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Behavior

神经发育复检新生幼鼠

Published: April 24, 2017 doi: 10.3791/55261
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pediatrics, University of Alberta

Summary

行为测试是确定脑损伤后的结果的黄金标准，并可以识别发育障碍的婴儿和儿童的存在。神经反射是这些异常的早期指标。在新生儿啮齿动物很容易地完成发育反射测试的主机进行了开发和说明。

Abstract

神经发育反射测试是在临床实践中通常使用的，以评估中枢神经系统的成熟。神经反射也被称为原始反射。他们是敏感的，并与后来的结果是一致的。反射异常被描述为不存在，持久性，再现，或延迟反射，其是处于对神经发育障碍的高风险的婴儿的预测指标。神经发育障碍，如脑瘫的动物模型，通常表现出发育异常反射，如将人类婴儿进行观察。所描述的技术评估各种新生大鼠神经发育反射的。神经反射测试提供了研究者的测试方法，是不是在如此年轻的动物，否则可用。这里介绍的方法，目的是协助调查人员在审查新生大鼠的发育里程碑检测早发BR的方法AIN损伤和/或确定治疗性干预的有效性。这里介绍的方法，目的是为研究者提供的一般准则。

Introduction

神经反射，或发展的里程碑，是对人类新生儿和婴儿最早使用的评估项目之一。神经反射是展示脑干和脊髓反射不由自主的和重复的动作。更高皮质网络，其特征在于演进迁移，髓鞘形成，和突触的成熟促进自愿控制和皮质抑制。在中枢神经系统演进的正常进展的改变可以破坏大脑发育，产生异常皮质布线，功能，和髓鞘形成，神经发育造成反射延迟或缺席。在神经发育残疾的高风险与人婴儿通常表现出异常的早期反射。反射异常可呈现在采集，不存在延迟，延长的存在，或再现以后的生活中，并且预测发育障碍的。 1，2因此，它模仿神经发育障碍的实验模型反射延迟是很重要的。

鼠害通常用作实验模型。出生的时候幼鼠是altricial，因此太不成熟承担具体的或复杂的运动，感觉和/或认知行为的任务。在这方面，他们的发育不成熟同时涉及他们的身体和器官的发育。老鼠是天生无毛为不能thermoregulate，是盲目的，无法行走。参照大脑发育，皮质相当成熟出生后发生。新生大鼠幼崽（出生当天称为1日龄; PD1）已经被建议以达到脑成熟水平是类似于23早产人脑 - 妊娠28周，而PD7-10幼仔相当于近长期人类的大脑。 3，4，5，6这种相关性是基于大体解剖分析，但是，如髓鞘形成和振幅整合脑电图脑成熟的其他措施也已经被描述。 5,7例如，预少突胶质细胞是主要的细胞在发展人胎脑从23 - 宫内 32周，这的成熟阶段对应于PD1-3啮齿动物。 5，8，9，10此外，髓鞘形成开始于宫内在人类中，而在大鼠幼仔它出现在周围PD7-10前脑;在新生啮齿动物脑在很大程度上仍然未髓。 11，12 Tucker 等。发现，P1大鼠的振幅整合脑电图图案为类似于一个23周gesta重刑人类胎儿，而PD7和PD10小狗是类似于一个30 - 52周和足月儿，分别。 7出于这些原因，在新生幼鼠新生儿反射测试提供了捕获个体发育和/或大脑发育受阻的机会。

下面描述反射的电池适于从由姆·福克斯和A. Lubics 13,14 WM福克斯相对于在小鼠反射的个体发育的最早研究者之一的研究。 13个这些反射包括，但不限于，四肢抓握和放置，悬崖回避，扶正，加速扶正，步态，听觉惊跳，姿势，和眼图张度。两个前肢及后肢把握（分别被称为人类掌跖把握，）由脊髓反射和从非主运动区皮质抑制变得容易。 15,16后肢放置（跖反射）反映皮质脊髓束的成熟。 16，17，18崖避免（保护反应），扶正（迷宫），以及加速扶正涉及感觉输入和电动机输出之间的集成和通信（例如，那些涉及触须和前庭系统）。 19，20，21步态体现运动。 14听觉惊跳评估声刺激和巨神经元的突触连接在细胞核脑桥网状尾。 21姿势涉及适当皮质脊髓/脊柱皮质突起，肌肉力量，和神经肌肉的神经支配。 22，23马伽马氨基丁酸受体turation可与眼图张度相关。 24重要的是要记住的是，反射反映一个更复杂的网络，在这里提供的是一般的关系是非常重要的。此外，这些反射提供在非常年轻的时候在那里更复杂的行为测试是不可行的评价神经发育的快速简便的方法。

本文的目的是提供一种可以很容易地纳入实验新生大鼠研究神经发育复检的一般准则。描述的方法是在长埃文斯新生幼鼠进行和结果的定量是基于外观的第一天。该反射测试当天被启动，并且使用的设备可以被修改以更好地适应不同的实验模型（例如用于不同菌株和物种）。通过建立ref的正常生理进展在一个特定的动物模型成熟法，调查员可以评估外部应激物，内源性的操作，和/或在新生大鼠的神经发育的治疗性干预的效果。总体而言，使用反射的脑成熟的确定是在预测围产期脑损伤有利的，并且是后面反射神经发育结局的。

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Protocol

动物护理和使用委员会，健康科学阿尔伯塔大学批准了所有动物研究。

注意：虽然此协议可以适用于其他物种和品系，该协议是为Long-Evans大鼠写的。这些大鼠已经显示出具有相对于其他啮齿动物品系优越马达性能和视觉敏锐度。 25，26，用于定时怀孕，膳食补充，产妇炎症，和神经发育反射的协议如下。

1.实验动物

  1. 当大鼠到达动物住房设施，从一天或两天的任何交互不要让他们适应新的环境。继习服，每天处理的老鼠大约五天，或者当老鼠不再显示压力的迹象。人类引起的压力可以改变测试结果和乐广告流产。
  2. 一旦老鼠是舒适，养殖开始。放置两个女性和在双层养殖笼一个雄性大鼠（H = 38厘米，1800厘米2面积）过夜（3 PM -上午08点）。这些笼预防应激和拥挤。在早晨，用移液管，冲洗雌性大鼠用大约0.25毫升盐水阴道。将溶液转移到一个离心管中。
  3. 两个女性和男性放回各自的传统笼养。
  4. 查看在光学显微镜（100倍）下在1.2节中收集的溶液，以确定将大鼠经历其发情周期的阶段，以及是否精子都存在。如果有精子，记录日期为胚胎天（E1）（ 图1）。如果怀孕，给女性她自己在E14的笼子。
    注意：在阴道涂片细胞是明确的，因此使用低光设置。确保冷凝器被调整到它的最低值。广告只是亮度控制调暗的光。如果亮度旋钮可用，将其设置为1。

2.早期断奶仔猪

注：此协议旨在最后一周怀孕，以评估饮食椰菜芽消费的治疗效果。据吴某等人成长的豆芽。 27。

  1. 浸泡花椰菜芽种子2 - 3小时。传播种子出在工作台面上种子sprouter盒和上发芽温暖表面设置。
  2. 水的种子，每天两次，一次是在AM（8 - 上午09点），一次在下午（3 - 下午4点）。
  3. 在第五天，通过一天的窗口放置豆芽（豆芽应该各有两片叶子，将成为绿色在一天）。
  4. 在一天结束时，通过轻轻地拉动花椰菜芽出筛分箱的收获豆芽打下在平坦表面上干燥。
  5. 一旦豆芽被完全干燥，瓦特eigh出200毫克，并装在密封的塑料袋中。
  6. 自E14，每日饲料每妊娠大鼠200mg的干燥花椰菜芽，直到PD21（一天幼仔断奶）。

3.炎症

  1. 诱发炎症和后代繁殖白质损伤，与脂多糖（LPS）的E19和E20每12小时注入孕鼠。在注射的当天，把笼到从住房设施的实验室。允许孕鼠驯化和变得冷静至少1小时。如果老鼠显示出永久的全身性或肾损害的临床症状，将立即实施安乐死，并从研究中移除。
  2. 称量怀孕水坝。
  3. 溶解200微克/千克的LPS（血清型0127：B8）在100μL生理盐水。吸出溶液到装有30 G½针1mL注射器。
    1. 使用新针，每次注射。使溶液预热几分钟，以尽量减少不适。
    2. 记录的时间和腹腔注射孕大坝。侧之间交替注射，以确保均匀分布。
      注：Machholz 等。讲解了正确的克制和注射过程。 28

    4.发展反射测试

    1. 在PD1（出生日期），请从大坝和记录出生体重的幼崽。将幼仔放回各自的笼子里，它们移动到动物设施，直到PD3。这确保水坝和小狗之间母体接合。
      1. 记录了可靠的评估复检。调整视频摄像机，以便它处于最大快门速度以一帧一帧的分析（1 / 1,000或多个）。使得其正上方或大鼠幼仔和用于每个反射所有材料旁边的摄像机位置。例如，对于后肢放置，放置相机大鼠幼崽的旁边，以保证提升和后肢放置被捕获。
      2. 对于加速扶正，将老鼠的小狗和着陆垫上面的摄像头，以记录小狗在半空中权的能力。
    2. 每天记录的权重，直到实验结束。上PD3，开始神经发育反射测试（ 图4）。移动笼成一个安静的房间最少测试前1个小时，以允许适应于环境。
    3. 在一致的时间，每天进行神经反射测试，大鼠是夜行动物。例如，上午09点之间的测试 - 每日下午12点。保持幼仔直属加热灯或在散热垫在所有时间，以维持稳定的体温为36.5℃;这个年龄段的幼鼠很容易失去的热量。用直肠温度探头测量。如果有效地完成，仔兔体温不改变，因为他们没有从大坝和枯枝落叶足够长的时间删除。注：监视热灯的温度，以确保其不超过37℃。 记录每一个反射的分数每一天直到肯定响应是观察。当小狗能连续两天执行任务时，会发生积极的反射反应。的积极响应的第一次出现的日期用于定量。没有进一步检测后的积极响应。因此，结束日期为每个反射是可变的。
  4. 前肢抓
    1. 开始在PD3，进行前肢握持反射测试。放置一个钝杆针对各前爪的手掌和手动应用光压力。光压力应稍移位前爪，确保接触时和幼崽能感觉到杆。抓会作为在该棒所有数字屈曲。当两个前爪抓住棒连续2天成功收购这种反射的发生。
    2. 分数前肢把握：
      0为不抓
      1用于由一个前爪成功把持（左或r飞行前爪可以在这里指定）
      2，通过这两个前爪抓成功
  5. 后肢抓
    1. 开始在PD3，进行后肢握反射测试。放置一个钝杆对每个后爪的鞋底和手动应用光压力。光压力应该稍微移动后爪，确保接触时和幼崽能感觉到杆。杆成功抓取出现的绕杆数字屈曲。当两只后爪抓住棒连续2天成功收购这种反射的发生。
    2. 分数后肢把握：
      0为不抓
      1成功把持由一个后爪（左或可以在这里指定右后爪）
      2，通过两只后爪抓成功
  6. 扶正
    1. 开始在PD3，开始翻正反射测试。牢牢把握在仰卧位的小狗，用四只爪子直立。放开ØF中的小狗，并立即开始计时。当小狗能够翻转/翻转到所有四只爪实现扶正，并且每个爪是垂直于本体。给每个小狗最多的15秒来实现这一目标。
    2. 分数扶正：
      0仰卧（或15秒的最大分配的时间）
      1侧卧（左侧或右侧可以在这里指定）或小狗的右，但在错误的姿势（或15秒的最大分配时间的能力）
      2成功扶正和适当的姿势
  7. 配售后肢
    1. 开始在PD4，开始后肢放置反射试验。垂直握住小狗在空中，由躯干。轻轻中风后爪的背部用钝表面（诸如桌子的边缘）。正确的放置反射是当大鼠幼仔撤回刺激后肢，随后向下后肢在该表面上的放置。
    2. 分数后肢PLacing反射：
      0为不成就
      1为一个后爪的放置（左或可以在这里指定右后爪）
      2成功后肢放置于两个后爪
  8. 悬崖回避
    1. 开始在PD4，开始了悬崖回避测试。放置大鼠幼仔在平坦表面的边缘，使得所述小狗的前爪和口鼻部是在边缘。正确的结果是一种保护性反应，其中，所述大鼠幼鼠从悬崖的边缘却步。实验者的手或泡沫着陆被放置在悬崖下方，以赶上从秋季小狗。
    2. 分数悬崖回避：
      0表示无运动或脱落的边缘
      1对试图摆脱悬崖走，但有四肢挂
      2成功的运动从悬崖上掉
  9. 步态
    1. 开始步态对PD6评价。在15厘米的diamet的中心地点幼仔呃圈，让小狗30秒完成任务。当大鼠幼崽能够在少于30秒移动至圆的外侧既前爪进行14成功的步态。
    2. 分数步态以秒所花费的老鼠的小狗外循环移动所需的时间。记录花费的小狗移动圈外两个前爪的时间。记录30秒，如果幼犬无法在规定时间内完成任务
  10. 听觉惊吓
    1. 开始在PD10听觉惊吓的分析。呈现巨响（钟形）直接在小狗评估惊愕反应是否存在。当小狗显示“抽搐”移动，从声音远观察到的正的惊恐反应。
    2. 分数听觉惊吓：
      （或没有）为无惊恐反应
      （或者是）对于正惊恐反应
  11. 姿势
    1. 开始对PD态势分析12.在非滑开表面地点幼仔，观察移动时小狗具有姿势。不成熟的姿态由移动时腹部，并相对于主体二者前爪和后爪的垂直指向的拖动反射。一个成熟的姿势被获取时小狗可以从表面抬起腹部和两个前爪和后爪，指出直的或平行于主体，移动时。
    2. 分数姿势：
      0为不运动
      移动时1未成熟姿势
      2为成熟的姿势而移动
  12. 眼开
    1. 开始在PD12大开眼界的分析。记录当天两眼皮开：
      0为不可见的眼睛
      1为一个可见的眼睛（左或右侧可以在这里指定）
      2两个可见的眼睛
  13. 加速正位
    1. 开始于PD14，开始加速测试扶正。将小狗在仰卧位30.48Çentimeters上述泡沫着陆。掉落的小狗，并观察其对权利本身的能力。扶正是指当小狗能翻身俯卧位和土地上它的爪子。
    2. 分数加速扶正：
      0落在它的后面
      1坠落在其一侧（左侧或右侧可以在这里指定）
      2登陆它的爪子

注：不同类型的反射的定量可根据研究者的问题。该反射的量化可以作为一种条件反射的初步观察，外观起来的第一天，直到反射消失，花费的时间成功地完成了任务，性能速度，和/或随着时间的性能改进来完成。 13，14，29，30，31为Current研究中，外观的第一天作为一个得分。当使用多子模型，来自同一窝幼仔通常的行为类似，由于他们的基因构成， 在子宫内和产后的环境和营养的可用性。 32因此，单个小狗不能占作为n = 1，由于垫料偏压。一窝内检查幼仔可以被平均，使得每个窝表示n = 1。 32，33可替换地，同窝内的几个幼仔可以使用混合效应模型，其中考虑到幼仔同一窝内进行分析。 32，33

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Representative Results

本实验设计的时间轴示于图2。 30种的方法和结果之前已公布。 30本研究的目的是评估膳食补充妊娠期间花椰菜芽和断奶前周期是否保护， 在子宫内暴露于LPS诱导的神经发育由延迟的后代。定时怀孕的大鼠给予生理盐水（对照组，100μL）或LPS（200微克/千克在100μL无菌生理盐水稀释）上E19和E20每12小时腹膜内注射。随机选择的怀孕水坝也分别给予干燥花椰菜芽（200毫克/天）从E14到PD21的膳食补充。 LPS被用来模仿母体炎症和西兰花嫩芽被赋予作为一个潜在的治疗干预，以保护后代。幼鼠在E23天生的（ 表1）。上PD3开始，经历幼仔神经发育反射的电池和采集反射的被定义为天反射出现（ 图3， 表1）。请参阅更详细的参考文章。 三十

出生体重

出生体重的分析揭示治疗（= F（1,23）18.5，0.0003）的主效应，饮食（F（1,23）= 6.5，P = 0.02），和交互作用（F（1,23） = 7.4，p = 0.01）。 LPS，母体炎症的反射，导致出生与盐水相比幼仔显著较小（6.3±0.2克，Tukey的P <0.001），盐水+花椰菜芽幼仔（6.2±0.2克，杜克是P＆幼仔（5.1±0.2 G） <0.001），和LPS +花椰菜芽幼仔（6。0±0.1克，Tukey的P <0.01）。的LPS +花椰菜芽幼崽出生体重没有从控制不同，这表明花椰菜芽幸免被生长限制了LPS幼仔。

神经发育复检

抓握反射

观察两个前肢后肢把持处理或饮食没有影响。所有的幼仔能够执行这些任务。

后肢配售

治疗的主要效应（F（1,23）= 6.8，p值= 0.02）中的混合物放置后肢检测。与盐水相比，（4.3±0.1天，Tukey的P <0.05）和盐水+花椰菜芽（4.3±0.0天，Tukey的P <0.05），LPS幼鼠显著延迟（5.1±0.3天）。虽然LPS +西兰花嫩芽幼仔的表现并没有从LPS幼崽不同，他们不再从控制不同，这从那些接受LPS和未治疗幼仔这种反射任务的改进。

悬崖回避

治疗的主要效应（F（1,25）= 6.0，P = 0.02）以下悬崖回避分析进行检测。 LPS幼仔（5.8±0.4天）在获得这种反射与盐水相比，（4.4±0.2天，Tukey的P <0.05）均显著损害。 LPS +西兰花嫩芽幼崽并没有不同于任何组的执行，这表明性能的改进。

步态

治疗的显著作用（F（1,24）= 15.1，P = 0.0007），饮食（F（1,24）= 6.3，P = 0.02），和帧间（= 0.005 F（1,24）= 9.5，p）的治疗和饮食之间动作之后发现步态分析。在与盐水相比，LPS幼仔（9.7±0.4天）检测到步态的延迟获取（7.5±0.3天，Tukey的P <0.001），盐水+花椰菜芽（7.7±0.3天，Tukey的P <0.001），和LPS +花椰菜芽幼仔（7.9±0.2天，Tukey的p <0.01）。

听觉惊吓

没有观察到差异。

扶正

检测到了性别效应（F（1,43）= 16.3，P = 0.0002），用于扶正，因此，雄性和雌性幼犬分别检查。男性未检测到的差异。在女性中，饮食（F（1,21）= 11.8，P = 0.002）的主要作用和相互作用效应（F（1,21）= 15.6，p值= 0.0007）被发现。 LPS +花椰菜芽幼仔（4.9±0.4天）能够更早权相比LPS幼仔（6.7±0.6天，Tukey的P <0.05）。

加速正位

加速试验扶正揭示治疗的显著主效应（F（1,25）= 4.51，P = 0.04）。 LPS（17.4±0.6天）和LPS +花椰菜芽幼仔（16.9±0.2天）在执行被延迟加速与盐水相比（16.0±0.4天）和盐水+花椰菜芽（16.4±0.5天）扶正。

姿势

检测以下姿势的分析处理和饮食的显著相互作用效应（F（1,24）= 5.8，p值= 0.02）。 LPS +西兰花嫩芽幼仔（14.9±0.4天）有一个成熟的姿态早于LPS（17.0±0.4天，Tukey的P <0.05）。

眼开

（F（1,23）= 4.71，P = 0.04）中的溶液在问候眼开口观察到饮食的主要显著效果。两个盐水+ BRSP（15.9±0.1天）和LPS +花椰菜芽幼仔（15.4±0.2天）达到这种反射早于盐水（16.0±0.2天）和LPS幼仔（16.0±0.1天）。

总体而言，妊娠晚期和断奶前期间椰菜芽消费能够负担得起对LPS诱导发育迟缓，保护在几个调查反射的。请参阅更详细的参考文章。 三十

图1
图1.宝sitive阴道涂片。成像与光学显微镜10个物镜阴道涂片的一个例子。该滑动表示由精子（箭头）的存在所指示的正面滑动。当执行阴道涂片，大鼠的动情周期可以被评定为发情前期，发情期，动情后期，或发情间期。这有助于精确定时育种更高的怀孕成功率。

图2
图2.实验设计时间轴。实验时间表评估所生的后代给予LPS的腹腔内注射水坝。在饮食中补充西兰花嫩芽上E14开始长达PD21。水坝被注入上E19和E20每12个小时（表示为黄色箭头）。产妇权重记录体重秤和体温覆盖有润滑剂的直肠温度探头。幼仔出生naturallY开E23（表示为黑色箭头）。开始在PD3，幼仔经历几次复检。在PD21，幼仔进行开放式的现场测试，以评估行为反应。

图3
图3.神经发育反射评估的时间线的实施例。反射出现在不同的发展阶段，因此，捕捉到这些反射的收购要求，在测试前开始几天。本研究采用长埃文斯幼鼠，但菌株和物种之间存在差异，因此应使用这些日期作为一般的指导下进行了初步试验。前肢握，后肢把握，扶正进行评估上PD3，后肢放置和悬崖回避上PD4，和步态上PD6。听觉吃惊是在上PD12 PD10，姿势和眼睛的开口评估，并且加速扶正上PD14。


图4.发展反射图像。反射测试图像上PD3在长埃文斯幼鼠进行。前肢握（A），后肢握（B），和翻正（C）检查开始于PD3。崖避免（D）和后肢放置（E）测试开始上PD4。步态（F）分析开始于PD6。加速扶正的装置被描绘（G）。 请点击此处查看该图的放大版本。

检测参数 组（平均值±SEM） 主效应（p值）
产仔数和重量 盐水 盐水+西兰花嫩芽 LPS LPS +西兰花嫩芽 治疗 饮食 相互作用
产仔数（幼崽数） 13.3±1.0 13.1±1.0 10.3±1.5 11±1.2 0.03 0.8 0.7
出生体重*＃天 6.3±0.2 6.2±0.2 5.1±0.2 6.0±0.1 0.0003 0.02 0.01
PD7重量* D 15.0±0.5 15.5±0.4 11.4±1.1 13.6±0.3 0.0006 0.09 0.2
PD21重量ð 50.0±1.4 48.7±1.6 46.4±1.2 48.2±1.4 0.2 0.9 0.3
Neurodevelop-
心理反射
前肢抓住 3.0±0.0 3.0±0.0 3.0±0.0 3.0±0.0 N / A N / A N / A
后肢掌握 3.6±0.3 3.5±0.3 4.6±0.6 3.3±0.1 0.3 0.1 0.1
后肢配售* 一 4.3±0.1 4.3±0.0 5.1±0.3 4.5±0.2 0.02 0.07 0.2
悬崖回避* 一 4.4±0.2 4.7±0.2 5.8±0.4 5.0±0.4 0.02 0.4 0.1
步态*＃一 7.5±0.3 7.7±0.3 9.7±0.4 7.9±0.2 0.0007 0.02 0.005
听觉惊吓一 11.5±0.3 11.5±0.1 12.0±0.5 11.8±0.2 0.2 0.8 0.9
姿势#A 15.6±0.5 15.9±0.6 17.0±0.4 14.9±0.4 0.8 0.08 0.02
眼开一个 16.0±0.2 15.9±0.1 16.0±0.1 15.4±0.2 0.08 0.04 0.2
加速扶正 16.0±0.4 16.4±0.5 17.4±0.6 16.9±0.2 0.04 1 0.3
扶正＃A（女性） 4.9±0.5 5.1±0.4 6.7±0.6 4.6±0.4 0.09 0.003 0.0007
扶正 （雄性） 3.9±0.2 4.6±0.3 5.9±1.9 4.2±0.6 0.4 0.6 0.2
外观的天 * LPS和盐水之间有显着差异
进行次活动的数量为B “3”>＃LPS及LPS + BRSP之间有显着差异
ç秒
ð克

表1.重量和神经发育反射的结果。从在子宫内的炎症和/或膳食花椰菜芽补充暴露于后代获得的结果。 30个这里介绍的权重是从出生，PD7和PD21。选择的时间点来表示一个早产儿，期限，以及1-2岁的婴幼儿。数据表示为平均值±SEM。统计分析研究中使用的是一种双向ANOVA接着Tukey的事后检验。外观的=天，B =次执行活动，和c数=执行活动，* =在时间（s）LPS和控制，＃= LPS及LPS +花椰菜芽之间显著差之间显著差异。 N = 5 -每组7窝（从四个幼仔中，两个雄性和雌性二，一垫料内的值进行平均来表示屑）。

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Discussion

神经反射测试是不正常的皮质发育和成熟的预测指标，这可能是情况下，其中明显的神经病理学并不明显意义。在神经发育测试，关键是要确保幼崽在同一时间每天检查。鼠是夜间活动，因此，如果测试是在一天中的不同时间执行他们的昼夜节律可能会改变性能。 34测试应在安静的房间内完成为大声喧哗，可以加应力的幼崽。 35只幼仔需要至少1个小时，以适应新的环境中，由于传输，人工处理，和新颖的设置可以在幼仔诱导应力。 35只幼仔还需要直接加热灯的下方或在加热垫的测试。仔兔年轻，能力稍逊，他们能够thermoregulate。 36由于这个原因，幼仔给出15秒和30秒用于分别执行上PD6 PD3上扶正和步态。 36此外，控制幼仔不应增长出生的时候限定，以重量表示的混杂因素。窝也应扑杀至8 - 10提供等于养料和性的表示。一旦幼仔诞生了，它允许一天的老鼠形成与大坝的结合，以预防孕产妇忽视是非常重要的。

幼犬必须进行测试一两天，前一天他们获得的反射，以捕捉外观的发作。根据实验模型，可能需要进行一些修改。新生小鼠比大鼠小得多。因此，用于可以具有设备的尺寸要被调整到新生小鼠的大小。一些故障排除可能还需要。不同菌株和物种可以具有反射的发作的略微不同的定时。 13在本报告中详述的定时是specific键长埃文斯幼仔，与测试开始于PD3，4，6，10，12新反射，和14（ 图3）。研究者可能需要在执行2反射测试 - 3升建立之前的实验测试的自然反射进展。此外，收集的数据进行统计分析时，实验者必须使用适当的技术来防止垃圾偏差。来自同一窝幼仔趋于类似地执行彼此，因此垫料表示n = 1，而不是个别的小狗。 32，33

测试神经反应能力很重要，因为它可用于新生儿的啮齿动物的唯一的测试，因为更复杂的行为测试，在这个年龄段是不可能的。没有其他措施，除了体重和外貌这个早期阶段提供。这里提供的方法已被用于一些研究者，从而支撑使用神经反射性的测试，尤其是在年轻的啮齿动物，而其他行为测试是不可行的。 13，14，29，30，31，37，38这些测试平行于反射在人类婴儿中进行测试，可以预测神经发育障碍，例如大脑性麻痹，并提供有关神经网络的个体发育的附加信息。反射的出现期间在断奶前周期的特定时间发生时，反映了神经系统的成熟。 39此协议的一个限制是，不是所有的实验模型可以进行反射的测试。鼠害是天生的不成熟，使得它们出生后的发育提供了捕捉反射发展的发病优势。其它动物模型如因为羊肉是天生的成熟和啮齿动物不同的发展，使一些复检的并不适用于这种模式。此外，反射测试不是认知或行为异常的直接测量，这是不确定的任何观察到的异常是否是暂时的还是持久的。

除了反射，行为测试可用于补充分析在老龄阶段进行。这是很重要的，因为异常反射延迟并不总是导致神经发育障碍。 2，40的测试通常在施用PD21（断奶的天）开始时啮齿动物能够执行认知和运动的任务。这些测试包括机器人不限于转棒，Morris水迷宫，和高架十字迷宫。简言之，将旋转试验是通过将啮齿动物在旋转棒，并记录其性能在杆的一段时间或直至所述啮齿动物瀑布进行关闭。本试验评估运动学习和实力，以及大脑结构如基底节和小脑的完整性。 41 Morris水迷宫是由放置在乳白色水一池的啮齿动物，并记录所花费的啮齿动物找到一个水下平台的时间。线索可以放在具有相同的提示总是在平台上面的池的每个象限以上。这种检查自我中心VS海马介导的空间学习和记忆的自我中心形式。 42高架十字迷宫测试测量的恐惧和焦虑，以及固有的探索行为。啮齿动物被放置在四个臂中，两个封闭和两个开放的中心，在地面上方升高。 43回避和探究行为（评估为在每个臂所花费的时间）的啮齿动物被记录的。 43个这些附加的测试检查感觉运动和认知功能，从而允许调查者作为SESS侮辱是否持续到成年，或者它是否是短暂的。

发育迟缓的预测，并补充行为测试需要提供针对病症以后的生活中存在互补性的证据。此外，控制响应必须有应变和物种的差异，遗传改变，药品监督管理， 等等。尽管有这些条件试验之前进行优化，所描述的技术很快就学会了，容易掌握，价格低廉，并提供有关的发展有着重要信息神经系统。他们提供了一个机会，以评估在上了年纪的幼崽神经系统的个体发育和成熟时，他们无法执行成熟的行为任务。此外，人类婴儿经常经历发育反射测试，并且因此，啮齿动物反射测试提供可译的装置。总之，这是一个异常初步筛选的好方法新生儿，可导致认知和行为的调查后神经发育。

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Disclosures

作者什么都没有透露。

Acknowledgments

作者要感谢我们的资助机构，其中包括NeuroDevNet（卓越的国家中心），将ALVA基金会，妇女和儿童健康研究所和艾伯塔大学。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Breeding
Transfer pipettes Fisherbrand 12-711-9AM Used for vaginal flushes.
Sterile Saline Hospira 7983254 The solution used to collect cells during vaginal flushes.
400 µL Microcentrifuge tubes Fisherbrand 05-408-120 Used to hold the saline solution.
Light microscope Leica Leica ATC 2000 For observation of the saline solution. Can be any light microscope used in the lab.
Slides Fisherbrand 12-552-5 The saline solution is placed on the slide. Can be any slides used in the lab.
Coverslips Fisherbrand 12-545-F To coverslip the slides. Can use any coverslips used in the lab.
Dietary  Supplementation
Broccoli Sprouts seeds Mumm's Sprouting Seeds Broccoli sprouts seeds are ordered and grown in the lab.
Countertop Seed Sprouter Box Mumm's Sprouting Seeds A box is used to germinate and grow the seeds prior to harvest.
250 mL beaker The beaker is used to soak the seed. Any size beaker that would fit can be used.
Maternal Inflammation
Lipoplysaccharide (LPS) Sigma L3129 The endotoxin used to mimic maternal inflammation.
1 mL Syringe BD Syringe 309659 Used to inject the pregnant rat.
Gauge (30 G x 1/2) BD PrecisionGlide Needle 305106 Use the smallest needle to avoid pain and discomfort.
Sterile Saline (0.9% Sodium Chloride, USP) Hospira Saline is used to dissolve LPS.
Weights
Scale Denver Instrument For recording the weights. Can be any scale with 2 decimal places used in the lab.
Neurodevelopmental Reflexes
Thin blunt rod Can be a paperclip or toothpick. This is for forelimb and hindlimb grasping.
Round filter paper Whatman 1001 150 15 cm diameter paper used for gait analysis.
Timer Fisher Scientific 06-662-51 For timing the time allocated to righting and gait.
Blunt surface Can be an edge of a table. This is for hindlimb placing and cliff avoidance.
Foam landing For when the pups perform accelerated righting.
Video recorder Sony VCT-D580RM To record all reflexes tested. Must be able to record at 1/1,000 fps
Bell For auditory startle. 
Heat lamp or pad To maintain the body temperature of the pups underoing examination.

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References

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Nguyen, A. T., Armstrong, E. A., Yager, J. Y. Neurodevelopmental Reflex Testing in Neonatal Rat Pups. J. Vis. Exp. (122), e55261, doi:10.3791/55261 (2017).

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