Summary
Eine kostengünstige, einfach zu bedienende und leistungsfähige System etabliert mögliche Behandlungen zu bewerten, die Blut Retina-Schranke Verletzung durch Histamin induzierte verbessern könnte. Blutgefäße Leckage, Müller-Zell-Aktivierung und die Kontinuität der neuronalen Prozesse werden genutzt, um die Schadensantwort und deren Umkehrung mit einem potenziellen Medikament, Lipoxin A4 zu beurteilen.
Introduction
Eine wachsende Zahl von Hinweisen unterstützt die Existenz von Blut Retina - Schranke (BRB) 1-5 und seine Ähnlichkeit mit dem Blut - Hirn - Schranke (BBB) 6,7. Kompromiss der BBB wurde ursächlich oder als diagnostischer Marker für chronische neurodegenerative Erkrankungen, wie Alzheimer-Krankheit (AD) 8,9 und akuter Erkrankungen wie Delirium 10 fest verbunden. Mechanistische Einblicke in diese Pathologien und Entdeckungen für potentielle Arzneimittelziele werden durch die begrenzte Zugänglichkeit und Netzwerk Kompliziertheit des Gehirns im Allgemeinen behindert. Alternativen , wie beispielsweise in vivo - Bildgebung 11, Gehirn organotypische Kultur 12, primären Zellkulturen 13,14 und Co-Kultursysteme 15 erzeugt worden sind . Allerdings sind die meisten dieser Modelle erfordern spezielle Instrumente, lange Versuchszeiten oder mehrere Marker-Zellen zu identifizieren. Funktionelle und strukturelle Ähnlichkeiten zwischen BBB und BRB sowie eine Korrelation zwischen der dysfunctions der beiden wurden 16-19 argumentiert. Zusätzlich leichteren Zugang, gut definierte Zelltypen und eine Schichtstruktur haben, die gut charakterisierten Netzhaut als ein Fenster zum Gehirn erlaubt. Die strukturellen und funktionellen Identität der BBB und BRB bleiben im Detail verglichen werden. Jedoch retinale Pathologien, insbesondere die BRB Verletzung, wurden ebenfalls mit dem Fortschreiten von verschiedenen Krankheiten eng in Verbindung gebracht worden, einschließlich Diabetes 18-19 und AD 21,22. Somit ist es von Interesse, eine BRB Dysfunktion System zu etablieren, nicht nur den Mechanismus zu beschreiben, sondern auch potentielle Arzneimittel zu screenen. In diesem Bericht wird ein Protokoll ermöglicht BRB Dysfunktion eine einfache akute retinale Kultur unter Verwendung entwickelt und präsentiert.
Erhöht BBB Permeabilität und AD-ähnliche pathologische Veränderungen wurden in einem Gehirn organotypischen Kultur etabliert mit Histamin inkubiert, einem pro-inflammatorischen Mediators 12. Daher wird in dem dargestellten System war Histamin applied zur ex - vivo - Retinal Kultur BRB Dysfunktion zu induzieren. Retinas von mehreren Arten, wie Mus musculus und Bos Taurus, getestet wurden. Aufgrund ihrer kommerziellen Verfügbarkeit und Ähnlichkeit mit menschlichem Gewebe, frisch wurden Schweine Augäpfel verwendet, um die Daten hier berichtet zu liefern. Nach Inkubation mit Histamin und / oder andere Medikamente wurden die Retinas zur Auswertung verarbeitet durch Immunfärbung für mehrere Proteine 12, wie Immunoglobulin G (IgG), eine der Hauptkomponenten des Blutes; glial fibrillary acidic protein (GFAP), ein bekannter Marker für Gliazellen Aktivierung; und Mikrotubuli-assoziierten Protein 2 (MAP2), ein Neuron-spezifischen Zytoskelettprotein essentiell für Mikrotubuluszusammenbau. Darüber hinaus ermöglicht die geschichtete Struktur der Netzhaut, eine detaillierte Analyse der Prozesse der Müller-Zellen und Ganglionzellen, wie beispielsweise Veränderungen in ihrer Breite und Kontinuität. So einige zusätzliche Parameter zur Verfügung, die Folgen der zu bewertenBRB Verletzung in einem frühen Stadium und auch die Umkehrung Auswirkungen möglicher Behandlungen zu bewerten.
In diesem Protokoll werden mögliche Umkehrung Wirkungen gescreent Drogen aus drei Perspektiven bewertet: das Austreten von Blutgefäßen (BVs), die Aktivierung von Gliazellen und beschädigungs Reaktion von neuronalen Zellen. Mehrere Quantifizierungsverfahren werden verwendet, zum Beispiel die Expressionsniveaus von einem Verbesserungsfilter dargestellt durch Intensität der Immunfärbung Breitenmessung eines Prozesses und die Kontinuität der neuronalen Prozesse gezeigt. Zum besseren Verständnis der Methode veranschaulichen und zu helfen , Ergebnisse zu interpretieren, Lipoxin A4 (LXA 4) eine Verbindung synthetisiert endogen als Reaktion auf entzündliche Verletzungen und mildernde endotheliale Dysfunktion 23, wurde zu Demonstrationszwecken gewählt.
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Protocol
Alle Protokolle wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Institutional Animal Care und Use Committee gegebenenfalls durchgeführt.
1. Vorbereitung
- Bereiten Sie die Stabilisierungsmedien mit 75% Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM), 25% Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS). Gut mischen, aliquotieren und bei -20 ° C bis zur Verwendung.
- Bereiten Sie die Phosphat-gepufferte Saline (PBS) und durch Autoklavieren sterilisieren. Bewahren Sie die Lösung bei Raumtemperatur. Erwärmen Sie den PBS auf 37 ° C vor dem Experiment (5 ml pro Vertiefung).
- Herstellung von 10%, 20% und 30% Saccharose in PBS. Filter alle Lösungen einzeln über getrennte 0,22 um Filter für die Sterilisation. Speichern Sie die Lösungen bei 4 ° C.
- Bereiten Sie die Histamin-Stammlösung in PBS auf eine Konzentration von 90 mM. Sterilisieren der Lösung durch Filtration über ein 0,22-um-Filter. Aliquot und die Lösung bei -80 ° C zu speichern. Vermeiden Sie mehrere Gefrier-und-Auftau-Zyklen.
- Machen Sie frisch 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS vor dem Experiment. Legen Sie sie auf Eis.
Vorsicht: Halten Sie PFA in einem Abzug und tragen Sie geeignete Schutzausrüstung. - Auftauen Stabilisierungsmedium (20 ml pro Retina). Hinzufügen, Penicillin-Streptomycin in einer Endkonzentration von 100 U / ml. Warmen Teil des Mediums (15 ml pro Retina) bis 37 ° C im Inkubator vor dem Experiment. Lassen Sie den Rest des Mediums auf dem Eis.
- Legen Sie die HBSS (10 ml pro Retina) auf Eis.
2. Retinal Organotypischen Kultur
- Übertragen Sie die Proben auf eine Gewebekultur Kapuze. Öffnen Sie die Augenmuschel von rund um das Objektiv zu schneiden. Mit einer Bürste, entfernen Sie den Glaskörper ohne auf der Netzhaut zu ziehen. Vorsichtig lösen mit einem Pinsel auf die Netzhaut von der Schnittkante der Papille zu belichten. Schwere der Sehnerv mit einer Rasierklinge und die Netzhaut lösen.
- Übertragen Sie die Netzhaut in eine Petrischale und sorgfältig auf die Netzhaut einmal mit kaltem HBSS spülen. Die Probe wird in HBSS auf ice. nach Bedarf Präparieren wie viele Netzhäuten aus Schritt 2.1 und dieser Schritt wird wiederholt.
- Schneiden Sie die Netzhaut in zwei Hälften symmetrisch mit einem Rasiermesser. Sanft übertragen Proben auf eine 6-Well-Platte mit 3 ml Stabilisierung Medien pro Vertiefung. Erlauben Äquilibrierung für 30 min bei 37 ° C in einem Inkubator mit der Atmosphäre , die 5% CO 2.
- Bereiten Sie die folgenden Reagenzien während der Inkubation bei Schritt 2.3: Verdünnen Sie die Histamin-Stammlösung auf die gewünschte Konzentration (450 & mgr; M) in warmem Medium. Auflösen LXA4 (gespeichert unter Argon) in das Medium bis zu einer Endkonzentration von 250 ng / ml.
HINWEIS: Wenn die Wirkung von LXA 4 zu messen, die eine Hälfte von einer einzigen Netzhaut für Histamin allein verwendet wird, während die andere Hälfte für Histamin mit LXA 4 verwendet wird. - Saugen Sie das Stabilisierungsmedium sorgfältig und fügen Sie das fertige Medium zu jeder Vertiefung (3 ml pro Vertiefung). Inkubieren der Proben bei 37 ° C für 1 h in einem Inkubator mit der Atmosphäre , die 5% CO 2.
- Spülen Sie dieProben einmal in warmen, sterilen PBS.
3. Bereiten Sie die Proben für Immunostaining
- Absaugen PBS von den Platten. In 4% PFA (3 ml pro Vertiefung) und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur.
- Schnell die PFA absaugen. Spülen Sie die Proben einmal mit PBS. Übertragen Sie die Proben auf 10% Sucrose (5 ml pro Vertiefung) und Inkubation für 2 bis 4 Stunden bei 4 ° C.
- Übertragen Sie die Proben auf ein 30% Sucrose (5 ml pro Vertiefung) und Inkubation über Nacht bei 4 ° C. Mischen Sie einen Teil des kommerziellen Einfriermedium mit zwei Teilen von 20% Saccharose das Arbeits Einfriermedium zu machen. Lassen Sie es bei 4 ° C über Nacht oder länger, bis die Luftblasen verschwinden.
- Übertragen Sie die Proben auf das Arbeits Einfriermedium und ermöglichen Äquilibrierung während 5 min bei Raumtemperatur. Schneiden Sie jede Netzhaut in Rechtecke (ca. 3 mm bis 5 mm).
- übertragen Sie sorgfältig die Proben in die Arbeits Einfrieren Medien in einem zylindrischen Behälter enthalten sind (etwa 1 cm Radius x 2 cm Höhe) devISED aus Aluminiumfolie. Stellen Sie sicher, dass die Netzhaut Scheiben vertikal sind (orientiert einen Querschnitt der Netzhaut zu schaffen, auf sectioning) und frieren sie in flüssigem Stickstoff. Speichern Sie die Blöcke bei -80 ° C bis zur Verwendung.
- Abschnitt jeder Block auf einem Kryostaten in 14 & mgr; m dicke Scheiben schneiden und montieren Sie die Abschnitte auf Glasplatten. Lagern Sie die Folien bei -80 ° C bis zur Verwendung.
4. Immunostaining
- Waschen der Schnitte mit 5% Sucrose Phosphatpuffer (SPB, 5% Saccharose in PBS, pH 7,4) einmal. Blockieren die nicht-spezifischen Bindungsstellen durch Inkubation der Abschnitte in Blockierungspuffer (5% SPB mit 10% normalem Ziegenserum und 0,5% Triton X-100) 1 Stunde bei Raumtemperatur.
- Inkubieren Sie die Abschnitte (auf Folien) mit dem entsprechenden primären Antikörper (GFAP oder MAP2, verdünnt auf 1: 500 in Blocking-Puffer) für 1 Stunde. Absaugen die Lösung. Waschen dreimal in 5% SPB. Für die endogene IgG-Färbung, diesen Schritt überspringen.
- Inkubieren Sie die Abschnitte mit dem entsprechenden SECON1 h: dary Antikörper (800 in Blockierungspuffer bei 1 Cyanine3 / FITC konjugiertem Esel-anti-Maus / anti-Kaninchen-IgG, verdünnt).
- Waschen Sie die Abschnitte gründlich mit 5% SPB dreimal. Bereiten Sie die Proben für die Mikroskopie von ihnen Montagemedium, das DAPI in Montage und Abdecken mit Deckgläsern.
- Mit einem Laser konfokalen Mikroskop, die Aufnahmen über ein 20fach - Objektiv unter identischen Parametern wie Laserintensität, Gain - Wert, Verweilzeit usw. in Gruppen. Festlegen der Anregungs- / Emissionswellenlängen für den blauen Kanal (zu detektieren DAPI) als 408/447 nm, für den roten Kanal (zu detektieren Cyanine3) als 561/785 nm und für den grünen Kanal (zu erkennen FITC) als 488/525 nm .
5. Bildanalyse
- Quantifizieren Prozentsatz von undichten Blutgefäße nach den folgenden Kriterien 12: Geben Sie nur die Blutgefäße mit endothelialen Zellkerne innerhalb der Ebene des Abschnitts in der Zählung; ein Blutgefäß undicht prüfen, ob es ag zeigtradient der Immunfärbung des Behälters umgibt.
- Um das Expressionsniveau bestimmen, wählen Sie Bereiche von Interesse und messen Sie den mittleren Grauwert unter Verwendung der Bildanalyse-Software.
- Um die Breite des Prozesses zu messen, einen Bereich des Abschnitts zu wählen, wo die Prozesse unterscheiden (die äußere Kernschicht, ONL, zum Beispiel). Dann wählen Sie ein optisches Feld, wo solche Prozesse sichtbar und kontinuierlich sind. Stellen Sie den Maßstab entsprechend der mikroskopischen Einstellung, eine Linie über den Prozess ziehen und die Messung durchzuführen.
- Um die Kontinuität des Prozesses, wählen Sie Bereiche von Interesse zu analysieren, wenden Sie den Filter genannt Varianz, die die Kanten im Bild verbessert, indem jedes Pixel mit seiner Nachbarschaft Varianz zu ersetzen, passen sich automatisch den Kontrast und die Helligkeit, die Linien zu zählen und die Zählung durch die Normalisierung Bereich.
- Berechnen statistische Bedeutungen unter Verwendung eines two-tailed t - Test nach Student. * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001. Plot das Ergebnis als Mittelwert ± SEM.
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Representative Results
Wir stellen eine kostengünstige, zeitsparende und einfach zu bedienendes System, mögliche Behandlungen zu bewerten, die gegen die BRB Verletzung durch Histamin induzierte schützen könnte. IgG wird in den Gefäßen in Kontrollnetzhaut (Abbildung 1A) beschränkt, sondern tritt aus der Blutgefäße auf Histamin - Exposition (Abbildung 1B), was bestätigt , dass das Modell erfolgreich etabliert.
LXA 4 wurde gewählt, um die Screening für Wirkstoffe gegen BRB Verletzung im vorliegenden System zu demonstrieren. BRB Dysfunktion gedämpft wird bei Behandlung mit LXA 4 (Figur 1D), die von selbst (1C) keinen signifikanten Effekt hat. Die Auflösung wird als Prozentsatz der ausgetretene Blutgefäße quantifiziert und das Ergebnis ist signifikant (Abbildung 1E). Zwei andere retinale Zelltypen, Müller Gliazellen (Abbildung 2) und Ganglionzellen (
Abb . 1: Das Blut Retinal Barriere kompromittiert auf Histamine Belichtung und rettete durch LXA4 Behandlung IgG - Immunfärbung (rot) wird von Retina präsentiert , die unbehandelt war (A), Schaden-induzierte mit nur Histamin (B), nur mit LXA 4 behandelt (C ) oder sowohl histam ausgesetztine und LXA 4 (D). In Kontrolle (A) und LXA 4 behandelt (C) Gruppen wird IgG innerhalb der Blutgefäße (BVs) , während in der Histamin - Gruppe (B) beschränkt wird IgG aus der BvS erkannt , wo es Leckage Wolken durch gestrichelte Kreise angedeutet bildet. Weitere Zugabe von LXA4 rettet die Gefäßfunktionsstörung (D). Maßstabsleiste, 20 & mgr; m. (E) Quantitative Messung der leaky BVs über den getesteten Gruppen. Die statistische Signifikanz wird durch einen zweiseitigen Student-t - Test bestimmt. * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001. Mittelwert ± SEM (n = 18) ist in dem Diagramm dargestellt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 2:
Abbildung 3: Die Kontinuität der Ganglionzellen Prozesse wird nicht von LXA 4 betroffen. (A) Immunostaining gegen MAP2 wird von Retina präsentiert , die unbehandelt war (A), Schaden-induzierten Histamin nur (B) behandelt mit LXA4 nur (C) oder sowohl auf Histamin ausgesetzt und LXA 4 (D). Eine positive Färbung wird in den Prozessen und Zellkörper der Ganglionzellen erhalten. Ein Beispielbild von MAP2 - Färbung (E) zusammen mit dem entsprechenden Filter verbesserte Bild (F) wird vorgestellt. Die kontinuierlichen Verfahren werden durch Pfeilspitzen angedeutet. Maßstabsleiste, 20 & mgr; m. (G) , um die Dichte der kontinuierlichen, MAP2-positive Ganglionzellen Prozesse aus allen Gruppen werden dargestellt. Die statistische Signifikanz wird durch einen zweiseitigen Student-t - Test bestimmt. *, P <0.05; ** P <0,01; *** P <0,001. Mittelwert ± SEM (n = 18) ist in dem Diagramm dargestellt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| HBSS | Life Technologies | 14170-112 | |
| Sucrose | J.T.Baker | 4072-05 | |
| Histamine | Sigma | H7125-1G | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | ||
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Freezing Media | Triangle Biomedical Sciences | TFM-5 | |
| Normal Goat Serum | Rockland | D104-00-0050 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| GFAP Antibody | Millipore | AB5804 | |
| MAP2 Antibody | EMD Millipore | MAB3418 | |
| FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-095-152 | |
| Cy3 conjugated Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 715-165-150 | |
| mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories, Inc. | H-1200 | |
| Laser Confocal Microscope | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.45s |
References
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