Introduction
Легкие находятся в постоянном контакте с внешней средой, и высоко подвергают воздействию как безвредные частиц и микробов со способностью вызывать заболевания. Поэтому крайне важно для иммунной системы, чтобы смонтировать сильные иммунные ответы против вторгшихся патогенов, но в равной степени важно для поддержания толерантности к вдыхаемых антигенов, которые не вызывают заболевания. Для обеспечения мощного иммунного надзора, дыхательной системы выстлана сети иммунных клеток, в том числе дендритные клетки (ДК). Контроллеры домена являются профессиональными антиген-представляющими клетками с уникальной способностью активировать наивные Т-клетки. В легких человека, РС - резиденты сталкиваются с антигеном , а затем обработать и транспортировать его в легких осушение лимфатических узлов для представления и активации Т - клеток , 1, 2, 3.
В иммунной системе человека, РС можно разделить на несколько подмножеств, с DistinКТ , но пересекающиеся функции: CD1c + и CD141 + миелоидных ДК (Главгосслужбы) и CD123 + плазмоцитов контроллеры домена (PDCs) 4, 5. В то время как самые подробные знания о человеческом ГЦ проистекает из исследований в крови, теперь очевидно , что человеческие легкие также питают редкие популяции DC подмножеств с Т-клеточным стимулирующим емкостью 6, 7, 8, 9. Тем не менее, аккумулирующие данные показывают , что иммунные клетки, в том числе контроллеры домена, различаются по частоте, фенотип, и функции в зависимости от их анатомического расположения 10. Таким образом, важно, чтобы изучить иммунные клетки из соответствующей ткани, чтобы понять их вклад в местный иммунитет и толерантности. Взятые вместе, это подчеркивает необходимость изучения легких резидентные РС при решении заболеваний легких, несмотря на контроллеры домена крови быть более доступными и доступными в людях.
Первые работы, изучающие легочные резидентные РС в организме человека в основном полагались на морфологии и экспрессии отдельных маркеров, таких как HLA-DR и CD11c, в срезах ткани с помощью иммуногистохимии 11, 12, 13. В противоположность этому, более поздние исследования, как правило, полагаются на проточной цитометрии анализа для изучения различных подмножеств иммунных клеток. Однако, так как трудно найти хотя бы одну клеточной поверхности маркер, который однозначно идентифицирует определенное подмножество постоянного тока, потенциальное ограничение исследований применения только четыре цвета проточной цитометрии является риск в том числе клеточных популяций с аналогичными фенотипических маркеров в качестве контроллеров домена. Например, CD11c экспрессируется на всех миелоидных ДК и подавляющее большинство моноцитов. С другой стороны, в исследованиях применения более совершенных проточная цитометрия панелей, незлокачественный легочной ткани от хирургических резекций пациентов, как правило, используютсяXref "> 10, 14, 15, 16, хотя остается неясным , являются ли эти редкие популяции действительно представительными ДКБ , присутствующих в здоровых субъектов. В целом, исследования ограничены во многом связано с тем , что хирургическим путем удаляется или вся ткань легких человека не хватает.
Для того, чтобы преодолеть некоторые из этих ограничений, эта работа описывает, как выполнить детальный анализ пространственного распределения и фенотипической идентификации контроллеров домена в слизистой оболочке эндобронхиальные биопсий, полученных у здоровых добровольцев, которые подвергаются бронхоскопию. Несколько небольших биопсий могут быть получены от каждого отдельного человека и впоследствии могут быть внедрены для секционирования и анализ с помощью иммуногистохимии или ферментативно переваривается для расширенного анализа проточной цитометрии. Использование легочной ткани в виде эндобронхиальные биопсий из bronchoscopies дает то преимущество, что позволило выполнить стУды на здоровых добровольцах, в отличие от открытой хирургии легких, что, по понятным причинам, ограничивается пациентами, которые требуют торакальной хирургии. Кроме того, ткань, которая оцифровывается во время бронхоскопии от здоровых добровольцев является физиологически нормальным, в отличие от не-пораженный участок легочной ткани у пациентов с легочным заболеванием. С другой стороны, биопсий невелики, и количество клеток, извлекаемых, даже при объединении нескольких биопсий, ограничивает тип анализов, которые могут быть выполнены.
Хотя настоящая работа сосредоточена на контроллерах, описанные способы могут быть непосредственно расширен за счет включения других (иммунные) клетки, представляющие интерес, которые находятся в тканях человека через слизистую оболочку легких. Кроме того, протоколы также непосредственно применимы к образцам, полученным от пациентов, страдающих легочными заболеваниями, где бронхоскопии является частью установления диагноза, таких как хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), саркоидоз, или рак легких.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Данное исследование было одобрено областным советом этической экспертизы в Умео, Швеция.
1. бронхоскопия для отбора проб Эндобронхиальная биопсий человека субъектов
- Получить информированное согласие от всех участников.
- Рассматривать предметы с оральной мидазолама (4-8 мг) и внутривенного гликопиррония (0.2-04 мг) за 30 мин до бронхоскопии. Применение местной анестезией с лидокаином в гортани и бронхах. Пусть предмет полоскание с ~ 3 мл лидокаина 4% и применяют 3 мл к основанию языка и в гортань через гортань шприц. Оптимизация под местной анестезией с 8-10 доз лидокаина спрея. Выполните этот шаг с темой заседания.
- Вставьте гибкий бронхоскоп видео через рот с помощью пластмассового мундштука с субъектом в положении лежа на спине. С помощью специального назначения спрей катетер для завершения местной анестезией дистальной трахеи и бронхов через бронхоскоп. При этом используют дозу приблизительно5-10 мл лидокаина 2%.
- Возьмите 6-9 эндобронхиальных слизистых оболочек биопсию из основного киля и основные бронхиальных подразделений с использованием Фенестрированные щипцов (Рисунок 1). После бронхоскопии и перед выходом из больницы, чтобы объект съемки покоя в течение 2-4 ч и обеспечить его / ее с легкой закуской.
2. Вложение биопсий в гликоле метилакрилата (ГМА) Смола
Примечание: Протокол иммунное GMA первоначально была разработана в Университете Саутгемптона, Гистохимия Research Unit 17.
- Фиксация: Для иммуногистохимии, удалите биопсий пинцетом и поместить их непосредственно в стеклянные пробирки, содержащие 3 мл обезвоженного ингибиторов ацетона и протеазы охлажденного льдом (фенилметилсульфонилфторид (35 мг / 100 мл ацетона) и иодацетамид (370 мг / 100 мл ацетона )). Закрепить ткань в течение ночи при -20 ° С (рисунок 2).
Примечание: Следующие шаги должны быть PERFOrmed в вытяжном шкафу с соответствующими нитриловые перчатки. Комплект вложение содержит компоненты, которые могут вызвать реакцию сенсибилизации, раздражение, и / или аллергический кожи. Все отходы должны быть утилизированы как опасные отходы. - Обезвоживание: удаления ацетона с ингибиторами и заменить свежим обезвоженного ацетона (без ингибиторов) в течение 15 мин при комнатной температуре (RT). Удалите ацетон и заменить его метилбензоатом в течение 15 мин.
- Проникновение: Подготовка обработки раствора 5% -ного раствора метилбензоат в гликоль метакрилата мономера; 10 мл достаточно для одного флакона. Используя пластиковые пипетки Пастера, отсос от раствора метил бензоат и заменить с 3 мл раствора для обработки. Инкубацию биопсий и избытка раствора для обработки при 4 ° С в течение 2 ч; Пипетки Пастера может быть использован для всех последующих изменений решения, включая встраивание решение.
- Обмен на это решение для обработки через каждые 2 ч (3x 2 ч инкубациями), так что общее время инфильтрации биоpsies в растворе для обработки составляет по меньшей мере 6 ч. Вставьте бумажные этикетки в верхней части вложения капсулы идентифицировать биопсию.
- Готовят вложение раствора 75 мг перекиси бензоила в 10 мл этиленгликоля метакрилата мономера. Добавить 0,25 мл N, N - диметиланилин поли (этиленоксида) (ускоритель) к раствору вложения , чтобы начать реакцию полимеризации. Удалите систему обработки и поместите одну биопсию в соответствующую капсулу вложения с помощью щипцов.
- Медленно заполнить вложение капсулу в верхней части с вложением раствора и закройте крышку. Избегайте нарушения биопсию и создания больших пузырьков воздуха. Инкубируйте капсулы при температуре 4 ° С до тех пор, пока смола полностью полимеризуется.
- Хранить встроенные биопсий при -20 ° С в 50 мл пробирку, содержащую приблизительно 5 г силикагеля.
3. Секционирование ГМА встраиваемый Эндобронхиальная Биопсию
- Микроскоп слайд-покрытие: Вымойте стекла микроскопа вПосудомоечная машина на обычном цикле. Накройте слайды и дайте им высохнуть на воздухе.
- Готовят раствор для нанесения покрытия из 10% поли-L-лизина (ФАПЧ) в дистиллированной воде. Погрузите слайды в растворе для нанесения покрытия в течение 5 минут, а затем дайте им высохнуть на воздухе. Хранить в сухом месте слайды ФАПЧ покрытием в оригинальных коробках.
- Промыть листового стекла полоски с 0,1% Tween 20 в дистиллированной воде. Промыть стекла с 70% -ным этанолом и насухо бумажным полотенцем. Разрежьте стеклянные ножи из стеклянной полосы с использованием ножа производителя. Храните ножи в контейнере, который предотвращает движение, чтобы гарантировать, что передний край не повреждены или поцарапан.
- Биопсия обрезки: Поместите капсулу биопсии в капсулу сплиттер и вырубить каждую сторону с использованием углеродистой стали одной кромки лезвия. Удалите ГМА Встраиваемый биопсию и поместить его твердо в тисках. Обрезают избыток ГМА из вокруг биопсии с использованием стального лезвия.
- GMA секционирования.
- Готовят 0,05% раствор аммиака с дистиллированной водой. Поместите стеклянный нож и биопсию гое микротома. Тщательно выровняйте блок биопсии с лезвием путем регулировки держателя ножа и угла блока биопсии, так что лезвие лежит плоско к поверхности блока.
- Вырезать толстые секции 2 мкм с использованием микротома на медленной скорости резания и использовать пинцет для передачи и всплывают из секций на воде аммиака. Поплавок секции на 45-90 сек, что позволяет нежную извлечение антигена и раскладывания секции.
- Возьмите секции с предметного стекла микроскопа. Проверьте гистологию биопсии, быстро окрашивания толуидиновым синим.
- Высушить слайды на горячей пластине набора до 50 ° С и применять 500 мкл фильтруется толуидиновым синим красителем в секцию с помощью пластиковой пипетки Пастера. Подогреть раздел на горячей плите, пока зеленое кольцо не начнет появляться на краю пятна, а затем смыть водой.
- С помощью светового микроскопа, проверьте гистологию биопсии. Разделы, используемые для иммуногистохимии должны содержать хорошие участки неповрежденной листовой пластинкиPropria и эпителий, с наименьшим количеством желез и как мало гладких мышц, насколько это возможно.
- Как и в разделе 3.4.2, вырезать участки, которые имеют хорошую гистологию и забрать их с ФАПЧ покрытием микроскопа для иммуногистохимического окрашивания. Вырезать по меньшей мере, две секции из каждой биопсии для анализа. Сухие скользит по меньшей мере, 1 ч. После сушки, секции могут быть завернуты в фольгу и хранили при -20 ° С в течение до 2-х недель, или они могут быть немедленно иммуноокрашиванию.
4. Иммуногистохимическое Окрашивание ГМА встраиваемый Эндобронхиальная Биопсию
Примечание: Азид натрия является токсичным. Готовят 0,1% раствор азида натрия в вытяжном шкафу и вдали от кислот. При контакте с кислотами выделяет токсичный газ.
- Нарисуйте вокруг участков с использованием алмазным пером и организовать слайдов на окрашивании стойку.
- Выполните пероксидазы блок. Приготовьте пероксидаза блок раствор 0,3% перекиси водорода в 0,1% растворе азида натрия. Applу 1 мл блока пероксидазы к разделам и инкубировать в течение 30 мин.
- Приготовьте промывочный раствор 0,05 М Трис-буферном солевом растворе (TBS), рН 7,6. Вымойте слайды в TBS, 3x 5 мин.
- Готовят 1% раствор БСА блока в DMEM. Сделайте это заранее и в больших объемах, аликвоты и заморозить его до тех пор, пока это необходимо. Слить слайды и инкубировать секций в блоке растворе в течение 30 мин, чтобы блокировать связывание неспецифических антител. Если неспецифическое связывание все еще имеет место, включают в себя 30-минутной инкубации шаг с 5% блок сыворотки из того же вида в качестве второго антитела.
- Развести первичных антител (CD45 или CD1a) в TBS до нужной концентрации (CD45, разбавленного в соотношении 1: 1000; CD1a разводили в соотношении 1: 1,00) и применить его к слайдам. Покровное секций и инкубировать в течение ночи при комнатной температуре.
- Вымойте слайды в TBS три раза. Развести биотинилированного вторичного антитела (направленное против первичных вида хозяина антител, в данном случае кролика против мышиного F (аb '2)) в TBS до нужной концентрации (1:300 разведение) и применить его к слайдам. Инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре.
- Приготовьте стрептавидин биотин-пероксидаза сложный, по крайней мере за 30 минут до использования. Убедитесь в том, что есть достаточно, чтобы охватить все слайды. Вымойте слайды в TBS три раза. Нанесите раствор на слайдах и инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре.
- Вымойте слайды в TBS три раза. Приготовьте 3-амино-9-ethylcarbazole (AEC) раствора субстрата пероксидазы (сделано в соответствии с инструкциями завода-изготовителя). Применить его к слайдам и инкубировать в течение 20-30 мин или до желаемой интенсивности пятна развивается.
- Промыть слайды в проточной водопроводной воде в течение 5 мин. Контрастное секции раствором гематоксилином Майера фильтруется в течение 2 мин. Вымойте слайды в проточной водопроводной воде в течение 5 мин.
- Слить слайды и охватывают участки с постоянной водной монтажной среды. Высушить слайды при температуре 80 ° С в сушильной печи. Разрешить слайды остыть, а затем установить их с DPX и поместите покровное.
5. StAining Анализ
- Проанализировать секции при 40-кратном увеличении с помощью светового микроскопа с смонтированной камерой, подключенной к компьютеру.
Примечание: Для получения клеточного анализа, граф положительно окрашенных, ядросодержащих клеток в бронхиальном пластинке слизистой и неповрежденной эпителием, за исключением участков гладких мышц, желез, крупных кровеносных сосудов, а также несовпадением или поврежденной ткани. - Среднее значение на основании количества клеток и корректировать среднее число клеток в области собственной пластинке слизистой оболочки и длины эпителия. Площадь собственной пластинке слизистой оболочки и длины эпителия можно рассчитать с помощью программы анализа изображений.
6. ферментативным расщеплением Эндобронхиальная Биопсию
- Стиральные биопсий: С помощью стерильного пинцета, место интактные биопсий в 15 мл коническую пробирку , содержащую 10 мл Хенкса солевом буферном растворе (HBSS) (рисунок 3). Выдержите в течение 5 мин при комнатной температуре на ротационном платформе при 30 оборотах в минуту. Передача биопсий в стерильную DМОГ декантацией содержание 15 мл пробирку с HBSS.
- Срыв мокроту с DTT: Заменить HBSS в пробирку с 10 мл HBSS, содержащем 5 мМ 1,4-дитиотреитола (DTT). Передача биопсий обратно в 15 мл пробирку с помощью стерильного пинцета. Инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре на ротационном платформе при 30 оборотах в минуту.
- Vortex трубку осторожно в течение 15 сек. Перенесите биопсий на стерильную блюдо декантацией содержание 15 мл пробирку с HBSS и DTT.
- Перенос биопсий в культуральную среду: Заменить HBSS и DTT в пробирку с 10 мл среды RPMI 1640 культуральной среды. Передача биопсий обратно в 15 мл пробирку с помощью стерильного пинцета. Инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре на ротационном платформе при 30 оборотах в минуту.
- Переваривание биопсию с коллагеназой и ДНКазой.
- Приготовьте переваривания раствор коллагеназы II (0,25 мг / мл) и ДНКазы (0,2 мг / мл) в предварительно нагретую RPMI, содержащего 1 М раствора HEPES. Добавить 500 мкл раствора сбраживания на лунку в культе ткани 48-луночногоЮр пластины.
- Поместите 1 биопсию на лунку в пищеварении растворе. Инкубируют планшет на качалке платформу в течение 60 мин при 37 ° C при 220 оборотах в минуту. Пипетка вверх и вниз, после того, как 30 мин до повторного диспергирования биопсий, и через 60 мин, чтобы полностью детализировать ткани.
- Подготовка одноклеточных суспензий.
- Бассейн вместе переваренные биопсий лунки в 50 мл пробирку, пропуская его через сито 40 клеток мкм. Собрать оставшиеся клетки путем промывки лунок с охлажденным льдом буфером FACS (фосфатный буферный солевой раствор (PBS), содержащем 2% фетальной бычьей сыворотки).
- Сожмите оставшиеся ткани на ситечко клеток с использованием задней части плунжера шприца. Центрифуга переваренные клетки при 400 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Осторожно удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 5 мл охлажденного льдом буфера FACS. Подсчитайте клетки вручную с помощью гемоцитометра и трипановым синим пятном для оценки жизнеспособности клеток.
- Ресуспендируют осадок клеток приблизительно 1 × 10 6 клеток в 200 мкл буфера FACS.
- Добавьте жизнеспособность клеток краситель для исключения мертвой ячейки в соответствии с протоколом производителя.
- Добавьте 5 мкл блокирующего реагента FcR и инкубировать в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
- Добавить клеточной поверхности антитела против CD45 (2 мкл), линии (CD3, CD20, CD56, CD66abce и CD14, 2 мкл каждого), CD16 (0,5 мкл), HLA-DR (3 мкл), CD11c (5 мкл), CD123 (5 мкл), CD1c (3 мкл) и CD103 (2 мкл) и инкубировали в течение 15 мин при температуре 4 ° С. Более подробная информация о антител можно найти в разделе методов, но титруют и оптимизации антител к точному проточного цитометра в использовании. Смыть избыток антител с PBS в течение 5 мин при 400 х г. Приобретать образцы свежей на проточном цитометре или фиксации клеток в 1% параформальдегидом до поздней acquisitиона.
- Идентификация человека контроллеры домена в биопсий легких с использованием проточной цитометрии анализа 18 (рисунок 4).
Примечание: С помощью проточной цитометрии программного обеспечения для анализа, иммунные клетки отличаются от других легочных клеток путем стробирования на CD45. Мертвые клетки могут быть исключены как клетки, которые являются положительными для LIVE / DEAD красителя. Из всех живых CD45 + клеток, линии дифференцировки клеток (В - клетки, Т - клетки, NK - клетки, нейтрофилы и моноциты) могут быть исключены с помощью коктейль из антител против CD20, CD3, CD56, CD14, CD66abce и CD16 в одном канале. После этого, HLA-DR + клетки позволит идентифицировать человека всех контроллеров домена. MDCs можно отличить от контроллерах PDC на основе экспрессии CD11c или отсутствие CD11c, соответственно. MDCs можно дополнительно разделить на CD1c + MDCs или CD141 +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Исследования, характеризующие дыхательные иммунные клетки человеческой ткани-резидентов, включая контроллеры домена, ограничены, в основном из-за того, что хирургическим путем удаляется или вся ткань легких человека не хватает. При этом, менее инвазивный метод получения ткани легкого от эндобронхиальные биопсий (EBB) здоровых добровольцев и разработанных протоколов для изучения иммунных клеток в ткани с помощью иммуногистохимии или проточной цитометрии описаны.
Здоровые добровольцы подверглись бронхоскопии, как было описано выше 19, 20. От шести до девяти 1-2 мм 3 эндобронхиальные слизистых оболочек биопсии были взяты из основного киля и основных бронхиальных подразделений каждого субъекта с использованием Фенестрированные пинцетом (Рис . 1А) Два биопсий были встроены в ГМА и впоследствии используется для иммуногистохимии, чтобы обеспечить пространственную информацию. Оставшиеся biopsiэс были ферментативно переваривается, и одноклеточные суспензии анализировали с использованием многоцветной проточной цитометрии, что позволило осторожного характеристику редких подмножеств клеток (рис 1В).
Для того, чтобы получить как можно больше пространственной информации , как это возможно из маленьких кусочков ткани, биопсии были встроены в ГМА , что позволяет мкм ультратонкие срезы (рис 2A-B). Как и ожидалось, клетки иммунной системы CD45-экспрессирующих были сравнительно редки, в среднем, 125 CD45 + клеток на мм 2 присутствовали в слизистой ткани легких во время стационарных условиях, как определено с помощью иммуногистохимии (фиг.2с). Контроль изотип IgG1 не приводило к положительным окрашиванием, что указывает на высокую специфичность первичного антитела. Число положительных клеток как эпителия легких и нижележащей собственной пластинке слизистой оболочки были определены количественно , и показали , что CD45 + клетки иммунной системы были более многочисленны в Лос - АнджелесеMina Propria , чем в эпителии (рис 2D). Кроме того, CD1a-экспрессирующие клетки были идентифицированы и перечислены, и они , скорее всего , представляют собой контроллеры домена (Рисунок 2E). В среднем менее одного CD1a + клеток на мм 2 был идентифицирован в пластинкой легких слизистой в стационарном состоянии (рис 2F).
Иммуногистохимия предоставляет информацию о анатомического распределения клеток в интактной ткани, но это, как правило, ограничен в своей способности определять клетки с использованием нескольких маркеров клеточной поверхности. Многоцветный проточной цитометрии, в зависимости от инструмента, имеет преимущество предоставления дополнительной информации в клетку, и он может быть использован в небольших образцах. До девяти слизистых оболочек легких биопсии, собирали, промывали и инкубировали, чтобы разрушить слизи. Каждая биопсия была затем расщепляли коллагеназой и ДНКазой в отдельные лунки 48 луночного планшета, в результате чего в одной клеточной суспензии (Figures 3A - 3B). В среднем, 1,5 х 10 6 клеток на эндобронхиальные субъекта были получены, и положительная корреляция между выходом клеток и жизнеспособность наблюдалось (рис 3C). Пониженная жизнеспособность клеток наблюдается с меньшим количеством клеток потенциально может быть объяснено более высокой концентрации фермента на клетку, которая была неоптимальным для клеток. Это вызов с биопсий различной как по размеру, так и в клеточной плотности, с некоторыми биопсий выборки более поверхностной слизистой оболочки, чем другие. Как и следовало ожидать, поток цитометрии анализ одной клеточной суспензии показало , что, в среднем, 12% клеток были CD45 + лейкоциты, в то время как большинство клеток в ткани слизистой оболочки легких в стационарных условиях не были иммунные клетки (рис 3D ). Цитометрии потока и данные IHC коррелировали, что подчеркивает силу применения обоих методов параллельно.
+ лейкоциты, выражающее HLA-DR , но были отрицательными для маркеров CD3 линии дифференцировки, CD20, CD56, CD66abce, CD14 и CD16 (Рисунок 4A). В этой небольшой популяции клеток, плазмоцитов РС (PDCs) были определены на основании их отсутствия экспрессии CD11c и их высокой экспрессии CD123 и HLA-DR (ТЭА). Среди CD11c + HLA-DR + LINEAGE-негативных клеток, как CD1c + (коралловый) и CD141 + (темно - бордовый) были идентифицированы миелоидных ДК (рис 4A). Для дальнейшей характеристики этих клеточных подмножеств, их экспрессию интегрина CD10 3, который связывается с Е-кадгерина, важной в анкеровки ткани, оценивали. В то время как все подмножества постоянного тока, а также Т-клетки, циркулирующие в периферической крови, были низкими или отрицательными для CD103, отчетливо выраженным часть клеток ДТС и Т, найденных в легких и того же индивидуума выражается CD103. Это было верно клеток , обнаруженных как в бронхоальвеолярного лаважа, а также в легочной ткани (фиг.4В).
Рисунок 1: Отбор проб ткани слизистой оболочки легких человека. (A) Bronchoscopies были проведены по предметам , чтобы получить эндобронхиальных биопсию из главных бронхиальных подразделений одного легкого с помощью щипцов. (B) Биопсия либо были встроены в ГМА для секционирования ткани и иммуногистохимии (синий график) или ферментативно расщепляют для получения одноклеточных суспензий для проточной цитометрии (розовый диаграммы).м / файлы / ftp_upload / 55222 / 55222fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Встраивание биопсию ГМА смолы. (А) Биопсии, взятые из bronchoscopies немедленно переносили в стеклянные флаконы, содержащие ледяной обезвоженного ацетона (левая панель). После фиксации в течение ночи, биопсии были пропитаны раствором метил бензоата. Биопсия были помещены в капсулы вложения, заполненных встраивание раствора для начала полимеризации (средняя панель). Встроенные биопсий можно хранить при температуре -20 ° С или может быть секционного для иммуногистохимического окрашивания (правая панель). (B) Принципиальные выдвигает на первый план ключевые шаги в процессе вложения биопсий с использованием ГМА. Типичные изображения секционного биопсий , показывающие наличие CD45 + (С) или CD1a + клетки (Е) показаны в сравнении с соответствующими изотипных управления (правая панели). Специфическое окрашивание отображается красным цветом, а ядра клеток контрастно гематоксилином в синий цвет. Шкала бар = 50 мкм. Гистограммы показывают медиану ± диапазон межквартильного от CD45 + (D) или CD1a + (F) клеток на мм 2 в эпителии или собственной пластинке слизистой оболочки (п = 20). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Ферментативное переваривание биопсий для проточной цитометрии. (А) эндобронхиальная биопсия взята из бронхоскопии в чашке Петри. Биопсия промывали в HBSS, обрабатывают DTT для удаления слизи, А.Н.d переваривают коллагеназы и ДНКазы до сбора отдельных клеток для анализа потока цитометрии. (Б) Схематическое суммирует основные процедуры для переваривания биопсий для проточной цитометрии. (С) На графике показана корреляция с выходом клеток и жизнеспособности, как оценено с помощью ручного подсчета и трипанового синего (n = 20). (D) Одноклеточные суспензии из расщепленной биопсии были проанализированы с помощью проточной цитометрии и оценивали жизнеспособность и экспрессию CD45 (лейкоцитарный общего антигена). Проточной цитометрии участка показан один представительный донор из 20 здоровых субъектов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Идентификация легких дендритных клеток подмножеств в переваренной бiopsies. (А) стратегия Gating для идентификации CD1c + и CD141 + миелоидных ДК (Главгосслужбы) и плазмоцитов (ГЦ PDCs) в слизистую оболочку легких тканей. Проточной цитометрии участков одного из представителей субъекта показаны. (Б) точечные графики показывают экспрессию интегрина CD103 на популяции ГЦ в биопсий легких (левая панель), бронхоальвеолярного лаважа (средняя панель), а также периферической крови (правая панель). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В данной статье описывается, как создавать подробные пространственные и фенотипическую характеристику легочных тканей РС-резидентов у здоровых людей с помощью иммуногистохимии и проточной цитометрии на эндобронхиальные слизистых оболочек биопсий, собранных во время бронхоскопии. В следующих пунктах критические шаги в протоколе подробно обсуждаются.
Критические шаги с Протоколом
Секционирование и иммуногистохимия: Очень важно, чтобы держать блоки биопсии при -20 ° C, если не используется их (шаг 2.5). Теплые блоки могут иногда становятся мягкими и не будет раздел, а также. Кроме того, сохранение блоков при -20 & deg; С, будет сохранять антигенные сайты и приводить к лучшему окрашиванию с помощью иммуногистохимии.
Секционирование и иммуногистохимия: Когда секционирования ГМА внедренных биопсий, удобно иметь 3-4 контейнеров аммиачной воды, доступные плавать секции дальше. Когда секция подобран, маке обязательно заменить его свежим секции (шаг 3.4). Это гарантирует, что к тому времени, что раздел обрабатывается снова, он будет плавали на воде аммиака в течение приблизительно правильной длины времени (45-90 сек), который помогает в презентации антигена и последующего иммуногистохимии. Режущие участки 2 мкм таким образом также позволяет последовательного секционирования, что означает, что та же клетка потенциально может быть окрашены с различной клеточной поверхности или внутриклеточных маркеров. Важно, чтобы не коснуться режущей кромки стекла лезвия, когда секционирования, так как она легко повреждается. Если есть какие-либо мусор от лезвия, который должен быть удален, всегда смахнуть от режущей кромки.
Ферментативный пищеварения и проточной цитометрии: В образцах ткани, где иммунные клетки являются редкими, очень важно, чтобы включить CD45 на панели окрашивания потока сначала идентифицировать лейкоциты (в меньшинстве) перед дальнейшей идентификации РС или других иммунных клеток, представляющих интерес. Кроме того, "еluorescence минус один "или изотипные управления имеют решающее значение для включения при проверке панели антител, используемых для обеспечения того, чтобы редкие события истинный сигнал над шумом.
Модификации и устранение неисправностей
Секционирование и иммуногистохимии: Для большинства клеточных маркеров, выраженных иммунными клетками, миндалины ткани могут быть использованы в качестве хорошего положительного контроля и титровать антитела для иммуногистохимии, с тем, чтобы избежать потери материала, ограниченного эндобронхиальную биопсии (этап 4). Для визуализации дендритных процессов ГЦ, ткани могут быть секционного параллельно эпителием, а не перпендикулярно через слизистую оболочку 21. Другие пероксидаза подложки могут быть использованы в дополнение к AEC, таких как DAB, если пользователь требует другого цвета подложки. Ферментного комплекса авидин / биотин также могут быть замещены, например, с щелочной фосфатазы.
Ферментативный пищеварения и проточной цитометрии: Несмотря на то, в концеobronchial биопсий маленькие, тканевые клетки-резидентов пережить ферментативного расщепления и переработки в суспензии одноклеточных для анализа проточной цитометрии (Рисунок 3). Тем не менее, важно оценить потенциальное воздействие ферментов на пятна, используемых в проточной цитометрии панели антител. Чтобы проверить, являются ли расщепляет протокол ферментативное переваривание выключен, не изменяет, не мешает меченых антител, более легко доступные клетки, экспрессирующие подобные маркеры, такие как мононуклеарных клеток периферической крови, можно лечить с помощью пищеварительных ферментов (стадия 6), или нет, и они может впоследствии окрашивали флуоресцентно меченными антителами и анализировали с помощью проточной цитометрии (этап 7). Если коллагеназа и ДНКазой не мешают наличия антигена, пятна с добавлением или без обработки клеток с ферментами, должны выглядеть следующим образом. Кроме того, это может быть проверено с помощью проточной цитометрии , как, а также нетронутыми срезы ткани и иммуногистохимии (Fi2 фигуры - 3) 19.
Ограничения техники
Бронхоскопия: Большинство здоровых людей переносят бронхоскопию хорошо, и это метод обычно используется для изучения и образцов легких, в том числе для сбора эндобронхиальных слизистых оболочек биопсий, как описано здесь (шаг 1). Тем не менее, бронхоскопии, как правило, не является подходящим способом для выполнения для продольной выборки, так как она часто воспринимается как неудобно, и это также затрат времени и ресурсов требуют процедуры. Поэтому эндобронхиальные биопсий обеспечивают только снимок иммунных клеток, присутствующих в ткани слизистых оболочек легких в данный момент времени, а не долгосрочное исследование изменений в динамике или кинетики.
Значимость техники в отношении существующих / альтернативных методов
Секционирование и иммуногистохимия: Преимущество встраивания в ГМА, а не парафина или криоконсервацииявляется высшим сохранение морфологии и антигенов, а также большего числа секций из небольших биопсий, из - за тонких срезов , которые можно получить 17.
Ферментативное переваривание и проточной цитометрии. Получая одиночных клеток из небольших биопсий, гораздо больше информации может быть достигнута с помощью многоцветной проточной цитометрии.
Будущие приложения или направления после освоения этой техники
Этот протокол, описанный два параллельных методов для максимизации информации, которую можно получить из небольших эндобронхиальные биопсий путем объединения иммуногистохимии и проточной цитометрии. Для того, чтобы охарактеризовать пространственное распределение редких иммунных клеток, таких как контроллеры домена, биоптаты могут быть встроены в ГМА для получения тонких срезов для иммуногистохимического анализа, в то время как отличить контроллеры домена от других иммунных клеток с подобными маркерами, ферментативное переваривание биопсий позволяет многоцветной проточной цитометрии быть реrformed. Чтобы включить несмещенной идентификации новых характеристик ГЦ во время воспаления или заболевания, автоматизированный анализ данных проточной цитометрии могут быть выполнены путем применения алгоритмов 22 выделения признаков. Будущие приложения включают в себя использование этих отдельных клеток для сортировки клеток для сбора конкретных клеточных популяций, которые могут быть использованы для РНК-последовательности или транскриптомных профилирования. Идентификация контроллеров домена, проживающих в легких может иметь важное значение для понимания изменений в иммунной ландшафта во время здоровья и болезни.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить волонтеров, которые внесли свой вклад клинический материал для исследования. Мы также признательны сотрудникам кафедры общественного здравоохранения и клинической медицины, Отдел медицины / респираторной медицины, университетской больницы, Умео (Norrlands universitetssjukhus) для сбора всех клинического материала.
Эта работа была выполнена при поддержке грантов для AS-S от Шведского исследовательского совета, шведского фонда Heart-Lung, Фонд шведского стратегических исследований и Каролинского института.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bronchoscopy | |||
| Bronchoscope BF1T160 | Olympus | BF1T160 | |
| Light source | Olympus | Exera CV-160 | |
| Fenestrated forceps | Olympus | FB21C | Used to take biopsies |
| Bite Block | Conmed | 1429 | 20 mm x 27 mm |
| Glucose 25% | 500 ml intravenous | ||
| Glycopyrronium bromide 0.2 mg/ml | Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion | ||
| Mixt. Midazolam 1 mg/ml p.o | Can be used for extra relaxation | ||
| Lidocaine, 40 mg/ml | Mouth and throat administration / Gargled | ||
| Lidocaine 100 mg/ml spray | Administered to back of throat | ||
| Lidocaine 20 mg/ml spray | Administered via bronchoscope to airways | ||
| GMA processing and embedding | |||
| Glass vials | 5 ml | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-1L | |
| Molecular sieves, 4 Å | Alfa Aesar | 88120 | 3-4 mm diameter pellets |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P-7626 | 0.035 g/100 ml acetone |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I-6125 | 0.37 g/100 ml acetone |
| Polythene-flat TAAB embedding capsules | TAAB laboratories | C094 | 500x 8 mm diameter, polythene, flat-bottom capsules |
| Capsule holder | TAAB laboratories | C054 | Holds 25 8 mm capsules |
| JB-4 GMA embedding kit | Polysciences | 00226 | Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12) |
| Methyl benzoate | Sigma-Aldrich | 27614-1L | |
| Silica gel with humidity indicator | Scharlau | GE0043 | 2.5-6 mm |
| GMA sectioning | |||
| Glass microscope slides | ThermoFisher Scientific | 10143562CEF | Cut edges, frosted end |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920-500mL | 1:10 for working solution |
| Sheet glass strips for ultramicrotomy | Alkar | ||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Wash solution (0.1% Tween20) |
| LKB 7800B Knifemaker | LKB | ||
| Capsule splitter | TAAB laboratories | C065 | |
| Carbon steel single edge blades | TAAB laboratories | B054 | |
| Vice | |||
| Ammonia, 25% | VWR | 1133.1000 | 2 ml in 1 L, 1:500 (0.05%) |
| Microtome | Leica | Leica RM 2165 | |
| Light source | Leica | Leica CLS 150 XE | |
| Microscope with swing arm stand | Leica | Leica MZ6 | |
| GMA Immunohistochemistry | |||
| Diamond tipped pen | Histolab | 5218 | |
| Hydrogen peroxide 30% solution | AnalaR Normapur | 23619.264 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Tris | Roche | 10708976001 | |
| Sodium chloride | VWR chemicals | 27810.295 | |
| Bovine serum albumin | Millipore | 82-045-2 | Probumin BSA diagnostic grade |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Anti-human CD45 antibody | BioLegend | 304002 | Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml |
| Anti-human CD1a antibody | AbD Serotech | MCA80GA | Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml |
| Mouse monoclonal IgG1 isotype control | Abcam | ab27479 | |
| Mouse monoclonal IgG2a isotype control | Dako | X094301-2 | |
| Vectastain ABC Elite standard kit | Vector Labs | PK-6100 | |
| AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite | Vector Labs | SK-4200 | |
| Mayers haematoxylin | HistoLab | 01820 | |
| Permanent Aqueous Mounting Medium | AbD Serotech | BUF058C | |
| Drying oven | |||
| DPX permanent mounting solution | VWR | 360292F | |
| Light microscope | Leica | Leica DMLB | |
| Microscope camera | Leica | Leica DFC 320 | |
| Analysis software | Leica | Leica Qwin V3 | |
| Enzymatic digestion | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | 55021C | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Forceps | |||
| Platform rocker | Grant instruments | PMR-30 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 14-432-22 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Flow cytometry | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit | Life Technologies | L34957 | |
| CD45 | BD | 555485 | |
| CD3 | BD | 557757 | |
| CD20 | BD | 335829 | |
| CD56 | Biolegend | 318332 | |
| CD66abce | Miltenyi | 130-101-132 | |
| HLA-DR | BD | 555813 | |
| CD14 | BD | 557831 | |
| CD16 | Biolegend | 302026 | |
| CD11c | BD | 560369 | |
| CD1c | Miltenyi | 130-098-009 | |
| CD141 | Miltenyi | 130-090-514 | |
| CD103 | Biolegend | 350212 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| LSR II Flow cytometer | BD | Flow cytometer | |
| FlowJo | FlowJo | Software for analysis | |
References
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
- Condon, T. V., Sawyer, R. T., Fenton, M. J., Riches, D. W. Lung dendritic cells at the innate-adaptive immune interface. J Leukoc Biol. 90 (5), 883-895 (2011).
- Lambrecht, B. N., Hammad, H. Biology of lung dendritic cells at the origin of asthma. Immunity. 31 (3), 412-424 (2009).
- Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
- Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).
- Demedts, I. K., Brusselle, G. G., Vermaelen, K. Y., Pauwels, R. A. Identification and characterization of human pulmonary dendritic cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 32 (3), 177-184 (2005).
- Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D. Identification rare-event detection and analysis of dendritic cell subsets in broncho-alveolar lavage fluid and peripheral blood by flow cytometry. Front Biosci. 8, s1175-s1180 (2003).
- Masten, B. J., et al. Characterization of myeloid and plasmacytoid dendritic cells in human lung. J Immunol. 177 (11), 7784-7793 (2006).
- Ten Berge, B., et al. A novel method for isolating dendritic cells from human bronchoalveolar lavage fluid. J Immunol Methods. 351 (1-2), 13-23 (2009).
- Yu, C. I., et al. Human CD1c+ dendritic cells drive the differentiation of CD103+ CD8+ mucosal effector T cells via the cytokine TGF-beta. Immunity. 38 (4), 818-830 (2013).
- Nicod, L. P., Lipscomb, M. F., Toews, G. B., Weissler, J. C. Separation of potent and poorly functional human lung accessory cells based on autofluorescence. J Leukoc Biol. 45 (5), 458-465 (1989).
- Sertl, K., et al. Dendritic cells with antigen-presenting capability reside in airway epithelium, lung parenchyma, and visceral pleura. J Exp Med. 163 (2), 436-451 (1986).
- van Haarst, J. M., de Wit, H. J., Drexhage, H. A., Hoogsteden, H. C. Distribution and immunophenotype of mononuclear phagocytes and dendritic cells in the human lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 10 (5), 487-492 (1994).
- Schlitzer, A., et al. IRF4 transcription factor-dependent CD11b+ dendritic cells in human and mouse control mucosal IL-17 cytokine responses. Immunity. 38 (5), 970-983 (2013).
- Yu, Y. A., et al. Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).
- Haniffa, M., et al. Human tissues contain CD141hi cross-presenting dendritic cells with functional homology to mouse CD103+ nonlymphoid dendritic cells. Immunity. 37 (1), 60-73 (2012).
- Britten, K. M., Howarth, P. H., Roche, W. R. Immunohistochemistry on resin sections: a comparison of resin embedding techniques for small mucosal biopsies. Biotech Histochem. 68 (5), 271-280 (1993).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
- Baharom, F., et al. Dendritic Cells and Monocytes with Distinct Inflammatory Responses Reside in Lung Mucosa of Healthy Humans. J Immunol. 196 (11), 4498-4509 (2016).
- Salvi, S., et al. Acute inflammatory responses in the airways and peripheral blood after short-term exposure to diesel exhaust in healthy human volunteers. Am J Respir Crit Care Med. 159 (3), 702-709 (1999).
- Schon-Hegrad, M. A., Oliver, J., McMenamin, P. G., Holt, P. G. Studies on the density, distribution, and surface phenotype of intraepithelial class II major histocompatibility complex antigen (Ia)-bearing dendritic cells (DC) in the conducting airways. J Exp Med. 173 (6), 1345-1356 (1991).
- Saeys, Y., Gassen, S. V., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nat Rev Immunol. 16 (7), 449-462 (2016).
