La détection des protéines liant l'ARN par In vitro ARN Pull-down en adipocytes Culture

RBP sont des protéines qui se lient à l'ARN double ou simple brin dans les cellules et participent à la formation de complexes ARN-protéine. RBP peuvent lier une variété d'espèces d'ARN, y compris l'ARNm et de longues ARN non codantes (lncRNAs), et exercer leur influence au niveau post-transcriptionnel. Les deux RBP et lncRNAs apparaissent comme nouveaux régulateurs dans le développement du tissu adipeux et de la fonction ^1,2,3. Pour comprendre le mécanisme de RBP- et la régulation du lncRNA médiée par des voies cellulaires, il est souvent nécessaire de détecter l'interaction entre une molécule d'ARN spécifique et un ou plusieurs RBP, et, parfois, d'identifier la gamme complète des partenaires protéiques d'un ARN transcription. Cependant, l'expérience peut être difficile en raison de la forte teneur en lipides dans les adipocytes. Le protocole de pull-down de l' ARN est décrit ici peut être utilisé pour récupérer les partenaires protéiques d'un ARN spécifique à partir de lysats de cultures primaires adipocytes ^4,5.

Justification de ce protocol se résume comme suit. Un appât à ARN est transcrit in vitro à partir d' une matrice d'ADN marqué à la biotine et conjugué à des billes magnétiques revêtues de streptavidine ^4. L'amorce d'ARN est mis en incubation avec des lysats cellulaires pour permettre la formation de complexes ARN-protéine, qui sont ensuite abaissés sur un support magnétique. Plus précisément, le protocole de pull-down de l' ARN décrit ci - dessous utilise un fragment d'ARN à partir d' AR 3'UTR comme appât pour récupérer la protéine Hur, une RBP universellement exprimée lié au 3'UTR des ARNm ^6,7, à partir theadipocytelysate de la culture primaire. Afin de tester la spécificité de liaison de cet essai, une RNAas non pertinents ainsi que des billes de streptavidine blanc est inclus comme témoin. Ce protocole est compatible avec Western blot ou par spectrométrie de masse (MS) pour confirmer la capture d'un RBP spécifique ou d'identifier le plein répertoire des pratiques commerciales restrictives, respectivement ⁸ capturés.

Plusieurs techniques sont disponibles pour étudier les interactions ARN-protéines. Pour révéler ARNs liés par un RBP donné, RIP (ARN immunoprécipitation) et CLIP (réticulation UV et immunoprécipitation) peut être appliquée. En revanche, pour identifier les partenaires protéiques d'un ARN donné, ARN pull-down, CHIRP (chromatine isolement par la purification de l'ARN), GRAPHIQUE (capture analyse d'hybridation de cibles d'ARN) et RAP (purification antisens d'ARN) peut être appliqué. En comparaison avec les plus tardifs, technique déroulant ARN prend moins d'efforts pour mettre en place. Il peut être utilisé pour capturer des protéines in vitro et in vivo. L'approche in vivo de l' ARN pull-down, qui est techniquement plus difficile que son homologue in vitro, préserve les interactions ARN-protéine par réticulation dans les cellules, capture des ARN aptamères marqués d'intérêt à partir de cellules, et détecte ensuite RBP liés. ARN pull-down peut être utilisé pour enrichir faible RBP abondantes, et d'isoler et d' identifier les complexes ARN-protéine qui ont des rôles fonctionnels divers dans le contrôle de la régulation cellulaire ^9,10

NOTE: L'ARN d'intérêt dans le cadre de cette étude est un fragment AR 3'UTR.

1. Préparation de l'ARN marqué à la Biotine

1. Pour obtenir l'ARN amplifier T7-AR-oligo- par PCR, suivie par une transcription in vitro en utilisant un kit commercial et en suivant les instructions du fabricant ^11.
   NOTE: Les amorces pour la PCR sont énumérées dans le tableau 4: T7-AR-F et T7-AR-R.
2. Pour un contrôle de liaison non spécifique, amplifier une séquence partielle de l'ADN luciférase de luciole (FL) par PCR à partir du plasmide psiCHECK-2, suivie par une transcription in vitro.
   NOTE: Amorces pour PCR sont énumérés dans le tableau 4: hluc (+) - T7-probe-F et hluc (+) - Sonde-R Tableau 4 séquences de matrice et des amorces pour l' amplification par PCR...
3. Pour une réaction PCR de 50 ul, mélanger 50 ng d'ADN (oligo ou plasmide), 4 dNTP pi (2,5 mM de chaque dNTP individuelle), 5 ul 10x tampon de réaction, 1 pl de 2,5 U / & #181; l 'ADN polymérase, 2 pl 10 pM amorce avant, 2 pi 10 pM amorce inverse, et de l'eau sans nucléase.
   1. Exécuter une amplification par PCR dans un thermocycleur en utilisant le programme suivant. ETAPE 1: un cycle de 95 ° C pendant 2 min; ETAPE 2: 35 cycles de 95 ° C pendant 30 secondes, 55 ° C pendant 30 secondes et 72 ° C pendant 30 secondes (AR) ou 60 secondes (FL); Etape 3: un cycle de 72 ° C pendant 10 min.
4. Synthétiser ARNs biotinylés en utilisant un kit de transcription in vitro en suivant les instructions du fabricant ^11. Dans cette expérience, utiliser des produits de PCR en tant que modèles pour la synthèse de l'ARN. Pour une réaction in vitro ul 20 de transcription, mélanger 200 ng d' ADN par PCR amplifié, 2 pi de chaque individu NTP, 1 ul de 10 mM de biotine-CTP, 2 ul de 10 x tampon de réaction, et 2 ul d' ARN polymerase de T7. Laisser incuber le mélange à 37 ° C pendant 4 heures.
5. Après la transcription in vitro, mélange réactionnel traiter avec 1 pi 2 U / DNase ul à 37 & #176; C pendant 15 minutes pour dégrader l'ADN matrice. Enfin, on dilue l'ARN biotinylé à un volume total de 60 ul pour une purification ultérieure.
6. Purifier ARNs biotinylés pour éliminer les sels et les nucléotides non constituées en utilisant des colonnes de purification en suivant les instructions du fabricant ^12. Mesurer la concentration d'ARN et conserver à -80 ° C pour la suite des essais déroulants.
7. Pour assurer une structure secondaire appropriée pour l' ARN d'intérêt dans l' ARN-protéine d' interaction, la chaleur 50 ul ARN biotinylé (50 pM) à 90 ° C pendant 2 min, froid sur la glace pendant 2 min, puis fournir avec 50 ul 2x tampon de structure de l' ARN (tableau 3) et permettre le pliage de l' ARN à la température ambiante pendant 30 min ^13,14.

2. Préparation des billes d'ARN-conjugué

REMARQUE: Utilisez un support magnétique pour la séparation des billes magnétiques et surnageant.

1. Resuspendre les billes magnétiques revêtues de streptavidine dans le flacon d'origine par une brève Vortexing suivant les instructions du fabricant. Transférer 150 ul billes en suspension à un tube de 1,5 ml. Placer le tube sur l'aimant pendant 1 min. surnageant Jeter. Gardez talon pastille.
   NOTE: Dans ARN dosages pull-down, lorsque aliquotage billes en suspension du flacon d'origine, utilisez 50 perles ul pour un essai suivi par western blot, et 200 billes pi pour un essai suivi par MS.
2. Laver les perles une fois par remise en suspension bourrelet culot avec 1 ml de recommandé 1x W & B du fabricant tampon (tableau 3) ( la liaison et le lavage), puis en faisant tourner le tube pendant 5 min à température ambiante dans un dispositif de rotation. surnageant Jeter. Gardez talon pastille.
3. Inactiver l' ARNase sur des billes, des billes de lavage à deux reprises, chaque fois par remise en suspension avec 400 billes pastille pi de tampon A. Le tampon A est une solution alcaline contenant du NaOH 0,1 M et 0,05 M de NaCl (Tableau 3). Tourner le tube pendant 2 min à température ambiante dans un rotateur. surnageant Jeter. Gardez talon pastille.
<li> Pour retirer des billes de NaOH, lavage des billes deux fois, à chaque fois par remise en suspension avec 400 billes pastille ul de tampon B (tableau 3), puis en faisant tourner le tube pendant 2 minutes à la température ambiante dans un dispositif de rotation. surnageant Jeter. Gardez talon pastille.
4. Resuspendre talon pastille avec un tampon 2x W & B 300 pi, perles divisées de manière égale et transférer dans trois tubes de 1,5 ml (100 perles pi par tube). Fournir les tubes contenant tringle avec RNase eau libre de 100 pi, 100 pi biotinylé ARN FL et 100 pi biotinylé AR 3'UTR ARN, respectivement.
5. Incuber chaque mélange de perles pendant 1 heure à température ambiante avec rotation. Placer les tubes sur l'aimant pendant 1 min. Jeter tout surnageant. Gardez des pastilles de perles.
6. Laver les perles deux fois, à chaque fois par remise en suspension chaque culot de billes avec du tampon W & B 1 x 400 pi, puis en faisant tourner les tubes pendant 5 min à température ambiante dans un dispositif de rotation.
7. Placer les tubes sur l'aimant pendant 1 min. Jeter tout surnageant. Resuspendre chaque pelle perlet avec 50 tampon d'isolement nucléaire ul (tableau 3).

3. Préadipocytes Isolement et Adipogenesis Induction

1. Comme décrit dans les publications précédentes ^5, disséquer préadipocytes du coussinet adipeux brun interscapulaire (C57BL6 souris de type sauvage, vieux de 3 semaines).
2. Cultivez et in vitro différencier les préadipocytes ^5. Les cellules sont prêtes pour application en aval 4-5 jours après le début de la différenciation.

4. Préparation du cellulaire Lysate de adipocytes primaires

REMARQUE: Veiller à toutes les procédures de préparation de lysat cellulaire sont faites sur la glace, et tous les tampons sont refroidis sur la glace. Pré-refroidissement homogénéisateurs de verre Dounce sur la glace.

1. Cultivez et différencier préadipocytes en 15 cm plats ⁵ (voir section 3.2). Chaque plat fournit des cellules adéquates pour un ARN test déroulant. Le jour 4 ou 5 jours de différenciation, défausse milieu de culture cellulaire, et laver CELLS une fois avec PBS 1x.
2. Pour récolter les cellules, ajouter 10 à 15 ml de PBS 1X aux cellules, gratter pour recueillir les cellules dans un tube de 50 ml et un culot de cellules par centrifugation à 200 g pendant 5 min à température ambiante. Rejeter le surnageant en utilisant 1 ml pipette.
3. Resuspendre le culot de cellules dans 2 ml de tampon hypotonique (tableau 3), et on incube les cellules sur de la glace pendant 15 min. Transfert des cellules à un homogénéisateur en verre de 15 ml de Dounce, et les cellules de cisaillement mécaniquement sur la glace avec 20 coups.
4. Pellet noyaux cellulaires par centrifugation à 3300 xg pendant 15 min à 4 ° C. Gardez granulés noyaux sur la glace pour une utilisation ultérieure (voir section 4.6). Transférer le surnageant dans 1,5 ml tubes, ajouter 3M KCl au surnageant pour obtenir une concentration finale de 150 mM, et de spin à 20.000 xg pendant 15 min à 4 ° C.
5. Après centrifugation, enlever soigneusement lipidlayeron le haut à l'aide de pipette de 1 ml, et de recueillir le surnageant comme le lysat cellulaire cytoplasmique.
6. Resuspendre culot noyaux (voir rubrique 4.4) dans 1 ml de tampon d'isolement nucléaire. Tnoyaux RANSFERT à un homogénéisateur en verre de 15 ml de Dounce en utilisant 1 ml pipette, et les noyaux de cisaillement mécanique sur la glace avec 100 coups. Sédimenter les débris nucléaires par centrifugation à 20 000 xg pendant 15 min à 4 ° C et recueillir le surnageant comme le lysat cellulaire nucléaire.
7. Soit combiner les lysats cellulaires nucléaires et cytoplasmiques, ou chaque fraction séparément, pour l'application déroulant en aval. Dans cette expérience de démonstration, ces deux fractions de lysat cellulaire ont été combinés à un rapport en volume de 1: 1.
8. Ajouter un inhibiteur de la RNase à ce lysat cellulaire non fractionnée pour obtenir une concentration finale de 0,5 U / ul. Mettez de côté 100 pl de lysat cellulaire que le contrôle d'entrée pour western blot ^15.

5. Liaison et élution de RBP

1. lysat Split cellule en trois aliquotes égales (1ml de lysat cellulaire dans un tube de 1,5 ml), et incuber avec le blanc, FL ARN-conjugué et des billes AR 3'UTR ARN-conjugués (voir section 2.8), respectivement, pendant 3 heures à 4 ° Cavec rotation.
2. Placer les tubes sur l'aimant pendant 1 min. Recueillir le surnageant à l'aide d'une pipette de 1 ml, suivie de l'isolement de l'ARN à partir du surnageant pour confirmer ARN intégralité. Isoler l' ARN en utilisant une solution de thiocyanate de guanidinium-phénol acide suivant les instructions du fabricant (tableau 2). Évaluer l'intégrité de l'ARN en analysant 28S et 18S sous-unités de l'ARN ribosomal. Gardez des pastilles de perles sur la glace.
3. Laver les billes magnétiques à six reprises, chaque fois par remise en suspension chaque culot de perles avec 1 ml de tampon d'isolement nucléaire contenant 40 U de RNase inhibiteur et 0,25% d'IGEPAL, puis en faisant tourner les tubes pendant 2 minutes à la température ambiante dans un dispositif de rotation. Utiliser un support magnétique pour la séparation des billes magnétiques et de surnageant. Jeter tout surnageant. Gardez des pastilles de perles sur la glace.
4. Utilisez les étapes suivantes pour éluer complexes ARN-protéine à partir de perles pour western blot. Tout d'abord, resuspendre chaque culot de billes dans 75 tampon d'isolement nucléaire ul; puis, ajouter 25 ul 4x western blot loading buffer (contenant du SDS) pour obtenir un volume total de 100 ul. Enfin, faire bouillir les perles dans cette solution, 100 ul à 95 ° C pendant 5 min.
   REMARQUE: Utiliser les étapes suivantes pour éluent complexes ARN-protéine à partir de perles pour MS. ETAPE 1: remettre en suspension chaque culot de billes dans 100 pi de tampon d'élution (tableau 3); STEP2: incuber des échantillons de perles pendant 2-3 heures à température ambiante avec rotation; STEP3: centrifugeuse et recueillir le surnageant contenant des protéines; STEP4: concentrer les solutions de protéines à 20-30 pi avant d'être soumis pour MS.
5. Centrifugeuse chaque 100 pi d'échantillon de perles à 12.000 xg pendant 30 secondes à 4 ° C, et recueillir le surnageant. Aliquoter 15 ul surnageant pour l'analyse de western blot (voir section 6.1 et 6.2). Sonder la membrane obtenue avec l'anticorps monoclonal de souris HuR dilué (1: 1000 dilution), pendant une nuit.

6. Western blot pour la vérification de RBP

1. RBP séparées par SDS-PAGE en utilisant des techniques standard.
2. Mener nouspoupe buvard en utilisant des techniques standard en sondant les pratiques commerciales restrictives associées à l'ARN d'intérêt.
   NOTE: Dans cette expérience de démonstration, HuR anticorps monoclonal de souris a été utilisé pour l'immunodétection de la protéine HuR.
3. Incuber la membrane avec l'anticorps résultant HuR dilué (1: 1000 dilution) à 5% en poids / volume de lait en poudre écrémé, 1 x TBS, 0,1% Tween - 20 à 4 ° C en agitant doucement, pendant la nuit. Laver la membrane trois fois avec 1x TBST. Incuber la membrane avec l'anticorps secondaire (chèvre anti-IgG de souris-HRP) à la température ambiante pendant 1 h. membrane Wash. Développer et signal d'enregistrement.

Dans cette expérience de démonstration, un fragment AR de l'ARN a été utilisé comme appât pour capturer sa protéine de liaison HuR. À la fois un ARN appât FL qui est non pertinente à la protéine Hur, et une aliquote de billes de streptavidine non conjugués vides ont servi de contrôles négatifs. interactions ARN-protéine peuvent se produire soit dans le noyau ou le cytoplasme, et ce protocole déroulant peut être appliquée soit totale ou fractionnés (nucléaire ou cytoplasmique) lysats cellulaires. L'analyse des protéines par Western Blot montre que l'échantillon de 15 pi de lysat de cellules non fractionnées (voir section 4.8), comme sans cordon de commande d'entrée, donne un résultat positif, ce qui indique que la protéine HuR est détectée dans le lysat adipocytaire de la culture primaire de souris en utilisant l'anticorps monoclonal. La fraction d'élution de l'ARN AR a donné un résultat positif, ce qui indique que la protéine HuR est détectée dans le lysat des adipocytes en utilisant des billes conjuguées ARN AR pour le dosage pull-down de l'ARN. Tant la fraction ARN d'élution FL et le béchantillon décharné de perles a donné des résultats négatifs, ce qui indique que les interactions non spécifiques entre fragment d'ARN et de protéines FL HuR, ainsi qu'entre les perles blanches et de protéines HuR ne sont pas détectables par cette approche de pull-down ARN. Les résultats de ces deux contrôles négatifs indiquent également qu'une interaction spécifique entre le fragment d'ARN et de protéines AR HuR est détecté avec succès par l'ARN protocole déroulant décrit ici.

Figure 1: Vérification Western Blot des HuR Capturé par les ARN déroulant Assays Entrée: reconstituée lysat cellulaire (cytoplasmique + lysat nucléaire);. Perles: l'échantillon à partir des billes magnétiques revêtues de streptavidine vierges; FL ARN: perles de streptavidine liées avec le FL ARNm; ARN 3'UTR AR: perles de streptavidine liées à l'AR 3'UTR ARNm; l'anticorps primaire: HuR anticorps monoclonal de souris; L'anticorps secondaire: anti chèvre-mouse IgG-HRP; Abréviation, FL: luciférase de luciole, AR: récepteur des androgènes; S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1: Équipement majeur utilisé dans cette étude de l' équipement majeur utilisé dans cette étude..

Tableau 2: Principaux réactifs utilisés dans cette étude Les principaux réactifs utilisés dans cette étude..

. Tableau 3: Principales solutions utilisées dans cette étude tampon de structure de l' ARN 2x (voir section 1.7); Buffer A (voir la section 2.3); Buffer B (voir section 2.4); 1x W & B (Reliure et lavage) tampon (voir sections 2.2, 2.5, 2.7); tampon 1x hypotonique (voir section 4.3); tampon d'isolement 1x nucléaire (voir sections 2.8, 4.6, 5.3, 5.4); 1x Elution buffer (voir NOTE suivant la section 5.4).

Tableau 4: Séquences de modèle et Amorces pour Amplification PCR T7-AR-oligo:. Matrice d'ADN pour l' amplification PCR (voir la section 1.1); T7-AR-F: amorce directe pour l'amplification PCR (voir section 1.1); T7-AR-R: amorce inverse pour l'amplification PCR (voir section 1.1); hluc (+) - T7-probe-F: amorce directe pour l'amplification PCR (voir section 1.2); hluc (+) - Sonde-R: amorce inverse pour l'amplification PCR (voir section 1.2).

Aucun conflit d'intérêt déclaré.