Summary
A basso costo, il sistema facile da usare e potente è stabilito per valutare i potenziali trattamenti che potrebbero migliorare barriera emato-retinica violazione indotta da istamina. perdita dei vasi sanguigni, l'attivazione delle cellule Müller e la continuità dei processi neuronali sono utilizzati per valutare la risposta al danno e la sua inversione con un potenziale farmaco, Lipoxin A4.
Introduction
Un crescente corpo di prove sostiene l'esistenza di barriera retinica sangue (BRB) 1-5 e la sua somiglianza con la barriera emato-encefalica (BBB) 6,7. Compromesso della BBB è stata strettamente legata causalmente o come marcatore diagnostico per le malattie neurodegenerative croniche come il morbo di Alzheimer (AD) 8,9 e acuti condizioni come il delirio 10. intuizioni meccanicistici in queste patologie e scoperte per i potenziali bersagli farmacologici sono generalmente ostacolati dalla limitata accessibilità e network complessità del cervello. Alternative come l'imaging in vivo 11, cervello organotipica cultura 12, colture cellulari primarie 13,14 e sistemi di co-coltura di 15 sono stati generati. Tuttavia, la maggior parte di questi modelli richiede strumenti speciali, lunghi periodi sperimentali o più marcatori per identificare le cellule. somiglianze funzionali e strutturali tra BBB e BRB nonché una correlazione tra la dysfunctions dei due sono stati sostenuto 16-19. Inoltre, un più facile accesso, tipi cellulari ben definiti e una struttura stratificata hanno consentito la retina ben caratterizzato come una finestra al cervello. Le identità strutturali e funzionali della BBB e BRB ancora essere confrontato nel dettaglio. Tuttavia, patologie retiniche, soprattutto la breccia BRB, sono stati strettamente associati con la progressione di varie malattie, compreso il diabete 18-19 e AD 21,22. Pertanto, è di interesse per stabilire un sistema disfunzione BRB non solo per delineare il meccanismo ma anche per schermo potenziali farmaci. In questo rapporto, un protocollo che consente BRB disfunzione utilizzando una semplice cultura della retina acuta è sviluppato e presentato.
Aumento della permeabilità BBB e cambiamenti patologici AD-simili sono stati stabiliti in una cultura organotipica cervello incubate con l'istamina, un mediatore pro-infiammatorio 12. Pertanto, nel sistema presentato, istamina era applied alla cultura della retina ex vivo per indurre disfunzioni BRB. Retine da diverse specie, come il Mus musculus e Bos taurus, sono stati testati. Grazie alla loro disponibilità commerciale e somiglianza con tessuti umani, bulbi oculari suina fresca sono stati utilizzati per fornire i dati qui riportati. Dopo incubazione con istamina e / o altri farmaci, le retine sono state preparate per la valutazione mediante immunocolorazione per diverse proteine 12, come immunoglobuline G (IgG), uno dei principali componenti del sangue; proteina silicea fibrillare gliale (GFAP), un indicatore ben noto per l'attivazione gliale; e proteine associate ai microtubuli 2 (MAP2), una specifica dei neuroni del citoscheletro proteina essenziale per l'assemblaggio dei microtubuli. Inoltre, la struttura a strati della retina consente un'analisi dettagliata dei processi di cellule Müller e cellule gangliari, quali i cambiamenti nella loro larghezza e continuità. Così diversi parametri aggiuntivi sono disponibili per valutare le conseguenze dellaBRB violazione in una fase iniziale e per valutare gli effetti di inversione di potenziali trattamenti pure.
In questo protocollo, i potenziali effetti di inversione dei farmaci schermati vengono valutati da tre prospettive: la fuoriuscita di vasi sanguigni (BVS), l'attivazione delle cellule gliali e il danno-risposta delle cellule neuronali. Diversi metodi di quantificazione sono utilizzati, per esempio, il livello di espressione dimostra intensità della immunocolorazione, misura della larghezza di un processo e la continuità dei processi neuronali mostrati da un filtro accessorio. Per meglio illustrare il metodo e per interpretare i risultati, Lipoxin A4 (LXA4), un composto endogeno sintetizzato in risposta al danno infiammatorio e attenuando la disfunzione endoteliale 23, è stata scelta a scopo dimostrativo.
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Protocol
Tutti i protocolli sono stati effettuati nel rispetto delle norme del Comitato di cura e l'uso di animali istituzionale, se del caso.
1. Preparazione
- Preparare il supporto di stabilizzazione con il 75% di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), il 25% Hanks 'soluzione salina bilanciata (HBSS). Mescolare bene, aliquotare e conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso.
- Preparare il tampone fosfato (PBS) e sterilizzare in autoclave. Conservare la soluzione a temperatura ambiente. Riscaldare la PBS a 37 ° C prima dell'esperimento (5 ml per pozzetto).
- Preparare 10%, 20% e 30% di saccarosio in PBS. Filtrare tutte le soluzioni individualmente oltre separati 0,22 micron filtri per la sterilizzazione. Salvare le soluzioni a 4 ° C.
- Preparare la soluzione di istamina magazzino in PBS ad una concentrazione di 90 mm. Sterilizzare la soluzione per filtrazione su filtro 0,22 micron. Aliquotare e salvare la soluzione a -80 ° C. Evitare ripetuti cicli di congelamento e scongelamento.
- Rendere fresca 4% paraformaldeide (PFA) in PBS prima dell'esperimento. Posizionarlo sul ghiaccio.
Attenzione: tenere PFA in una cappa aspirante e indossare equipaggiamento protettivo. - Scongelare il supporto di stabilizzazione (20 ml per retina). Aggiungere penicillina-streptomicina ad una concentrazione finale di 100 U / ml. parte calda del mezzo (15 ml per retina) a 37 ° C in incubatore prima dell'esperimento. Lasciare il resto del mezzo su ghiaccio.
- Posizionare il HBSS (10 ml per retina) sul ghiaccio.
2. retina Cultura Organotipica
- Trasferire i campioni ad una cappa coltura tissutale. Aprire l'oculare tagliando intorno alla lente. Utilizzando un pennello, rimuovere delicatamente il vitreo senza tirare sulla retina. staccare delicatamente la retina dal bordo di taglio con una spazzola per esporre il disco ottico. Grave il nervo ottico con un rasoio e rilasciare la retina.
- Trasferire la retina in una capsula di Petri e risciacquare con cura la retina una volta con HBSS freddo. Trasferire il campione in HBSS su ICE. Sezionare il maggior numero di retine fuori, se necessario ripetendo passo 2.1 e questo passo.
- Tagliare la retina a metà simmetricamente con un rasoio. Delicatamente trasferire i campioni di un 6-bene con 3 ml di mezzi di stabilizzazione per pozzetto. Consentire equilibrazione per 30 min a 37 ° C in un incubatore con l'atmosfera contenente il 5% di CO 2.
- Preparare i seguenti reagenti durante l'incubazione a Passo 2.3: Diluire la soluzione di istamina magazzino alla concentrazione desiderata (450 micron) in media caldo. Sciogliere LXA4 (immagazzinato sotto argon) in mezzo ad una concentrazione finale di 250 ng / ml.
NOTA: Quando si misura l'effetto di LXA4, una metà da una singola retina viene utilizzato solo per l'istamina, mentre l'altra metà è utilizzato per l'istamina con LXA4. - Aspirare il mezzo di stabilizzazione con attenzione e aggiungere il mezzo preparato in ogni pozzetto (3 ml per pozzetto). Incubare i campioni a 37 ° C per 1 ora in un incubatore con l'atmosfera contenente il 5% di CO 2.
- Sciacquare ilcampioni di volta in caldo, PBS sterile.
3. Preparare i campioni per Immunocolorazione
- Aspirare PBS dalle piastre. Aggiungere 4% PFA (3 ml per pozzetto) e incubare per 15 min a temperatura ambiente.
- aspirare rapidamente il PFA. Lavare i campioni una volta con PBS. Trasferire i campioni al 10% di saccarosio (5 ml per pozzetto) e incubare per 2 a 4 ore a 4 ° C.
- Trasferire i campioni ad un saccarosio 30% (5 ml per pozzetto) e incubare una notte a 4 ° C. Mescolare una parte del mezzo di congelamento commerciale con due parti di 20% di saccarosio per rendere il mezzo congelamento lavorare. Lasciare a 4 ° C per una notte o più a lungo fino a quando l'aria bolle scompaiono.
- Trasferire i campioni al mezzo di congelamento di lavoro e raggiungere l'equilibrio per 5 min a temperatura ambiente. Tagliare ogni retina in rettangoli (circa 3 mm di 5 mm).
- Trasferire accuratamente i campioni nei mezzi congelamento lavorare contenuta in un contenitore cilindrico (circa 1 cm Altezza Raggio x 2 cm) devzato da un foglio di alluminio. Assicurarsi che le fette retiniche verticale (orientata per fornire una sezione trasversale della retina upon sezionamento) e congelare in azoto liquido. Salvare i blocchi a -80 ° C fino al momento dell'uso.
- Sezione ogni blocco su un criostato in 14 micron fette spesse e montare le sezioni su vetrini. Conservare i vetrini a -80 ° C fino al momento dell'uso.
4. immunocolorazione
- Lavare le sezioni con tampone fosfato 5% di saccarosio (SPB, 5% di saccarosio in PBS, pH 7,4) una volta. Bloccare le non specifici siti di legame incubando le sezioni in tampone di bloccaggio (5% SPB con 10% siero di capra normale e 0,5% Triton X-100) per 1 ora a temperatura ambiente.
- Incubare sezioni (su diapositive) con l'anticorpo primario appropriata (GFAP o MAP2, diluito 1: 500 in tampone di bloccaggio) per 1 ora. Aspirare la soluzione. Lavare tre volte in 5% SPB. Per la colorazione del endogena IgG, saltare questo passaggio.
- Incubare le sezioni con la seconda corrispondenteanticorpi Dary (Cyanine3 / FITC coniugato asino anti-topo / anti-IgG di coniglio, diluito 1: 800 in tampone di bloccaggio) per 1 ora.
- Lavare le sezioni accuratamente con 5% SPB tre volte. Preparare i campioni per la microscopia da loro montaggio in mezzo di montaggio contenente DAPI e copertura con lamelle.
- Utilizzando un laser microscopio confocale, catturare immagini attraverso una lente 20X sotto parametri identici come l'intensità del laser, valore di guadagno, tempo di sosta, ecc tra i gruppi. Impostare le lunghezze d'onda di eccitazione / emissione per il canale blu (per rilevare DAPI) come 408/447 nm, per il canale rosso (per rilevare Cyanine3) come 561/785 nm e per il canale verde (per rilevare FITC) come 488/525 nm .
Analisi 5. Immagine
- Quantificare la percentuale dei vasi sanguigni che perde in base ai seguenti criteri 12: Include solo vasi sanguigni con nuclei delle cellule endoteliali all'interno del piano di sezione nel conteggio; prendere in considerazione una che perde vaso sanguigno se mostra aggardiente di immunostaining che circonda la nave.
- Per determinare il livello di espressione, selezionare regioni di interesse e misurare il valore di grigio medio utilizzando il software di analisi di immagine.
- Per misurare la larghezza del processo, scegliere un'area della sezione in cui i processi sono distinti (strato esterno nucleare ONL, per esempio). Quindi scegliere un campo ottico in cui tali processi sono visibili e continuo. Impostare la barra di scala in base all'impostazione microscopico, tracciare una linea attraverso il processo ed eseguire la misurazione.
- Per analizzare la continuità del processo, selezionare regioni di interesse, applicare il filtro chiamato varianza che esalta le bordi dell'immagine sostituendo ogni pixel con la sua varianza zona, regolare automaticamente il contrasto e la luminosità, contare le righe e normalizzare il conteggio dal la zona.
- Calcola significatività statistica con t-test di Student a due code. *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0.001. Pmolto il risultato come media ± SEM.
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Representative Results
Vi presentiamo un basso costo, sistema di time-efficiente e facile da usare per valutare i potenziali trattamenti che potrebbero proteggere contro la violazione BRB indotta da istamina. IgG è vincolato all'interno dei vasi in retina di controllo (Figura 1A), ma le perdite fuori dei vasi sanguigni su esposizione istamina (Figura 1B), a conferma che il modello è stata stabilita.
LXA4 è stato scelto per dimostrare lo screening per i farmaci contro BRB breccia nel sistema presentato. BRB erettile è attenuato dopo trattamento con LXA4 (Figura 1D), che non ha alcun effetto significativo di per sé (Figura 1C). L'inversione viene misurata come percentuale dei vasi sanguigni disgiunti e il risultato è significativo (Figura 1E). Altri due tipi di cellule della retina, le cellule gliali Müller (Figura 2) e le cellule gangliari (
Figura 1:. La retina barriera emato è compromessa in seguito all'esposizione istamina e salvato da un trattamento LXA4 immunocolorazione IgG (rosso) è presentato da retina che è stata trattata (A), il danno indotto da solo con l'istamina (B), trattati con solo LXA4 (C ), o esposti a entrambi histamine e LXA4 (D). Nel controllo (A) e gruppi LXA4 trattati (C), IgG è limitato all'interno dei vasi sanguigni (BVS), mentre nel gruppo di istamina (B), IgG viene rilevata dalla BVS dove forme nuvole di dispersione indicate da cerchi punteggiati. Ulteriore aggiunta di LXA4 salva disfunzione recipiente (D). Barra della scala, 20 micron. (E) la misurazione quantitativa della BvS che perde attraverso i gruppi testati. La significatività statistica è determinata dalla t-test di Student a due code. *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0.001. Media ± SEM (n = 18) è riportato in grafico. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:
Figura 3: la continuità dei processi Ganglion cellulari non è influenzata dal LXA4. (A) immunocolorazione contro MAP2 è presentato da retina che era non trattato (A), il danno indotto con l'istamina solo (B) trattato con solo LXA4 (C) o esposta sia istamina e LXA4 (D). La colorazione positiva si ottiene nei processi e corpi cellulari delle cellule gangliari. Un'immagine campione di MAP2 colorazione (E) insieme con la sua immagine di filtro avanzata corrispondente (F) è presentato. I processi continui sono indicati da frecce. Barra della scala, 20 micron. (G) La densità dei processi, cellule gangliari MAP2-positivi continui da tutti i gruppi sono presentati. La significatività statistica è determinata dalla t-test di Student a due code. *, P <0.05; **, P <0,01; ***, P <0.001. Media ± SEM (n = 18) è riportato in grafico. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| HBSS | Life Technologies | 14170-112 | |
| Sucrose | J.T.Baker | 4072-05 | |
| Histamine | Sigma | H7125-1G | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | ||
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Freezing Media | Triangle Biomedical Sciences | TFM-5 | |
| Normal Goat Serum | Rockland | D104-00-0050 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| GFAP Antibody | Millipore | AB5804 | |
| MAP2 Antibody | EMD Millipore | MAB3418 | |
| FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-095-152 | |
| Cy3 conjugated Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 715-165-150 | |
| mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories, Inc. | H-1200 | |
| Laser Confocal Microscope | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.45s |
References
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