Abstract
機能的な受容体は、細胞への侵入を獲得するようにインフルエンザAウイルス（IAV）赤血球凝集素は、細胞表面上のシアル酸を認識する。野生の水鳥はIAVのための自然宿主であるが、IAVは、家禽、豚、馬やヒトへの種の壁を越えることができます。鳥ウイルスは、ヒトウイルスが優先α2-6結合（人間型受容体）とシアル酸を認識するのに対し、α2-3結合（鳥型受容体）によって最後から二番目のガラクトースに取り付けられたシアル酸を認識する。鳥類ウイルスはヒト型受容体に適合しているかどうかを監視するために、いくつかの方法を用いることができます。合成シアロシドの多様なライブラリーを有するグリカンマイクロアレイはますます受容体特異性を評価するために使用されます。しかし、この技術は、結合活性を測定するために使用されません。結合活性の測定は、典型的には、従来のポリプロピレンの96ウェルプレートに吸着されたグリカンの連続希釈ヘマグルチニンまたはウイルスの結合を評価することによって達成されます。 αとこのアッセイでは、グリカン2-3またはα2-6シアル酸は、ビオチンに結合し、ストレプトアビジンプレートに吸着させ、または直接プラスチックに吸着したポリアクリルアミド（PAA）に結合されています。我々は、有意に直接PAA結合シアロシドマイクロウェルガラススライド上での非PAA結合相手を印刷することによって、このアッセイを小型化しています。このセットアップは、単一のスライド上の48アレイと、二つの非シアル化されたコントロールを含む6種類のグリカンを、尋問、8希釈で6糖鎖結合タンパク質の同時アッセイを可能にします。これは、従来のプレートアッセイで18倍、96ウェルプレートに相当します。グリカンアレイ形式は、化合物および生物学的製剤の消費を減少し、大幅効率が向上します。
Introduction
ワイルド水鳥IAVのための自然宿主であるが、IAVは、ヒトを含む、家禽および哺乳動物に種関門を通過することができます。ヒトウイルスがα2-6結合したシアル酸（ヒト型受容体）に結合するのに対し、鳥IAVsは、α2-3結合したシアル酸（鳥型受容体）を認識します。効率的に複製および鳥類IAVは、ヒト型受容体1に結合する必要がある人間との間で送信できるようにするには。
IAVsは、その赤血球凝集素（HA）およびノイラミニダーゼ（NA）エンベロープ糖タンパク質の抗原性を特徴付ける血清学に基づいて分割されます。 NAはウイルスのライフサイクルと切断するシアル酸2の他端の受容体破壊酵素であるのに対し、HAは、シアル酸に結合します。 H1N1、H2N2およびH3N2を含むすべての人間の感染ウイルスは、鳥類の起源3を持っています。人間のクロスオーバーには、いくつかの鳥十年の最後の2にわたりH5N1、H7N7、およびH7N9で、発生しているが最もよく知られています。ハウ版は、他のサブタイプはより散発的に人間に感染した（H6N1、H7N1、H7N2、H9N2、H10N7、H10N8）4。幸いなことに、これらのウイルスのいずれも完全ヒト型α2-6結合シアル酸受容体5-8に適応できていなかったようです。ヒト宿主内で複製および伝送に対応するために、鳥や他の人獣共通感染ウイルスの適応は、人間の健康に壊滅的な影響を与える可能性があります。したがって、これらのウイルスは、ヒト型受容体に結合するために進化しているかの事前の知識は、新興インフルエンザウイルスの世界的な監視を支援します。
受容体の好みの決意は、最初の異なる種の赤血球を用いて解明し、インフルエンザの研究9-12の間で好まれるアッセイのまましました。鳥ウイルスがα2-3シアル酸およびシアル酸をリンクα2-6ヒトウイルスを認識デモはもともと酵素的に李のそれぞれを含むように操作赤血球の血球凝集反応を用いたアッセイに基づいていましたnkages 13,14。読み出しが赤血球凝集、ウイルス学者のための標準的なアッセイではあるが、根本的なグリカン構造は、端末のみリンケージを定義されていません。さらに、細胞を再シアリル化するために使用するシアリルトランスフェラーゼの限られた可用性は、このアッセイ15-18の使用が制限されています。その後、受容体結合の好みを決定する他の方法は、プレートベースのアッセイ19,20にポリアクリルアミド（PAA）またはポリ-グルタミン酸（PGA）の構造に連結されたシアル化グリカン構造を使用して導入しました。いくつかのバリエーションが、堅牢信頼性が非常に敏感なELISA型アッセイ21-23もたらすその各々は、マイクロタイタープレートにグリカンまたはウイルスのいずれかをコーティング可能です。また、ビオチン結合型グリカンは、PAA / PGAを置き換えることができますし、ストレプトアビジンでコーティングしたプレート2,24に結合させることができます。いくつかの特定の血清を必要とすることができるが、ELISAはPAAにリンクされている標準およびいくつかのグリカンは、容易にされているcommerciallyおよび非商業的に入手可能な（機能グライコミクスのためのコンソーシアム（http://www.functionalglycomics.org））。
グリカンマイクロアレイ技術は、複数の異なるグリカンがスポットされているように、受容体特異性を決定するための貴重なツールとして浮上しており、異なる構造の広範な配列への結合は、単一のアッセイ25-29内に評価することができます。これらの構造体へのIAVの結合は、IAVが優先30-33を認識グリカン構造のより良い理解を提供します。糖鎖マイクロアレイは、結合アッセイを実行するためのサンプルボリュームの少量を必要とし、唯一のスポット当たりグリカンの微量（2 NL）を使用しています。しかしながら、これらのアレイは、典型的には、グリカン受容体の特異性を評価するためにのみ使用されます。複数の濃度範囲で、複数のウイルス、または赤血球凝集素タンパク質の分析は、必要スライドの数を禁止することができます。また、現在までに、相対的な結合活性アッセイは、グリカンのarを使用して開発されていません線技術。
グリカンマイクロアレイ技術およびELISAベースのアッセイにおけるPAA結合型グリカンの感度によりもたらされる低いサンプル要件を結合するために、我々は、比較して同等以上の分解能で高スループット分析を可能にするマルチウェルグリカンアレイを開発しようとしました従来のELISAベースのアッセイに。同時に、我々は消費生物学的製剤およびレポーター化学物質の量を最小限にしたかったです。最終的な結果は、特にIAV特異性を監視するために開発さ小型化結合活性アッセイであり、他のグリカン結合タンパク質を評価するためにも同様に適用可能です。テフロンマスクで48マイクロウェルに分離ガラススライドを使用して、6つの異なるグリカンは、ウェル当たり6連でスポットします。マイクロアレイプラットフォームは、いくつかの利点を持つマクロELISA形式で見られる受容体結合に同じ傾向が得られます。これらは、いくつかの行Iのコーティングに対して、最小限のサンプルを使用して、6反復中の化合物（I）の印刷を含みますプレート、ウェルあたり100μlのを使用してナ。コントロールを含む単一のウェルに同時に分析（II）複数の異なる化合物; （III）インキュベーション体積との大幅な減少。 （IV）、蛍光読み取りを使用して、より大きなダイナミックレンジ。単一のスライドを18倍、96ウェルプレートに相当するように計算することができます。
以下のプロトコルでは、製造および分析することが可能な任意の研究室は、マイクロアレイは、この小型化されたELISA形式を製造することができる必要がありますスポッティング。
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Protocol
注：特に指定のない限り、すべての工程は室温で実施されます。
1.アレイの構築
- グリカン調製とプレートのセットアップ
- 印刷バッファの株式を準備します。まず、第二リン酸ナトリウムの150mMのストック溶液の500ミリリットルを作ります。また、リン酸二水素ナトリウム溶液150 mMストック溶液50mlを加えます。 8.5のpHに到達するまでフラスコに、磁気攪拌棒及びpHメーターを使用して、ゆっくりと一塩基性溶液と第二リン酸ナトリウム溶液を滴定します。 0.005％へのTween-20を追加します。
- グリカンのサンプルを準備します。希薄PAA共役グリカン、（diLacNAc（Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA）、3SLNLN（Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA）と6SLNLN（Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA（ 図1A ））step1.1.1から印刷バッファには100μg/ mlに希釈される。一価グリカンdiLacNAc（Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-（CH 2）3 NH 2、3SLNLN（Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ - （CH 2）3 NH 2）と6SLNLN（Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1- 4GlcNAcβ -ステップ1.1.1から印字バッファ内の100μMに（CH 2）3 NH 2））。最後に、グリッドマーカー/着陸灯として使用するために、アミン官能化染料を準備します。色素マーカースポットが1μMで印刷されています。
注：Atto488-NHS色素は、我々の印刷に使用されます。しかし、スライドスキャナーによって読み取り可能な任意のアミン官能化色素は、この目的のために適切です。 - 印刷ロボットに使用される384ウェルマイクロタイタープレートへの転送各グリカンサンプルを10μl。密封されたチューブ中、-20℃での印刷緩衝溶液に保管未使用グリカン。 Tansfer印刷版への色素マーカー10μlの。
- 印刷
注：すべてのSTEpsの懸念が触れたり、手袋を使用して行う必要があり、スライドを動かすこと。- レイアウトの正しい構成に応じてプリントヘッドにアレイヤーピンを配置します。このレイアウトのすべてのサンプルと配列を印刷するには1ピンを使用します。同じサンプルのスポットは互いに横に正確に印刷されないように、それぞれの側に、一つの特徴をスキップ（機能は、特定の化合物の単一のスポットとして定義されている）、6のブロックでグリカンを印刷します。
注：エンドユーザーが設定を決定する必要があります。 - 袋からスライドを削除し、オープンボックス、および各スライドに超高純度窒素ガスを吹き付けてその表面にあるかもしれない任意のダスト粒子やプラスチックの小片を削除します。アレイヤーステージ上に、側面をコーティングしたスライドの所望の数を、置きます。
- プログラムはアレイヤーは、印刷ピンの先端に過剰な液体を除去するために、ポリ-L-リジンコートスライド上に「事前スポット」3を使用して、ソースプレートに訪問当たり27スポットのパラメータを使用します
- MPU（主電源ユニット）と気候コントロールユニットの電源をオンにします。コンピュータ上のタイル解析ソフトウェアを開きます。
- プリントにレイアウトを選択します。 1単一のピン - アレイ1×1の印刷ツールの印刷に使用されるように、[オプション]→[ピンツールを選択します。ターゲットタブ→ツールアレイ定義→印刷パターンを選択して、ピッチ（スポット間距離）を追加し、行と列の数、印刷するサンプルを収容するために、サンプルの印刷パターン（この配列のために8 ×8の印刷パターンは、合計7の試料について340ミクロンのピッチ）で使用されます。
- ターゲット→スライドのレイアウトを選択し、48ウェル（4×12）のスライドテンプレートに各反復配列の印刷を可能にするために、ブロック間の距離をプログラムします。ソースを選択し、（6サンプルウェルと1色素マーカー十分に対応するために使用されます。このプリント7ソース・ピックアップのために）（1ピンを使用した場合、各試料について1）ソースピックアップの番号を追加します。
注：ソースの対話はその数を示すためにGREENを有効にしてくださいソース訪問の印刷パターンで印刷されるサンプルが一致します。 - ターゲット→アダプタプレートを選択し、レイアウトをスライドさせ、スライド数を調整（5スライドは1プレスポッティングスライドでこの印刷のために一度に印刷されています）。
- プレスポッティングスライド（BLUE）の場所と "本当の"スライドに細心の注意を払って、トレイを活性化し、トレイにスライドの所望の数を追加するには、T1]ボタンをクリックして、トレイを解放します。
- 真空を遮断し、真空を有効にするには、[OK]をクリックし、残りのすべての真空ポートで、プレーンガラススライドを置きます。すべてのスライドが所定の位置に保持されていることを確認し、ホームポジションにトレイを戻すには、[OK]をクリックします。
- プレートホルダーに印刷版をロードし、ラックを所定の位置に正しく設定されていることを確認。 GOをクリックして、印刷処理を続行することができます。
- アレイあたり6スポットの反復で残りの24スポット（4列/ソース訪問）を印刷します。
- 384ウェルプレートをロードしますプリンタに印刷を開始します。 55と65％の間で印刷を通じて、印刷中に、相対湿度を維持。プリンタは5スライドを印刷した後に停止します。
注：このアッセイにおいて、マイクロアレイは、特定の8×8パターンで印刷されているが、異なるマイクロアレイ印刷ロボットが目的のレイアウトを実現するために装置固有のプログラミングが必要になります。それは彼らの機器の仕様与えられた最も適切なパターンを決定するために、エンドユーザーに任されています。
- レイアウトの正しい構成に応じてプリントヘッドにアレイヤーピンを配置します。このレイアウトのすべてのサンプルと配列を印刷するには1ピンを使用します。同じサンプルのスポットは互いに横に正確に印刷されないように、それぞれの側に、一つの特徴をスキップ（機能は、特定の化合物の単一のスポットとして定義されている）、6のブロックでグリカンを印刷します。
- 加湿/固定化
注：スライドの印刷が終了したら、彼らは一時的な固定化ステップとも呼ばれる加湿を受けます。印刷後を加湿するスポットを再湿潤剤および完全な遮断を確実にすることによって、サンプルの添付ファイルを均質化するのに役立ちます。- すぐに30分の期間、印刷後100％の湿度チャンバ内のスライドを置きます。スライドを配置し、大きなガラス皿の底に平らに非常に湿った紙タオルを置くことによって、チャンバを構築このようないくつかの試験管ラックなどのラックのソート、印刷面を上にし、水分中のトラップにラップで密封する上で。
- 番号は、乾燥ボックス内のアルコール/溶媒耐性マーキングペンとストアと摺動します。一晩乾燥させます。
- 番号、ブロッキング、およびストレージ
- 50mMのホウ酸緩衝液中の50mMエタノールアミン - ブロッキングバッファーを準備します。まず、磁気撹拌棒を含むフラスコ中の50mMの最終濃度まで、のddH 2 Oに、ホウ酸を溶かします。すべての固体が溶解するまで撹拌プレート上の溶液を激しく撹拌します。絶えず撹拌しながら、希望の50 mMの濃度に到達するために16.54 Mストック溶液からエタノールアミンの適切な量を追加します。 9.2の最終pHに調整するための濃水酸化ナトリウムを追加します。
- 1時間ブロッキング緩衝液中に印刷されたスライドを浸します。
- 1時間後、ブロッキング緩衝液の余分な痕跡を除去するためのddH 2 Oでスライドをすすぎます。適切な廃棄物容器内のブロッキング緩衝液を廃棄してください。
- ガラス染色ホルダーとスピン乾燥にスライドを転送します。 5分間、10×gでの速度で、スイングプレートホルダーを装備した遠心機でそれらを配置することによりドライ配列。
- スライドが乾燥したら、それらは直ちに培養又は保存することができます。保管条件は、密封されたビニール袋で-20℃です。
2.グリカン結合タンパク質の分析
- ハイブリダイズする配列が収まるする加湿チャンバーを準備します。シンプルなチャンバースライドを休まれる時に湿らせたペーパータオルとラックと底部に積層パイレックス皿、で構成されています。
- ビオチン化レクチンを使用するSNA（ サンブカ黒質凝集素）とバッファをプロービング中10μgのストレプトアビジン555染料/ mlの+を2μg/ mlのECA（ エリスリナ属cristagalli凝集素）、（PBS + 0.01％のTween-20）。 HA（A /ベトナム/ 1203/04 H5N1およびA / KY / 07 H1N1、この例では）、使用のために以前に34を説明したように、事前複合化ミリリットルを20μg/の濃度を開始します。マウス-α-連鎖球菌：簡単に言えば、HAするブロッキング緩衝液中でヤギα - マウスAlexa647混合物（PBS + 3％BSA + 0.01％のTween-20）、4で：2：1のモル比。
注：アレイは、グリカンが固定化され、（ 図1B）、検出されていることを確認するためにレクチンを用いてプローブされています。 - 384ウェルプレートに20μLのグリカン結合タンパク質 - 抗体混合液を移し、30分間氷上でインキュベートします。緩衝液10μlに10μlのサンプルを混合することによって、それらの適切なバッファ、8回で、1：シリアルレクチンおよびHAサンプル1を希釈。
- マイクロウェル表面へのサンプルのピペット8μlを、90分間、密封された加湿（100％RH）チャンバー内でインキュベートします。
- その後、PBSで4回エッジを保持し、PBS及び0.05％のTweenの混合物でそれらを4回浸漬することにより、一度にスライド1を洗浄し、脱イオンHで最終的に4回2 O.使い方ブロッキング工程で説明したのと同じ乾燥プロトコルは、10×gで5分間遠心機で乾燥したアレイをスピン。
3.スキャニングとデータ解析
注：グリカンマイクロアレイは、マイクロアレイスキャナーの製造元に応じて、異なる設定でスキャンすることができます。レーザパワーと分解能を変化させることにより、器具は、そのダイナミックレンジ（ 図1C）内の可能な限り多くの信号を用いて画像を生成することができます。
- 蛍光スライドスキャナを使用して、すぐに糖鎖結合性タンパク質とのインキュベーション後にアレイをスキャンします。スライドが正しく走査装置に挿入されていることを確認するように注意してください。
- オープンスキャンソフトウェア。プログラムを開くには、開始]をクリックします。スキャナのナビゲーションパネルメニューのスキャナ→接続または緑のボタン：スキャナに接続します。
- スキャナのオープンオートローダのドア。特定の順序でオートローダのスロットにスライドを置きます。オートローダのドアを閉じます。 Cl嫌なスキャナーでスライドを自動検出するツールのナビゲーションパネルの「ローダーを読んで」。
- スキャンパラメータを設定します。実験（ 例えば 635レーザーパワー高、検出ゲイン50％）への適切なスキャナ→スキャンパラメータ。スキャンスライド：スキャナ→スキャン。スキャン画像と名前個々のスキャンを保存するフォルダを作成することによって、パスを選択します。前実際のスキャンにこれを行います。各個別のスライドについて、この手順を繰り返します。スキャンを開始するには、[OK]をクリックします。
- 楽器を設定し、スライドをスキャンするスキャナソフトウェアを使用してください。設定スキャナは反復25％、50％及び75％の利得設定を増加させるとともに、低レーザーパワー（5ミリワット）でスキャンします。
注：設定がテストされ、最適化されたが、各スキャンは、おそらく、光退色による色素の蛍光出力を低下させることができることを心に留めておくことができます。- このようなMAPIXソフトウェアなどのオープンデータ収集および解析ソフトウェア。プログラムを開くには、開始]をクリックします。オープンスキャン画像：IMをオープン→ファイル年齢。オープンGALファイル：→オープングリッドを分析し、適切なGALファイルを選択します。
- グリッドを移動するイメージ→ブロックモード：ブロックモードに入ります。スライド上の適切な場所にグリッドを設定するグリッド・マーカーを使用します。印刷された配列を一致させるために、必要に応じて個々のブロックを調整します。
- ブロック内の個々のスポットの位置とサイズを調整するイメージ→スポットモード：スポットモードを入力します。一旦、全てのブロックとのスポットを調整し、所定の位置に、→測光計算を分析することにより、信号強度を測定しています。出力ファイルを保存します。
- スライドをスキャンが終了したら、画像が（ - G 図 1D）インストールされた画像処理プログラムとの間で信号を結合するために分析されます。画像分析のために、スキャンしたTIFF画像の上GAL（アレイリスト）ファイルをロードします。
注：GALファイルには、各スポットの位置のスポットレイアウトパターンとアイデンティティの両方が含まれています。アレイ用のGALファイルは、CRです384ウェルソースプレート内のサンプルとその場所のアイデンティティを含むタブ区切りのテキストファイルを使用して、プリンタソフトウェアによってeated。 - 適切GALグリッドを配置するために、マイクロアレイ上に印刷されたグリッドマーカー/着陸灯を使用してください。個々のスポットは、個別に移動する必要があるかもしれないが、よく印刷された配列は、一般的に、グリッド内のブロックを容易に配置することができるようになります。グリッド配置の後、ソフトウェアでスポット強度を収集し、タブ区切りのテキストファイル（.txt）として保存。
- スプレッドシートプログラムを使用して、スキャナからの出力ファイルを開きます。フォルダの場所から適切なマクロファイルを開きます。 [表示]→[マクロ→RunMacroをクリックします。
注：事前に書かれた、生の出力データをコピーして、不要な行や列を削除し、サンプルでデータをソート、信号の平均値マイナスバックグラウンド値を計算し、それぞれのグラフを含むスプレッドシートワークシートにで得られた値をプロットします6 SAMPのレは、アレイ上でテストされています。
- スプレッドシートプログラムを使用して、スキャナからの出力ファイルを開きます。フォルダの場所から適切なマクロファイルを開きます。 [表示]→[マクロ→RunMacroをクリックします。
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Representative Results
印刷、スキャン＆データ分析します
適切な印刷を確保するためには、スライド上の各アレイの輪郭を描くテフロンマスク内の斑点グリッドの正確なアライメントを持っていることが重要です。テフロンコーティングの性質に、印刷中に、スポットがMPXスライド上の肉眼で見ることができません。注目は、ポリ-L-リジンコートしたスライド上のプレスポットの出現にその後支払われます。直接印刷した後、各スライドが原因スポットで乾燥させ、バッファーの塩に表示され、各スポッティング化合物の存在を目で確認する必要があります。アレイは、テフロン国境やスポッティング機能の正しい数内のスポットの正確な位置合わせのために検査されます。
スライドは、光退色を避けるために、より高いスキャン電源に下の反復プロセスでスキャンされ、HIGの比較を可能にしています彼女の結合活性は、それぞれ、高いおよび低い出力信号を有する親和性結合タンパク質を、低下させます。走査に続いて、出力画像内の各スポットの蛍光強度は、撮像プログラムを使用して測定されます。各アレイは、アレイ表面（ - G 図1D）に印刷された機能の数と一致するグリッドファイルでオーバーレイされます。印刷された蛍光染料を使用して、印刷されたグリカンの境界が定義され、印刷されたサンプルのアイデンティティと統合されているマスクは、各スポットをlassoes。イメージングマスク投げ縄は、タブ区切りのテキストファイルに結像スポット（サイズ、信号強度、グリッド座標等 ）と出力この情報のすべての側面を記録します。集計ソフト（スプレッドシート）を使用して、サンプルがアイデンティティによってソートされ、平均信号強度マイナス背景には、外れ値として最高と最低の信号を残し、各サンプルの6スポットの4にわたって平均化されます。信号の平均値の折れ線グラフマイナスの背景には、アレイに適用される8タンパク質濃度に対してプロットし、各サンプルの1行が含まれています。最終的な出力グラフは、非線形回帰計算（ 図1I）を使用して平滑化されます。
糖鎖結合タンパク質
PAA-配列は、インフルエンザウイルス赤血球凝集素の受容体結合特異性を評価するために使用されます。私たちの配列のさらなる特徴は、類似したプレートアッセイには存在しない、同じマイクロウェル中の非シアル化されたコントロールが含まれていることです。その印刷の化合物は、印刷後に存在する評価するために、既知の特異性を有する一般的に使用される植物レクチンを用いました。 ECAは、N-アセチルグルコサミン（Galβ1-4GlcNAcまたはのLacNAc）にβ1-4結合された末端のガラクトースに結合し、末端ガラクトースをシアル酸でキャップされている場合は結合しないであろう。 ECAは、当社の小型化グリカン編曲上の非シアリル化グリカンを検出し、AY（ 図2A）。シアル化グリカンサンプルのいずれかへの結合の欠如は、これらが完全に末端シアル酸でキャップされていることも示しています。 α2-6結合したシアル酸について、SNAレクチン制御（ 図2B）として使用しました。予想されるように、SNAのみ結合したシアル酸をα2-6に結合するが、PAA-連結された非PAA-リンクジのLacNAcの繰り返しに対する親和性の顕著な違いを持ちます。この違いは、PAA結合型グリカンの感度を反映し、低親和性で結合し得るタンパク質の識別を可能にします。 α2-3結合シアル酸のみα2-3結合したシアル酸を認識することが知られているA /ベトナム/ 1203年から1204年のウイルス由来のH5ヘマグルチニンの場合は6を使用しました。 H5 HAの結合プロファイルは、実際にPAA-リンク構造（ 図2C）のためのより高い結合力で、α2-3結合したシアル酸に対する特異性を示しています。最後に、人間の季節のH1N1株からのH1血球凝集素を使用した、その予想通り、のみ結合シアル酸含有する構造（ 図2D）を α2-6に結合しました。
図1：印刷、スキャン、画像解析 （A）PAA結合6SLNLNをガラススライド上に印刷されている代表的なグリカン構造として示されています。マルチウェルグリカンアレイ上のグリカン結合タンパク質をインキュベート（B）は、アレイ表面上の液滴を作成する8μlの容量で示されています。共焦点蛍光スライドスキャナーでアレイ走査のグリカン結合タンパク質のインキュベーション後（C）は 、代表的な画像が得られます。 （D）画像を適切な位置合わせのためのグリッドマーカーを使用して、グリッドにオーバーレイされ、単一のスポットを分析することができます。 （E）Aの近くで、単一の糖鎖結合性タンパク質8配列の完全なセット、のアップ1希釈：8 1を用いて分析しました。 （F）単一のウェル内の単一のアレイが、表されます。 6の複製がはっきりと見えるように、アレイは、右上（3箇所）及び左下（2箇所）でグリッドマーカーによってdemarkedされ、この糖鎖結合性タンパク質は、アレイ上の単一の化合物に特異的に結合します。 （G）格子は、特定の個々のスポットを囲む投げ縄で示されています。 （H）イメージングソフトウェアは、イメージファイルからの信号値を算出し、タブ区切りデータファイルを出力します。 （I）のデータは、代表的な出力グラフを作成するには、スプレッドシートやstasticalソフトウェアで表にすることができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：植物レクチン（ECA、SNA）の出力とIAV HEMA異なる特異性（A /ベトナム/ 1203年から1204年、H1からA /ケンタッキー/ 07からH5）とgglutinins。（A）ECAは、具体的に、端末のLacNAcまたはGalb1-4GlcNAcを結合し、非シアリル化化合物の存在を検出し、対照として使用IAVのヘマグルチニンのため。 （B）SNAは末端α2-6シアル酸を担持するだけグリカンを認識します。 （C）H5N1の組換えヘマグルチニン（A /ベトナム/ 1203年から1204年）株は、シアル酸をα2-3に結合し、鳥型受容体結合プロファイルを提供します。 （D）は、ヒトの季節性H1N1（A /ケンタッキー/ 07）の組換えヘマグルチニン ヒト型受容体のみに結合します。蛍光シグナル強度は、各スポットについて測定し、平均強度マイナス背景は表計算プログラムを使用して計算した平均しました。各グリカンについて、平均信号強度が6から計算されたスポットを複製します。 6反復除去され、残りの4レプリカの最高と最低の信号TESは、平均信号、標準偏差（SD）、および標準誤差測定（SEM）を計算するために使用されます。グラフはSEM値であり、各サンプルおよびエラーバーの平均平均信号マイナス背景を表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
IAV受容体の特異性を評価することは、鳥ウイルスのパンデミックの可能性を分析する上で重要なステップです。ウイルスによるシアル酸の認識は、そのような細胞からへの結合および放出などのいくつかの生物学的性質に連結されています。鳥ウイルスが結合α2-6達成し、種の壁は、パンデミック対策を可能に交差するの知識は、アミノ酸の変異が必要です。いくつかのアッセイは、受容体特異性を決定するために使用されます。しかし、すべてが唯一の特異性とその逆の結合活性を測定していないなど、自分の欠点を有しています。
ここでは、より複雑なグリカンのPAA-リンクされている端末の断片を使用して広く使用され、受け入れられたELISA、に基づく新規な小型化されたツールについて説明します。 4明確に定義されたレクチン、植物の2及びインフルエンザの2ウイルスの起源を使用して、我々は特異性と相対的な結合活性を維持することを示しています。
我々は、化学物質の削減とBIOLOGの量を計算するとグリカンアレイチップ上にELISAを小型化することにより、使用のiCalは、我々は驚くほど大きな差に達します。まず、生物学的製剤。我々は10倍少ないアッセイ容量を使用し、6連で6試験化合物を使用します。これは、96ウェルプレート中36X行等価であると計算することができます。その結果、我々は360X少ない生物学的製剤を使用することです。重要なステップは、適切な印刷や未精製糖鎖の結合剤を用いた高背景や貧しい検出抗体のリスクが含まれます。
このアッセイで使用される化合物は、まだ利用可能であるが、容易に化学酵素合成により作製されていません。マイクロアレイ印刷技術を用いて、各スポットは、マイクロタイタープレートのウェル当たり100μlのに比べて、わずか2 NLです。 48ウェルおよび6の化合物を含有する単一のスライドを印刷、6連で、我々は約1152 NLを消費します。同じ濃度の化合物の100μlで1842ウェルの合計をコーティング96ウェルプレートの結果で同じコーティング手順。したがって、プリントT彼は我々が1,500xの印象的な削減を達成、プレートアッセイと比較して、化合物。したがって、合計で、生物学的製剤は、1500倍360倍およびグリカン消費量を低減しています。ロボット液体ハンドラーを使用して、我々は、全アッセイをハイスループットスクリーニングとして使用することができるように、ほとんどの工程を自動化することができることを想定します。
印刷マイクロアレイおよびその後の画像解析は、特殊な機械や道具を必要としますが、これらの機器はまれではなく、多くの大学や研究機関で存在しています。印刷は、直接であると化学変化を必要としません。したがって、我々はこの化合物の最小量とシンプルな印刷技術を用いて、このアッセイは、より一般的に適用することができ、と考えています。これはインキュベーション体積を減少させて低コストを維持しながら、抗体および貴重な生物学的製剤のコストは、この技術は、実現可能な限られたリソースでラボがIAVまたは高い忠実度で他のグリカン結合タンパク質の特異性を評価するために行います秒。
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Acknowledgments
この作品は、スクリップスマイクロアレイ基盤施設、及び疾病対策センター（JCP）からの契約によって部分的にサポートされていました。 RPdVは、科学研究費オランダ機構（NWO）からルビコンとVENI助成金の受取人です。 NIGMS助成金GM62116（JCP）によって資金を供給機能グライコミクスのためのコンソーシアム（http://www.functionalglycomics.org/）は、この研究で使用されるいくつかのグリカンを提供します。これは、スクリップス研究所から出版29113です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEXTERION® Slide H MPX-48 | Schott | 1091525 | Microwell slides |
| ProScanArray Plus | PerkinElmer | discontinued | confocal microarray scanner |
| Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software | Innopsys | - | confocal microarray scanner |
| MicroGrid II | Digilab | - | microaray printer |
| SNA | Vector Labs | B-1305 | Plant Lectin |
| ECA | Vector Labs | B-1145 | Plant Lectin |
| Anti-Strep Antibody | IBA | 2-1509-001 | Anitbody for HA binding |
| Anti-Mouse Alexa-647 | Life | A-21235 | Anitbody for HA binding |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | detergent |
| di-basic Sodium Phosphate | Sigma | 255793 | printing buffer component |
| mono-basic Sodium phosphate | Sigma | 229903 | printing buffer component |
| poly-l-lysine solution | Sigma | P8920 | pre-spotting slide component |
| sodium hydroxide | Sigma | 221465 | pre-spotting slide component |
| ethanol | Sigma | 493546 | pre-spotting slide component |
| phosphate buffered saline | Corning | 46-013-CM | incubation/washing buffer |
| SMP4B pins | Telechem | SMP4B | printing pin |
| Compressed Nitrogen (Grade5) | Praxair | UN1066 | general dusting/drying tool |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | Slide blocking reagent |
| ethanolamine | Sigma | E9508-500ML | Slide blocking reagent |
| Atto 488 | AttoTec | AD 488-91 | Gridmarker on array |
| PAA-LNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA368 | Spotted glycans |
| PAA-3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA362 | Spotted glycans |
| PAA-6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA343 | Spotted glycans |
| LNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te98 | Spotted glycans |
| 3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te175 | Spotted glycans |
| 6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te176 | Spotted glycans |
| 384-well microtiter plate | Matrix TechCorp | 4361 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-150 | Slide Numbering |
| Wheaton slide staining dish | Sigma | Z103969-1EA | Blocking and Drying |
References
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