Introduction
Akciğerler dış çevre ile sürekli temas halindeyiz ve çok hastalığa neden kapasitesine sahip hem zararsız parçacıkların ve mikropların maruz kalmaktadır. Bu nedenle, işgalci patojenlere karşı güçlü bir bağışıklık tepkisini monte bağışıklık sistemi için çok önemlidir, ancak hastalığa neden olmayan inhale edilen antijenler tolerans sağlamak için eşit derecede önemlidir. güçlü bir bağışıklık gözetim sağlamak için, solunum sistemi, dendritik hücreler (DC) da dahil olmak üzere bağışıklık hücreleri, bir ağ ile astarlanmıştır. DH'ler naif T hücrelerini aktive etmek özgü kapasiteli profesyonel antijen sunan hücrelerdir. İnsan akciğerlerde, yerleşik DH'ler bir antijen ve sonra işlemi karşılaşırsanız ve T hücreleri 1, 2, 3 tanıtımı ve aktivasyonu için akciğer lenf düğümlerine taşıyın.
insan bağışıklık sisteminde, DCler Distin ile birkaç alt takımından ayrılabilirct ama örtüşen fonksiyonları: CD1c + ve CD141 + miyeloid DH'ler (MDC) ve CD123 + plazmositoid DC'ler (PDC) 4, 5. Insan DC'lerde en detaylı bilgi kanda çalışmalardan kaynaklanıyor olsa da, insan akciğerleri de T-hücre uyarıcı kapasitesi 6, 7, 8, 9 DC alt gruplarının nadir popülasyonları liman artık açıktır. Ancak, biriken veri DC'lere dahil bağışıklık hücreleri, onların anatomik konumu 10 bağlı frekans, fenotip ve fonksiyon açısından farklılık göstermektedir. Nedenle, yerel bağışıklık ve hoşgörü katkılarını anlamak için, ilgili dokudan bağışıklık hücrelerini incelemek için önemlidir. Birlikte ele alındığında, bu kan DC'ler daha kolay kullanılabilir ve erişilebilir olmasına rağmen, akciğer hastalıkları ele alırken akciğer yerleşik DC'ler incelemek gerektiğinin altını çizen İnsanlarda.
Insanlarda akciğer yerleşik DH'lerin inceleyen ilk çalışmalar öncelikle immünohistokimya 11, 12, 13 kullanılarak doku kesitlerinde, morfoloji ve HLA-DR ve CD11c'nin olarak tek belirteçler, ifadesi dayanmıştır. Buna karşılık, genellikle akış sitometrik dayanıyordu daha yeni çalışmalar, farklı immün hücre alt grupları incelemek için analiz eder. bu benzersiz belirli bir DC alt kümesini tanımlayan tek bir hücre-yüzey işaretleyici bulmak zor olduğundan Ancak, çalışmaların potansiyel sınırlama sadece dört renkli akım sitometri uygulayarak DC'ler benzer fenotipik işaretleri ile hücre popülasyonlarının dahil riskidir. Örneğin, CD11c, tüm miyeloid DC'lerin ve monositlerin büyük çoğunluğu üzerinde ifade edilir. Öte yandan, çalışmalarda daha ileri akış sitometri panelleri uygulanması, hastanın cerrahi rezeksiyon ile ilgili kanserli olmayan akciğer dokusu tipik olarak kullanılanxref "> 10, 14, 15, 16, nadir popülasyonları sağlıklı kişilerde DC'ler mevcut gerçekten temsilcisi olmadığı belirsizdir rağmen. Genel olarak, çalışmalar nedeniyle cerrahi olarak çıkarılırlar veya tüm insan akciğer dokusu kıt olmasından büyük ölçüde sınırlıdır.
Bu sınırlamalar bazılarının üstesinden gelmek için, bu iş mekansal dağılımı ve bronkoskopi geçmesi sağlıklı gönüllülerden elde edilen mukozal endobronşiyal biyopsi DC'lerin bir fenotipik tanımlama ayrıntılı bir analizini gerçekleştirmek açıklamaktadır. Birkaç küçük biyopsiler her birey alınabilir ve daha sonra kesit ve analiz gelişmiş akım sitometri analizi için sindirilmiş enzimatik immünhistokimya veya kullanmak için gömülü olabilir. bronkoskopi elde endobronfliyal biyopsi şeklinde akciğer dokusu kullanılarak mümkün st gerçekleştirmek için yapma avantajı kazandıranudy sağlıklı gönüllü üzerinde, akciğer açık cerrahi aksine bilinen nedenlerle, göğüs cerrahi gerektiren hastalar ile sınırlıdır, o. Ayrıca, sağlıklı gönüllülerden bir bronkoskopi sırasında örneklenir doku akciğer hastalığı olan hastalarda akciğer dokusunda olmayan bir etkilenen bölgeye aksine, fizyolojik olarak normaldir. Öte yandan, biyopsiler, küçük ve birden fazla biyopsileri havuzu da alınan hücrelerin sayısı, gerçekleştirilebilir analizlerin sınırlar.
Bu çalışma DC'ler odaklanırken, doğrudan genişletilebilir açıklanan yöntemler, insan mukozal akciğer dokusunda bulunan diğer ilgi (bağışıklık) hücreleri dahil etmek. Ayrıca, protokoller aynı zamanda bronkoskopi, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), sarkoidoz, ya da akciğer kanseri gibi tanı oluşturulması parçası olan pulmoner hastalıklardan muzdarip hastalardan elde edilen örneklerde için direkt olarak uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Bu araştırma Umea, İsveç'te bölgesel Etik Değerlendirme Kurulu tarafından onaylandı.
İnsan Deneklerin Örnekleme Endobronşiyal Biyopsilerinde 1. Bronkoskopi
- Tüm katılımcılardan bilgilendirilmiş onam edinin.
- Oral midazolam (4-8 mg) ve intravenöz glikopirronyum (0,2-04 mg) bronkoskopi önce 30 dk konuları davranın. gırtlak ve bronşlarda lidokain topikal anestezi uygulayın. lidokain% 4 ~ 3 ml konu gargara edelim ve dil kökünde ve bir gırtlak şırıngayla gırtlak içine 3 ml uygulanır. lidokain sprey 8-10 dozları ile topikal anestezi optimize edin. Konu oturma ile bu adımı yürütmek.
- yatar pozisyonda konu ile plastik ağızlık yoluyla ağız yoluyla bir esnek video bronkoskop yerleştirin. bronkoskop aracılığıyla uzak trakea ve bronşların topikal anestezi tamamlamak için bir amaç yapımı sprey kateter kullanın. Burada yaklaşık bir doz kullanmaklidokain% 2 5-10 ml.
- 6-9 ana karina endobronşiyal mukozal biyopsi ve Fenestralı forseps kullanarak ana bronş bölünmeler (Şekil 1) atın. bronkoskopi ardından ve hastaneden ayrılmadan önce, 2-4 saat boyunca söz konusu dinlensin ve hafif bir yemek ile onu / onu sağlamak.
2. Glikol Metil (GMA) reçine içinde Biyopsisi katıştırma
NOT: GMA immün protokol başlangıçta Southampton Üniversitesi, Histokimyası Araştırma Birimi 17 geliştirildi.
- Sabitleme: İmmünohistokimya için, forseps biyopsi çıkarın ve (buz soğukluğunda susuz aseton ve proteaz inhibitörlerinin 3 ml içeren cam şişelere doğrudan fenilmetilsülfonil florid (35 mg / 100 mi aseton) yerleştirmek ve iyodoasetamid (370 mg / 100 mi aseton )). -20 ° C (Şekil 2) gece boyunca doku sabitleyin.
Not: Aşağıdaki adımlar perfo edilmelidirUygun nitril eldiven ile davlumbaz rmed. gömme kiti hassasiyeti, tahriş ve / veya alerjik reaksiyonlara neden olabilir bileşenleri içerir. Tüm atık tehlikeli atık olarak bertaraf edilmelidir. - Dehidrasyon: inhibitörleri ile aseton alınır ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca (RT) (inhibitörsüz), taze susuz aseton ile değiştirin. aseton çıkarın ve 15 dakika boyunca metil benzoat ile değiştirin.
- Sızma: glikol metakrilat monomer içinde% 5 metil benzoat çözeltisi bir işleme çözeltisi hazırlanması; 10 mi, bir vial için yeterlidir. metil benzoat çözeltisi kapalı plastik pastör pipet, emme kullanılarak ve işleme çözeltisinin 3 ml'si ile değiştirin. biyopsileri ve 2 saat boyunca 4 ° C de aşırı işlem çözeltisinin inkübe; Pasteur pipet çözeltisi gömme dahil olmak üzere tüm müteakip çözeltisi değişiklikler için de kullanılabilir.
- işleme çözüme her 2 saat (3x 2 saat inkubasyon), yani biyo toplam sızma süresini alışverişiişlem çözelti içinde psies en az 6 saattir. biyopsi tanımlamak için gömme kapsüllerin üst ucunu kağıt etiketleri yerleştirin.
- glikol metakrilat monomer, 10 ml, 75 mg benzoil peroksit bir gömme çözeltisi hazırlayın. Polimerizasyon reaksiyonunu başlatmak için gömme çözeltisine, N, N -dimethylaniline poli (etilen oksit), 0.25 ml (gaz) ekleyin. işleme çözüm çıkarın ve forseps kullanarak ilgili gömme kapsül içine bir biyopsi yerleştirin.
- Yavaşça çözüm gömme ile üst gömme kapsülünü dolduracak ve kapağını kapatın. biyopsi rahatsız ve büyük hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının. Reçine tamamen polimerize kadar 4 ° C 'de kapsüller inkübe edin.
- silika jel, yaklaşık 5 g ihtiva eden bir 50 ml tüp içinde -20 ° C de gömülü biyopsi saklayın.
GMA gömülü Endobronşiyal Biyopsilerinde 3. Kesit
- Mikroskop lamı kaplama: bir mikroskop slaytlar yıkayınNormal döngüsünde bulaşık makinesi. slaytlar Kapak ve havada kurumaya onlara izin.
- damıtılmış su içinde% 10 poli-L-lisin (PLL) çözeltisi bir kaplama çözeltisi hazırlandı. 5 dakika boyunca kaplama solüsyonu slaytlar Batmak, ve daha sonra onlara hava kurumaya bırakın. kendi orijinal kutularında kuru PLL kaplı slaytlar saklayın.
- damıtılmış su içinde% 0.1 Tween 20 düz cam şeridi yıkayın. kağıt havlu ile% 70 etanol ve kuru ile cam durulayın. Bir bıçak yapımcısı kullanarak cam şerit cam kanatları kesin. kesme kenarı hasarlı veya yakalattıracak olmadığından emin olmak için hareketi engelleyen bir kap içinde bıçakları saklayın.
- Biyopsi kırparak: Bir kapsül ayırıcı biyopsi kapsülü yerleştirin ve bir karbon-çelik tek kenar bıçak kullanılarak her tarafı aşağı kesti. GMA gömülü biyopsi çıkarın ve bir mengeneye sıkıca yerleştirin. çelik bıçak kullanarak biyopsi etrafında aşırı GMA Trim.
- GMA bölümleme.
- damıtılmış su ile% 0.05 amonyak çözeltisi hazırlayın. th cam bıçak ve biyopsi yerleştirine mikrotom. Dikkatle bıçak bloğunun yüzeyine düz duracak şekilde bıçak tutucu ve biyopsi bloğunun açısını ayarlayarak bıçak ile biyopsi bloğunu aynı hizaya getirin.
- Yavaş kesim hızı mikrotom kullanılarak 2 mikron kalınlığında bölümleri kesmek ve aktarmak ve amonyak su bölümleri yüzer forseps kullanabilir. nazik antijen alımı sağlayan ve bölümün açılımı, 45-90 saniye boyunca bölümleri yüzer.
- mikroskop lamı ile bölümleri toplayın. hızla toluidin mavisi ile boyanarak biyopsi histoloji kontrol edin.
- 50 ° C'ye kadar bir sıcak plaka kümesi slaytlar kurutun ve plastik bir Pasteur pipeti kullanılarak bir bölüme süzüldü toluidin mavi leke 500 ul uygulanır. yeşil bir halka leke kenarında ortaya çıkmaya başlayana kadar sıcak plaka bölümüne ısıtın ve daha sonra su ile iyice yıkayın.
- Bir ışık mikroskobu kullanılarak, biyopsi histoloji kontrol edin. immünohistokimya için kullanılan Bölümler hasarsız lamina iyi alanlarını içermelidiraz sayıda bezleri ve mümkün olduğu kadar az düz kas propriya ve epitel.
- bölüm 3.4.2 olduğu gibi, iyi histoloji sahip bölümleri kesmek ve immünohistokimyasal için PLL kaplı mikroskop lamı ile onları almak. Analiz için biyopsisinden gelen en az iki bölüm kesilir. en az 1 saat için kuru kayar. Kurutma işleminden sonra, bölümler kalay folyo içine de sarılabilir ve en fazla 2 hafta boyunca -20 ° C'de saklandı veya hemen boyanmış olabilir.
GMA gömülü Endobronşiyal Biyopsilerinde 4. İmmünohistokimyasal Boyama
NOT: Sodyum azid zehirli. Davlumbaz içinde% 0,1 sodyum azid çözeltisi hazırlayın ve uzak asitlerden. Asitlerle temasında toksik gaz çıkarır.
- Bir elmas uçlu kalem kullanarak bölümleri etrafında çizin ve bir boyama raf üzerine slaytları düzenlemek.
- Bir Peroksidaz bloğu gerçekleştirin. % 0.1 sodyum azid çözeltisi içinde% 0.3 bir hidrojen peroksit peroksidazı bloke çözeltisi hazırlayın. ApplY1 bölümlere peroksidazı bloke ml ve 30 dakika boyunca inkübe edin.
- 0.05 M Tris-tamponlu tuzlu su (TBS), pH 7.6 bir yıkama çözeltisi hazırlayın. , TBS içinde 3x 5 dakika slaytlar yıkayın.
- DMEM içinde% 1 BSA blok çözeltisi hazırlayın. peşin ve büyük hacimler, kısım bu yapın ve gerektiğinde kadar dondurmak. slaytları süzün ve özgül olmayan bağlanma antikorun bloke etme 30 dakika blok çözeltisi içinde bölümleri inkübe edin. özgül olmayan bağlanma devam ederse, ikinci antikor olarak aynı türden% 5 serum bloğu ile bir 30 dakika inkübasyon aşamasını içerir.
- (:; CD1a 1 oranında sulandırılmış 1000: 1,00 1 seyreltilmiş CD45) ve slaytlar uygulamak istenen konsantrasyona TBS birincil antikor (CD45 veya CD1a) seyreltin. bölümler lamel ve oda sıcaklığında gece boyunca inkübe edilir.
- TBS içinde üç kez slaytlar yıkayın. (TBS içinde istenen konsantrasyona (2) bu durumda tavşan anti-fare F (ab 'primer antikor konak türlerinden karşı), 1:30 biyotinlenmiş sekonder antikor seyreltilir0 seyreltme) ve slaytlar için geçerlidir. Oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe edin.
- Kullanmadan önce streptavidin-biyotin peroksidaz kompleksi en az 30 dakika hazırlayın. Tüm slaytları karşılamak için yeterli olduğundan emin olun. TBS içinde üç kez slaytlar yıkayın. slaytlar solüsyonu uygulanır ve oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe edin.
- TBS içinde üç kez slaytlar yıkayın. 3-amino-9-etilkarbazol (üretici talimatlarına göre yapılmıştır) (AEC) peroksidaz substrat çözeltisi hazırlayın. slaytlara uygulamak ve 20-30 dakika süreyle ya da istenen leke yoğunluğu gelişene kadar kuluçkaya yatmaktadır.
- 5 dakika boyunca musluk suyu slaytlar durulayın. 2 dakika süreyle süzülmüş Mayer hematoksilin çözeltisi ile bölümleri counterstain. 5 dakika boyunca musluk suyu slaytlar yıkayın.
- slaytlar boşaltın ve kalıcı sulu montaj ortamı ile bölümleri kapsamaktadır. bir kurutma fırınında 80 ° C'de slaytlar kurutun. slaytlar soğutun ve daha sonra DPX ile monte ve bir lamel yapmasına izin ver.
5. StTahliye Analiz
- Bir bilgisayara bağlı bir monte edilmiş bir kamera ile bir ışık mikroskobu kullanılarak 40X büyütmede bölümleri analiz edin.
Not: Hücresel analiz için, pozitif düz kas, bezler, büyük kan damarları ve uyumsuz veya zarar görmüş dokuların alanlar hariç, bronşiyal lamina propria ve bozulmamış epitel içinde, çekirdekli hücreler boyanmış sayısı. - hücre sayımı ortalama ve lamina propria alanı ve epitel uzunluğu ortalama hücre sayısını düzeltin. ve lamina propriya epitel uzunluğunun alanı bir görüntü analiz programı kullanarak hesaplanabilir.
Endobronşiyal Biyopsilerinde 6. Enzimatik sindirimi
- Yıkama biyopsileri: Hank tamponlu salin solüsyonu (HBSS) (Şekil 3), 10 ml içeren 15 ml'lik konik bir tüp içinde steril forseps yer sağlam biyopsileri kullanılması. 30 rpm'de sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir. steril d biyopsileri aktarınHBSS ile 15 ml tüp içeriğini boşaltılarak ish.
- DTT ile mukus bozmak: 5 mM 1,4-ditiyotreitol (DTT) içeren HBSS, 10 ml bir tüp HBSS değiştirin. Steril forseps kullanarak 15 ml tüp içine geri biyopsi aktarın. 30 rpm'de sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında 15 dakika süreyle inkübe edilir.
- 15 sn için tüp hafifçe karıştırın. HBSS ve DTT ile 15 ml tüp içeriğini boşaltılarak steril kabı üzerine biyopsi aktarın.
- Kültür ortamına biyopsileri aktarma: RPMI 1640 kültür ortamında, 10 ml bir tüp içinde HBSS ve DTT değiştirin. Steril forseps kullanarak 15 ml tüp içine geri biyopsi aktarın. 30 rpm'de sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
- kolajenaz ve DNaz ile biyopsi sindirilmesi.
- 1 M HEPES çözeltisi içeren, önceden ısıtılmış RPMI kolajenaz II (0.25 mg / ml) ve DNase (0.2 mg / ml) 'in bir sindirim çözeltisi hazırlayın. 48-çukurlu bir doku kült 500 uL oyuk başına sindirim çözeltisi ekleyinure plakası.
- Sindirim solüsyonu içinde oyuk başına 1 biyopsi yerleştirin. 220 rpm'de 37 ° C'de 60 dakika boyunca bir çalkalama platformu üzerinde plaka inkübe edin. Pipet yukarı ve 30 dakika biyopsi yeniden dağıtmak için sonra aşağı ve 60 dakika sonra tamamen doku ayrıştırmak.
- tek hücre süspansiyonlarının hazırlanması.
- birlikte yüzme 40 mikron hücre süzgecinden geçirilerek bir 50 ml tüp içine kuyu sindirilmiş biyopsileri. buz gibi soğuk FACS tampon maddesi (fosfat tamponlu tuz (PBS) ihtiva eden% 2 fetal sığır serumu) ile yıkanmasından kalan hücreler toplanır.
- Bir şırınga pistonu arkasını kullanarak hücre süzgecinden kalan doku sıkın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de sindirilmiş hücreleri santrifüjleyin. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve buz gibi soğuk FACS tampon maddesi 5 ml pelletini. elle hücrelerin canlılığını değerlendirmek için bir hemasitometre ve Tripan mavisi leke kullanarak hücreleri saymak.
- FACS tampon 200 ul, yaklaşık 1 x 10 6 hücre hücre pelletini.
- üreticinin protokolüne uygun olarak, ölü hücre çıkarılması için, bir hücre canlılığı boya ekleyin.
- FcR bloke edici ayıracı 5 ul ilave edin ve 4 ° C'de 5 dakika inkübe edilir.
- , CD16 (0.5 ul), HLA-DR (3 ul), CD11c (5 ul), CD123, CD45 (2 ul), soy (2 ul, her CD3, CD20, CD56, CD66abce ve CD14) karşı hücre yüzeyi antikor ekleyin (5 ul), CD1c (3 ul) ve CD103 (2 ul) ve 4 ° C'de 15 dakika inkübe edilir. antikorlar ile ilgili ayrıntılar yöntemleri bölümünde bulunan, ancak kullanımda sitometre kesin akışına antikorlar titre ve optimize edilebilir. 400 x g'de 5 dakika boyunca PBS ile aşırı antikorların yıkayın. bir akış sitometresinde taze örnekleri Edinme veya daha sonra acquisit öncesinde% 1 paraformaldehid hücreleri saptamakiyon.
- Tahlil 18 (Şekil 4) sitometri bir akış kullanılarak akciğer biyopsilerinde insan DC'ler belirleyin.
Not: Analiz yazılımı sitometri akışı ile, bağışıklık hücreleri CD45 üzerinde kapılama diğer akciğer hücrelerinden ayırt edilir. Ölü hücreler CANLI / DEAD boya için pozitif hücreler olarak devre dışı bırakılabilir. Tüm canlı CD45 + hücreleri, soy hücrelerinin (B hücreleri, T hücreleri, NK hücreleri, nötrofiller ve monositler) bir kanal CD20, CD3, CD56, CD66abce, CD14 ve CD16 karşı antikorların bir kokteyl ile devre dışı bırakılabilir. HLA-DR + hücrelerinin insan DH'lerinin kimlik sağlayacak sonra. MDC CD11c sentezlenmesi sırasında veya CD11c eksikliği göre PDC ayırt edilebilir. MDC daha CD1c + MDC veya CD141 + ayrılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DC'lere dahil olmak üzere insan solunum doku yerleşik bağışıklık hücrelerini, karakterize Çalışmalar, büyük oranda cerrahi olarak çıkarılırlar veya tüm insan akciğer dokusu kıt olması nedeniyle sınırlıdır. Burada, sitometri immünhistokimya kullanarak dokuda bağışıklık hücreleri incelemek veya akış sağlıklı gönüllülerde ve gelişmiş protokollerin endobronşiyal biyopsi (EBB) akciğer dokusunu elde etme az invazif bir yöntem özetlenmiştir.
Daha önce 19, 20 açıklandığı gibi sağlıklı gönüllüler, bronkoskopi uygulandı. Altı ile dokuz 1-2 mm 3 endobronşiyal mukoza biyopsileri ana karina ve Fenestralı forseps (Şekil 1A) kullanarak her konunun ana bronş bölümden alınmıştır. İki biyopsileri GMA gömülü ve daha sonra konumsal bilgi sağlamak için immünohistokimya kullanılmıştır. kalan biopsiES enzimatik sindirilir ve tek hücre süspansiyonları, nadir görülen hücre alt (Şekil 1B) dikkatli karakterizasyonu izin verilmiş olan, akış sitometrisi çok renkli kullanılarak analiz edilmiştir.
Küçük doku parçaları mümkün olduğunca çok uzamsal bilgi edinmek için, biyopsiler ultra ince mikron bölümler (Şekil 2A-B) sağlar GMA gömüldü. Beklendiği gibi immünohistokimya (Şekil 2C) ile denendiği gibi, CD45-eksprese eden bağışıklık hücreleri, nispeten nadir ortalama, mm2 başına 125 CD45 + hücreleri kararlı hal koşullarında mukozal akciğer dokusu içinde mevcut idi. IgG1 izotip kontrolü birincil antikor yüksek spesifite gösteren hiçbir pozitif boyanma sonuçlandı. Akciğer epitel ve altta yatan lamina propria hem de pozitif hücrelerin sayısı miktarı ve CD45 + bağışıklık hücreleri la daha bol olduğunu gösterdiepitel (Şekil 2B) daha mina propria. Ayrıca, CD1a-ifade eden hücreler tanımlanır ve numaralandırılmış ve bunlar büyük olasılıkla DCler (Şekil 2E) temsil etmektedir. Ortalama olarak, mm 2 taneden az bir CD1a + hücre kararlı durumda akciğer lamina propria (Şekil 2F) tespit edilmiştir.
İmmünohistokimya sağlam doku hücrelerinin anatomik dağılımı hakkında bilgi verir, ancak genellikle birden fazla hücre yüzey belirteçleri kullanarak hücreleri tanımlamak kabiliyeti sınırlıdır. Çok renkli, alet bağlı olarak, akış sitometrisi, hücre başına daha ayrıntılı bilgi temin etme avantajına sahiptir ve bu küçük örnekler de kullanılabilir. Dokuz adede kadar mukozal akciğer biyopsileri, toplanmış yıkanır ve mukus bozmaya inkübe edildi. Her biyopsisi daha sonra F (tek bir hücre süspansiyonu elde 48 iyi plakasının ayrı ayrı oyuklanndan, kollajenaz ve DNAaz ile sindirilmişigures 3A - 3B). Ortalama olarak, konu başına 1.5 x 10 6 Endobronşiyal hücreleri elde edildi ve hücre verimi ve canlılığı arasında pozitif bir korelasyon (Şekil 3C) gözlenmiştir. daha düşük hücre numaraları ile gözlenen daha az hücre canlılığı, potansiyel hücre için optimal olan hücre başına daha yüksek bir enzim konsantrasyonu ile açıklanabilir. Bu biyopsiler, bazı biyopsiler diğerlerinden daha yüzeysel mukozanın daha örnekleme büyüklüğü, ve hücre yoğunluğu hem de değişen bir sorundur. Beklendiği gibi, tek bir hücre süspansiyonunun sitometrik analizi sabit durum koşulları altında, akciğer mukozal doku hücrelerinin çoğunluğu bağışıklık hücreleri (Şekil 3B değil ise, ortalama olarak, hücrelerin% 12 CD45 + lökosit edildi, ortaya akış ). paralel olarak her iki teknikler kullanılarak gücünü vurgular ilişkili akış sitometrik ve IHC verileri.
(Şekil 4A) için negatif canlı CD45 + lökositler üzerinde bir kapı kullanılarak belirlendi. Hücrelerin bu küçük popülasyonunda, plazmasitoid DCler (PDC) CD11c ifade onların eksikliği ve CD123 ve HLA-DR (çamurcun), onların yüksek ifadesine dayalı tespit edilmiştir. CD11c + HLA-DR + soy-negatif hücreleri arasında, miyeloid DCler tanımlandı CD1c + (mercan) ve CD141 + (vişne) (Şekil 4A), her iki. Bundan başka, integrin CD10 ifadelerini bu hücre alt kümelerini karakterize etmek için Doku ankraj önemli E-kadherin, bağlanan 3 değerlendirilmiştir. Tüm DC alt-gruplar, hem de T-hücreleri, periferik kan dolaşım birlikte, CD103 düşük veya negatif olduğu aynı bireyin akciğerlerinde bulunan DH'ler ve T hücrelerinin ayrı bir kısmı CD103 ifade edilmiştir. Bu, bronkoalveolar lavaj, hem de akciğer dokusunda (Şekil 4B) hem de bulunan hücreler için de geçerliydi.
Şekil 1: insan akciğer mukoza dokusu Örnekleme. (A) Bronkoskopik uygulamalar rijit bronkoskop bir akciğer kullanarak forseps ana bronş bölümlerinden endobronşiyal biyopsi almak için konular üzerinde gerçekleştirilmiştir. (B) biyopsiler ya akış sitometri (pembe diyagram) için tek hücre süspansiyonları elde etmek sindirilmiş enzimatik doku kesit ve immünohistokimyasal (mavi şeması) için GMA gömülü veya bulundu.m / files / ftp_upload / 55222 / 55222fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: GMA reçine biyopsiye gömülmesi. (A) bronkoskopi alınan biyopsiler hemen buz soğukluğunda susuz aseton (sol panel) içeren cam şişelere transfer edildi. Gecede fiksasyon ardından, biyopsiler metil benzoat solüsyonu ile infiltre edildi. Biyopsiler polimerizasyonu (orta panel) başlamak çözeltisi gömme dolu kapsüller gömme yerleştirildi. Yerleşik biyopsiler -20 ° C'de muhafaza edilebilir veya immünohistokimya boyama (sağ panel) için kesitli olabilir. (B) GMA kullanarak gömme biyopsi sürecinde şematik golleri önemli adımlar. CD45 varlığını gösteren kesitli biyopsi Temsilcisi görüntüleri + (C) ya da CD1a + hücreleri (E), ilgili izotip kontrol (sağ panel) ile karşılaştırıldığında gösterilmiştir. Spesifik boyama kırmızı ile gösterilen ve hematoksilen ile zıt hücre çekirdekleri mavi olan bir. Ölçek çubuğu 50 mikron =. Çubuk grafikler CD45 + (D) veya CD1a + (F) epitel ya da lamina propria (n = 20) mm 2 başına hücrelerinin çeyrekler arası aralık ± medyan göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: flow sitometri için biyopsi enzimatik sindirim. (A) Petri kabındaki bir bronkoskopi alınan bir endobronşiyal biyopsi. biyopsiler balgamı DTT ile muamele HBSS içinde yıkandı, birakım sitometri analizi için tek hücre toplanması öncesinde kollajenaz ve DNaz ile sindirildi d. (B) şematik flow sitometri için biyopsi sindirerek ana prosedürleri özetlemektedir. Kılavuzu sayma ve tripan mavi eksklüzyonu ile (n = 20) ile değerlendirildiği gibi (Cı) Grafik hücre verimi ve canlılığı ilişkiyi göstermektedir. (D) ile sindirilmiş biyopsisinden Tek hücre süspansiyonları, akış sitometrisi ile analiz edildi ve yaşayabilirlik ve CD45 ekspresyonu (lökosit ortak antijenini) açısından değerlendirildi. arsa sitometri akışı 20 sağlıklı denek dışında bir temsilci donör gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: sindirilmiş b akciğer dendritik hücre alt tanımlanmasıiopsies. Akciğer mukozal dokuda CD1c + ve CD141 + miyeloid DCler (MDC) ve plazmasitoid DC (PDC) tanımlanması için (A) 'Ayırıcı stratejisi. bir temsilci denekten alınan araziler sitometri akışı gösterilmektedir. (B) nokta araziler akciğer biyopsisi (sol panel), bronkoalveoler lavaj (orta panel) DC'lerin popülasyonları üzerindeki integrin CD103 ifadesini ve periferik kan (sağ panel) gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu kağıt immünohistokimya kullanılarak sağlıklı insanlarda akciğer dokusu yerleşik DC'lerin detaylı mekansal ve fenotipik karakterizasyonu üretmek ve bronkoskopi sırasında toplanan endobronşiyal mukozal biyopsi üzerinde flow sitometri açıklamaktadır. Aşağıdaki paragraflarda protokol kritik adımlar ayrıntılı olarak ele alınmaktadır.
Protokol Kritik adımlar
Kesit ve immünhistokimya: Onlara (adım 2.5) kullanmadığınız zamanlarda -20 ° C'de biyopsi blokları tutmak için kritik öneme sahiptir. Sıcak bloklar bazen yumuşak olabilir ve bölüm de olmaz. Buna ek olarak, -20 ° C 'de bloklar tutarak tane antijen korunması ve immünohistokimya kullanılarak daha iyi bir boyama ile sonuçlanır.
Kesit ve immünhistokimya: GMA gömülü biyopsi kesit zaman, ilgili bölümler yüzer mevcut amonyak su 3-4 konteynerleri olması uygundur. Bir bölüm alınır, mataze bölüm (adım 3.4) ile değiştirin emin ke. Bu durum, bölüm daha işlenir zaman, antijen sunumu ve daha sonra immünohistokimya yardımcı zaman yaklaşık olarak doğru uzunluğa (45-90 saniye), amonyak, su üzerinde yüzen olacaktır, sağlar. Bu şekilde 2 mikron olan kesme aynı hücre potansiyel olarak farklı hücre yüzeyi ya da hücre içi işaretleri ile boyanmış anlamına gelir ardışık kesit, sağlar. Kesit zaman kolayca hasarlı olarak, cam bıçak kesme kenarı dokunmamaya önemlidir. kaldırılması gerekiyor bıçak herhangi bir enkaz varsa, her zaman uzak kesme kenarından fırçalayın.
Enzimatik sindirim ve akım sitometri: bağışıklık hücreleri nadirdir doku örneklerinde, ilk ileri tanımlayan DClerin veya diğer ilgi bağışıklık hücrelerinin önce (azınlıkta) lökositlerin tanımlamak için akış boyama panelinde CD45 dahil etmek önemlidir. Ayrıca, "fluorescence eksi bir "ya da izotip kontrolleri üzerinde gürültü gerçek sinyal nadir olayların sağlamak için kullanılan antikor panelleri doğrulanırken dahil etmek önemlidir are.
Değişiklikler ve Sorun Giderme
Kesit ve immünohistokimya: bağışıklık hücreleri tarafından ifade edilen çok selüler işaretler için, bademcik dokusu iyi pozitif kontrol olarak da kullanılabilir ve sınırlı endobronfliyal biyopsi malzemesinin (aşama 4) israfını önlemek amacıyla immünohistokimya için antikor titre. DH'lerin dendritik süreçleri görselleştirmek için, dokular oldukça dik mukozanın 21 ile daha epiteline paralel kesitli olabilir. Kullanıcı farklı alt-tabaka bir renk gerektiriyorsa diğer peroksidaz alt-tabakalar, DAB gibi AEC ek olarak kullanılabilir. avidin / biyotin enzim kompleksi, alkalin fosfataz ile, örneğin, ikame edilmiş olabilir.
Enzimatik sindirim ve akış sitometri: Sonunda rağmenobronchial biyopsiler doku yerleşik hücreler akım sitometri analizi için tek bir hücre süspansiyonu içine enzimatik sindirim ve işleme hayatta, (Şekil 3) küçüktür. Ancak, antikor paneline flow sitometri kullanılan lekeleri üzerinde enzimlerin potansiyel etkisini değerlendirmek için önemlidir. enzimatik sindirimi protokolü böler kapalı değiştiren veya antikor boyama ile müdahale, periferal kan tek-çekirdekli hücreleri içindeki belirteçler, eksprese daha kolay erişilebilir hücreleri, sindirim enzimleri (aşama 6) ya da tedavi edilebilir olup olmadığını test ve bunlar için Daha sonra göre floresan etiketli antikorlar ile boyanmış ve akış sitometrisi (basamak 7) ile analiz olabilir. kollajenaz ve DNaz antijen durumu engel yoksa, ya da enzimlerle hücrelerin tedavi edilmeden lekeleri benzer görünmelidir. Ayrıca, bu Fi (flow sitometri ikisini de kullanarak doğrulanmadı yanı sıra doku bölümleri ve immünhistokimya bozulmamış olarak alınabilirgures 2 - 3) 19.
Tekniğin Sınırlamalar
Bronkoskopi: En sağlıklı bireyler de bir bronkoskopi tahammül ve rutin burada (adım 1) açıklandığı gibi, incelemek ve endobronşiyal mukozal biyopsi toplamak için de dahil olmak üzere, akciğerler örnek için kullanılan bir yöntemdir. Bununla birlikte, bronkoskopi çoğunlukla rahatsızlık olarak algılandığı için, uzunlamasına bir örnekleme yapmak için, tipik olarak uygun bir yöntem değildir, ve aynı zamanda, bir zaman ve kaynak talep eden bir işlemdir. Bu nedenle, bronkoskopik biyopsiler sadece belirli bir zamanda mukoza akciğer dokusunda mevcut bağışıklık hücrelerinin anlık yerine dinamikleri ve kinetik değişikliklerin uzun süreli bir çalışma sağlar.
Mevcut / Alternatif Yöntemler Göre Tekniği Önemi
Kesit ve immünhistokimya: avantaj yerine parafin veya daha dondurulması ile GMA gömme17 elde edilebilir, ince bölümlerine bağlı morfoloji ve antijenler ve küçük biyopsilerinden bölümden daha fazla sayıda üst korunması vardır.
Enzimatik sindirim akım sitometri ve. Küçük biyopsilerinden tek hücre elde edilmesi ile, çok daha fazla bilgi akış sitometrisi çok renk ile elde edilebilir.
Bu Tekniği Mastering sonra gelecek Uygulamalar veya Tarifi
Bu protokol, immünohistokimyasal birleştiren ve akış sitometresi ile küçük endobronfliyal biyopsilerinden elde edilebilir bilgi maksimize etmek için, iki paralel yöntem tarif. Böyle DC'ler gibi nadir bağışıklık hücrelerinin mekansal dağılımını karakterize etmek için biyopsiler benzer işaretleri ile diğer bağışıklık hücrelerinden DC'ler ayırt etmek ise, immünohistokimya için ince kesitler elde etmek GMA gömülü olabilir, biyopsi enzimatik sindirim çok renkli akım sitometri veriyor PE olduğurformed. Inflamasyon veya hastalık sırasında DH'lerin yeni özelliklerinin tarafsız kimlik etkinleştirmek için, akış sitometrik verilerinin otomatik analizi özellik çıkarma algoritmaları 22 uygulanarak yapılabilir. Gelecekteki uygulamalar RNA sıralanması veya transkriptomik profilleme için kullanılabilir belirli hücre popülasyonlarının toplamak için hücre sıralama bu tek hücre kullanmayı içerir. akciğerlerde ikamet eden DC'ler kimlik sağlığı ve hastalıkları sırasında bağışıklık manzara değişiklikleri anlamak için önemli olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.
Acknowledgments
Yazarlar, bu çalışmanın klinik malzeme katkıda bulunan gönüllülere teşekkür etmek istiyorum. Biz de tüm klinik materyalin toplanması için Halk Sağlığı ve Klinik Tıp, Tıp / Solunum Hastalıkları Bölümü, Üniversite Hastanesi, Umea (Norrlands universitetssjukhus) Bölümü personeline teşekkür ediyoruz.
Bu çalışma İsveç Araştırma Konseyi, İsveç Kalp-Akciğer Vakfı, Stratejik Araştırmalar İsveç Vakfı ve Karolinska Enstitüsünde AS-S hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bronchoscopy | |||
| Bronchoscope BF1T160 | Olympus | BF1T160 | |
| Light source | Olympus | Exera CV-160 | |
| Fenestrated forceps | Olympus | FB21C | Used to take biopsies |
| Bite Block | Conmed | 1429 | 20 mm x 27 mm |
| Glucose 25% | 500 ml intravenous | ||
| Glycopyrronium bromide 0.2 mg/ml | Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion | ||
| Mixt. Midazolam 1 mg/ml p.o | Can be used for extra relaxation | ||
| Lidocaine, 40 mg/ml | Mouth and throat administration / Gargled | ||
| Lidocaine 100 mg/ml spray | Administered to back of throat | ||
| Lidocaine 20 mg/ml spray | Administered via bronchoscope to airways | ||
| GMA processing and embedding | |||
| Glass vials | 5 ml | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-1L | |
| Molecular sieves, 4 Å | Alfa Aesar | 88120 | 3-4 mm diameter pellets |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P-7626 | 0.035 g/100 ml acetone |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I-6125 | 0.37 g/100 ml acetone |
| Polythene-flat TAAB embedding capsules | TAAB laboratories | C094 | 500x 8 mm diameter, polythene, flat-bottom capsules |
| Capsule holder | TAAB laboratories | C054 | Holds 25 8 mm capsules |
| JB-4 GMA embedding kit | Polysciences | 00226 | Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12) |
| Methyl benzoate | Sigma-Aldrich | 27614-1L | |
| Silica gel with humidity indicator | Scharlau | GE0043 | 2.5-6 mm |
| GMA sectioning | |||
| Glass microscope slides | ThermoFisher Scientific | 10143562CEF | Cut edges, frosted end |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920-500mL | 1:10 for working solution |
| Sheet glass strips for ultramicrotomy | Alkar | ||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Wash solution (0.1% Tween20) |
| LKB 7800B Knifemaker | LKB | ||
| Capsule splitter | TAAB laboratories | C065 | |
| Carbon steel single edge blades | TAAB laboratories | B054 | |
| Vice | |||
| Ammonia, 25% | VWR | 1133.1000 | 2 ml in 1 L, 1:500 (0.05%) |
| Microtome | Leica | Leica RM 2165 | |
| Light source | Leica | Leica CLS 150 XE | |
| Microscope with swing arm stand | Leica | Leica MZ6 | |
| GMA Immunohistochemistry | |||
| Diamond tipped pen | Histolab | 5218 | |
| Hydrogen peroxide 30% solution | AnalaR Normapur | 23619.264 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Tris | Roche | 10708976001 | |
| Sodium chloride | VWR chemicals | 27810.295 | |
| Bovine serum albumin | Millipore | 82-045-2 | Probumin BSA diagnostic grade |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Anti-human CD45 antibody | BioLegend | 304002 | Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml |
| Anti-human CD1a antibody | AbD Serotech | MCA80GA | Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml |
| Mouse monoclonal IgG1 isotype control | Abcam | ab27479 | |
| Mouse monoclonal IgG2a isotype control | Dako | X094301-2 | |
| Vectastain ABC Elite standard kit | Vector Labs | PK-6100 | |
| AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite | Vector Labs | SK-4200 | |
| Mayers haematoxylin | HistoLab | 01820 | |
| Permanent Aqueous Mounting Medium | AbD Serotech | BUF058C | |
| Drying oven | |||
| DPX permanent mounting solution | VWR | 360292F | |
| Light microscope | Leica | Leica DMLB | |
| Microscope camera | Leica | Leica DFC 320 | |
| Analysis software | Leica | Leica Qwin V3 | |
| Enzymatic digestion | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | 55021C | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Forceps | |||
| Platform rocker | Grant instruments | PMR-30 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 14-432-22 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Flow cytometry | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit | Life Technologies | L34957 | |
| CD45 | BD | 555485 | |
| CD3 | BD | 557757 | |
| CD20 | BD | 335829 | |
| CD56 | Biolegend | 318332 | |
| CD66abce | Miltenyi | 130-101-132 | |
| HLA-DR | BD | 555813 | |
| CD14 | BD | 557831 | |
| CD16 | Biolegend | 302026 | |
| CD11c | BD | 560369 | |
| CD1c | Miltenyi | 130-098-009 | |
| CD141 | Miltenyi | 130-090-514 | |
| CD103 | Biolegend | 350212 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| LSR II Flow cytometer | BD | Flow cytometer | |
| FlowJo | FlowJo | Software for analysis | |
References
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
- Condon, T. V., Sawyer, R. T., Fenton, M. J., Riches, D. W. Lung dendritic cells at the innate-adaptive immune interface. J Leukoc Biol. 90 (5), 883-895 (2011).
- Lambrecht, B. N., Hammad, H. Biology of lung dendritic cells at the origin of asthma. Immunity. 31 (3), 412-424 (2009).
- Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
- Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).
- Demedts, I. K., Brusselle, G. G., Vermaelen, K. Y., Pauwels, R. A. Identification and characterization of human pulmonary dendritic cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 32 (3), 177-184 (2005).
- Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D. Identification rare-event detection and analysis of dendritic cell subsets in broncho-alveolar lavage fluid and peripheral blood by flow cytometry. Front Biosci. 8, s1175-s1180 (2003).
- Masten, B. J., et al. Characterization of myeloid and plasmacytoid dendritic cells in human lung. J Immunol. 177 (11), 7784-7793 (2006).
- Ten Berge, B., et al. A novel method for isolating dendritic cells from human bronchoalveolar lavage fluid. J Immunol Methods. 351 (1-2), 13-23 (2009).
- Yu, C. I., et al. Human CD1c+ dendritic cells drive the differentiation of CD103+ CD8+ mucosal effector T cells via the cytokine TGF-beta. Immunity. 38 (4), 818-830 (2013).
- Nicod, L. P., Lipscomb, M. F., Toews, G. B., Weissler, J. C. Separation of potent and poorly functional human lung accessory cells based on autofluorescence. J Leukoc Biol. 45 (5), 458-465 (1989).
- Sertl, K., et al. Dendritic cells with antigen-presenting capability reside in airway epithelium, lung parenchyma, and visceral pleura. J Exp Med. 163 (2), 436-451 (1986).
- van Haarst, J. M., de Wit, H. J., Drexhage, H. A., Hoogsteden, H. C. Distribution and immunophenotype of mononuclear phagocytes and dendritic cells in the human lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 10 (5), 487-492 (1994).
- Schlitzer, A., et al. IRF4 transcription factor-dependent CD11b+ dendritic cells in human and mouse control mucosal IL-17 cytokine responses. Immunity. 38 (5), 970-983 (2013).
- Yu, Y. A., et al. Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).
- Haniffa, M., et al. Human tissues contain CD141hi cross-presenting dendritic cells with functional homology to mouse CD103+ nonlymphoid dendritic cells. Immunity. 37 (1), 60-73 (2012).
- Britten, K. M., Howarth, P. H., Roche, W. R. Immunohistochemistry on resin sections: a comparison of resin embedding techniques for small mucosal biopsies. Biotech Histochem. 68 (5), 271-280 (1993).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
- Baharom, F., et al. Dendritic Cells and Monocytes with Distinct Inflammatory Responses Reside in Lung Mucosa of Healthy Humans. J Immunol. 196 (11), 4498-4509 (2016).
- Salvi, S., et al. Acute inflammatory responses in the airways and peripheral blood after short-term exposure to diesel exhaust in healthy human volunteers. Am J Respir Crit Care Med. 159 (3), 702-709 (1999).
- Schon-Hegrad, M. A., Oliver, J., McMenamin, P. G., Holt, P. G. Studies on the density, distribution, and surface phenotype of intraepithelial class II major histocompatibility complex antigen (Ia)-bearing dendritic cells (DC) in the conducting airways. J Exp Med. 173 (6), 1345-1356 (1991).
- Saeys, Y., Gassen, S. V., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nat Rev Immunol. 16 (7), 449-462 (2016).
