Summary
一个低成本，易于使用和强大的制度的建立，以评估可能改善组胺引起血视网膜屏障破坏的潜在治疗。血管渗漏，穆勒细胞活化和神经过程的连续性被用来评估损伤反应及其逆转与潜在的药物，脂氧素A4。
Introduction
越来越多的证据支持体血视网膜屏障（BRB）1-5和其相似的血脑屏障（BBB）6,7的存在。血脑屏障的折衷已经紧密连锁因果或作为诊断标志物的慢性神经变性疾病如阿尔茨海默氏病（AD）8,9和急性病症如谵妄10。机械分析上市这些病状和发现的潜在的药物靶标一般是由脑的有限访问性和网络复杂阻碍。替代品，如在体内成像11，脑器官型培养12，原代细胞培养13,14和共培养系统15已经产生。然而，大多数这些模型需要特殊的仪器，实验长周期或多个标记来识别细胞。血脑屏障和BRB之间的功能和结构相似性，以及镝之间的相关性两个sfunctions已经争论16-19。此外，更容易获得的，定义良好的细胞类型和层状结构已经允许充分表征视网膜作为窗口到大脑。血脑屏障和BRB的结构和功能的身份留在详细地进行比较。然而，视网膜病变，尤其是BRB违约，也被紧紧与各种疾病的进展，包括糖尿病18-19和AD 21,22相关联。因此，感兴趣的是建立一个BRB功能障碍系统不仅划定机制，但也以筛选潜在药物。在这份报告中，用一个简单的急性视网膜文化协议，实现BRB功能障碍是制定并提交。
增加血脑屏障通透性和AD样病理改变已经建立了与组 胺，促炎症介质12孵育大脑器官文化。因此，在所提出的系统中，组胺是申请灭蝇灯对体外培养的视网膜诱导BRB功能障碍。从几个物种，如小家鼠和普通牛视网膜，进行了测试。由于它们的商业可用性和相似之处人体组织，新鲜的猪眼球，用来提供此报告的数据。组胺和/或其他药物孵育后，视网膜被免疫染色几种蛋白12，例如免疫球蛋白G（IgG）的，血液的主要成分之一处理进行评估;胶质纤维酸性蛋白（GFAP），神经胶质激活一个公知的标记;和微管相关蛋白2（MAP2），一个特定的神经元细胞骨架蛋白对微管组装至关重要。此外，视网膜的层状结构允许Müller细胞和神经节细胞的过程的详细分析，如在它们的宽度和连续性变化。因此几个附加参数可用来评估的后果BRB违反在早期阶段和评估的潜在治疗逆转的效果好。
血管渗漏（BVS），神经胶质细胞的活化和神经元细胞的损伤响应：在该协议中，筛选药物的潜在反转效果从三个方面进行评估。几个量化方法被利用，例如，通过免疫染色，处理并通过增强滤波器示出神经元过程的连续性的宽度测量的强度中所示的表达水平。为了更好地说明该方法，并帮助解释结果，脂氧素A4（LXA4），响应炎性损伤和衰减内皮功能障碍23内源性合成的化合物，已被选定为示范的目的。
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Protocol
所有协议均符合开展与机构动物护理和使用委员会在适用的政策。
1.准备
- 用75％的制备稳定化的媒体的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM），25％的Hanks'平衡盐溶液（HBSS）中。在-20°C，直到使用拌匀，分装和储存。
- 制备磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，并通过高压灭菌消毒。在室温下储存的溶液。实验（5毫升，每孔）之前温PBS中至37℃。
- 制备10％，20％，并在PBS中30％蔗糖。过滤器单独分开过0.22微米的过滤器进行消毒所有的解决方案。保存在4℃的溶液。
- 制备在PBS中的组胺原液至90毫米的浓度。消毒通过过滤通过0.22微米过滤器的溶液。等分试样并保存在-80℃的溶液中。避免反复冷冻和解冻。
- 试验前在PBS新鲜的4％多聚甲醛（PFA）。把它放在冰上。
注意：保持PFA在通风橱穿适当的防护设备。 - 解冻稳定介质（20毫升，每视网膜）。青霉素 - 链霉素加入100单位/毫升的最终浓度。实验前的介质（每视网膜15毫升）中于37℃在培养箱中的温暖的一部分。留在冰介质的其余部分。
- 放置的HBSS（10毫升，每视网膜）在冰上。
2.视网膜器官文化
- 转移样品到组织培养罩。通过镜头周围切开眼罩。使用刷子，不拉在视网膜上轻轻取出玻璃体。轻轻地从分离切割边缘视网膜用画笔暴露视盘。严重视神经用剃刀和释放视网膜。
- 转移视网膜成培养皿并用冷HBSS仔细冲洗视网膜一次。放在HBSS样品上我CE。根据需要重复步骤2.1这一步解剖许多视网膜出来。
- 切成两半视网膜对称用剃刀。轻轻样品转移至6孔板用3ml稳定介质的每孔。允许在37℃下30分钟的平衡在用含有5％的CO 2气氛的培养箱。
- 在步骤2.3制备孵育期间下列试剂：稀释组胺原液在温暖介质所需浓度（450μM）。溶解LXA4（氩气下储存）到培养基中，以250纳克/毫升的最终浓度。
注：当测量LXA4的效果，从单一的视网膜的一半被用于单独组胺，而另一半被用于与LXA4组胺。 - 小心吸稳定介质和制备的介质添加到每个孔中（3每孔毫升）中。孵育样品在37℃下1小时在用含有5％的CO 2气氛的培养箱。
- 冲洗样品在温暖，无菌PBS一次。
3.准备免疫染色的样品
- 抽吸PBS从板上。添加4％PFA（每孔3ml）和孵育在室温下15分钟。
- 迅速吸出PFA。冲洗一次使用PBS中的样品。转移样品至10％蔗糖（5毫升，每孔），并在4℃下孵育2至4小时。
- 转移样品至30％的蔗糖（5毫升，每孔），并在4℃下孵育过夜。混合商用冷冻介质的一个部分，用20％的蔗糖的两部分，以使工作冷冻培养基。在4℃过夜或更长的时间离开它，直到气泡消失在空气中。
- 转移样品到工作冷冻培养基，并允许平衡，在室温下5分钟。修剪每个视网膜成的矩形（大致为3毫米×5毫米）的。
- 小心将样品转移到包含在一个筒状容器（约1cm半径×2cm的高度）dev的工作冷冻媒体从铝箔ISED。确保视网膜切片垂直（面向后切片，以提供在视网膜的一个横截面）并在液氮中冷冻。在-80°C，直到使用保存的块。
- 第一个低温恒温器每块到14微米厚的片，并安装在载玻片上的章节。在-80°C，直到使用存储的幻灯片。
4.免疫染色
- 洗，用5％蔗糖磷酸缓冲液（SPB，在PBS中的5％蔗糖，pH值7.4）一旦部分。通过在封闭缓冲液（5％的SPB，用10％正常山羊血清和0.5％的Triton X-100）在室温下温育1小时的节阻断非特异性结合位点。
- （在封闭缓冲液500 GFAP或MAP2，在1稀释）1小时孵育适当的主要抗体的部分（上幻灯片）。吸出溶液。在5％的SPB洗涤三次。对于染色内源性抗体，跳过此步骤。
- 孵育切片与相应塞康1小时：卡里抗体（800中的封闭缓冲液Cyanine3 / FITC缀合的驴抗小鼠/抗兔IgG，稀释为1）。
- 洗部分彻底用5％的SPB三次。在安装中含有DAPI和盖玻片覆盖安装他们准备显微镜的样品。
- 使用激光共聚焦显微镜，拍摄图像通过在相同的参数，如激光强度，增益值的20X镜头，停留时间等不同群体。设置的激发/发射波长为蓝色通道（检测DAPI）作为四百四十七分之四百零八纳米，对于红色信道（检测Cyanine3），为七百八十五分之五百六十一nm，对于绿色通道（检测FITC），为五百二十五分之四百八十八纳米。
5.图像分析
- 按照下列标准12量化渗漏血管的百分比：仅包含血管与计数部分的平面内的内皮细胞核;考虑血管渗漏，如果它显示了股份公司周围血管免疫染色radient。
- 以确定表达水平，选择感兴趣的区域，并使用图像分析软件测量的平均灰度值。
- 为了测量过程的宽度，选择在哪里的处理是不同的（外核层，ONL，例如）的部分的面积。然后，选择在哪里这样的过程是可见的，连续的光场。根据微观设置中设置的比例尺，得出整个过程线和执行测量。
- 分析过程的连续性，选择感兴趣的区域，运用称为方差的滤波器，其由与它的邻域方差替换每个像素增强图像中的边缘，自动调节对比度和亮度，计算所述线和由正常化的计区。
- 采用双尾学生t检验计算统计学意义。 *，P <0.05; **，P <0.01; *** P <0.001。 P很多结果为平均±SEM。
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Representative Results
我们提出了一个低成本，省时高效且易于使用的系统，以评估可能防止组胺引起的BRB违约的潜在治疗。的IgG对照视网膜（ 图1A）的血管内的制约，但漏出的血管时组胺曝光（ 图1B），确认该模型建立成功的。
LXA4被选为演示药物对BRB破坏的系统呈现的筛选。 BRB功能障碍是在治疗与LXA4（ 图1D），其具有本身没有显著效果（ 图1C）衰减。的反转定量作为泄漏的血管的百分比，其结果是显 著（ 图1E）。两个其它的视网膜细胞类型，穆勒胶质细胞（ 图2）和神经节细胞（
图1： 该血液视网膜屏障是在组胺曝光危及的和由LXA4处理营救的IgG免疫染色（红色）从视网膜这是未经处理的（A）中提出的，损伤诱导只用组胺（B）中 ，只有LXA4处理（℃ ），或者暴露于两者histamINE和LXA4（D）。在对照组（A）和LXA4处理（C）的基团，抗体是血管（BVS），而组胺组（B）中，IgG的被检测出在那里形成由虚线圆表示漏云BVS的内受到限制。 LXA4的进一步加成抢救容器功能障碍（D）。比例尺，20μm的（E）在整个测试组漏BVS的定量测量。统计学显着性是通过双尾学生t检验确定。 *，P <0.05; **，P <0.01; *** P <0.001。平均值±SEM（N = 18）中的图表绘制。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：
图3： 神经节细胞过程的连续性不被LXA4影响。 （A）的免疫染色对MAP2从视网膜这是未经处理的（A）中提出的，损伤诱导与仅LXA4（C）的处理过的组胺只（B）或暴露于组胺和LXA4（D）。阳性染色在进程和神经节细胞的细胞体获得。 MAP2染色（E）及其相应的过滤器增强的图像（F）一起样本图像呈现。连续过程由箭头指示。比例尺，20微米（G）从所有组连续，MAP2阳性神经节细胞过程的密度呈现。统计学显着性是通过双尾学生t检验确定。 *，P <0。05; **，P <0.01; *** P <0.001。平均值±SEM（N = 18）中的图表绘制。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| HBSS | Life Technologies | 14170-112 | |
| Sucrose | J.T.Baker | 4072-05 | |
| Histamine | Sigma | H7125-1G | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | ||
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Freezing Media | Triangle Biomedical Sciences | TFM-5 | |
| Normal Goat Serum | Rockland | D104-00-0050 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| GFAP Antibody | Millipore | AB5804 | |
| MAP2 Antibody | EMD Millipore | MAB3418 | |
| FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-095-152 | |
| Cy3 conjugated Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 715-165-150 | |
| mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories, Inc. | H-1200 | |
| Laser Confocal Microscope | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.45s |
References
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