Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Острый сетчатке Модель для оценки крови сетчатке Барьерные нарушения и потенциальных лекарственных препаратов для лечения

Published: September 13, 2016 doi: 10.3791/54619
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,2
1Graduate School of Biomedical Sciences, Rowan University, 2Department of Cell Biology, Rowan University School of Osteopathic Medicine

Summary

Недорогой, простой в использовании и мощная система создана для оценки потенциальных методов лечения, которые могли бы улучшить барьерную сетчатки крови нарушение, вызванное гистамином. Утечка кровеносного сосуда, активация клеток Мюллера и непрерывность нейронных процессов используются для оценки реакции ущерба и его разворот с потенциальным препаратом, lipoxin А4.

Introduction

Все больше доказательств поддерживает существование барьера сетчатки крови (BRB) 1-5 и его сходство с гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) 6,7. Компромисс ГЭБ была тесно связана причинной или в качестве диагностического маркера хронических нейродегенеративных заболеваний , таких как болезнь Альцгеймера (AD) 8,9 и острых состояний , таких как делирий 10. Механистические способность проникновения в суть этих патологий и открытий для потенциальных мишеней для лекарственных средств, как правило, затруднено из-за ограниченной доступности и сети запутанности мозга. Такие альтернативы, как визуализации в естественных условиях 11 мозга органотипического культуры 12 первичных культур клеток 13,14 и систем совместного культивирования 15 были сформированы. Тем не менее, большинство из этих моделей требуют специальных инструментов, длинные экспериментальные периоды или несколько маркеров для идентификации клеток. Функциональные и структурные сходства между ГЭБ и BRB, а также корреляция между Dysfunctions из двух уже утверждалось , 16-19. Кроме того, более легкий доступ, хорошо определенные типы клеток и слоистая структура позволили хорошо охарактеризованный сетчатку как окно в мозг. Структурные и функциональные тождества ВВВ и BRB остаются для сравнения в деталях. Тем не менее, патологиями сетчатки глаза, особенно нарушение BRB, также были тесно связаны с прогрессированием различных заболеваний, включая диабет и 21,22 18-19 AD. Таким образом, представляет интерес для создания системы дисфункции BRB не только очертить механизм, но и на экран потенциальных лекарств. В этом докладе, протокол позволяет BRB дисфункции, используя простой острый сетчатке культуры разработан и представлен.

Повышение проницаемости ГЭБ и AD-как патологические изменения были установлены в мозг органотипического культуры инкубировали с гистамином, провоспалительного медиатора 12. Таким образом, в представленной системы, гистамин Applс использованием СВУ культуры сетчатки экс естественных условиях , чтобы побудить BRB дисфункции. Сетчатка из нескольких видов, таких как Mus Musculus и Bos Taurus, были протестированы. Из-за их коммерческой доступности и сходством с человеческой ткани, свежие свиньи глазные яблоки использовались для предоставления данных, представленных здесь. После инкубации с гистамином и / или другими наркотиками, сетчатка были обработаны для оценки иммунным окрашиванием в течение нескольких белков 12, таких как иммуноглобулин G (IgG), один из основных компонентов крови; глиальных фибриллярный кислый белок (GFAP), хорошо известный маркер для глиальных активации; и ассоциированный с микротрубочками белок 2 (MAP2), нейрон-специфический белок цитоскелета необходимы для сборки микротрубочек. Кроме того, слоистая структура сетчатки позволяет проводить детальный анализ процессов клеток Мюллера и ганглиозных клеток, такие как изменения в их ширине и непрерывности. Таким образом, несколько дополнительных параметров можно оценить последствия решенияBRB нарушение на ранней стадии и оценить разворотные эффекты потенциальных методов лечения, а также.

В этом протоколе, потенциальные эффекты реверсирование экранированных препаратов оцениваются с трех точек зрения: утечки кровеносных сосудов (БВС), активации клеток глии и живучесть реакции нервных клеток. Существует несколько методов количественного определения используются, например, уровень экспрессии показал интенсивности иммунным, измерения ширины процесса и непрерывность нейрональных процессов, показанных с помощью фильтр улучшения. Для того, чтобы лучше проиллюстрировать метод и помочь интерпретировать результаты, lipoxin А4 (LXA4), соединение эндогенно синтезированный в ответ на воспалительные повреждения и смягчающие эндотелиальной дисфункции 23, был выбран для демонстрационных целей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все протоколы были проведены в соответствии с политикой Institutional Animal Care и использование комитета, где это применимо.

1. Подготовка

  1. Приготовьте стабилизации среды с 75% Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM), 25% Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS). Хорошо перемешайте, аликвоты и хранят при -20 ° С до использования.
  2. Приготовьте фосфатно-буферном солевом растворе (ФБР) и стерилизуют автоклавированием. Хранить раствор при комнатной температуре. Нагреть PBS до 37 ° С до эксперимента (5 мл на лунку).
  3. Готовят 10%, 20% и 30% сахарозы в PBS. Фильтр все решения индивидуально более отдельных фильтров 0,22 мкм для стерилизации. Сохраните решения при 4 ° С.
  4. Подготовьте гистамин маточного раствора в PBS до концентрации 90 мМ. Стерилизовать раствор путем фильтрации через 0,22 мкм фильтр. Аликвоты и сохранить раствор при температуре -80 ° С. Избегайте многократных циклов замораживания-оттаивания и-.
  5. Сделать свежий 4% параформальдегида (PFA) в PBS до начала эксперимента. Поместите его на льду.
    Внимание: Хранить PFA в вытяжном шкафу и носить соответствующее защитное оборудование.
  6. Разморозить стабилизации среды (20 мл на сетчатке). Добавить пенициллин-стрептомицина до конечной концентрации 100 ед / мл. Теплое часть среды (15 мл на сетчатке) до 37 ° С в инкубаторе до эксперимента. Оставьте остальные среды на льду.
  7. Поместите HBSS (10 мл на сетчатке) на льду.

2. сетчатке Органотипической Культура

  1. Передача образцов в капюшоне культуры ткани. Откройте окуляр разрезанием вокруг объектива. Используя щетку, аккуратно удалите стекловидное тело, не вытаскивая на сетчатке. Аккуратно отделить сетчатку от обрезной кромки с помощью кисти, чтобы выставить диск зрительного нерва. Тяжелое зрительного нерва с бритвой и отпустить сетчатку.
  2. Передача сетчатки глаза в чашку Петри и тщательно промыть сетчатку один раз с использованием холодного HBSS. Поместите образец в HBSS на Iсе. Проанализируйте, как много сетчатку по мере необходимости, повторите шаг 2.1 и этот шаг.
  3. Обрежьте сетчатку пополам симметрично с бритвой. Аккуратно перенести образцы в 6-луночный планшет с 3 мл стабилизационного сред на лунку. Уравновешивание Разрешить течение 30 мин при 37 ° С в инкубаторе с атмосферой , содержащей 5% CO 2.
  4. Подготовьте следующие реагенты при инкубации на шаге 2.3: Развести гистамин маточного раствора до желаемой концентрации (450 мкМ) в теплой среде. Растворите LXA4 (хранится под аргоном) в среде до конечной концентрации 250 нг / мл.
    Примечание: При измерении эффекта LXA4, одна половина из одной сетчатки используется для одного только гистамина, в то время как другая половина используется для гистамина с LXA4.
  5. Аспирируйте стабилизации среды тщательно и добавить Готовую среду в каждую лунку (3 мл на лунку). Инкубируйте образцы при температуре 37 ° С в течение 1 ч в инкубаторе с атмосферой , содержащей 5% CO 2.
  6. промойтеОбразцы один раз в теплой, стерильной PBS.

3. Подготовка образцов для Иммуноокрашивание

  1. Отберите PBS с планшетов. Добавить 4% PFA (3 мл на лунку) и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре.
  2. Быстро аспирация PFA. Промыть образцы один раз с помощью PBS. Передача образцов до 10% сахарозы (5 мл на лунку) и инкубируют в течение от 2 до 4 ч при 4 ° С.
  3. Передача образцов до 30% сахарозы (5 мл на лунку) и инкубируют в течение ночи при температуре 4 ° С. Смешайте одну часть коммерческой среды замораживания с двумя частями 20% сахарозы, чтобы сделать рабочую среду замораживания. Оставьте его при температуре 4 ° С в течение ночи или дольше, пока пузырьки воздуха исчезают.
  4. Передача образцов в рабочей среде замораживания и достижения равновесия в течение 5 мин при комнатной температуре. Обрежьте каждый сетчатку на прямоугольники (примерно 3 мм и 5 мм).
  5. Аккуратно перенести образцы в рабочую морозильную сред, содержащихся в цилиндрическом контейнере (около 1 см радиус х 2 см высоты) DevИСЭД из алюминиевой фольги. Убедитесь, что ломтики ретинальные вертикальны (ориентированы, чтобы обеспечить поперечное сечение сетчатки при секционирования) и замораживают их в жидком азоте. Сохранить блоки при -80 ° С до использования.
  6. Раздел каждый блок на криостата на 14 мкм ломтики толщиной и смонтировать разделы на стеклах. Хранить слайды при температуре -80 ° С до использования.

4. Иммунологическое

  1. Промыть участки с 5% фосфатного буфера сахарозы (SPB, 5% сахарозы в PBS, рН 7,4) один раз. Блок неспецифические сайты связывания путем инкубации срезов в блокирующем буфере (5% SPB с 10% нормальной козьей сыворотки и 0,5% Тритон Х-100) в течение 1 ч при комнатной температуре.
  2. Инкубируйте секций (на слайдах) с соответствующим первичным антителом (GFAP или MAP2, разбавленного в соотношении 1: 500 в блокирующем буфере) в течение 1 ч. Аспирируйте решение. Промыть три раза в 5% SPB. Для окрашивания эндогенного IgG, пропустите этот шаг.
  3. Инкубируйте разделы с соответствующим SECONритом антитела (Cyanine3 / FITC, конъюгированного с осла против мышиного / анти-IgG кролика, разбавленной в отношении 1: 800 в блокирующем буфере) в течение 1 часа.
  4. Вымойте участки тщательно с 5% SPB три раза. Подготовка образцов для микроскопии путем установки их в монтажной среде, содержащей DAPI и покрытие покровные.
  5. С помощью лазера конфокальной микроскопии, захват изображения через объектив 20Х при одинаковых параметрах , таких как интенсивность лазерного, значение усиления, время выдержки и т.д. во всех группах. Установка длины волн возбуждения / излучения для синего канала (для обнаружения DAPI) в качестве 408/447 нм, для красного канала (для обнаружения Cyanine3) в качестве 561/785 нм и для зеленого канала (для обнаружения FITC) в качестве 488/525 нм ,

Анализ 5. Изображение

  1. Количественно процент вытекающей кровеносных сосудов в соответствии со следующими критериями: 12: Включить только кровеносные сосуды с ядрами эндотелиальных клеток в плоскости сечения в подсчете; рассмотреть дырявое кровеносных сосудов, если он показывает AGRadient иммуноокрашивания окружающих сосуд.
  2. Для определения уровня экспрессии, выберите интерес областей и измерения среднего значения серого с помощью программного обеспечения для анализа изображений.
  3. Для измерения ширины процесса, выбрать площадь участка, где процессы различны (наружный ядерный слой, ОНЛ, например). Затем выберите оптический поле, где такие процессы являются видимыми и непрерывными. Установите шкалу масштаба в соответствии с микроскопической обстановке, провести линию через процесс и выполнить измерение.
  4. Для того, чтобы проанализировать непрерывность процесса, выберите области интереса, применить фильтр, называемый дисперсией, которое усиливает края в изображении, заменяя каждый пиксель с его окрестности дисперсии, автоматически регулировать яркость и контрастность, подсчет строк и нормализовать количество самая площадь.
  5. Расчет статистических значений с помощью т -TEST в две-Стьюдента. *, P <0,05; **, Р <0,01; ***, P <0,001. псерия результат как среднее ± SEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы представляем недорогой, эффективный по времени и простой в использовании системы для оценки потенциальных методов лечения, которые могли бы защитить против нарушения BRB, вызванного гистамином. IgG , ограничен в сосудах , в контрольной сетчатки (рис 1А), но утечки из кровеносных сосудов при воздействии гистамина (Рисунок 1В), подтверждая , что модель успешно установлено.

LXA4 был выбран, чтобы продемонстрировать скрининг препаратов против BRB нарушения в представленной системе. BRB дисфункция ослабляется при обработке LXA4 (рис 1D), которая не оказывает существенного влияния на себя (рис 1C). Разворот Количественную как процент вытекшего кровеносных сосудов и в результате значительно (рис 1E). Два других типов клеток сетчатки глаза, Müller глиальные клетки (Рисунок 2) и ганглиозные клетки ( (рис 2E) , показанных через GFAP окрашивания (рисунок 2, AD) , но не оказывает существенного влияния на непрерывность дендритных процессов в ганглиозных клеток (рис 3G), показанный MAP2 окрашивание (Рисунок 3, AE). Следует также отметить, что никаких существенных изменений в уровне экспрессии белков либо не будет обнаружено.

Рисунок 1
Рисунок 1:. Кровь сетчатке Барьерный скомпрометирован на гистамин Exposure и спасена LXA4 Лечение IgG иммунное (красный) представлена ​​от сетчатки , которая была необработанной (A), повреждение индуцированных только гистамина (B), обрабатывают только LXA4 (C ), или подвергаться воздействию как histamине и LXA4 (D). В контроле (А) и LXA4 обрабатывают (С) групп, IgG , ограничен в кровеносных сосудах (БВС) в то время как в группе гистамина (В), IgG , детектируется из купюроприемниками , где она образует облака утечки пунктирными кругами. Дальнейшее добавление LXA4 спасает дисфункцию сосудов (D). Шкала бар, 20 мкм. (Е) Количественное измерение негерметичных купюроприемниками через тестируемых группах. Статистическая значимость определяется т -TEST в две-Стьюдента. *, P <0,05; **, Р <0,01; ***, P <0,001. Среднее значение ± SEM (n = 18) изображен на графике. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Фигура 2: Rong> Müller Клеточные процессы скомпрометированы гистамином и спасена LXA4 лечения. иммуногистохимическое GFAP представлена ​​от сетчатки , которая была необработанной (A), повреждение индуцированной гистамином только (B) , получавших только LXA4 (С) или подвергают воздействию как гистамин и LXA4 (D). Положительное окрашивание получают в процессах клеток Мюллера через сетчатку и вокруг них купюроприемниками. Шкала бар, 20 мкм. (Е) Ширина клеточных процессов Мюллера из всех групп представлены. измерялись около 30 индивидуальных процессов в группе. Статистическая значимость определяется т -TEST в две-Стьюдента. *, P <0,05; **, Р <0,01; ***, P <0,001. Среднее значение ± SEM (n = 30) изображен на графике. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

т "ВОК: Keep-together.within-страница =" 1 "> Рисунок 3
Рисунок 3: Непрерывность Ганглий клеточных процессов не зависит от LXA4. (А) Иммуноокрашивание против МАР2 представлена ​​от сетчатки , которая была необработанной (А), повреждение индуцированной гистамином только (B) , получавших только LXA4 (С) или подвергают воздействию как гистамин и LXA4 (D). Положительное окрашивание получают в процессах и клеточных тел ганглиозных клеток. Образец изображения map2 окрашивания (Е) вместе с соответствующим фильтром улучшенного изображения (F) представлено. Непрерывные процессы обозначены стрелками. Шкала бар, 20 мкм. (G) Плотность непрерывных MAP2-позитивных процессов ганглиозных клеток из всех групп представлены. Статистическая значимость определяется т -TEST в две-Стьюдента. *, P <0.05; **, Р <0,01; ***, P <0,001. Среднее значение ± SEM (n = 18) изображен на графике. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies  11965-092
HBSS Life Technologies  14170-112
Sucrose J.T.Baker 4072-05
Histamine  Sigma H7125-1G
Penicillin-Streptomycin  Invitrogen
PFA Electron Microscopy Sciences 15710
Freezing Media  Triangle Biomedical Sciences TFM-5
Normal Goat Serum  Rockland D104-00-0050
Triton X-100 Sigma T8787
GFAP Antibody Millipore AB5804
MAP2 Antibody EMD Millipore MAB3418
FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 711-095-152
Cy3 conjugated Donkey anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 715-165-150
mounting medium containing DAPI Vector Laboratories, Inc. H-1200
Laser Confocal Microscope Nikon Eclipse Ti microscope
ImageJ National Institutes of Health 1.45s

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cunha-Vaz, J., Bernardes, R., Lobo, C. Blood-retinal barrier. J Ophthalmol. 21, 3 (2011).
  2. Kim, J. H., et al. Blood-neural barrier: intercellular communication at glio-vascular interface. J Biochem Molec Biol. 39, 339-345 (2006).
  3. Kumagai, A. K. Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes. Diabetes Metab Res Rev. 15, 261-273 (1999).
  4. Runkle, E. A., Antonetti, D. A. The blood-retinal barrier: structure and functional significance. Methods Molec Biol. 686, Clifton, N.J. 133-148 (2011).
  5. Takata, K., Hirano, H., Kasahara, M. Transport of glucose across the blood-tissue barriers. Int Rev Cytol. 172, 1-53 (1997).
  6. Goncalves, A., Ambrosio, A. F., Fernandes, R. Regulation of claudins in blood-tissue barriers under physiological and pathological states. Tissue Barriers. 1, 24782 (2013).
  7. Patton, N., et al. Retinal image analysis: concepts, applications and potential. Prog Ret Eye Res. 25, 99-127 (2006).
  8. Di Marco, L. Y., et al. Vascular dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease--A review of endothelium-mediated mechanisms and ensuing vicious circles. Neurobiol Dis. 82, 593-606 (2015).
  9. Nagele, R. G., et al. Brain-reactive autoantibodies prevalent in human sera increase intraneuronal amyloid-beta(1-42) deposition. J Alzheimer's Dis: JAD. 25, 605-622 (2011).
  10. Goldwaser, E., Acharya, N., Nagele, R. Cerebrovascular and blood-brain barrier compromise: A mechanistic link between vascular disease and Alzheimer's disease subtypes of neurocognitive disorders. J Parkinsons Dis Alzheimer's Dis. 2, 10 (2015).
  11. Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain. Nat Photonics. 7, (2013).
  12. Sedeyn, J. C., et al. Histamine Induces Alzheimer's Disease-Like Blood Brain Barrier Breach and Local Cellular Responses in Mouse Brain Organotypic Cultures. Biomed Res Int. 2015, 937148 (2015).
  13. Avdeef, A., Deli, M. A., Neuhaus, W. Blood-Brain Barrier in Drug Discovery: Optimizing Brain Exposure of CNS Drugs and Minimizing Brain Side Effects for Peripheral Drugs. Di, L., Kerns, E. H. , John Wiley & Sons, Inc. Ch. 10 188 (2014).
  14. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10, 33 (2013).
  15. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
  16. Alberghina, M., Lupo, G., Anfuso, C. D., Moro, F. Palmitate transport through the blood-retina and blood-brain barrier of rat visual system during aging. Neurosci Lett. 150, 17-20 (1993).
  17. Hosoya, K., Yamamoto, A., Akanuma, S., Tachikawa, M. Lipophilicity and transporter influence on blood-retinal barrier permeability: a comparison with blood-brain barrier permeability. Pharm Res. 27, 2715-2724 (2010).
  18. Minamizono, A., Tomi, M., Hosoya, K. Inhibition of dehydroascorbic acid transport across the rat blood-retinal and -brain barriers in experimental diabetes. Biol Pharm Bull. 29, 2148-2150 (2006).
  19. Serlin, Y., Levy, J., Shalev, H. Vascular pathology and blood-brain barrier disruption in cognitive and psychiatric complications of type 2 diabetes mellitus. Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2011, 609202 (2011).
  20. Kolb, H. How the retina works - Much of the construction of an image takes place in the retina itself through the use of specialized neural circuits. Am Sci. 91, 28-35 (2003).
  21. Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease. J Neurol Neurosurgery Psychiatry. 83, 917-922 (2012).
  22. Tan, Z., Ge, J. Amyloid-beta, the retina, and mouse models of Alzheimer disease. Am J Pathol. 176, 2055 (2010).
  23. Serhan, C. N. Pro-resolving lipid mediators are leads for resolution physiology. Nature. 510, 92-101 (2014).
  24. Bucolo, C., et al. Effects of topical indomethacin, bromfenac and nepafenac on lipopolysaccharide-induced ocular inflammation. J Pharm Pharmacol. 66, 954-960 (2014).
  25. Edelman, J. L., Lutz, D., Castro, M. R. Corticosteroids inhibit VEGF-induced vascular leakage in a rabbit model of blood-retinal and blood-aqueous barrier breakdown. Exp Eye Res. 80, 249-258 (2005).

Tags

Медицина выпуск 115 крови барьер сетчатки сетчатка сосудистая дисфункция гистамин lipoxin A4 Müller клетки ганглиозные клетки
Острый сетчатке Модель для оценки крови сетчатке Барьерные нарушения и потенциальных лекарственных препаратов для лечения
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, H., Rodriguez, A. R., Spur, B.… More

Wu, H., Rodriguez, A. R., Spur, B. W., Venkataraman, V. An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment. J. Vis. Exp. (115), e54619, doi:10.3791/54619 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter