Summary
testes de comportamento é o padrão ouro para determinar os resultados após lesão cerebral, e pode identificar a presença de deficiências de desenvolvimento em lactentes e crianças. reflexos do desenvolvimento neurológico são um indicador precoce destas anormalidades. Uma série de testes de reflexo de desenvolvimento facilmente realizados em roedores neonatais foram desenvolvidos e descritos aqui.
Abstract
teste de reflexo do neurodesenvolvimento é vulgarmente utilizados na prática clínica para avaliar a maturação do sistema nervoso. reflexos do desenvolvimento neurológico são também referidos reflexos como primitivos. Eles são sensíveis e consistente com os resultados posteriores. reflexos anormais são descritos como uma ausência, persistência, reaparecimento, ou latência de reflexos, que são os índices preditivos de crianças que estão em alto risco para desordens do neurodesenvolvimento. modelos animais de deficiência do desenvolvimento neurológico, como paralisia cerebral, muitas vezes exibem reflexos desenvolvimento aberrantes, como seria observado em bebês humanos. As técnicas descritas avaliar uma variedade de reflexos do neurodesenvolvimento em ratos recém-nascidos. teste de reflexo do desenvolvimento neurológico oferece o investigador um método de teste que não seja de outra forma disponíveis em tais animais jovens. A metodologia aqui apresentada destina-se a ajudar os investigadores no exame marcos de desenvolvimento em ratos recém-nascidos como um método de detecção de largo de início precocelesão ain e / ou determinação da eficácia de intervenções terapêuticas. A metodologia aqui apresentada tem como objetivo fornecer uma orientação geral para os investigadores.
Introduction
reflexos do desenvolvimento neurológico, ou marcos de desenvolvimento, são uma das primeiras avaliações utilizadas em recém-nascidos humanos e bebês. reflexos neurológicos são movimentos involuntários e repetitivos que demonstram tronco cerebral e da medula espinhal reflexos. Maturação de redes corticais superiores caracterizadas por migração em evolução, mielinização, e sinaptogénese promover controle voluntário e inibição cortical. As alterações na progressão normal da evolução do sistema nervoso central podem interromper o desenvolvimento do cérebro, resultando na fiação anormal cortical, funcionamento, e mielinização, causando atrasos reflexas do neurodesenvolvimento ou ausências. bebês humanos de alto risco para a deficiência do desenvolvimento neurológico, muitas vezes exibir primeiros reflexos anormais. reflexos anormais podem apresentar-se como um atraso na aquisição, ausência, presença prolongada, ou reaparecimento mais tarde na vida, e são preditivos de deficiências de desenvolvimento. 1, 2 Portanto, É importante para imitar atrasos reflexas em modelos experimentais de deficiência do neurodesenvolvimento.
Os roedores são vulgarmente utilizados como modelos experimentais. filhotes de ratos são altricial quando nasceu, e, portanto, muito imaturo para realizar motor específico ou complexo, tarefas comportamentais sensoriais e / ou cognitivas. A este respeito, a imaturidade do desenvolvimento refere-se a ambos o seu desenvolvimento físico e órgão. Ratos nascem sem pêlos com uma incapacidade de termorregulação, são cegos e incapazes de andar. Com referência ao desenvolvimento do cérebro, maturação cortical substancial ocorre no pós-natal. crias de ratos recém-nascidos (dia de nascimento referido como dia pós-natal 1; PD1) têm sido sugeridos para atingir um nível de maturação do cérebro que é semelhante a um cérebro humano prematuro de 23 - 28 semanas de gestação, enquanto PD7-10 filhotes são equivalentes a quase- cérebro humano prazo. 3, 4, 5, 6Esta correlação baseia-se em análises anatómicas bruto, no entanto, também têm sido descritas outras medidas de maturação cerebral, tais como electroencefalogramas mielinização e amplitude integrado. 5, 7, por exemplo, pré-oligodendrócitos são as células predominantes no cérebro fetal humano em desenvolvimento a partir de 23 - 32 semanas no útero, e esta fase de maturação corresponde a um roedor PD1-3. 5, 8, 9, 10 Além disso, a mielinização começa no útero em seres humanos enquanto que em ratos, que aparece na parte frontal do cérebro em torno PD7-10; o cérebro de roedores recém-nascido permanece em grande parte un-mielinizadas. 11, 12, Tucker et ai. descobriu que o padrão de eletroencefalograma de amplitude integrada de um rato P1 para ser semelhante a um 23-semana gestação feto humano, ao passo que um filhote de cachorro PD7 e PD10 é semelhante a um 30-32 semana e termo infantil, respectivamente. 7 Por estas razões, o teste de reflexo recém-nascido em filhotes de ratos neonatais oferece uma oportunidade para capturar a ontogenia e / ou interrupção do desenvolvimento do cérebro.
A bateria de reflexos descritos abaixo são adaptados a partir de estudos por WM Fox e R. Lubics 13, 14 WM Fox foi um dos primeiros investigadores a respeito da ontogenia dos reflexos no rato. 13 Estes reflexos incluem, mas não estão limitados a, agarramento do membro e colocação, evitar rochedo, endireitamento, acelerado endireitamento, da marcha, de sobressalto auditivo, postura, e da abertura do olho. Ambos dos membros anteriores e dos membros posteriores aperto (referido como palmar e plantar aperto em seres humanos, respectivamente) são facilitados por meio de reflexos espinais e inibição corticoespinhal de áreas motoras não primários. 15, 16 dos membros posteriores colocação (reflexo plantar) reflecte a maturação do tracto corticoespinhal. 16, 17, 18 Cliff evitação (respostas protectoras), endireitamento (labirinto), e acelerado endireitamento envolvem integração e a comunicação entre a entrada sensorial e a saída do motor (tais como os envolvidos com as vibrissas e vestibular). 19, 20, 21 Gait reflecte locomoção. 14 de sobressalto auditivo avalia estimulação acústica e conexões sinápticas de neurónios gigantes no núcleo reticular pontis caudal. 21 Postura envolve projecções adequadas corticais-espinal / espinal-cortical, a força muscular, neuromuscular e inervação. 22, 23 Maturation dos receptores de ácido -aminobutírico gama pode correlacionar com a abertura do olho. 24 É importante ter em mente que os reflexos refletir uma rede muito mais complicado e desde aqui é uma correlação geral. Além disso, esses reflexos fornecer um método rápido e fácil de avaliar o desenvolvimento neurológico em idades muito jovens, onde os testes de comportamento mais complexo não é viável.
O objectivo deste estudo é o de proporcionar uma orientação geral para o teste de reflexo do neurodesenvolvimento que podem ser facilmente incorporados em estudos com ratos neonatais experimentais. A metodologia descrita foi realizada em Long-Evans crias de rato neonatal e quantificação dos resultados foi baseada no primeiro dia de aparecimento. O dia em que reflex teste é iniciado e o equipamento utilizado pode ser modificado para se adequar a uma melhor modelo experimental diferente (tal como, por diferentes estirpes e espécies). Ao estabelecer a progressão fisiológica normal de refmaturação lex num modelo animal específico, os investigadores podem avaliar os efeitos de factores de stress externos, manipulações endógenos, e / ou intervenções terapêuticas sobre neurodesenvolvimento em modelos de ratos neonatais. Em geral, o uso de reflexos como uma determinação da maturidade cerebral é vantajoso prever na lesão cerebral perinatal, e é um reflexo do neurodesenvolvimento posteriores.
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Protocol
O Animal Care e do Comitê Use, Ciências da Saúde da Universidade de Alberta aprovou todos os estudos com animais.
Nota: Embora este protocolo pode ser adaptado para outras espécies e estirpes, este protocolo é escrito para ratos Long-Evans. Estes ratos demonstraram ter desempenhos superiores a motor e acuidade visual em comparação com outras estirpes de roedores. 25, 26 O protocolo para gravidezes cronometrados, a suplementação dietética, inflamação materna, e reflexos do neurodesenvolvimento é o seguinte.
1. Animais Experimentais
- Quando os ratos chegam à instalação de alojamento animal, abster-se de qualquer interação por um dia ou dois para permitir que eles se aclimatar ao seu novo ambiente. Seguindo aclimatação, lidar com os ratos a cada dia durante cerca de cinco dias, ou quando os ratos são não mostrando sinais de stress. stress induzido-humana pode alterar os resultados do teste e de Leanúncio para a perda da gravidez.
- Uma vez que os ratos são confortáveis, a criação começa. Colocar duas fêmeas e um rato macho numa gaiola de criação de dois andares (h = 38 cm, a 1.800 cm2 da área do piso durante a noite) (03:00 - 8 AM). Essas gaiolas prevenir o stress e superlotação. De manhã, usando uma pipeta de transferência, lave a vagina dos ratos fêmeas com aproximadamente 0,25 ml de solução salina. Transferir a solução para um tubo de microcentrífuga.
- Coloque as duas fêmeas e machos de volta para suas respectivas gaiolas convencionais.
- Ver a solução recolhida na secção 1.2, sob um microscópio de luz (100X) para determinar em que fase do ciclo estral da ratazana está experimentando e se ou não o esperma estão presentes. Se existem esperma, gravar a data como dia embrionário (E1) (Figura 1). Se grávida, dá a fêmea sua própria gaiola no E14.
NOTA: As células no esfregaço vaginal são, claro, portanto, usar uma configuração de pouca luz. Certifique-se de que o condensador é ajustado para sua configuração mais baixa. de Anúnciosapenas o controle de brilho para escurecer a luz. Se um mostrador brilho está disponível, configurá-lo para 1.
2. dietética Suplementação
NOTA: Este protocolo destina-se a avaliar os efeitos terapêuticos de brócolis dietética consumo broto durante a última semana de gravidez. Crescer os rebentos de acordo com Wu et al. 27.
- Mergulhe as sementes de rebentos de brócolos por 2-3 h. Espalhar as sementes sobre uma caixa sprouter semente bancada e definida sobre uma superfície quente para a germinação.
- Regar as sementes duas vezes por dia, uma vez em a AM (8 - 09:00) e uma vez no PM (3 - 04:00).
- No dia cinco, coloque os brotos por uma janela para o dia (brotos deve ter duas folhas cada e ficará verde durante o dia).
- No final do dia, a colheita das couves puxando suavemente os rebentos de brócolos fora da caixa peneirada e deitado sobre uma superfície plana para secar.
- Uma vez que os rebentos são completamente secas, weigh a 200 mg e em lugar de um saco de plástico selado.
- Começando em E14, alimentar cada ratazana grávida 200 mg de rebentos de brócolos secas diariamente até PD21 (o dia filhotes são desmamados).
3. Inflamação
- Para induzir a inflamação e reproduzir de lesões da substância branca em prole, injectar ratazanas grávidas com lipopolissacarídeo (LPS) a cada 12 h no E19 e E20. No dia da injecção, trazer a gaiola para o laboratório a partir da instalação de alojamento. Permitir que o rato grávida para se aclimatar e tornar-se calmo durante pelo menos 1 h. Se um rato apresenta sinais clínicos de danos permanentes nos rins ou sistémica, ele vai ser imediatamente sacrificados e removida a partir do estudo.
- Pesar a barragem grávida.
- Dissolve-se 200 ug / kg de LPS (serotipo 0127: B8) em 100 mL de solução salina. Aspirar a solução numa seringa de 1 ml equipada com uma agulha 30 G ½.
- Usar uma agulha nova por cada injecção. Permitir que a solução a aquecer-se durante alguns minutos para minimizar o desconforto.
- Anote o tempo e injetar a barragem grávida intraperitoneal. injecções alternados entre os lados para assegurar a igualdade de distribuição.
NOTA: Machholz et al. descreve os procedimentos de retenção e de injecção adequadas. 28
4. testes Developmental Reflex
- Em PD1 (dia do nascimento), filhotes de remover os pesos de nascimento de barragens e ficha. Coloque os filhotes de volta para suas respectivas gaiolas e movê-los para a instalação de animal até PD3. Isto assegura a ligação entre a barragem e materna pup.
- Grave o reflexo testes para avaliação confiável. Ajustar a câmara de vídeo de modo que é a velocidade máxima do obturador para análises quadro-por-quadro (1 / s) 1000. Posicione a câmera de vídeo para que ele seja diretamente acima ou ao lado do filhote de rato e todos os materiais utilizados para cada reflexo. Por exemplo, para a colocação dos membros posteriores, colocar a câmara ao lado da cria de rato para assegurar a elevação e colocação do membro posterior é capturado.
- Para endireitamento acelerado, coloque a câmera acima do filhote de rato e almofada de aterragem, a fim de gravar a capacidade do filhote de cachorro para a direita no ar.
- pesos ficha diariamente até ao fim da experiência. Em PD3, iniciar o teste de reflexo do neurodesenvolvimento (Figura 4). Mover gaiolas num quarto silencioso durante um período mínimo de 1 h antes do teste para que se aclimatem ao ambiente.
- Realizar o teste de reflexo do neurodesenvolvimento em um tempo consistente cada dia, os ratos são noturno. Por exemplo, teste entre nove horas - doze horas por dia. Manter os filhotes directamente sob uma lâmpada de aquecimento ou sobre uma almofada de calor em todos os tempos, para manter uma temperatura corporal estável de 36,5 ° C; filhotes de ratos desta idade perdem calor facilmente. Medida com uma sonda de temperatura rectal. Se feito de forma eficiente, as temperaturas filhotes corpo não mudam, porque eles não são removidos da represa e lixo tempo suficiente. NOTA: Monitorar a temperatura da lâmpada de calor para assegurar que esta não exceda 37 ° C.
- membro anterior Grasping
- A partir do dia PD3, realizar o teste do reflexo forelimb alcance. Coloque uma haste romba contra a palma da mão de cada pata dianteira e aplicar uma ligeira pressão manual. A pressão da luz deve deslocar ligeiramente a pata dianteira para assegurar que o contacto é feito e as crias podem sentir a haste. Agarrando aparecerá como flexão de todos os dígitos em torno da haste. aquisição bem sucedida deste reflexo ocorre quando ambas as patas dianteiras agarrar a haste durante dois dias seguidos.
- Pontuação do alcance membro anterior:
0 para não agarrar
1 para agarrar bem sucedida por uma pata anterior (para a esquerda ou rforepaw ight pode ser especificado aqui)
2 para agarrar bem sucedida por ambas as patas dianteiras
- hindlimb Grasping
- A partir do dia PD3, realizar o teste do reflexo hindlimb alcance. Coloque uma haste romba contra a sola de cada pata traseira e aplicar uma ligeira pressão manual. A pressão da luz deve deslocar ligeiramente a pata posterior para assegurar que o contacto é feito e as crias podem sentir a haste. agarrar bem sucedida da haste aparece como a flexão dos dedos em torno da haste. aquisição bem sucedida deste reflexo ocorre quando ambas as patas posteriores agarrar a haste durante dois dias seguidos.
- Pontuação do alcance dos membros posteriores:
0 para não agarrar
1 para o sucesso agarrar por uma pata traseira (esquerda ou pata traseira direita pode ser especificado aqui)
2 para agarrar bem sucedida por ambas as patas traseiras
- corrigindo
- A partir do dia PD3, iniciar o teste do reflexo de endireitamento. Segure firmemente o filhote em decúbito dorsal, com as quatro patas na posição vertical. Deixar ir of o filhote e imediatamente iniciar o temporizador. Endireitamento é conseguido quando o cachorro é capaz de virar / rolar sobre a todas as quatro patas, e cada pata é perpendicular ao corpo. Dê a cada filhote um máximo de 15 s para atingir esse objetivo.
- Marcar o endireitamento:
0 para deitado de costas (ou 15 s para o tempo máximo atribuído)
1 para deitado sobre o lado (esquerdo ou do lado direito pode ser especificado aqui) ou a capacidade do filhote para a direita, mas na postura errada (ou 15 s para o tempo máximo atribuído)
2 para endireitamento de sucesso e postura adequada
- colocação hindlimb
- Começando em PD4, iniciar o membro posterior colocação de teste do reflexo. Segurar o filhote verticalmente no ar, pelo tronco. Acidente vascular cerebral suavemente o dorso da pata traseira com uma superfície de ponta romba (tal como o bordo de uma mesa). Um reflexo colocação correta é quando o filhote de rato retira a hindlimb estimulada, seguido pelo posicionamento do membro posterior para baixo nessa superfície.
- Marcar o pl hindlimbacing reflexo:
0 para nenhum sucesso
1 para a colocação de uma pata traseira (esquerda ou pata traseira direita pode ser especificado aqui)
2 para sucedida colocação hindlimb para ambas as patas posteriores
- Cliff Avoidance
- Começando em PD4, iniciar o teste penhasco evasão. Coloque a cria de rato ao bordo de uma superfície plana, de tal modo que as patas dianteiras e focinho do filhote são sobre a borda. O resultado correcto é uma resposta protectora, em que a cria de rato se afasta da borda da escarpa. A mão do experimentador ou um pouso de espuma é colocado sob o penhasco para pegar o cachorro da queda.
- Pontuação evitar penhasco:
0 para nenhum movimento ou cair fora da borda
1 por tentativas a afastar-se do rochedo mas com membros de suspensão
2 para o movimento bem-sucedido longe do precipício
- Marcha
- Comece a avaliação da marcha em PD6. filhotes lugar no centro de um 15 centímetros diameter círculo e permitir que o cachorro 30 s para completar a tarefa. 14 Uma marcha bem sucedida é realizada quando a cria de rato é capaz de se mover tanto as patas dianteiras fora do círculo em menos de 30 s.
- Marcar a marcha como o tempo em segundos que leva o filhote de rato para mover fora do círculo. Grave o tempo que leva o filhote para mover ambas as patas dianteiras fora do círculo. Ficha 30 s, se o filhote é incapaz de completar a tarefa dentro do tempo determinado
- auditivo Startle
- Iniciar a análise de sobressalto auditivo em PD10. Apresentar um ruído alto (sino) diretamente sobre o filhote para avaliar se ou não uma resposta de sobressalto está presente. A resposta de sobressalto positiva é observada quando o filhote exibe um movimento 'empurrão', longe do som.
- Marcar o sobressalto auditivo:
(Ou não) para nenhuma resposta de sobressalto
(Ou sim) para uma resposta de sobressalto positiva
- Postura
- Comece análise postura em PD12. Place filhotes sobre uma superfície aberta e não escorregadia, e observar a postura do cachorro tem quando se move. Uma postura imaturo é reflectida arrastando do abdómen, quando em movimento, e que aponta perpendicular de ambas as patas dianteiras e patas traseiras em relação ao corpo. Um postura madura é adquirida quando o cachorro pode levantar o abdómen desde a superfície e ambas as patas dianteiras e patas traseiras são apontada directamente, ou em paralelo com o corpo, quando em movimento.
- Marcar a postura:
0 para nenhum movimento
1 para a postura imaturos quando se deslocam
2 para a postura maduro enquanto se move
- Olho aberto
- Comece análise de abertura olho em PD12. Grave o dia ambas as pálpebras abertas:
0 para sem olhos visíveis
1 para um olho visível (lado esquerdo ou direito pode ser especificado aqui)
2 para dois olhos visíveis
- Comece análise de abertura olho em PD12. Grave o dia ambas as pálpebras abertas:
- Righting acelerado
- A partir do dia PD14, começar a testar corrigir acelerado. Coloque o filhote em uma supina posição 30.48 centimeters acima de uma aterragem de espuma. Soltar o cachorro e observar a sua capacidade de endireitar-se. Endireitamento se refere a quando o cachorro é capaz de virar para a posição prona e terra em suas patas.
- Marcar o endireitamento acelerado:
0 para cair em suas costas
1 para cair em seu lado (esquerdo ou do lado direito pode ser especificado aqui)
2 para pouso em suas patas
Nota: Diferentes tipos de quantificação dos reflexos estão disponíveis, dependendo da questão dos investigadores. Quantificação dos reflexos pode ser feito como a observação inicial de um reflexo, primeiro dia da aparência até o desaparecimento do reflexo, o tempo que leva para realizar com sucesso a tarefa, a velocidade de desempenho e / ou melhoria do desempenho ao longo do tempo. 13, 14, 29, 30, 31 Para o current estudo, o primeiro dia de aparecimento foi usada como um marcador. Ao usar modelos multíparas, filhotes da mesma ninhada normalmente se comportam de forma semelhante, devido à sua composição genética, no útero e ambiente pós-parto e disponibilidade nutricional. 32 Por conseguinte, um único filhote pode não ser contabilizado como uma n = 1 devido à polarização da maca. Filhotes examinados dentro de uma ninhada pode ser calculada a média para que cada maca representa um n = 1. 32, 33 Alternativamente, vários filhotes dentro da mesma ninhada pode ser analisada utilizando o modelo de efeitos mistos, que leva em conta as crias dentro da mesma ninhada. 32, 33
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Representative Results
A linha do tempo desta concepção experimental é apresentada na Figura 2. 30 Os métodos e os resultados foram publicados previamente. 30 O objetivo do estudo foi avaliar se a suplementação dietética com brotos de brócolis durante a gestação e no período pré-desmama protegida a prole de atraso do desenvolvimento neurológico induzido por exposição in utero a LPS. ratas grávidas cronometradas foram dadas injecções intraperitoneais de solução salina (controlo, 100 L) ou LPS (200 ug / kg, diluída em 100 ul de solução salina estéril) no E19 e E20 a cada 12 h. vacas prenhes aleatoriamente seleccionados também foram dadas a suplementação dietética de rebentos de brócolos foram secas (200 mg / dia) de E14 a PD21. LPS foi usado para imitar maternos brotos inflamação e brócolis foram dadas como uma potencial intervenção terapêutica para proteger a prole. Filhotes nasceram naturalmente sobre E23 (
peso de nascimento
Análise de peso de nascimento revelou um efeito principal do tratamento (F (1,23) = 18,5, 0,0003), dieta (F (1,23) = 6,5, p = 0,02), e um efeito de interacção (F (1,23) = 7,4, p = 0,01). LPS, como um reflexo da inflamação materna, resultou em crias de (5,1 ± 0,2 g) nascidos significativamente menor em comparação com os filhotes de solução salina (6,3 ± 0,2 g, p de Tukey <0,001), solução salina + brócolos da filhotes (6,2 ± 0,2 g, p de Tukey <0,001), e LPS + brócolos da filhotes (6.0 ± 0,1 g, p de Tukey <0,01). peso de nascimento dos rebentos filhotes LPS + brócolos não eram diferentes dos controlos, sugerindo que os rebentos de brócolos poupados os LPS filhotes de crescimento a ser restringido.
Desenvolvimento neurológico Reflex Testing
Agarrando Reflex
Não foram observados efeitos de tratamento ou dieta para ambos forelimb e apreensão dos membros posteriores. Todos os filhotes foram capazes de realizar essas tarefas.
Colocação hindlimb
Um efeito principal do tratamento (F (1,23) = 6,8, p = 0,02) foi detectada pela colocação dos membros posteriores. Em comparação com solução salina (4,3 ± 0,1 dias, p de Tukey <0,05) e solução salina + Rebentos de brócolos (4,3 ± 0,0 dias, p de Tukey <0,05), LPS crias foram significativamente adiada (5,1 ± 0,3dias). Embora o desempenho de LPS + filhotes Rebentos de brócolos não diferiram dos filhotes LPS, eles já não diferiu do controle, sugerindo uma melhoria nesta tarefa reflexo daqueles filhotes que receberam LPS e nenhum tratamento.
Cliff Avoidance
Um efeito principal do tratamento (F (1,25) = 6,0, p = 0,02) foi detectada após análise evitar escarpa. LPS filhotes (5,8 ± 0,4 dias) foram significativamente comprometida em obter este reflexo em comparação com solução salina (4,4 ± 0,2 dias, p de Tukey <0,05). LPS + Rebentos de brócolos filhotes não funcionar de modo diferente de qualquer um dos grupos, sugerindo uma melhora no desempenho.
Marcha
Um efeito significativo de tratamento (F (1,24) = 15,1, p = 0,0007), dieta (F (1,24) = 6,3, p = 0,02), e uma interacção entre o tratamento e dieta (F (1,24) = 9,5, p = 0,005) foi encontrado analisa seguinte marcha. A aquisição retardada da marcha foi detectada em crias de LPS (9,7 ± 0,4 dias), em comparação com solução salina (7,5 ± 0,3 dias, p de Tukey <0,001), solução salina + Rebentos de brócolos (7,7 ± 0,3 dias, p de Tukey <0,001), e LPS + Rebentos de brócolos filhotes (7,9 ± 0,2 dias, p de Tukey <0,01).
auditivo Startle
Não foram observadas diferenças.
corrigindo
Foi detectado um efeito sexo (F (1,43) = 16,3, p = 0,0002) para corrigir, por conseguinte, os filhotes de ambos os sexos e foram examinados separadamente. Não foram detectadas diferenças para os homens. Nas fêmeas, um efeito principal da Dieta (F (1,21) = 11,8, p = 0,002) e um efeito de interacção (F (1,21) = 15,6,p = 0,0007) foi encontrado. LPS + brócolos da filhotes (4,9 ± 0,4 dias) foram capazes de direito anterior em relação ao LPS filhotes (6,7 ± 0,6 dias, p de Tukey <0,05).
Righting acelerado
O teste acelerado endireitamento revelou um efeito principal significativo do tratamento (F (1,25) = 4,51, p = 0,04). LPS (17,4 ± 0,6 dias) e de LPS + filhotes de brócolos (16,9 ± 0,2 dias) foram atrasados no desempenho acelerado endireitamento em comparação com solução salina (16,0 ± 0,4 dias) e soro fisiológico + Rebentos de brócolos (16,4 ± 0,5 dias).
Postura
Foi detectado um efeito significativo a interacção do tratamento e dieta (F (1,24) = 5,8, p = 0,02) na sequência da análise de postura. LPS + brócolos da filhotes (14,9 ± 0,4 dias) teve uma postura madura mais cedo do que LPS (17,0 ± 0,4 dias, p de Tukey <0,05).
Olho aberto
Um efeito principal significativo da dieta (F (1,23) = 4,71, p = 0,04) foi observado em relação à abertura do olho. Ambos salina + BRSP (15,9 ± 0,1 dias) e de LPS + filhotes de brócolos (15,4 ± 0,2 dias) atingido esse reflexo mais cedo do que Saline (16,0 ± 0,2 dias) e LPS filhotes (16,0 ± 0,1 dias).
Em geral, o consumo de Sprout brócolos durante a gestação tarde e o período pré-desmame era capaz de proporcionar protecção contra atrasos no desenvolvimento induzida por LPS em vários dos reflexos investigados. Consulte o artigo referenciado para mais detalhes. 30
Figura 1. Positive Vaginal Smear. Um exemplo de um esfregaço vaginal fotografada com uma lente objectiva de 10x num microscópio de luz. Esta corrediça representa um slide positivo indicado pela presença de esperma (seta). Ao realizar um esfregaço vaginal, o ciclo estral da ratazana pode ser avaliada como qualquer proestro, estro, metaestro, ou diestro. Isso auxilia no sincronismo com precisão fértil para uma taxa de sucesso de gravidez superior.
Figura 2. Desenho Experimental Timeline. A linha do tempo experimental para avaliar crias nascidas de barragens dadas injecções intraperitoneais de LPS. A suplementação com brotos de brócolis começa na E14 até PD21. Barragens são injectados no E19 e E20 a cada 12 h (denotados como setas amarelas). pesos maternos são registadas com uma escala de peso e a temperatura do corpo, com uma sonda de temperatura rectal coberto com lubrificante. Os filhotes nascem naturally em E23 (denotada como uma seta preta). Começando no PD3, filhotes submetidos a vários testes de reflexo. Em PD21, filhotes de submeter-se ao teste de campo aberto para avaliar as respostas comportamentais.
Figura 3. Exemplo de uma linha do tempo para a Avaliação do neurodesenvolvimento Reflexos. Reflexos aparecem em diferentes estágios de desenvolvimento, assim, capturando a aquisição desses reflexos exige que o teste começa alguns dias antes. Este estudo utilizou crias de ratos Long-Evans, mas existem diferenças entre estirpes e espécies, portanto, uma experiência preliminar deve ser realizada utilizando estas datas como um guia geral. aperto membro anterior, aperto dos membros posteriores, e endireitamento são avaliadas em PD3, colocação dos membros posteriores e evitar escarpa em PD4, e marcha em PD6. sobressalto auditivo é avaliada em PD10, postura e olho aberturas PD12, e acelerado endireitamento em PD14.
Figura 4. Imagens de Desenvolvimento Reflexos. Imagens de reflexo testes realizados em PD3 em filhotes de ratos Long-Evans. Aperto dos membros anteriores (A), aperto do membro posterior (B), e endireitamento exame (C) começa na PD3. Cliff evitação (D) e o teste da pata traseira colocação (E) começa em PD4. Marcha (F) analisa começa na PD6. O aparelho de endireitamento acelerada é representada (L). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| exame Parâmetro | Grupos (média ± SEM) | Principais efeitos (p-valor) | |||||
| Tamanho da ninhada e Pesos | Salina | Salinas + Rebentos de brócolos | LPS | LPS + Rebentos de brócolos | Tratamento | Dieta | Interação |
| Litter Size (número de filhotes) | 13,3 ± 1,0 | 13,1 ± 1,0 | 10,3 ± 1,5 | 11 ± 1,2 | 0,03 | 0,8 | 0,7 |
| Peso ao nascer * # d | 6,3 ± 0,2 | 6,2 ± 0,2 | 5,1 ± 0,2 | 6,0 ± 0,1 | 0,0003 | 0,02 | 0,01 |
| Pesos PD7 * d | 15,0 ± 0,5 | 15,5 ± 0,4 | 11,4 ± 1,1 | 13,6 ± 0,3 | 0,0006 | 0,09 | 0,2 |
| Pesos de d PD21 | 50,0 ± 1,4 | 48,7 ± 1,6 | 46,4 ± 1,2 | 48,2 ± 1,4 | 0,2 | 0,9 | 0,3 |
| Neurodevelop- Reflexos mentais | |||||||
| Membro anterior Segure um | 3,0 ± 0,0 | 3,0 ± 0,0 | 3,0 ± 0,0 | 3,0 ± 0,0 | n / D | n / D | n / D |
| Hindlimb Segure um | 3,6 ± 0,3 | 3,5 ± 0,3 | 4,6 ± 0,6 | 3,3 ± 0,1 | 0,3 | 0,1 | 0,1 |
| Hindlimb Colocação * a | 4,3 ± 0,1 | 4,3 ± 0,0 | 5,1 ± 0,3 | 4,5 ± 0,2 0,02 | 0,07 | 0,2 | |
| Cliff Avoidance * a | 4,4 ± 0,2 | 4,7 ± 0,2 | 5,8 ± 0,4 | 5,0 ± 0,4 | 0,02 | 0,4 | 0,1 |
| Gait * # um | 7,5 ± 0,3 | 7,7 ± 0,3 | 9,7 ± 0,4 | 7,9 ± 0,2 | 0,0007 | 0,02 | 0,005 |
| Auditivo Startle um | 11,5 ± 0,3 | 11,5 ± 0,1 | 12,0 ± 0,5 | 11,8 ± 0,2 | 0,2 | 0,8 | 0,9 |
| #A postura | 15,6 ± 0,5 | 15,9 ± 0,6 | 17,0 ± 0,4 | 14,9 ± 0,4 | 0,8 | 0,08 | 0,02 |
| Oculares Aberturas um | 16,0 ± 0,2 | 15,9 ± 0,1 | 16,0 ± 0,1 | 15,4 ± 0,2 | 0,08 | 0,04 | 0,2 |
| Acelerada corrigir um | 16,0 ± 0,4 | 16,4 ± 0,5 | 17,4 ± 0,6 | 16,9 ± 0,2 | 0,04 | 1 | 0,3 |
| Corrigindo #a (fêmeas) | 4,9 ± 0,5 | 5,1 ± 0,4 | 6,7 ± 0,6 | 4,6 ± 0,4 | 0,09 | 0,003 | 0,0007 |
| Corrigir um (machos) | 3,9 ± 0,2 | 4,6 ± 0,3 | 5,9 ± 1,9 | 4,2 ± 0,6 | 0,4 | 0,6 | 0,2 |
| um dia de aparecimento | * Significativamente diferente entre LPS e solução salina | ||||||
| b Número de actividade vezes foi executada | # Significativamente diferente entre LPS e LPS + BRSP | ||||||
| c Segundos | |||||||
| d Grams | |||||||
Tabela 1. Os pesos e Neurodevelopmental Reflex os resultados. Os resultados obtidos a partir de descendência expostos a inflamação no útero e / ou rebentos de brócolos suplementação dietética. 30 Os pesos aqui apresentados são de nascimento, PD7 e PD21. Os pontos de tempo foram selecionados para representar um prematuro, prazo, e infantil 1-2 anos de idade. Os dados são apresentados como média ± SEM. A análise estatística utilizada no estudo foi uma análise de variância de duas vias seguido pelo teste post hoc de Tukey.a = dias de aparência, b = número de vezes que a actividade foi realizado, e c = o tempo (s) a actividade foi realizada, * = diferença significativa entre LPS e de controlo, # = diferença significativa entre LPS e LPS + rebentos de brócolos. n = 5 - 7 litros por grupo (valores de quatro crias, dois machos e duas fêmeas, dentro de uma ninhada foram calculadas as médias para representar a ninhada).
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Discussion
teste de reflexo do neurodesenvolvimento é uma medida preditivo do desenvolvimento cortical anormal e maturação, que podem ser de importância em circunstâncias onde neuropatologia evidente não é evidente. Durante o teste do neurodesenvolvimento, é crítico para assegurar que os filhotes são examinadas ao mesmo tempo por dia. Os ratos são noturnos e, portanto, o seu ritmo circadiano pode alterar o desempenho se o teste é realizado em tempos diferentes durante o dia. 34 O teste deve ser concluído em uma sala silenciosa como ruídos altos pode adicionar estresse para os filhotes. 35 Os filhotes requerem um mínimo de 1 hora para se aclimatar a novos ambientes, desde o transporte, manuseio humano, e as configurações novas pode induzir o stress nos filhotes. 35 Os filhotes também precisam ser testados directamente por baixo de uma lâmpada aquecida ou em uma almofada aquecida. O mais jovem dos filhotes, a menos capazes eles são capazes de termorregulação. 36 Por este motivo, os filhotes são dadas 15s e 30 s para efectuar o endireitamento em PD3 e marcha em PD6, respectivamente. 36 Além disso, os filhotes de controlo não deve ser restringido crescimento quando carregado, como peso representa um factor de confusão. Ninhadas também deve ser abatidos para 8-10 para proporcionar nutrição e igual representação de relações sexuais. Uma vez que os filhotes nascem, é importante para permitir um dia para o rato para formar uma ligação com a represa para evitar negligência materna.
Os filhotes devem ser testados um ou dois dias antes do dia em que adquirir o reflexo, a fim de capturar o início da aparência. Dependendo do modelo experimental, pode ser necessário algumas modificações. ratos recém-nascidos são muito menores do que os ratos. Portanto, o tamanho do equipamento utilizado pode ter de ser ajustado para o tamanho dos ratinhos recém-nascidos. Alguns solução de problemas também podem ser necessários. Diferentes estirpes e espécies podem ter um pouco diferente de temporização do aparecimento dos reflexos. 13 O momento detalhado neste relatório é especific para filhotes Long-Evans, com testes para novos reflexos comecem em PD3, 4, 6, 10, 12, e 14 (Figura 3). O investigador pode precisar de realizar testes de reflexo em 2 - 3 litros de estabelecer a progressão reflexo natural antes do ensaio experimental. Além disso, ao realizar análises estatísticas nos dados recolhidos, o experimentador deve utilizar técnicas adequadas para prevenir a produção de areia. Filhotes da mesma ninhada tendem a realizar de forma semelhante a um outro, por conseguinte, a maca representa um n = 1, não o cachorro indivíduo. 32, 33
Testando os reflexos do desenvolvimento neurológico é importante porque é o único teste disponível para roedores recém-nascidos, uma vez que os testes de comportamento mais complexo não é possível nestas idades. Há outras medidas estão disponíveis neste período precoce, além de peso e aparência física. As composições proporcionadas aqui têm sido usadas por muitos investigadores, apoiando assim autilização de testes reflexo neurológico, especialmente em roedores jovens, onde outros testes comportamentais não são viáveis. 13, 14, 29, 30, 31, 37, 38 Estes testes paralelos para reflex no teste realizado em lactentes humanos, são preditivos de desordens do neurodesenvolvimento, tais como a paralisia cerebral, e fornecer informações adicionais sobre a ontogenia das redes neurais. O surgimento de reflexos ocorre durante os tempos específicos durante o período de pré-desmame, reflectindo a maturação do sistema nervoso. 39 Uma limitação deste protocolo é que nem todos os modelos experimentais pode ser submetido a testes de reflex. Roedores nascem imaturos, de tal forma que o seu desenvolvimento pós-natal oferece a vantagem de capturar o início do desenvolvimento reflexo. Outros modelos animais, taiscomo o cordeiro nascem maduros e desenvolver de forma diferente de roedores, de modo que alguns dos testes de reflexo não é aplicável a este modelo. Além disso, testes de reflexo não é uma medida direta de alterações cognitivas ou comportamentais, e é incerto se quaisquer anormalidades observadas são transitórios ou persistentes.
Além de reflexos, testes comportamentais pode ser realizada para análises complementares em idades mais avançadas. Isto é de importância porque os atrasos reflexos aberrantes nem sempre levam a desordens do desenvolvimento neurológico. 2, 40 Os ensaios s tipicamente administradas começando em PD21 (o dia do desmame) quando os roedores são capazes de realizar tarefas cognitivas e motoras. Estes testes incluem bot não limitado ao rotarod, labirinto aquático de Morris, e labirinto em cruz elevado. Resumidamente, o teste rotarod é realizado por colocação do roedor em uma haste rotativa, e gravando o seu desempenho na haste durante um período de tempo, ou até que as quedas de roedoresfora. Este teste avalia a aprendizagem de motor e força, bem como a integridade das estruturas cerebrais tais como gânglios basais e cerebelo. 41 O Morris labirinto de água consiste na colocação do roedor em uma piscina de água branca leitosa, e gravar o tempo que leva o roedor para encontrar uma plataforma submersa. Sugestões podem ser colocados acima de cada quadrante da piscina com a mesma sugestão sempre acima da plataforma. Este examina egocêntrico vs formas alocêntrica de hipocampo mediada aprendizagem espacial ea memória. 42 O labirinto em cruz elevado teste mede o medo e ansiedade, bem como o comportamento exploratório inerente. Os roedores são colocados no centro de quatro braços, dois fechados e dois abertos, elevados acima do solo. 43 A prevenção e o comportamento exploratório (avaliada como o tempo passado em cada braço) dos roedores são registados. 43 Estes testes adicionais examinar sensório-motora e cognitiva funcionamento, permitindo que o investigador como parasess se o insulto dura até a idade adulta, ou se é transitória.
atrasos de desenvolvimento são preditivos e testes comportamentais suplementar é necessário para fornecer provas complementares para a presença de uma doença mais tarde na vida. Além disso, as respostas de controlo deve ser optimizado antes de experimentar com a estirpe e as espécies diferenças, alterações genéticas, a administração da droga, etc. Apesar de estas condições, as técnicas descritas são rapidamente aprendido, facilmente dominado, barato, e fornecer informações importantes sobre o desenvolvimento do sistema nervoso. Eles oferecem uma oportunidade para avaliar a ontogenia e maturação do sistema nervoso em filhotes em uma idade em que eles são incapazes de realizar tarefas comportamentais maduros. Além disso, os lactentes humanos muitas vezes submetidos a testes de reflexo de desenvolvimento, e assim, o teste de reflexo de roedor proporciona um meio de tradutibilidade. Em conclusão, este é um excelente método para o rastreio preliminar de anormaldesenvolvimento neurológico no recém-nascido, que pode levar a investigação posterior da cognição e comportamento.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer aos nossos agências de financiamento, que incluem NeuroDevNet (a centros nacionais de excelência), a Fundação ALVA, das Mulheres e Instituto de Pesquisa de Saúde Infantil, e da Universidade de Alberta.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Breeding | |||
| Transfer pipettes | Fisherbrand | 12-711-9AM | Used for vaginal flushes. |
| Sterile Saline | Hospira | 7983254 | The solution used to collect cells during vaginal flushes. |
| 400 µL Microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-120 | Used to hold the saline solution. |
| Light microscope | Leica | Leica ATC 2000 | For observation of the saline solution. Can be any light microscope used in the lab. |
| Slides | Fisherbrand | 12-552-5 | The saline solution is placed on the slide. Can be any slides used in the lab. |
| Coverslips | Fisherbrand | 12-545-F | To coverslip the slides. Can use any coverslips used in the lab. |
| Dietary Supplementation | |||
| Broccoli Sprouts seeds | Mumm's Sprouting Seeds | Broccoli sprouts seeds are ordered and grown in the lab. | |
| Countertop Seed Sprouter Box | Mumm's Sprouting Seeds | A box is used to germinate and grow the seeds prior to harvest. | |
| 250 mL beaker | The beaker is used to soak the seed. Any size beaker that would fit can be used. | ||
| Maternal Inflammation | |||
| Lipoplysaccharide (LPS) | Sigma | L3129 | The endotoxin used to mimic maternal inflammation. |
| 1 mL Syringe | BD Syringe | 309659 | Used to inject the pregnant rat. |
| Gauge (30 G x 1/2) | BD PrecisionGlide Needle | 305106 | Use the smallest needle to avoid pain and discomfort. |
| Sterile Saline (0.9% Sodium Chloride, USP) | Hospira | Saline is used to dissolve LPS. | |
| Weights | |||
| Scale | Denver Instrument | For recording the weights. Can be any scale with 2 decimal places used in the lab. | |
| Neurodevelopmental Reflexes | |||
| Thin blunt rod | Can be a paperclip or toothpick. This is for forelimb and hindlimb grasping. | ||
| Round filter paper | Whatman | 1001 150 | 15 cm diameter paper used for gait analysis. |
| Timer | Fisher Scientific | 06-662-51 | For timing the time allocated to righting and gait. |
| Blunt surface | Can be an edge of a table. This is for hindlimb placing and cliff avoidance. | ||
| Foam landing | For when the pups perform accelerated righting. | ||
| Video recorder | Sony | VCT-D580RM | To record all reflexes tested. Must be able to record at 1/1,000 fps |
| Bell | For auditory startle. | ||
| Heat lamp or pad | To maintain the body temperature of the pups underoing examination. |
References
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