Introduction
Los pulmones están en contacto continuo con el medio externo y están muy expuestas a ambas partículas inofensivas y microbios con la capacidad de causar la enfermedad. Por lo tanto, es crítico para el sistema inmune para montar respuestas inmunes potentes contra los patógenos invasores, pero es igualmente importante para mantener la tolerancia a los antígenos inhalados que no causan enfermedad. Para proporcionar la vigilancia inmune potente, el sistema respiratorio se alinea con una red de células inmunes, incluyendo células dendríticas (DC). DC son células presentadoras de antígeno profesionales con la capacidad única de activar las células T vírgenes. En los pulmones humanos, DCs residentes encuentran un antígeno y entonces el proceso y lo transportan a los ganglios linfáticos pulmonares de drenaje para su presentación a y activación de células T 1, 2, 3.
En el sistema inmune humano, los DC se puede dividir en varios subconjuntos, con Distinct pero superpuestas funciones: CD1c + y CD141 + DC mieloides (PMD) y CD123 + plasmacytoid países en desarrollo (PDC) 4, 5. Mientras que la mayoría conocimiento detallado en países en desarrollo humano se deriva de estudios en la sangre, es ahora evidente que los pulmones humanos también albergan poblaciones raras de subconjuntos de DC con las células T capacidad estimuladora 6, 7, 8, 9. Sin embargo, la acumulación de datos muestran que las células inmunes, incluyendo países en desarrollo, difieren en su frecuencia, fenotipo y función dependiendo de su ubicación anatómica 10. Por lo tanto, es importante para estudiar las células inmunes del tejido relevante para entender su contribución a la inmunidad local y la tolerancia. En conjunto, esto pone de relieve la necesidad de estudiar las CD pulmonares residente hora de abordar las enfermedades pulmonares, a pesar de ser más fácilmente disponible y accesible sangre países en desarrollo en humanos.
Los primeros estudios que investigaron las CD pulmonares residente en el ser humano se basó principalmente en la morfología y la expresión de marcadores individuales, tales como HLA-DR y CD11c, en secciones de tejido mediante inmunohistoquímica 11, 12, 13. Por el contrario, los estudios más recientes se han basado generalmente en los análisis de citometría de flujo para estudiar diferentes subconjuntos de células inmunes. Sin embargo, ya que es difícil encontrar un solo marcador de la superficie celular que identifica de forma única un subconjunto específico de CC, la limitación potencial de los estudios aplicando citometría de flujo de cuatro colores solamente es el riesgo de incluir poblaciones de células con marcadores fenotípicos similares a los de los países en desarrollo. Por ejemplo, CD11c se expresa en todos los DC mieloides y la gran mayoría de los monocitos. Por otro lado, en los estudios de la aplicación de los paneles de citometría de flujo más avanzados, el tejido pulmonar no canceroso de resecciones quirúrgicas de los pacientes se usa típicamentexref "> 10, 14, 15, 16, aunque no está claro si estas poblaciones raras son verdaderamente representativa de los DC presente en los sujetos sanos. En general, los estudios se limitan en gran parte debido al hecho de que quirúrgicamente eliminado o tejido pulmonar humano completo es escasa.
Para superar algunas de estas limitaciones, este trabajo describe cómo realizar un análisis detallado de la distribución espacial y una identificación fenotípica de los países en desarrollo en las biopsias de mucosa de la mucosa obtenidas de voluntarios sanos que se someten a una broncoscopia. Varios biopsias pequeñas se pueden recoger de cada individuo y, posteriormente, se pueden incorporar para seccionar y el análisis mediante inmunohistoquímica o enzimáticamente digerido para el análisis avanzado de citometría de flujo. El uso de tejido pulmonar en la forma de la biopsia endobronquial obtenidos de broncoscopias confiere la ventaja de hacer posible la realización de la study en voluntarios sanos, a diferencia de la cirugía abierta de los pulmones que, por razones obvias, se limita a los pacientes que requieren cirugía torácica. Además, el tejido que se muestrea durante una broncoscopia de voluntarios sanos es fisiológicamente normal, en contraste con un área no afectada del tejido pulmonar en pacientes con una enfermedad pulmonar. Por otro lado, las biopsias son pequeñas y el número de células recuperadas, incluso cuando la agrupación de varias biopsias, limita el tipo de análisis que se pueden realizar.
Mientras que el presente trabajo se centra en los países en desarrollo, los métodos descritos se puede ampliar directamente a incluyen otras células (inmunes) de interés que residen en el tejido de la mucosa de pulmón humano. Además, los protocolos son también directamente aplicables a muestras obtenidas de pacientes que padecen enfermedades pulmonares donde broncoscopia es parte de establecer el diagnóstico, tales como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), sarcoidosis, o cáncer de pulmón.
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Protocol
NOTA: Esta investigación fue aprobado por la Junta de Revisión Ética regional en Umea, Suecia.
1. La broncoscopia para el muestreo endobronquial biopsias de sujetos humanos
- Obtener el consentimiento informado de todos los participantes.
- El tratamiento de sujetos con midazolam oral (4-8 mg) y glicopirronio intravenosa (0,2 a 04 mg) 30 minutos antes de la broncoscopia. Aplicar anestesia tópica con lidocaína en la laringe y bronquios. Dejar que el haga gárgaras con objeto ~ 3 ml de lidocaína al 4% y se aplican 3 ml de la base de la lengua y de la laringe a través de una jeringa laringe. Optimizar la anestesia tópica con 8-10 dosis de lidocaína en aerosol. Llevar a cabo este paso con el objeto de estar.
- Inserte un broncoscopio flexible de vídeo a través de la boca a través de una boquilla de plástico con el sujeto en posición supina. Utilizar un catéter de pulverización a tales efectos para completar la anestesia tópica de la tráquea y los bronquios distales a través del broncoscopio. Aquí, utilizar una dosis de aproximadamente5-10 ml de lidocaína al 2%.
- Tome 6-9 biopsias de la mucosa endobronquiales de la carina principal y las principales divisiones bronquiales utilizando fórceps fenestrada (Figura 1). Tras la broncoscopia y antes de abandonar el hospital, dejar que el resto sujeto durante 2-4 horas y proveer él / ella con una comida ligera.
2. Incorporación de las biopsias en glicol metacrilato (GMA) Resina
NOTA: El protocolo inmunotinción GMA fue desarrollado originalmente en la Universidad de Southampton, Unidad de Investigación histoquímica 17.
- Fijación: Para la inmunohistoquímica, retire las biopsias de las pinzas y colocarlos directamente en viales de vidrio que contienen 3 ml de inhibidores de la acetona y la proteasa deshidratados enfriado con hielo (fluoruro de fenilmetilsulfonilo (35 mg / 100 ml de acetona) y yodoacetamida (370 mg / 100 ml de acetona )). Fijar el tejido durante la noche a -20 ° C (Figura 2).
NOTA: Los siguientes pasos deben ser performó en una campana extractora con guantes de nitrilo apropiado. El kit de incrustación contiene componentes que pueden causar reacciones de sensibilización, irritación y / o de la piel alérgica. Todos los residuos deben eliminarse como residuos peligrosos. - Deshidratación: eliminar la acetona con inhibidores y reemplazar con acetona deshidratada fresco (sin inhibidores) durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT). Eliminar la acetona y reemplazarlo con benzoato de metilo durante 15 minutos.
- Infiltración: Preparar una solución de procesamiento de la solución de benzoato de metilo 5% en monómero de metacrilato de glicol; 10 ml es suficiente para un vial. El uso de pipetas Pasteur de plástico, de aspiración de la solución de benzoato de metilo y reemplazar con 3 ml de solución de procesamiento. Incubar las biopsias y solución de procesamiento en exceso a 4 ° C durante 2 horas; pipetas Pasteur se pueden utilizar para todos los cambios de soluciones posteriores, incluyendo la solución de inclusión.
- Intercambiar la solución de procesamiento de cada 2 horas (3 x 2 incubaciones hr), por lo que el tiempo total de la infiltración de la biopsies en la solución de elaboración es de al menos 6 horas. Insertar etiquetas de papel en el extremo superior de las cápsulas de incrustación para identificar las biopsias.
- Preparar una solución de incrustación de peróxido de benzoilo 75 mg en 10 ml de monómero de metacrilato de glicol. Añadir 0,25 ml de N, N dimetilanilina poli (óxido de etileno) (acelerador) a la solución de incrustación para comenzar la reacción de polimerización. Eliminar la solución de procesamiento y coloque una biopsia en la cápsula incrustación relevante el uso de fórceps.
- llenar lentamente la incorporación de la cápsula en la parte superior con una solución de la incrustación y cerrar la tapa. Evitar molestar a la biopsia y la creación de grandes burbujas de aire. Incubar las cápsulas a 4 ° C hasta que la resina se ha polimerizado por completo.
- Almacenar las biopsias incorporados a -20 ° C en un tubo de 50 ml que contenía aproximadamente 5 g de gel de sílice.
3. La sección del biopsia endobronquial incrustados-GMA
- recubrimiento del portaobjetos del microscopio: Lavar los portaobjetos de microscopio en unalavavajillas en un ciclo normal. Tapar los portaobjetos y dejar que se sequen al aire.
- Preparar una solución de recubrimiento de la solución de 10% de poli-L-lisina (PLL) en agua destilada. Sumergir los portaobjetos en solución de revestimiento durante 5 minutos, y luego dejar secar al aire. Almacenar diapositivas PLL recubiertos en seco en sus cajas originales.
- Lavar las tiras de vidrio de hoja con 0,1% de Tween 20 en agua destilada. Enjuague el vaso con 70% de etanol y secar con toallas de papel. Cortar láminas de vidrio de la tira de cristal utilizando un fabricante de cuchillos. Almacenar las cuchillas en un recipiente que impide el movimiento para asegurar que el borde de corte no se dañe o mellado.
- La biopsia de corte: Coloque la cápsula de biopsia en un divisor de la cápsula y reducir cada lado con una hoja de un solo filo de acero al carbono. Retire la biopsia incrustado-GMA y colocarlo firmemente en un tornillo de banco. Recorte el exceso de GMA de todo el biopsia utilizando la hoja de acero.
- seccionamiento GMA.
- Preparar una solución de amoniaco 0,05% con agua destilada. Coloque la cuchilla de vidrio y biopsia en THe microtomo. alinear cuidadosamente el bloque de biopsia con la hoja mediante el ajuste del soporte de la cuchilla y el ángulo del bloque de biopsia de modo que la cuchilla se apoya plana contra la superficie del bloque.
- Cortar 2 micras de grosor utilizando el microtomo en una velocidad de corte lento y el uso de fórceps para transferir y flotar las secciones en el agua amoniacal. Flotar las secciones de 45-90 seg, lo que permite la recuperación de antígenos suave y despliegue de la sección.
- Recoge secciones con portaobjetos de microscopio. Compruebe la histología de la biopsia mediante tinción con azul de toluidina rápidamente.
- Secar los portaobjetos en un conjunto de placa caliente a 50 ° C y aplicar 500 l de toluidina filtrado mancha azul a una sección usando una pipeta de plástico Pasteur. Se calienta la sección sobre la placa caliente hasta un anillo verde comienza a emerger en el borde de la mancha, y luego lavar con agua.
- El uso de un microscopio de luz, compruebe la histología de la biopsia. Secciones utilizados para inmunohistoquímica deben contener buenas zonas de la lámina sin dañospropia y el epitelio, con el menor número de glándulas y tan poco músculo liso como sea posible.
- Al igual que en la sección 3.4.2, cortar secciones que tienen buena histología y recogerlos con portaobjetos de microscopio recubiertos de PLL para la tinción inmunohistoquímica. Corte al menos dos secciones de cada biopsia para su análisis. secar los portaobjetos durante al menos 1 hora. Después del secado, las secciones pueden ser envueltos en papel de aluminio y se almacenaron a -20 ° C durante un máximo de 2 semanas, o pueden ser inmunoti~neron inmediatamente.
4. La tinción inmunohistoquímica de biopsias endobronquiales incrustados-GMA
NOTA: La azida sódica es tóxica. Preparar la solución de azida de sodio al 0,1% dentro de una campana de ventilación y lejos de ácidos. El contacto con ácidos libera gas tóxico.
- Dibujar alrededor de secciones usando un lápiz con punta de diamante y organizar las diapositivas sobre un estante de tinción.
- Cabo un bloqueo de la peroxidasa. Preparar una solución de bloqueo de peroxidasa de peróxido de hidrógeno 0,3% en solución de azida de sodio 0,1%. Apply 1 ml de la peroxidasa bloque con las secciones y se incuba durante 30 min.
- Preparar una solución de lavado de solución salina tamponada con Tris 0,05 M (TBS), pH 7,6. Se lavan los portas en TBS, 3x 5 min.
- Preparar una solución de bloqueo BSA 1% en DMEM. Haga esto con antelación y en volúmenes grandes, alícuota y congelarlo hasta que se necesite. Escurrir las diapositivas e incubar las secciones en solución de bloqueo durante 30 minutos para bloquear la unión no específica de anticuerpos. Si se sigue produciendo la unión inespecífica, incluir una etapa de incubación de 30 min con el bloque 5% de suero de la misma especie como el anticuerpo secundario.
- Diluir el anticuerpo primario (CD45 o CD1a) en TBS hasta la concentración deseada (CD45 diluido a 1: 1.000; CD1a diluido a 1: 1,00) y aplicarlo a las diapositivas. Cubreobjetos las secciones y se incuba durante la noche a RT.
- Lavar los portaobjetos en TBS tres veces. Diluir anticuerpo secundario biotinilado (dirigido contra la especie huésped anticuerpo primario, en este caso de conejo anti-ratón F (ab '2)) en TBS a la concentración deseada (1:300 dilución) y aplicarlo a las diapositivas. Incubar durante 2 horas a RT.
- Preparar una estreptavidina biotina-peroxidasa complejo al menos 30 min antes de su uso. Asegúrese de que no es suficiente para cubrir todas las diapositivas. Se lavan los portas en TBS tres veces. Aplicar la solución a los portaobjetos y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente.
- Se lavan los portas en TBS tres veces. Preparar 3-amino-9-etilcarbazol solución de sustrato de peroxidasa (AEC) (hecho por las instrucciones del fabricante). Aplicarlo a las diapositivas y se incuba durante 20-30 minutos o hasta que la intensidad de la mancha deseada desarrolla.
- Enjuague los portaobjetos en agua corriente del grifo durante 5 minutos. CONTRATINCIÓN las secciones con solución de hematoxilina de Mayer filtrada durante 2 min. Se lavan los portas en agua corriente durante 5 minutos.
- Escurrir las diapositivas y cubrir las secciones con medio de montaje acuoso permanente. Secar los portaobjetos a 80 ° C en un horno de secado. Deje que los portaobjetos se enfríen, y luego se montan con DPX y colocar un cubreobjetos.
5. StAnálisis aining
- Analizar las secciones a un aumento de 40X utilizando un microscopio de luz con una cámara montada conectado a un ordenador.
NOTA: Para el análisis celular, cuente con tinción positiva, las células nucleadas dentro de la lámina propia y el epitelio bronquial intacta, excluyendo las áreas de músculo liso, glándulas, vasos sanguíneos grandes, y el tejido no coinciden o dañado. - La media de los recuentos de células y corregir el recuento de células promedio para el área de la lámina propia y la longitud del epitelio. El área de la lámina propia y la longitud del epitelio se puede calcular utilizando un programa de análisis de imagen.
6. La digestión enzimática de las biopsias endobronquiales
- Biopsias de lavado: El uso de pinzas estériles, lugar biopsias intactas en un tubo cónico de 15 ml que contiene 10 ml de solución salina tamponada de Hank (HBSS) (Figura 3). Incubar durante 5 min a temperatura ambiente en una plataforma oscilante a 30 rpm. La transferencia de las biopsias a un d estérilish por decantación el contenido del tubo de 15 ml con HBSS.
- La interrupción de la mucosidad con TDT: Sustituir el HBSS en el tubo con 10 ml de HBSS conteniendo 5 mM de 1,4-ditiotreitol (DTT). La transferencia de las biopsias de nuevo en el tubo de 15 ml usando pinzas estériles. Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente en una plataforma oscilante a 30 rpm.
- Vortex el tubo suavemente durante 15 segundos. La transferencia de las biopsias en una placa estéril por decantación el contenido del tubo de 15 ml con HBSS y DTT.
- La transferencia de las biopsias al medio de cultivo: Sustituir el HBSS y TDT en el tubo con 10 ml de RPMI 1640 medio de cultivo. La transferencia de las biopsias de nuevo en el tubo de 15 ml usando pinzas estériles. Incubar durante 10 min a RT en una plataforma oscilante a 30 rpm.
- La digestión de las biopsias con colagenasa y DNasa.
- Preparar una solución de digestión de la colagenasa II (0,25 mg / ml) y ADNasa (0,2 mg / ml) en RPMI precalentado que contiene solución 1 M HEPES. Añadir 500 l de solución de digestión por pocillo en un culto de tejido de 48 pocillosplaca de Ure.
- Coloca 1 biopsia por pocillo en una solución de digestión. Se incuba la placa en una plataforma de agitación durante 60 minutos a 37 ° C a 220 rpm. Pipeta hacia arriba y abajo después de 30 minutos para volver a dispersar las biopsias, y después de 60 minutos, al desagregar por completo el tejido.
- Preparación de suspensiones de células individuales.
- Piscina juntos las biopsias digeridos de los pocillos en un tubo de 50 ml pasándolo a través de un filtro de células de 40 micras. Recoger las células restantes por lavado de los pocillos con tampón de FACS enfriado con hielo (solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía suero bovino fetal al 2%).
- Exprimir el tejido restante en el filtro de células usando la parte posterior del émbolo de una jeringa. Centrifugar las células digeridas a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Retirar con cuidado el sobrenadante y resuspender el precipitado en 5 ml de tampón FACS enfriado con hielo. Contar las células de forma manual utilizando un hemocitómetro y tinción de azul de tripán para evaluar la viabilidad de las células.
- Resuspender el sedimento celular a aproximadamente 1 x 10 6 células en 200 l de tampón de FACS.
- Añadir un colorante de viabilidad celular para la exclusión de células muertas de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Añadir 5 l de FcR reactivo de bloqueo y se incuba durante 5 min a 4 ° C.
- Añadir anticuerpos de superficie celular contra CD45 (2 l), el linaje (CD3, CD20, CD56, CD66abce, y CD14; 2 l cada una), CD16 (0,5 l), HLA-DR (3 l), CD11c (5 l), CD123 (5 l), CD1c (3 l), y CD103 (2 l) y se incuba durante 15 min a 4 ° C. Los detalles de anticuerpos se pueden encontrar en la sección de métodos, pero titulan y optimizar los anticuerpos para el flujo preciso citómetro en uso. Lavar el exceso de anticuerpos con PBS durante 5 minutos a 400 x g. Adquirir las nuevas muestras en un citómetro de flujo o fijar las células en paraformaldehído al 1% antes de la tarde acquisition.
- Identificar países en desarrollo humano en biopsias pulmonares utilizando un ensayo de citometría de flujo 18 (Figura 4).
NOTA: El uso de un software de análisis de citometría de flujo, las células inmunes se distinguen de otras células pulmonares colocando puertas de CD45. Las células muertas se pueden excluir como células que son positivas para el colorante LIVE / DEAD. De todos CD45 + células en vivo, las células de linaje (células B, células T, células NK, neutrófilos y monocitos) se puede excluir el uso de un cóctel de anticuerpos frente a CD20, CD3, CD56, CD66abce, CD14, y CD16 en un canal. Después de que las células, HLA-DR + permitirán la identificación de todos los países en desarrollo humano. MDC se pueden distinguir de PDC sobre la base de la expresión de CD11c o la falta de CD11c, respectivamente. MDC se pueden dividir en CD1c + MDC o CD141 +.
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Representative Results
Los estudios que caracterizan las células del tejido residente respiratorias humanas inmunes, incluyendo países en desarrollo, es limitado, debido en gran parte al hecho de que quirúrgicamente eliminado o tejido pulmonar humano completo es escasa. Aquí, un método menos invasivo para obtener tejido pulmonar a partir de biopsias endobronquiales (EBB) de voluntarios sanos y protocolos desarrollados para estudiar las células inmunes en los tejidos mediante inmunohistoquímica o citometría de flujo se describen.
Los voluntarios sanos fueron sometidos a broncoscopia, como se ha descrito previamente 19, 20. De seis a nueve de 1-2 mm 3 biopsias de la mucosa endobronquiales se tomaron de la carina principal y las principales divisiones bronquiales de cada sujeto utilizando pinzas fenestrada (Figura 1A). Dos biopsias fueron incorporados en la GMA y posteriormente utilizados para inmunohistoquímica para proporcionar información espacial. El restante biopsiES fueron digeridos enzimáticamente, y las suspensiones de una sola célula se analizaron usando múltiples colores citometría de flujo, lo que permitió una cuidadosa caracterización de subconjuntos de células raras (Figura 1B).
Para obtener toda la información espacial como sea posible de los pequeños trozos de tejido, las biopsias fueron incorporados en GMA que permite micras secciones ultrafinas (Figura 2A-B). Como era de esperar, las células inmunes CD45 que expresan eran relativamente raros en promedio, 125 CD45 + células por mm 2 estaban presentes en el tejido pulmonar de la mucosa durante condiciones de estado estacionario, tal como se evaluó por inmunohistoquímica (Figura 2C). El control de isotipo IgG1 no dio lugar a una tinción positiva, lo que indica una alta especificidad del anticuerpo primario. El número de células positivas tanto en el epitelio pulmonar y la lámina propia subyacente se cuantificó y mostró que las células CD45 + inmunes fueron más abundantes en el lamina propria que en el epitelio (figura 2D). Por otra parte, se identificaron las células que expresan CD1a y se enumeran, y que, probablemente, representan los países en desarrollo (Figura 2E). En promedio, menos de una célula de CD1a + por mm 2 se identificó en la lámina propia de pulmón en estado estacionario (Figura 2F).
La inmunohistoquímica proporciona información sobre la distribución anatómica de las células en el tejido intacto, pero típicamente está limitado en su capacidad para definir las células utilizando múltiples marcadores de la superficie celular. Multi-color de citometría de flujo, dependiendo del instrumento, tiene la ventaja de proporcionar más información por célula, y puede ser utilizado en muestras pequeñas. Hasta nueve biopsias de pulmón de la mucosa se combinaron, se lavaron, y se incubaron a interrumpir el moco. A continuación, cada biopsia fue digerido por colagenasa y ADNasa en pocillos individuales de una placa de pocillos 48, lo que resulta en una suspensión de una sola célula (Figures 3A - 3B). En promedio, se obtuvieron 1,5 x 10 6 células endobronquiales por sujeto, y no se observó una correlación positiva entre el rendimiento y la viabilidad celular (Figura 3C). La viabilidad celular reducida observada con el número de células más bajas potencialmente podría explicarse por una concentración de enzima más alta por célula que fue subóptima para las células. Esto es un desafío con biopsias variando en tamaño y de la densidad celular, con algunas biopsias de muestreo más de la mucosa superficial que otros. Como era de esperar, análisis citométrico de flujo de la suspensión de una sola célula reveló que, en promedio, 12% de las células fueron CD45 + leucocitos, mientras que la mayoría de las células en el tejido de la mucosa pulmonar en condiciones de estado estacionario no eran células inmunes (Figura 3D ). La citometría de flujo y datos correlacionados IHC, que pone de relieve la fuerza de emplear ambas técnicas en paralelo.
+ leucocitos que expresaba HLA-DR pero fueron negativos para los marcadores de linaje CD3, CD20, CD56, CD66abce, CD14, y CD16 (Figura 4A). En esta pequeña población de células, se identificaron plasmocitoide DC (PDC) basado en su falta de expresión de CD11c y su alta expresión de CD123 y HLA-DR (verde azulado). Entre las células de linaje negativo CD11c + HLA-DR +, tanto CD1c + (corales) y CD141 + (marrón) se identificaron CD mieloides (Figura 4A). Para caracterizar mejor estos subgrupos de células, su expresión de la integrina CD10 3 que se une a la E-cadherina, importante en el anclaje del tejido, se evaluó. Mientras que todos los subconjuntos de corriente continua, así como las células T circulantes en la sangre periférica, fueron bajos o negativos para CD103, una proporción distinta de células CD y T que se encuentran en los pulmones de un mismo individuo expresa CD103. Este fue el caso de células que se encuentran tanto en el lavado broncoalveolar, así como en el tejido pulmonar (Figura 4B).
Figura 1: Toma de muestras de tejido de la mucosa de pulmón humano. Las broncoscopias (A) se realizaron en sujetos para obtener biopsias endobronquiales de las principales divisiones bronquiales de un pulmón utilizando fórceps. (B) Las biopsias fueron incorporados ya sea en la GMA para seccionar los tejidos e inmunohistoquímica (esquema azul) o enzimáticamente digerido para obtener una sola célula suspensiones para citometría de flujo (diagrama de color rosa).m / archivos / ftp_upload / 55222 / 55222fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Incorporación de las biopsias realizadas en resina de GMA. (A) Las biopsias tomadas de broncoscopias se transfirieron de inmediato a viales de vidrio que contienen acetona deshidratada enfriada con hielo (panel izquierdo). Después de la fijación durante la noche, las biopsias fueron infiltradas con una solución de benzoato de metilo. Las biopsias se colocaron en la incrustación de cápsulas llenas con solución de incrustación para iniciar la polimerización (panel medio). biopsias embebidas se pueden almacenar a -20 ° C o se pueden seccionaron para la tinción inmunohistoquímica (panel derecho). (B) Los aspectos más destacados esquemáticas pasos clave en el proceso de integración de las biopsias utilizando GMA. Imágenes representativas de biopsias seccionadas que muestran la presencia de CD45 + (C) o células CD1a + (E) se muestran en comparación con los respectivos controles de isotipo (paneles de la derecha). La tinción específica se muestra en rojo, y los núcleos celulares contraste con hematoxilina están en azul. Barra de escala = 50 micras. Los gráficos de barras muestran la media ± rango intercuartílico de CD45 + (D) o CD1a + (F) células por mm 2 en el epitelio o la lámina propia (n = 20). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La digestión enzimática de las biopsias para citometría de flujo. (A) Una biopsia endobronquial tomado de una broncoscopia en una placa de Petri. Las biopsias se lavaron en HBSS, se trató con DTT a eliminar el moco, unaD digerido con colagenasa y ADNasa antes de la recogida de las células individuales para el análisis de citometría de flujo. (B) El esquema resume los principales procedimientos para la digestión de las biopsias para citometría de flujo. (C) El gráfico muestra la correlación en el rendimiento de células y la viabilidad, como se evaluó por recuento manual y Trypan exclusión de azul (n = 20). (D) Las suspensiones de una sola célula a partir de la biopsia digerido se analizaron por citometría de flujo y se evaluó la viabilidad y la expresión de CD45 (antígeno común de leucocitos). La citometría de flujo gráfico muestra un donante representativo de cada 20 sujetos sanos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Identificación de pulmón subconjuntos de células dendríticas en digerida biopsies. (A) la estrategia de apertura de puerta para la identificación de CD1c + y CD141 + CD mieloides (MDC) y plasmacytoid países en desarrollo (PDC) en el tejido de la mucosa pulmonar. se muestra la citometría de flujo parcelas de un sujeto representativo. (B) Los gráficos de puntos muestran la expresión de la integrina CD103 en las poblaciones de los países en desarrollo en las biopsias de pulmón (panel izquierdo), el lavado broncoalveolar (panel central), y de la sangre periférica (panel derecho). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este documento se describe cómo generar una caracterización espacial y fenotípica detallada de las CD pulmonares de tejido residentes en los seres humanos sanos mediante inmunohistoquímica y citometría de flujo en biopsias de la mucosa endobronquiales recogidos durante la broncoscopia. En los párrafos siguientes pasos críticos en el protocolo se discuten en detalle.
Los pasos críticos con el Protocolo
Seccionamiento e inmunohistoquímica: Es fundamental para mantener los bloques de biopsia a -20 ° C cuando no se les usando (paso 2.5). bloques calientes a veces pueden llegar a ser suave y no sección. Además, mantener los bloques a -20 ° C preservará los sitios antigénicos y resultar en una mejor tinción inmunohistoquímica utilizando.
Seccionamiento e inmunohistoquímica: Cuando seccionar las biopsias incrustados-GMA, es conveniente tener 3-4 contenedores de agua amoniacal disponibles para flotar en las secciones. Cuando una sección se recogió, make asegúrese de sustituirla por una nueva sección (paso 3.4). Esto asegura que, en el momento en que el artículo se manipula de nuevo, se han estado flotando en el agua de amoniaco para aproximadamente la longitud correcta de tiempo (45-90 seg), que ayuda en la presentación de antígenos y la posterior inmunohistoquímica. Corte 2 micras secciones de esta manera también permite seccionamiento consecutivo, lo que significa que la misma célula potencialmente se puede teñir con diferente de la superficie celular o marcadores intracelulares. Es importante no tocar el filo de la cuchilla durante el corte de vidrio, ya que se daña fácilmente. Si hay cualquier residuo de la hoja que debe ser eliminado, siempre cepillar lejos del borde de corte.
La digestión enzimática y citometría de flujo: En muestras de tejido donde las células inmunes son poco frecuentes, es fundamental incluir en el panel CD45 tinción de flujo para identificar primero los leucocitos (en minoría) antes de identificar aún más las CD u otras células inmunes de interés. Además, "fcontroles luorescence menos uno "o isotipo son críticos para incluir al validar los paneles de anticuerpos utilizados para asegurar que los eventos raros son verdadera señal sobre ruido.
Modificaciones y solución de problemas
Seccionamiento e inmunohistoquímica: Para la mayoría de marcadores celulares expresados por las células inmunes, tejido de las amígdalas se puede utilizar como un buen control positivo y para titular anticuerpos para inmunohistoquímica con el fin de evitar el desperdicio de material de biopsia endobronquial limitado (paso 4). Para visualizar los procesos dendríticos de las CD, los tejidos pueden ser seccionados paralelo al epitelio, en lugar de perpendicularmente a través de la mucosa 21. Otros sustratos de la peroxidasa se pueden utilizar además de AEC, tales como DAB, si el usuario requiere un color sustrato diferente. El complejo enzimático de avidina / biotina también puede estar sustituido, por ejemplo, con fosfatasa alcalina.
La digestión enzimática y citometría de flujo: Aunque el finbiopsias obronchial son pequeñas, las células del tejido residente sobrevivir a la digestión enzimática y el procesamiento en una suspensión de una sola célula para el análisis de citometría de flujo (Figura 3). Sin embargo, es importante evaluar el impacto potencial de las enzimas en las manchas utilizadas en la citometría de flujo panel de anticuerpos. Para probar si los escinde protocolo digestión enzimática fuera, altera, o interfiere con la tinción de anticuerpos, las células más fácilmente accesible que expresan marcadores similares, tales como las células mononucleares de sangre periférica, se pueden tratar con las enzimas digestivas (paso 6) o no, y posteriormente por puede teñidas con anticuerpos marcados fluorescentemente y se analizaron por citometría de flujo (paso 7). Si la colagenasa y ADNasa no interfieren con la disponibilidad de antígeno, las manchas con o sin tratamiento de las células con enzimas deberían ser similares. Además, esto puede ser verificado utilizando tanto la citometría de flujo, así como secciones de tejido intacto y la inmunohistoquímica (Fifiguras 2 - 3) 19.
Limitaciones de la Técnica
Broncoscopia: La mayor parte sana individuos toleran bien una broncoscopia, y es un método utilizado habitualmente para examinar y probar los pulmones, incluso para obtener biopsias de la mucosa endobronquiales, como se describe aquí (paso 1). Sin embargo, la broncoscopia no es típicamente un método adecuado para llevar a cabo para el muestreo longitudinal, ya que a menudo se percibe como incómodo, y también es un procedimiento mucho tiempo y exigente de recursos. Por lo tanto, la biopsia endobronquial sólo proporcionan una instantánea de las células inmunes presentes en el tejido de la mucosa de pulmón en un momento dado, en lugar de un estudio a largo plazo de cambios en la dinámica o cinética.
Importancia de la Técnica en Materia de Métodos Alternativos / Existentes
Seccionando e inmunohistoquímica: La ventaja de la incorporación de GMA en lugar de parafina o mediante crioconservaciónes la conservación superior de la morfología y antígenos, y un mayor número de secciones de las pequeñas biopsias, debido a las secciones delgadas que se pueden obtener 17.
La digestión enzimática y citometría de flujo. Con la obtención de células individuales a partir de pequeñas biopsias, mucha más información se puede lograr mediante varios colores citometría de flujo.
Las aplicaciones futuras o llegar después de dominar esta técnica
Este protocolo describe dos métodos paralelos para maximizar la información que puede obtenerse a partir de pequeñas biopsias endobronquiales mediante la combinación de técnicas de inmunohistoquímica y citometría de flujo. Para caracterizar la distribución espacial de las células inmunes raras, tales como las DC, las biopsias se pueden incrustar en GMA para obtener secciones delgadas para inmunohistoquímica, mientras que para distinguir las DC de otras células inmunes con marcadores similares, la digestión enzimática de las biopsias permite citometría de flujo de múltiples colores ser performed. Para permitir la identificación imparcial de las características novedosas de los países en desarrollo durante la inflamación o de la enfermedad, el análisis automatizado de los datos de citometría de flujo se puede realizar mediante la aplicación de algoritmos de extracción de características 22. Las futuras aplicaciones incluyen el uso de estas células individuales para la clasificación celular para recoger las poblaciones de células específicas que se pueden utilizar para la secuenciación de ARN o de perfiles transcriptomic. La identificación de los países en desarrollo que residen en los pulmones puede ser importante para la comprensión de los cambios en el paisaje inmunológico durante la salud y la enfermedad.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a los voluntarios que han contribuido con material clínico de este estudio. También estamos agradecidos al personal del Departamento de Salud Pública y Medicina Clínica, División de Medicina Medicina / Respiratoria del Hospital Universitario de Umea (Norrlands universitetssjukhus) para la recogida de todo el material clínico.
Este trabajo fue apoyado por becas de AS-S desde el Consejo Sueco de Investigación, la Fundación Sueca de Corazón y Pulmón, la Fundación Sueca para la Investigación Estratégica, y el Instituto Karolinska.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bronchoscopy | |||
| Bronchoscope BF1T160 | Olympus | BF1T160 | |
| Light source | Olympus | Exera CV-160 | |
| Fenestrated forceps | Olympus | FB21C | Used to take biopsies |
| Bite Block | Conmed | 1429 | 20 mm x 27 mm |
| Glucose 25% | 500 ml intravenous | ||
| Glycopyrronium bromide 0.2 mg/ml | Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion | ||
| Mixt. Midazolam 1 mg/ml p.o | Can be used for extra relaxation | ||
| Lidocaine, 40 mg/ml | Mouth and throat administration / Gargled | ||
| Lidocaine 100 mg/ml spray | Administered to back of throat | ||
| Lidocaine 20 mg/ml spray | Administered via bronchoscope to airways | ||
| GMA processing and embedding | |||
| Glass vials | 5 ml | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-1L | |
| Molecular sieves, 4 Å | Alfa Aesar | 88120 | 3-4 mm diameter pellets |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P-7626 | 0.035 g/100 ml acetone |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I-6125 | 0.37 g/100 ml acetone |
| Polythene-flat TAAB embedding capsules | TAAB laboratories | C094 | 500x 8 mm diameter, polythene, flat-bottom capsules |
| Capsule holder | TAAB laboratories | C054 | Holds 25 8 mm capsules |
| JB-4 GMA embedding kit | Polysciences | 00226 | Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12) |
| Methyl benzoate | Sigma-Aldrich | 27614-1L | |
| Silica gel with humidity indicator | Scharlau | GE0043 | 2.5-6 mm |
| GMA sectioning | |||
| Glass microscope slides | ThermoFisher Scientific | 10143562CEF | Cut edges, frosted end |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920-500mL | 1:10 for working solution |
| Sheet glass strips for ultramicrotomy | Alkar | ||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Wash solution (0.1% Tween20) |
| LKB 7800B Knifemaker | LKB | ||
| Capsule splitter | TAAB laboratories | C065 | |
| Carbon steel single edge blades | TAAB laboratories | B054 | |
| Vice | |||
| Ammonia, 25% | VWR | 1133.1000 | 2 ml in 1 L, 1:500 (0.05%) |
| Microtome | Leica | Leica RM 2165 | |
| Light source | Leica | Leica CLS 150 XE | |
| Microscope with swing arm stand | Leica | Leica MZ6 | |
| GMA Immunohistochemistry | |||
| Diamond tipped pen | Histolab | 5218 | |
| Hydrogen peroxide 30% solution | AnalaR Normapur | 23619.264 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Tris | Roche | 10708976001 | |
| Sodium chloride | VWR chemicals | 27810.295 | |
| Bovine serum albumin | Millipore | 82-045-2 | Probumin BSA diagnostic grade |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Anti-human CD45 antibody | BioLegend | 304002 | Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml |
| Anti-human CD1a antibody | AbD Serotech | MCA80GA | Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml |
| Mouse monoclonal IgG1 isotype control | Abcam | ab27479 | |
| Mouse monoclonal IgG2a isotype control | Dako | X094301-2 | |
| Vectastain ABC Elite standard kit | Vector Labs | PK-6100 | |
| AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite | Vector Labs | SK-4200 | |
| Mayers haematoxylin | HistoLab | 01820 | |
| Permanent Aqueous Mounting Medium | AbD Serotech | BUF058C | |
| Drying oven | |||
| DPX permanent mounting solution | VWR | 360292F | |
| Light microscope | Leica | Leica DMLB | |
| Microscope camera | Leica | Leica DFC 320 | |
| Analysis software | Leica | Leica Qwin V3 | |
| Enzymatic digestion | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | 55021C | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Forceps | |||
| Platform rocker | Grant instruments | PMR-30 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 14-432-22 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Flow cytometry | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit | Life Technologies | L34957 | |
| CD45 | BD | 555485 | |
| CD3 | BD | 557757 | |
| CD20 | BD | 335829 | |
| CD56 | Biolegend | 318332 | |
| CD66abce | Miltenyi | 130-101-132 | |
| HLA-DR | BD | 555813 | |
| CD14 | BD | 557831 | |
| CD16 | Biolegend | 302026 | |
| CD11c | BD | 560369 | |
| CD1c | Miltenyi | 130-098-009 | |
| CD141 | Miltenyi | 130-090-514 | |
| CD103 | Biolegend | 350212 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| LSR II Flow cytometer | BD | Flow cytometer | |
| FlowJo | FlowJo | Software for analysis | |
References
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