Summary
低コストで、簡単に使用できる強力なシステムは、ヒスタミンにより誘発される血液網膜関門の違反を改善する可能性のある潜在的な治療法を評価するために確立されています。血管漏出、ミュラー細胞の活性化および神経突起の連続性は、損傷応答および潜在的薬物、リポキシンA4との逆転を評価するために利用されます。
Introduction
証拠の成長体は、血液網膜関門（BRB）1-5と血液脳関門（BBB）6,7との類似性が存在することをサポートしています。 BBBの妥協はしっかりと、このようなせん妄10として因果関係や、アルツハイマー病（AD）などの慢性神経変性疾患の診断マーカーとして8,9および急性の条件をリンクされています。潜在的な薬剤標的のためのこれらの病理と発見への機構的洞察は、一般的に脳の限られたアクセシビリティとネットワーク複雑さによって妨げられています。このようなin vivoイメージング11、脳の器官培養の12、初代細胞培養13,14と共培養システム15などの選択肢が生成されています。しかしながら、これらのモデルの多くは、細胞を同定するために特殊な器具、長い実験期間または複数のマーカーを必要とします。機能的および構造的BBBとBRBの間の類似性だけでなく、dyの間の相関関係2のsfunctionsは16-19を主張してきました。また、簡単にアクセス、明確に定義された細胞型および層状構造は、脳へのウィンドウとしてよく特徴付けられた網膜を許可しています。 BBB及びBRBの構造的および機能的な同一性を詳細に比較されていません。しかし、網膜の病状、特にBRBの違反は、またしっかりと糖尿病18-19とAD 21,22を含む、様々な疾患の進行と関連しています。したがって、機構を描写するだけでなく、潜在的な薬物をスクリーニングするだけでなく、BRBの機能不全システムを確立するために重要です。この報告書では、単純な急性網膜文化を使用して、BRBの機能不全を可能にするプロトコルが開発され、提示されています。
増加BBBの透過性およびAD様病理学的変化は、ヒスタミン、前炎症性メディエータ12とインキュベートし、脳の器官培養で確立されています。したがって、提示システムでは、ヒスタミンはAPPLましたBRBの機能不全を誘導するためにex vivoでの網膜培養をIED。このようなハツカネズミとボス牡牛座のようないくつかの種からの網膜は、テストされています。それらの商業的入手し、ヒト組織に似ていることに、新鮮な豚眼球はここで報告されたデータを提供するために利用されました。ヒスタミンおよび/ または他の薬物とインキュベートした後、網膜は、免疫グロブリンG（IgG）、血液の主要なコンポーネントの1つとして、いくつかのタンパク質12の免疫染色による評価のために処理しました。グリア細胞繊維性酸性タンパク質（GFAP）、グリア活性化のための周知のマーカー。そして、微小管結合タンパク質2（MAP2）、微小管アセンブリのための不可欠なニューロン特異的細胞骨格タンパク質。さらに、網膜の層構造は、その幅と継続性の変化として、ミュラー細胞と神経節細胞のプロセスの詳細な分析を可能にします。このようにいくつかの追加のパラメータがの影響を評価するために利用可能ですBRB違反早い段階で、同様に潜在的な治療法の逆転の効果を評価します。
血管の漏れ（のBV）、グリア細胞の活性化および神経細胞の損傷応答：このプロトコルでは、スクリーニング薬の潜在的な反転効果は3つの観点から評価されています。いくつかの定量法は、例えば、免疫染色の強度、強調フィルタにより示される神経突起のプロセス及び連続の幅測定によって示される発現レベルを利用しています。より良い方法を説明するために、結果の解釈を助けるために、リポキシンA4（LXA4）、内因的炎症性損傷および減衰内皮機能不全23に対応して合成した化合物は、デモの目的のために選択されています。
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Protocol
すべてのプロトコルは、施設内動物管理使用委員会該当する場合のポリシーに準拠して実施しました。
1.準備
- 75％のダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で安定化媒体を準備し、25％ハンクス平衡塩溶液（HBSS）。使用するまで-20℃でアリコートとストア、よく混ぜます。
- リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を準備し、オートクレーブで滅菌します。溶液を室温で保管してください。実験（ウェル当たり5ミリリットル）の前に37℃にPBSを温め。
- PBS中の10％、20％および30％スクロースを準備します。殺菌のための独立した0.22μmのフィルターの上、個別にすべてのソリューションをフィルタリングします。 4℃でのソリューションを保存します。
- 90 mMの濃度にPBS中のヒスタミン原液を準備します。 0.22μmのフィルターを介して濾過することにより溶液を滅菌します。小分けし、-80℃で溶液を保存します。複数の凍結と融解の繰り返しは避けてください。
- 実験の前に、PBS中の新鮮な4％パラホルムアルデヒド（PFA）を確認します。氷の上に置きます。
注意：ドラフト内でPFAを維持し、適切な保護具を着用します。 - 安定化媒体（網膜あたり20 ml）を解凍します。 100 U / mlの最終濃度になるようにペニシリン - ストレプトマイシンを追加します。実験前インキュベーターで37℃まで媒体の暖かい部分（網膜当たり15ミリリットル）。氷の上の媒体の残りの部分を残します。
- 氷上でHBSS（網膜当たり10ミリリットル）を配置します。
2.網膜器官培養
- 組織培養フードにサンプルを転送します。レンズ周りを切断することにより、アイカップを開きます。ブラシを使用して、静かに網膜を引っ張ることなく、硝子体液を除去します。ゆっくりと視神経乳頭が露出するようにブラシで切断縁から網膜を切り離します。カミソリを伴う重度の視神経と網膜をリリース。
- ペトリ皿に網膜を転送し、慎重に冷HBSSを使用して一度網膜をすすぎます。私にHBSS中にサンプルを置き、CE。ステップ2.1と、この工程を繰り返すことにより、必要な数の網膜を解剖。
- かみそりで対称的に半分に網膜をカット。穏やかにウェル当たり安定培地3mlで6ウェルプレートにサンプルを移します。 5％CO 2を含有する雰囲気のインキュベーター中で37℃で30分間平衡化を可能にします。
- ステップ2.3でのインキュベーションの間に以下の試薬を準備し、暖かい培地中の所望の濃度（450μM）にヒスタミン原液を希釈します。 250 ngの/ mlの最終濃度まで培地にLXA4（アルゴン下で保存されている）を溶解します。
注：LXA4の効果を測定する場合、他の半分はLXA4でヒスタミンを用いているが、単一の網膜から半分は、単独でヒスタミンに使用されます。 - 慎重に安定化媒体を吸引除去し、各ウェル（ウェル当たり3ミリリットル）に調製した培地を追加します。 5％CO 2を含有する雰囲気のインキュベーター中で1時間、37℃でサンプルをインキュベートします。
- リンス一度暖かい、滅菌PBS中のサンプル。
3.免疫染色のためのサンプルを準備します
- プレートから吸引し、PBS。 4％PFA（ウェルあたり3 ml）を加え、室温で15分間インキュベートします。
- 迅速PFAを吸引。一度PBSを用いてサンプルをすすぎます。 10％スクロースにサンプル（ウェルあたり5ミリリットル）に移し、4℃で2時間〜4インキュベートします。
- 30％スクロース（ウェル当たり5ml）中にサンプルを移し、4℃で一晩インキュベートします。作動凍結培地を作製するために、20％ショ糖の2つの部分を有する市販の凍結培地の一部を混合します。気泡が消えるまで、一晩以上4°Cでそれを残します。
- 作動凍結培地にサンプルを移し、室温で5分間平衡化を可能にします。長方形（5ミリメートルによっておよそ3ミリメートル）にそれぞれの網膜をトリミングします。
- 慎重に円筒状容器（約1cm半径×2センチ高さ）devの中に含まれる作業の凍結培地にサンプルを移しますアルミ箔からised。網膜のスライスは、液体窒素でそれらを凍結する（セクショニング時に網膜の断面を提供するように配向）垂直であることを確認してください。使用するまで-80℃でブロックを保存します。
- 項各14μmの厚さのスライスにクライオスタット上のブロックとは、ガラススライド上のセクションをマウントします。使用するまで-80℃でスライドを保存してください。
4.免疫染色
- 一度、5％ショ糖リン酸緩衝液（SPB、PBS中の5％スクロース、pH7.4）でセクションを洗ってください。室温で1時間（10％正常ヤギ血清および0.5％トリトンX-100で5％SPB）をブロッキング緩衝液中で切片をインキュベートすることによって非特異的結合部位をブロックします。
- 1時間：（ブロッキング緩衝液中で500 1に希釈し、GFAPまたはMAP2、）適切な一次抗体を用いて（スライド上）のセクションをインキュベートします。ソリューションを吸引。 5％SPBで3回洗浄します。内因性のIgGを染色するために、このステップをスキップします。
- 対応するseconを持つセクションをインキュベート1時間：DARY抗体（ブロッキング緩衝液中で800 1に希釈シアニン/ FITC結合ロバ抗マウス/抗ウサギIgG）。
- 5％SPB 3回で十分セクションを洗ってください。メディア取り付けDAPIを含有し、カバースリップで覆うことでそれらを実装することにより、顕微鏡用の試料を準備します。
- グループ間など 、滞留時間、値を得るため、このようなレーザ強度と同一のパラメータの下で20Xレンズを通して画像を取り込む、レーザー共焦点顕微鏡を使用して。 525分の488 nmのように（FITCを検出するために）785分の561 nmのように緑のチャンネルのために（シアニン3を検出するために）赤チャンネルのために、447分の408 nmのように（DAPIを検出するために）青チャネルの励起/発光波長を設定します。
5.画像解析
- 次の基準12に従って漏れやすい血管の割合を定量化：数のセクションの平面内の内皮細胞の核を有する血管のみを含めます。それはAGを示している場合は、血管漏出性を検討します容器の周囲の免疫染色のradient。
- 発現レベルを決定するために、関心領域を選択し、画像解析ソフトウェアを用いて、平均グレー値を測定します。
- プロセスの幅を測定するために、プロセスが異なっている部分（例えば外核層、ONL）のエリアを選択します。そして、このようなプロセスが見えると連続している光学フィールドを選択します。 、微視的な設定に応じてスケールバーを設定し、プロセス全体に線を描画して、測定を行います。
- プロセスの継続性を分析するために、関心の選択領域は、その近傍の分散で、各ピクセルを置き換えることによって、画像のエッジを強化する分散と呼ばれるフィルタを適用し、自動的に、コントラストと明るさを調整する行をカウントし、カウントを正規化エリア。
- 両側スチューデントt検定を用いて統計的有意性を計算します。 *、P <0.05。 **、P <0.01。 ***、P <0.001。 P平均±SEMとして多くの結果を。
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Representative Results
私たちは、ヒスタミンにより誘発されるBRBの侵害から保護する可能性のある潜在的な治療法を評価するため、低コスト、時間、効率的で使いやすいシステムを提案します。 IgGは対照網膜（ 図1A）で血管内に拘束されているが、モデルが正常に確立されたことを確認ヒスタミン曝露（ 図1B）の際に血管の外に漏れます。
LXA4は提示システムにおけるBRBの違反に対する薬剤のスクリーニングを実証するために選ばれました。 BRBの機能不全は、それ自体では有意な効果（ 図1C）を持っていないLXA4（ 図1D）、で処理して減衰されます。反転が漏洩血管の割合として定量化され、結果が（ 図1E）重要です。他の二つの網膜細胞型、ミュラーグリア細胞（ 図2）と神経節細胞（
図1： 血液網膜関門は、ヒスタミン露光時に危殆とLXA4治療によって救出されたIgG免疫染色（赤）は未処理であった網膜（A）から提示され、損傷によって誘発されるヒスタミンのみ（B）で、C（のみLXA4で処理）、またはその両方histamにさらさINEとLXA4（D）。ヒスタミン基（B）において、IgGは、それが点線の円で示さ漏れ雲を形成するのBVから検出され、一方対照（A）及びLXA4処理した（C）群では、IgGは、血管（のBV）に制限されます。 LXA4のさらなる添加は、血管機能不全（D）を救います。スケールバーは20μm。（E）は、試験したグループ間で、漏洩のBVの定量的測定。統計的有意性は、 両側スチューデントt検定によって決定されます。 *、P <0.05。 **、P <0.01。 ***、P <0.001。グラフにプロットされた（n = 18）±SEMを意味している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：
図3： 神経節細胞プロセスの継続がLXA4の影響を受けません。 MAP2に対する免疫染色（A）は、（A）未処置であった網膜から提示され、損傷誘発性LXA4のみ（C）で処理されたヒスタミンのみ（B）またはヒスタミンおよびLXA4（D）の両方にさらされます。陽性染色は、プロセスと神経節細胞の細胞体において得られます。一緒に、その対応するフィルタ強調画像（F）を有するMAP2染色（E）のサンプル画像が提示されます。連続プロセスは、矢印で示されています。スケールバーは20μm。（G）全ての群からの連続的、MAP2陽性神経節細胞プロセスの密度が示されています。統計的有意性は、 両側スチューデントt検定によって決定されます。 *、P <0。05; **、P <0.01。 ***、P <0.001。グラフにプロットされた（n = 18）±SEMを意味している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| HBSS | Life Technologies | 14170-112 | |
| Sucrose | J.T.Baker | 4072-05 | |
| Histamine | Sigma | H7125-1G | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | ||
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Freezing Media | Triangle Biomedical Sciences | TFM-5 | |
| Normal Goat Serum | Rockland | D104-00-0050 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| GFAP Antibody | Millipore | AB5804 | |
| MAP2 Antibody | EMD Millipore | MAB3418 | |
| FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-095-152 | |
| Cy3 conjugated Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 715-165-150 | |
| mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories, Inc. | H-1200 | |
| Laser Confocal Microscope | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.45s |
References
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