Summary
En lav-kost, lett-å-bruke og kraftig system etablert for å vurdere potensielle behandlinger som kan bli forbedret blod retinal barriere brutt indusert av histamin. Blodkar lekkasje Muller celleaktivering og kontinuiteten av neuronale prosesser blir benyttet for å vurdere skaden respons og dens reversering med en potensiell medikament, lipoxin A4.
Introduction
En voksende mengde bevis støtter eksistensen av blod retinal barriere (BRB) 1-5 og sin likhet til blod-hjerne barrieren (BBB) 6,7. Kompromiss av BBB er tett knyttet kausalt eller som en diagnostisk markør for å kroniske neurodegenerative sykdommer slik som Alzheimers sykdom (AD) 8,9 og akutte lidelser så som delirium 10. Mekanistiske innsikt i disse patologi og funn for potensielle narkotika mål er generelt hemmet av begrenset tilgjengelighet og nettverk intricacy av hjernen. Alternativer som in vivo avbildning 11, hjerne organotypiske kultur 12, primære cellekulturer 13,14 og co-kultur systemer 15 har blitt generert. Men de fleste av disse modellene krever spesielle instrumenter, lange eksperimentelle perioder eller flere markører for å identifisere celler. Funksjonelle og strukturelle likheter mellom BBB og BRB, samt en korrelasjon mellom dysfunctions av de to har blitt hevdet 16-19. I tillegg er det lettere tilgang, vel-definerte celletyper og en lagdelt struktur tillot godt karakterisert netthinnen som et vindu til hjernen. De strukturelle og funksjonelle identiteter BBB og BRB gjenstår å bli sammenlignet i detalj. Imidlertid, retinale sykdommer, spesielt BRB brudd, har også vært tett assosiert med progresjonen av forskjellige sykdommer, inklusive diabetes, 18-19 og 21,22 AD. Det er således av interesse å etablere et BRB dysfunksjon system ikke bare for å avgrense den mekanisme, men også for å screene potensielle medikamenter. I denne rapporten er en protokoll som har BRB dysfunksjon ved hjelp av en enkel akutt retinal kultur utvikles og presenteres.
Økt BBB permeabilitet og AD-lignende patologiske endringer har blitt etablert i en hjerne organotypiske kultur inkuberes med histamin, en pro-inflammatorisk megler 12. Derfor, i presenterte system, histamin var ApplIED til ex vivo retinal kultur å indusere BRB dysfunksjon. Netthinne fra flere arter, for eksempel Mus musculus og Bos Taurus, har blitt testet. På grunn av sin kommersielle tilgjengelighet og likhet til menneskelig vev, ble friske svin øyeepler utnyttes til å tilby de dataene som presenteres her. Etter inkubering med histamin og / eller andre stoffer, ble netthinne bearbeidet for bedømmelse ved farging av flere proteiner 12, slik som immunoglobulin G (IgG), en av hovedkomponentene i blodet; glial fibrillary surt protein (GFAP), en kjent markør for glial aktivisering; og microtubule-assosiert protein 2 (MAP2), et nevron-spesifikk cytoskeletal protein viktig for microtubule montering. Videre er den lagdelte strukturen av netthinnen tillater en detaljert analyse av prosesser av Muller celler og ganglion-celler, slik som endringer i deres bredde og kontinuitet. Dermed flere andre parametre er tilgjengelige for å vurdere konsekvensene avBRB brudd på et tidlig stadium, og å evaluere reversering effekten av potensielle behandlinger også.
I denne protokollen, er potensielle reverseringseffekter av medikamenter vist evaluert fra tre perspektiver: lekkasje av blodårer (BVS), aktivering av gliaceller og skaden-responsen av neuronale celler. Flere kvantifisering fremgangsmåter blir benyttet, for eksempel, ekspresjonsnivået er vist ved intensiteten av immunofarging, bredde måling av en prosess og kontinuitet av neuronale prosesser som vises ved en forsterkning filter. For bedre å illustrere metoden og å bidra til å tolke resultatene, lipoxin A4 (LXA4), en forbindelse endogent syntetisert i respons til inflammatoriske skader og dempe endotelial dysfunksjon 23, har blitt valgt for demonstrasjonsformål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protokoller ble utført i samsvar med politikken til Institutional Animal Care og bruk komité der det er aktuelt.
1. Forberedelse
- Klargjør stabilisering media med 75% Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM), 25% Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS). Bland godt, delmengde og oppbevar ved -20 ° C inntil bruk.
- Klargjør fosfatbufret saltvann (PBS) og sterilisere i autoklav. Oppbevar løsningen ved romtemperatur. Varm PBS til 37 ° C før forsøket (5 ml per brønn).
- Fremstille 10%, 20% og 30% sukrose i PBS. Filter alle løsningene individuelt enn separate 0,22 mikrometer filtre for sterilisering. Redd løsninger ved 4 ° C.
- Klargjør histamin stamløsning i PBS til en konsentrasjon på 90 mM. Steriliser oppløsningen ved filtrering over et 0,22 pM filter. Alikvot og lagre oppløsningen ved -80 ° C. Unngå flere fryse-og-tine sykluser.
- Gjør frisk 4% paraformaldehyde (PFA) i PBS før forsøket. Plasser den på is.
Forsiktig: Hold PFA i et avtrekksskap og bruke egnet verneutstyr. - Tine stabilisering medium (20 ml per retina). Legg Penicillin-Streptomycin til en sluttkonsentrasjon på 100 U / ml. Varme del av mediet (15 ml pr retina) til 37 ° C i inkubator før forsøket. La resten av mediet på is.
- Plasser HBSS (10 ml pr retina) på is.
2. Retinal organotypiske Culture
- Overfør prøvene til en vev kultur hette. Åpne øyemusling ved å kutte rundt linsen. Ved hjelp av en pensel, forsiktig fjerne glasslegemet uten å trekke på netthinnen. Forsiktig løsne netthinnen fra klippekanten med en børste for å avsløre den optiske platen. Alvorlig synsnerven med en barberhøvel og slipp netthinnen.
- Overfør netthinnen i en petriskål og forsiktig skylle netthinnen en gang ved hjelp av kald HBSS. Plasser prøven i HBSS på ice. Dissekere så mange netthinner ut etter behov ved å gjenta trinn 2,1 og dette trinnet.
- Skjær netthinnen i to symmetrisk med en barberhøvel. Forsiktig overføre prøver til en 6-brønns plate med 3 ml stabilisering media per brønn. Tillate likevektsinnstilling i 30 minutter ved 37 ° C i en inkubator med en atmosfære inneholdende 5% CO2.
- Fremstille de følgende reagenser i løpet av inkubasjon ved Trinn 2.3: Fortynn histamin stamoppløsning til den ønskede konsentrasjon (450 uM) i varmt medium. Oppløs LXA4 (lagret under argon) til mediet til en sluttkonsentrasjon på 250 ng / ml.
MERK: Når man måler effekten av LXA4, er den ene halvdelen av et enkelt netthinnen som brukes for histamin alene, mens den andre halvparten er brukt for histamin med LXA4. - Aspirer stabilisering medium nøye og legge den tilberedte medium til hver brønn (3 ml per brønn). Prøvene inkuberes ved 37 ° C i 1 time i en inkubator med en atmosfære inneholdende 5% CO2.
- skyllprøver en gang i varme, sterile PBS.
3. Forbered Prøver for Farging
- Aspirer PBS fra platene. Tilsett 4% PFA (3 ml per brønn) og inkuberes i 15 minutter ved romtemperatur.
- Raskt aspirer PFA. Skyll prøvene en gang ved hjelp av PBS. Overføre prøvene til 10% sukrose (5 ml per brønn) og inkuberes i 2 til 4 timer ved 4 ° C.
- Overføre prøvene til en 30% sukrose (5 ml per brønn) og inkuberes over natten ved 4 ° C. Bland en del av den kommersielle frysemediet med to deler av 20% sukrose for å gjøre arbeidsfrysemedium. La den stå ved 4 ° C over natten eller lenger før luftbobler forsvinner.
- Overføre prøvene til arbeidsfrysemedium og tillate likevektsinnstilling i 5 min ved romtemperatur. Trim hver hinnen i rektangler (ca 3 mm med 5 mm).
- overføre forsiktig prøvene inn i arbeids iskaldt media inneholdt i en sylindrisk beholder (ca. 1 cm radius x 2 cm høyde) devsert fra aluminiumsfolie. Sørg for at netthinnens skivene er vertikal (orientert for å gi et tverrsnitt av netthinnen ved seksjonering) og fryse dem i flytende nitrogen. Lagre blokkene ved -80 ° C inntil bruk.
- § hver blokk på en cryostat inn 14 mikrometer tykke skiver og montere deler på glassplater. Oppbevar skinnene ved -80 ° C inntil bruk.
4. Farging
- Vask seksjoner med 5% sucrose fosfatbuffer (SPB, 5% sukrose i PBS, pH 7,4) en gang. Blokkere ikke-spesifikke bindingssteder ved inkubering av seksjonene i blokkeringsbuffer (5% SPB med 10% normalt geiteserum og 0,5% Triton X-100) i 1 time ved romtemperatur.
- Inkuber seksjoner (på objektglass) med det passende primære antistoff (GFAP eller MAP2, fortynnet til 1: 500 i blokkeringsbuffer) i 1 time. Aspirer løsningen. Vask tre ganger i 5% SPB. For flekker endogene IgG, hoppe over dette trinnet.
- Inkuber seksjonene med den tilsvarende secondary antistoffer (Cyanine3 / FITC-konjugert esel-anti-muse / anti-kanin IgG, fortynnet 1: 800 i blokkeringsbuffer) i 1 time.
- Vask delene grundig med 5% SPB tre ganger. Forberede prøver for mikroskopi ved å montere dem i monteringsmedium som inneholder DAPI og dekker med Dekk.
- Ved hjelp av en laser konfokalmikroskop, ta bilder gjennom en 20X objektiv under identiske parametere som laser intensitet, gain verdi, holdetid, etc. på tvers av grupper. Sett eksitasjon / utslipp bølgelengder for den blå kanalen (for å oppdage DAPI) som 408/447 nm, for den røde kanalen (for å oppdage Cyanine3) som 561/785 nm og for den grønne kanalen (for å oppdage FITC) som 488/525 nm .
5. Bildeanalyse
- Kvantifisere prosentandel av utette blodkar i henhold til de følgende kriterier 12: Ta bare blodkar med endotel-cellekjerner i snittplanet i tellingen; vurdere en blodåre lekk hvis det viser agradient av immunofarging som omgir fartøyet.
- For å bestemme uttrykket nivå, velger områder av interesse og måle gjennomsnitts grå verdi ved hjelp av bildeanalyse programvare.
- For å måle bredden av fremgangsmåten ved å velge et område av delen hvor prosessene er distinkte (det ytre kjernelaget, onl, for eksempel). Deretter velger du en optisk felt der slike prosesser er synlig og kontinuerlig. Sett målestokken i henhold til den mikroskopiske innstilling, tegne en linje over prosessen og utføre målingen.
- For å analysere kontinuiteten av fremgangsmåten ved å velge regioner av interesse, sett på filter kalt varians som forbedrer kantene i bildet ved å erstatte hver piksel med sin nabolaget varians, automatisk justere kontrast og lysstyrke, teller linjene og normal tellingen av område.
- Beregn statistiske betydninger ved hjelp av en to-tailed Student t-test. *, P <0,05; ** P <0,01; ***, P <0,001. PMange resultatet som gjennomsnitt ± SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi presenterer en lav pris, tidsbesparende og lett-å-bruke system for å vurdere potensielle behandlinger som kan beskytte mot BRB brudd indusert av histamin. IgG er begrenset innenfor fartøyene i kontroll hinnen (figur 1A), men lekker ut av blodårene ved histamin eksponering (figur 1B), bekrefter at modellen er opprettet.
LXA4 ble valgt for å demonstrere screening av medikamenter mot BRB brudd i den presenterte system. BRB dysfunksjon blir dempet ved behandling med LXA4 (figur 1D), som ikke har noen signifikant effekt i seg selv (figur 1C). Reverseringen er kvantifisert som en prosentandel av de lekket blodkar og resultatet er signifikant (figur 1E). To andre retinal celletyper, Muller glialceller (figur 2) og ganglion-celler (
Figur 1:. The Blood Netthinne Barrier er kompromittert på Histamin Eksponering og Reddet av LXA4 Behandling IgG farging (rød) er presentert fra netthinnen som var ubehandlet (A), skade-indusert med bare histamin (B), behandlet med LXA4 bare (C ), eller utsatt for både histamine og LXA4 (D). I kontroll (A) og LXA4 behandlet (C) grupper, blir IgG begrenset innenfor blodkarene (BVS), mens i den histamin-gruppen (B), blir IgG påvises ut av BVS hvor det danner lekkasje skyer indikert med stiplede sirkler. Ytterligere tilsetning av LXA4 redder fartøyet dysfunksjon (D). Målestokk, 20 nm. (E) Kvantitativ måling av utette Bokvisninger på tvers av de testede gruppene. Statistisk signifikans bestemmes av en to-halet Student t-test. *, P <0,05; ** P <0,01; ***, P <0,001. Gjennomsnitt ± SEM (n = 18) er plottet i diagrammet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:
Figur 3: Kontinuitet i Ganglion celleprosesser er ikke påvirket av LXA4. (A) immunfarging mot MAP2 er presentert fra netthinnen som var ubehandlet (A), skade-indusert med histamin bare (B) ble behandlet med bare LXA4 (C) eller utsatt for både histamin og LXA4 (D). Positiv farging ble oppnådd i de prosesser og cellelegemer av ganglion-celler. En prøve bilde av MAP2 farging (E) sammen med det tilsvarende filter med forbedret bilde (F) er presentert. De kontinuerlige fremgangsmåter er angitt ved pilspisser. Målestokk, 20 um. (G) Tettheten av de kontinuerlige, MAP2-positive ganglion celleprosesser fra alle grupper er presentert. Statistisk signifikans bestemmes av en to-halet Student t-test. *, P <0.05; ** P <0,01; ***, P <0,001. Gjennomsnitt ± SEM (n = 18) er plottet i diagrammet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| HBSS | Life Technologies | 14170-112 | |
| Sucrose | J.T.Baker | 4072-05 | |
| Histamine | Sigma | H7125-1G | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | ||
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Freezing Media | Triangle Biomedical Sciences | TFM-5 | |
| Normal Goat Serum | Rockland | D104-00-0050 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| GFAP Antibody | Millipore | AB5804 | |
| MAP2 Antibody | EMD Millipore | MAB3418 | |
| FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-095-152 | |
| Cy3 conjugated Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 715-165-150 | |
| mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories, Inc. | H-1200 | |
| Laser Confocal Microscope | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.45s |
References
- Cunha-Vaz, J., Bernardes, R., Lobo, C.
- Kim, J. H., et al. Blood-neural barrier: intercellular communication at glio-vascular interface. J Biochem Molec Biol. 39, 339-345 (2006).
- Kumagai, A. K. Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes. Diabetes Metab Res Rev. 15, 261-273 (1999).
- Runkle, E. A., Antonetti, D. A. The blood-retinal barrier: structure and functional significance. Methods Molec Biol. 686, Clifton, N.J. 133-148 (2011).
- Takata, K., Hirano, H., Kasahara, M. Transport of glucose across the blood-tissue barriers. Int Rev Cytol. 172, 1-53 (1997).
- Goncalves, A., Ambrosio, A. F., Fernandes, R. Regulation of claudins in blood-tissue barriers under physiological and pathological states. Tissue Barriers. 1, 24782 (2013).
- Patton, N., et al. Retinal image analysis: concepts, applications and potential. Prog Ret Eye Res. 25, 99-127 (2006).
- Di Marco, L. Y., et al. Vascular dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease--A review of endothelium-mediated mechanisms and ensuing vicious circles. Neurobiol Dis. 82, 593-606 (2015).
- Nagele, R. G., et al. Brain-reactive autoantibodies prevalent in human sera increase intraneuronal amyloid-beta(1-42) deposition. J Alzheimer's Dis: JAD. 25, 605-622 (2011).
- Goldwaser, E., Acharya, N., Nagele, R. Cerebrovascular and blood-brain barrier compromise: A mechanistic link between vascular disease and Alzheimer's disease subtypes of neurocognitive disorders. J Parkinsons Dis Alzheimer's Dis. 2, 10 (2015).
- Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain. Nat Photonics. 7, (2013).
- Sedeyn, J. C., et al. Histamine Induces Alzheimer's Disease-Like Blood Brain Barrier Breach and Local Cellular Responses in Mouse Brain Organotypic Cultures. Biomed Res Int. 2015, 937148 (2015).
- Avdeef, A., Deli, M. A., Neuhaus, W. Blood-Brain Barrier in Drug Discovery: Optimizing Brain Exposure of CNS Drugs and Minimizing Brain Side Effects for Peripheral Drugs. Di, L., Kerns, E. H. , John Wiley & Sons, Inc. Ch. 10 188 (2014).
- Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10, 33 (2013).
- Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
- Alberghina, M., Lupo, G., Anfuso, C. D., Moro, F. Palmitate transport through the blood-retina and blood-brain barrier of rat visual system during aging. Neurosci Lett. 150, 17-20 (1993).
- Hosoya, K., Yamamoto, A., Akanuma, S., Tachikawa, M. Lipophilicity and transporter influence on blood-retinal barrier permeability: a comparison with blood-brain barrier permeability. Pharm Res. 27, 2715-2724 (2010).
- Minamizono, A., Tomi, M., Hosoya, K. Inhibition of dehydroascorbic acid transport across the rat blood-retinal and -brain barriers in experimental diabetes. Biol Pharm Bull. 29, 2148-2150 (2006).
- Serlin, Y., Levy, J., Shalev, H. Vascular pathology and blood-brain barrier disruption in cognitive and psychiatric complications of type 2 diabetes mellitus. Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2011, 609202 (2011).
- Kolb, H. How the retina works - Much of the construction of an image takes place in the retina itself through the use of specialized neural circuits. Am Sci. 91, 28-35 (2003).
- Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease. J Neurol Neurosurgery Psychiatry. 83, 917-922 (2012).
- Tan, Z., Ge, J. Amyloid-beta, the retina, and mouse models of Alzheimer disease. Am J Pathol. 176, 2055 (2010).
- Serhan, C. N. Pro-resolving lipid mediators are leads for resolution physiology. Nature. 510, 92-101 (2014).
- Bucolo, C., et al. Effects of topical indomethacin, bromfenac and nepafenac on lipopolysaccharide-induced ocular inflammation. J Pharm Pharmacol. 66, 954-960 (2014).
- Edelman, J. L., Lutz, D., Castro, M. R. Corticosteroids inhibit VEGF-induced vascular leakage in a rabbit model of blood-retinal and blood-aqueous barrier breakdown. Exp Eye Res. 80, 249-258 (2005).
