볼 수 없다. 주의를 폴리 -L- 라이신 코팅 된 슬라이드에 프리 반점의 외관 후 지불된다. 직접 인쇄 후, 각 슬라이드 인해 그 자리에서 건조 버퍼의 염을 볼 수 있습니다 각각의 발견 화합물의 존재를 눈으로 확인해야합니다. 배열은 테프론 테두리와 발견 기능의 정확한 수 내 관광 명소의 올바른 정렬을 위해 검사된다.
슬라이드 사진 표백을 피하기 위해 높은 스캔 전원 이하의 반복 과정에서 스캔 HIG의 비교를 허용하고그녀의 결합력이 각각 높고 낮은 출력 신호를 결합 단백질 결합력을 낮춘다. 주사 후, 상기 출력 영상의 각 스팟의 형광 강도 촬상 프로그램을 사용하여 측정된다. 각 어레이는 어레이 표면 (- G도 1d) 상에 인쇄 된 특징의 수에 일치하는 격자 파일에 오버레이된다. 인쇄 된 형광 염료를 사용하여 인쇄 된 글리 칸의 경계를 정의하고 인쇄 샘플의 ID와 통합 마스크 각 스폿 lassoes. 이미징 마스크는 올가미 (, 크기, 신호 강도 그리드 등 좌표)을 이미지화 된 지점의 모든 측면을 기록하고 출력 탭으로 구분 된 텍스트 파일에이 정보를합니다. 소프트웨어 표 (스프레드 시트)를 사용하여 시료를 식별하여 분류되고, 평균 신호 세기를 뺀 배경 특이점으로서 최고 및 최저 신호를두고 각각의 샘플에 대한 6 개의 스폿 4 걸쳐 평균화된다. 평균 평균 신호의 선 그래프마이너스 배경 배열에 적용되는 팔 단백질 농도에 대해 도시 및 각 샘플에 대해 하나의 행을 포함합니다. 최종 출력 그래프 비선형 회귀 계산 (도 1I)을 사용하여 평활화한다.
글리 칸이 결합 단백질
PAA-배열은 바이러스 hemagglutinins 인플루엔자의 수용체 결합 특이성을 평가하는 데 사용됩니다. 우리 어레이의 추가적인 특징은 유사한 플레이트 분석법에 존재하지 같은 마이크로 웰에서 시알 릴화되지 않은 제어를 포함한다. 알려진 특이 사용 하였다 인쇄 화합물은 인쇄 후 있는지 평가하기 위해, 일반적으로 사용되는 식물 렉틴. ECA는 N 아세틸 글루코사민 (Galβ1-4GlcNAc 또는 LacNAc)에 β1-4 연결 단자 갈락토스 결합 및 터미널 갈락토스는 시알 산으로 덮인 경우 바인딩되지 않습니다. ECA는 우리의 소형화 도착 당쇄의 비 - 시알 릴화 된 글리 칸을 검출바깥 (그림 2A). 시알 릴화 된 글리 칸 샘플 중 결합의 부족이 완전히 말단 시알 산으로 캡핑되는 것을 또한 나타낸다. α2-6 결합 시알 산 들어 SNA는 렉틴 제어 (도 2b)으로 사용 하였다. 예상대로, SNA는 연결 시알 산을 α2-6에 결합하지만, PAA 링크 비 PAA 연결된 디 LacNAc 반복에 대한 친 화성에서 주목할만한 차이. 이 차이는 PAA 연결된 글리 칸의 민감도를 반영 낮은 결합력과 결합 할 수있다 단백질의 차별을 허용한다. α2-3 결합 시알 산, 만 α2-3 결합 시알 산을 인식하는 것으로 알려져 A / 베트남 / 1203년부터 1204년까지 바이러스 유래의 헤 마글 루티 닌 H5의 6을 사용 하였다. H5 HA의 결합 프로파일은 참으로 PAA 결합 구조 (그림 2C)에 대한 높은 결합력과 α2-3 연결 시알 산에 대한 특이성을 보여줍니다. 마지막으로, 인간 계절 H1N1 스트레인의 헤 마글 루티 닌 H1을 사용하고, 그 예상 만링크 된 시알 산 함유 구조 (그림 2D)를 α2-6 수밖에.
그림 1 : 인쇄, 스캔 및 이미지 분석 (A) PAA - 복합 6SLNLN는 유리 슬라이드에 인쇄되어 대표 글리 칸 구조로 표시됩니다.. 멀티 웰 어레이 글리 칸 글리 칸에 결합 단백질을 인큐베이션 (B)의 배열 표면 상에 액 적을 생성하는 8 ㎕의 양으로 나타낸다. 공 초점 형광 슬라이드 스캐너 어레이 스캔의 당쇄 결합 단백질의 인큐베이션 후 (C)가 대표 화상이 얻어진다. (D) 화상이 적절한 정렬 격자 마커를 사용하여, 그리드에 오버레이되며, 상기 단일 지점을 분석 할 수있다. (E) 가까이 (8) 배열의 완전한 세트의 최대되는 하나의 당쇄 결합 단백질1 희석 : 팔 하나를 사용하여 분석 하였다. 하나의 잘 (F) 하나의 배열, 표현된다; 육의 복제가 명확하게 볼 수 있습니다로 배열이 오른쪽 상단 (3 점)와 왼쪽 아래 (2 점)의 격자 마커에 의해 demarked되고,이 글리 칸 결합 단백질은 배열의 단일 화합물을 결합한다. (G) 그리드는 특정 개인 지점을 둘러싸는 lassos 함께 표시됩니다. (H) 이미징 소프트웨어는 이미지 파일에서의 신호 값을 계산하고, 탭 - 구분 된 데이터 파일을 출력한다. (I) 데이터는 스프레드 시트 또는 대표 출력 그래프를 만들 수 stastical 소프트웨어 표로 할 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 식물 렉틴 (ECA, SNA)과 IAV의 HEMA의 출력상이한 특이성 gglutinins (행 H5 A / 베트남 / 1203년에서 1204년까지, H1로부터 A / 켄터키 / 07). (A)가 ECA 구체적 단말 LacNAc 또는 Galb1-4GlcNAc를 결합하고, 대조군으로 사용 된 비 - 시알 릴화 화합물의 존재를 검출 IAV의 hemagglutinins합니다. (B) SNA 터미널 α2-6 시알 산 베어링 만 글리 칸을 인식합니다. (C)가 H5N1의 재조합 헤 마글 루티 닌 (A / 베트남 / 1203년부터 1204년까지) 균주는 시알 산을 α2-3에 결합 및 조류 형 수용체 결합 프로파일을 제공합니다. (D) 인간의 계절 H1N1의 재조합 헤 마글 루티 닌 (A / 켄터키 / 07) 인간 형 수용체 만 결합한다. 형광 신호 강도는 각각의 지점에서 측정 한 강도의 평균을 뺀 배경은 스프레드 시트 프로그램을 사용하여 계산 된 것을 의미한다. 각 당쇄를 들어, 평균 신호 세기는 6 점 복제로부터 계산된다. 6 복제의 최고 및 최저 신호를 제거하고 4 개의 복제본을 나머지TES는 평균 신호의 표준 편차 (SD)를 계산하는데 사용되고, 표준 오차 측정 (SEM). 그래프는 각 샘플 및 오류 바의 평균 평균 신호 마이너스 배경을 표현하는 것은 SEM 값입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
IAV 수용체 특이성을 평가하는 것은 조류 바이러스의 대유행 가능성을 분석하는 중요한 단계이다. 바이러스에 의해 시알 산 인식은 같은 셀에 결합 및 해제로 여러 생물학적 성질에 연결되어 있습니다. 조류 바이러스가 결합 α2-6 달성하고 종 장벽이 대유행 대비를 가능하게 교차하는 지식은 아미노산 돌연변이가 필요합니다. 여러 분석은 수용체 특이성을 결정하기 위해 사용된다; 그러나, 모든 반대로 만 측정 결합력이 아닌 특이 포함한 결점들을 갖는다.
여기에서 우리는 더 복잡한 글리 칸의 PAA 연결된 단말기 조각을 사용하여 널리 사용 및 인정 ELISA를 기반으로 새로운 소형 도구를 설명합니다. 4 잘 정의 된 렉틴, 공장의 2 인플루엔자의 2 바이러스 원점을 사용하여, 우리는 우리가 특이 상대 결합력을 유지하는 것으로 나타났다.
우리는 화학 biolog의 감소량을 계산하면글리 칸 어레이 칩 상에 ELISA를 소형화에 의해 사용 iCal을, 우리는 눈에 띄게 큰 차이를 도달한다. 먼저, 생물학적; 우리는 10 배 이하의 체적 분석을 사용하여 6 회 반복 6의 시험 화합물을 사용한다; 이것을 96 웰 플레이트에서 36 배의 행 당량으로 계산 될 수있다. 그 결과는 우리가 360x 적은 생물학적 제제를 사용하는 것입니다. 중요한 단계는 적절한 인쇄 및 정제되지 않은 글리 칸 결합제 또는 불량 검출 항체를 사용하여 높은 배경의 위험을 포함한다.
이 분석에 사용되는 화합물은 계속 사용할 수 있지만, 쉽게 화학 - 효소 합성에 의해 만들어진되지 않습니다. 마이크로 어레이 인쇄 기술을 사용하여, 각각의 스폿은 마이크로 타이 터 플레이트의 웰 당 100 μL에 비해, 불과 2 NL이다. 6 복제 48 우물과 6 화합물을 포함하는 하나의 슬라이드를 인쇄, 우리는 약 1,152 NL을 소비한다. 동일한 농도의 화합물을 100 ㎕로 웰 1842 총 코팅 96- 웰 플레이트에서 동일한 결과 코팅 방법. 따라서, 인쇄 t그는 우리가 1,500x의 현저한 감소를 달성, 플레이트 분석에 비해 화합물. 따라서, 총, 생물학적 1,500 배 360 배 및 글리 칸 소비를 감소된다. 로봇 액체 핸들러를 사용하여, 우리는 대부분의 단계는 전체 분석은 높은 처리량 스크린으로 사용할 수 있도록 자동화 될 수 있다는 구상.
인쇄 마이크로 어레이 및 후속 이미지 분석 특수 기계 및 도구를 필요로 할 수 있지만,이 악기는 희귀하지 않은 많은 대학과 기관에서 존재한다. 인쇄 다이렉트 화학적 변화를 필요로하지 않습니다. 따라서 화합물 및 간단한 인쇄 기술이 최소량이 분석은보다 일반적으로 적용 할 수 있다고 믿는다. 이 배양 볼륨을 감소시키기 때문에 낮은 비용을 유지하면서, 항체 귀중한 생물학적의 비용은,이 기술은 IAV 또는 높은 충실도와 다른 글리 칸 결합 단백질의 특이성을 평가하기 위해 제한된 자원을 가진 실험실 것이 가능하게됩니다에스.
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Acknowledgments
이 작품은 스크립스 마이크로 어레이 핵심 시설 및 질병 통제 예방 센터 (JCP)로부터 계약에 의해 부분적으로 지원되었다. RPdV는 과학 연구에 대한 네덜란드기구 (NWO)에서 루비콘과 VENI 부여받는 것입니다. NIGMS 부여 GM62116 (JCP)에 의해 투자 컨소시엄은 기능 글리코 믹스에 대한 (http://www.functionalglycomics.org/) 본 연구에 사용 된 여러 글리 칸을 제공했다. 이는 스크립스 연구소에서 발행 29,113입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEXTERION® Slide H MPX-48 | Schott | 1091525 | Microwell slides |
| ProScanArray Plus | PerkinElmer | discontinued | confocal microarray scanner |
| Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software | Innopsys | - | confocal microarray scanner |
| MicroGrid II | Digilab | - | microaray printer |
| SNA | Vector Labs | B-1305 | Plant Lectin |
| ECA | Vector Labs | B-1145 | Plant Lectin |
| Anti-Strep Antibody | IBA | 2-1509-001 | Anitbody for HA binding |
| Anti-Mouse Alexa-647 | Life | A-21235 | Anitbody for HA binding |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | detergent |
| di-basic Sodium Phosphate | Sigma | 255793 | printing buffer component |
| mono-basic Sodium phosphate | Sigma | 229903 | printing buffer component |
| poly-l-lysine solution | Sigma | P8920 | pre-spotting slide component |
| sodium hydroxide | Sigma | 221465 | pre-spotting slide component |
| ethanol | Sigma | 493546 | pre-spotting slide component |
| phosphate buffered saline | Corning | 46-013-CM | incubation/washing buffer |
| SMP4B pins | Telechem | SMP4B | printing pin |
| Compressed Nitrogen (Grade5) | Praxair | UN1066 | general dusting/drying tool |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | Slide blocking reagent |
| ethanolamine | Sigma | E9508-500ML | Slide blocking reagent |
| Atto 488 | AttoTec | AD 488-91 | Gridmarker on array |
| PAA-LNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA368 | Spotted glycans |
| PAA-3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA362 | Spotted glycans |
| PAA-6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA343 | Spotted glycans |
| LNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te98 | Spotted glycans |
| 3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te175 | Spotted glycans |
| 6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te176 | Spotted glycans |
| 384-well microtiter plate | Matrix TechCorp | 4361 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-150 | Slide Numbering |
| Wheaton slide staining dish | Sigma | Z103969-1EA | Blocking and Drying |
References
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