Summary
Поведенческие тестирование является золотым стандартом для определения результатов лечения после травмы головного мозга, и может определить наличие пороков развития у младенцев и детей. Неврологические рефлексы являются ранним признаком этих нарушений. было разработано и описано здесь Множество легко выполнено с развитием испытаний рефлекторных в неонатальном грызуне.
Abstract
Неврологические испытания рефлекса широко используются в клинической практике для оценки созревания нервной системы. Неврологические рефлексы также называют примитивными рефлексами. Они чувствительны и согласуются с более поздними результатами. Патологические рефлексы описаны как отсутствие, настойчивость, появление или латентность рефлексов, которые являются прогностическими показателями детей, которые подвержены высоким риском развития нервных системы расстройств. Модели на животных психомоторного инвалидности, таких как церебральный паралич, часто демонстрируют аномальные рефлексы развития, как можно было бы наблюдать в человеческих младенцев. Методики, описанные в оценке различных нейроразвития рефлексов у новорожденных крыс. Неврологические испытания рефлекса предлагает следователь метод тестирования, которое иначе не доступен в таких молодых животных. Методология, представленная здесь, призвано помочь исследователям в изучении этапов развития у новорожденных крыс в качестве способа обнаружения раннего начала бртравмы айн и / или определения эффективности лечебных мероприятий. Методология, представленная здесь, призвана обеспечить общее руководство для следователей.
Introduction
Неврологические рефлексы, или этапы развития, являются одним из самых ранних оценок, используемых на человека новорожденных и младенцев. Неврологические рефлексы непроизвольные и повторяющиеся движения, которые демонстрируют ствол мозга и спинномозговые рефлексы мозга. Созревание высших корковых сетей, характеризующихся развивающейся миграция, миелинизацию и синаптогенез содействие добровольного контроля и корковое торможение. Изменения в нормальной прогрессии эволюции центральной нервной системы, могут нарушить развитие мозга, что приводит к аномальной корковой проводке, функционированию и миелинизации, вызывая задержки психомоторного рефлекса или пропуска. Человеческие младенцы с высоким риском развития нейросенсорной инвалидизации часто демонстрируют аномальные ранние рефлексы. Аномальные рефлексы могут представить как задержку в приобретении, отсутствии, длительное присутствие или повторное появление в более позднем возрасте, а также прогнозировать отклонения в развитии. 1, 2 Поэтому, Важно, чтобы имитировать задержки рефлекторных в экспериментальных моделях психомоторных инвалидов.
Грызуны обычно используются в качестве экспериментальных моделей. Крысы щенки птенцовые птицы при рождении, и, следовательно, слишком незрелыми, чтобы предпринять конкретные шаги или сложный двигатель, сенсорные и / или когнитивные, поведенческие задачи. В связи с этим, их незрелость развития относится как к их физическому и органному развитию. Крысы рождаются голыми с неспособностью регулировать температуру, слепы, и не в состоянии ходить. Со ссылкой на развитие головного мозга, значительное кортикальное созревание происходит послеродовом. Новорожденные крысята (день рождения называют послеродовой день 1; PD1) был предложен, чтобы достичь уровня созревания мозга, который похож на недоношенный человеческий мозг 23 - 28 недель беременности, в то время как PD7-10 щенков эквивалентны ближне- термин человеческий мозг. 3, 4, 5, 6Эта корреляция основана на грубых анатомических анализах, однако, и другие меры созревания мозга, такие как миелинизация и амплитудный интегрированный электроэнцефалограмм также были описаны. 5, 7 , например, пра-олигодендроциты являются преобладающими клетками в развивающемся человеческом мозге плода от 23 - 32 недель в утробе матери, и эта стадия созревания соответствует PD1-3 грызуну. 5, 8, 9, 10 Кроме того, миелинизация начинается в утробе матери у человека , тогда как в крысятах он появляется в переднем мозге вокруг PD7-10; новорожденный грызун мозг остается в значительной степени не-миелиновые. 11, 12 Tucker и соавт. Обнаружено, что амплитуда интегрированной модель электроэнцефалограммы из P1 крысы, чтобы быть похожей на 23-недельный GestaТион человеческий плод, в то время как PD7 и PD10 щенок сродни 30 - 32 недели и срок младенца, соответственно. 7 По этим причинам, новорожденный рефлекс тестирование у новорожденных крысят дает возможность захвата онтогенеза и / или нарушения развития мозга.
Батареи рефлексов , описанных ниже , выполнены из исследований Ум Фокс и А. Lubics 13, 14 Ум Фокс был одним из самых ранних исследователей относительно онтогенеза рефлексов у мышей. 13 Этих рефлексов , включают в себя, но не ограничиваются ими, хватанием конечности и размещением, избегание скалы, восстанавливающих, ускоренные восстанавливающих, походки, слуховой испугом, поза, и открытием глаз. Оба передних конечностей и задних конечностей схватывание (именуемые ладонной и подошвенной рук у людей, соответственно) способствует спинальных рефлексов и корково торможения от неосновных моторных зон. 15, 16 задние конечности размещения (Рефлекс Бабинского) отражает созревание корково -кишечный тракт. 16, 17, 18 избегание Клифф (защитные реакции), восстанавливающая (лабиринт), а ускоренная восстанавливающий включают интеграцию и связь между сенсорным входом и выходом двигателя (например, связанно с вибриссами и вестибулярными системами). 19, 20, 21 Походка отражает локомоции. 14 Слуховой испуг оценивает акустическую стимуляцию и синаптические связи гигантских нейронов в ядре сетчатого Pontis caudalis. 21 включает в себя соответствующие осанки / спинальные-кортикальной проекции корковых-спинальной мышечной силы, и нервно - мышечной иннервации. 22, 23 Маturation гамма - аминомасляной кислоты рецепторов может коррелировать с открытием глаз. 24 Важно иметь в виду , что рефлексы отражают гораздо более сложную сеть, представленная здесь , общая корреляция. Кроме того, эти рефлексы обеспечивают быстрый и легкий метод оценки неврологического развития в очень раннем возрасте, где более сложный поведенческий анализ не представляется возможным.
Целью данной статьи является предоставление общих рекомендаций для психомоторного тестирования рефлекса, который может быть легко включен в экспериментальные неонатальные исследования на крысах. Методология, описанная была проведена в Лонг-Эванс щенков у новорожденных крыс и количественная оценка результатов была основана на первый день появления. День, что рефлекс тестирование инициируется и оборудования используются могут быть изменены, чтобы лучше соответствовать другой экспериментальной модели (например, для различных штаммов и видов). Устанавливая нормальную физиологическую прогрессию рефаLex созревания в конкретной модели на животных, исследователи могут оценить влияние внешних факторов стресса, эндогенных манипуляций и / или терапевтических вмешательств на развитие нервной системы у новорожденных крыс моделей. В целом, использование рефлексов как определение зрелости мозга является предпочтительным в прогнозировании перинатальной травмы головного мозга, и является отражением более поздних психомоторных результатов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Уход за животными и использование комитета медицинских наук в Университете Альберты одобрил все исследования на животных.
Примечание: В то время как этот протокол может быть адаптирован для других видов и штаммов, этот протокол написан для крыс Лонга-Эванс. Эти крысы были показаны, что имеют превосходные характеристики и двигательные остроты зрения по сравнению с другими штаммами грызунов. 25, 26 Протокола приуроченных беременности, диетические добавки, материнское воспаление и психомоторных рефлексы заключается в следующем.
1. Экспериментальные животные
- Когда крысы приезжают к жилому объекту животного, воздерживаться от каких-либо взаимодействий на день или два, чтобы дать им возможность привыкнуть к новой обстановке. После акклиматизации, не обрабатывать крыса каждый день в течение приблизительно пять дней, или когда крысы больше не проявляют признаки стресса. стресс-индуцированной человек может изменить результаты испытаний и Леобъявления к потере беременности.
- После того, как крысы комфортабельны, начинается разведение. Поместите две самки и один самец крысы в двойном двухэтажным размножения клетки (h = 38 см, 1800 см 2 площади пола) в течение ночи (3 вечера - 8 AM). Эти клетки предотвращают стресс и перенаселенность. Утром, с помощью пипетки передачи, промойте влагалище самок крыс с приблизительно 0,25 мл физиологического раствора. Передача раствора в микроцентрифужной трубку.
- Поместите две самки и самец обратно в их соответствующих обычных клетках.
- Просмотр раствора, собранные в разделе 1.2 под световым микроскопом (100Х), чтобы определить, на какой стадии эстрального цикла крыса испытывает и будет ли или нет спермы присутствуют. Если есть сперма, записывать дату как день эмбрионального (E1) (рисунок 1). Если беременная, дать самке свою собственную клетку на E14.
Примечание: Клетки в вагинальных мазках очевидны, поэтому использовать параметр низкой освещенности. Убедитесь в том, что конденсатор устанавливается на минимальное значение. Объявлениетолько управление яркостью, чтобы приглушить свет. Если яркость диск доступен, установите его в 1.
2. Диетические Supplementation
Примечание: Этот протокол предназначен для оценки терапевтического эффекта диетического потребления брокколи прорастает в течение последней недели беременности. Grow ростки в соответствии с Ву и др. 27.
- Замочите семена брокколи в течение 2 - 3 ч. Распространение семян на проростки в поле столешницы семян и установить на теплую поверхность для прорастания.
- Вода семена два раза в день, один раз в AM (8 - 9 AM) и один раз в ПМ (3 - 4 PM).
- На пятый день, место рассады окна в течение дня (рассада должна иметь два листа каждых и станет зеленым в течение дня).
- В конце концов, урожай рассады, осторожно потянув брокколи из просеянной коробки и положите на ровную поверхность для просушки.
- После того, как ростки полностью высушены, шиз 200 в восемь мг и поместить в герметичный пластиковый пакет.
- Начиная с Е14, не кормить каждый беременных крыс 200 мг сушеных ростков брокколи ежедневно до PD21 (день щенков отлученных).
3. Воспаление
- Для того, чтобы вызвать воспаление и воспроизводить белый травмы вещества в потомстве, вводят беременным крысам липополисахарида (LPS) каждые 12 ч на E19 и E20. В день инъекции, привести клетку в лабораторию из жилого объекта. Дайте беременной крысы, чтобы акклиматизироваться и стать спокойным, по крайней мере, 1 ч. Если крыса показывает клинические признаки постоянного системного или почечного повреждения, она будет эвтаназии немедленно и исключены из исследования.
- Взвешивание беременной дамбы.
- Растворить 200 мкг / кг LPS (серотип 0127: В8) в 100 мкл физиологического раствора. Аспирируйте раствор в 1 мл шприц, снабженный 30 G ½ иглы.
- Используйте новую иглу для каждой инъекции. Дайте раствору прогреться в течение нескольких минут, чтобы свести к минимуму дискомфорт.
- Запишите время и впрыснуть беременную плотину внутрибрюшинно. Альтернативные инъекции между сторонами, чтобы обеспечить равномерное распределение.
Примечание: Machholz и др. описывает соответствующие процедуры удержания и инъекций. 28
4. Испытания Развивающее Reflex
- На ФД1 (день рождения), удалить щенок от веса при рождении плотины и записи. Поместите щенка обратно в соответствующие клетки и переместить их в виварии до ПД3. Это обеспечивает материнское склеивание между плотиной и детенышем.
- Записывают рефлекс тестирования для надежной оценки. Настройка видео камеры таким образом, что она находится на максимальной скорости затвора для кадра за кадром анализа (1/1000 с). Установите видеокамеру так, что она находится непосредственно над или рядом с щенком крыс и всех материалов, используемых для каждого рефлекса. Например, для размещения задних конечностей, поместите камеру рядом с щенком крысы, чтобы обеспечить подъем и размещение задних конечностей захватываются.
- Для ускоренных восстанавливающего поместите камеру над щенком крыс и посадочной площадкой для того, чтобы записать способность щенка направо в воздухе.
- Веса записи ежедневно до конца эксперимента. На ПД3, начинает психомоторное тестирование рефлекса (рис 4). Перемещение клеток в тихой комнате в течение как минимум 1 ч до испытания, чтобы для акклиматизации к окружающей среде.
- Выполните психомоторное тестирование рефлекса на последовательное время каждый день, как крысы являются ночными. Например, тест с 9 утра - 12 вечера ежедневно. Хранить щенок непосредственно под нагревательной лампой или на тепловую площадке в любое время, чтобы поддерживать стабильную температуру тела 36,5 ° С; крыса щенков этого возраста легко теряют тепло. Измерение с помощью ректального датчика температуры. Если сделано эффективно, температура тела щенков не изменится, потому что они не удаляются из плотины и подстилок достаточно долго. Примечание: Монитор температуры тепла лампы, чтобы убедиться, что он не превышает 37 ° С.
- Захватывающая передние конечности
- Начиная с ПД3, провести тест рефлекс хватательный передних конечностей. Поместите тупой стержень против ладони каждой лапы и применить легкое давление вручную. Давление света должен слегка сместить переднюю лапу, чтобы обеспечить, что контакт сделан и детёныши могут почувствовать тягу. Захватывающие будет выглядеть как сгибание всех цифр вокруг стержня. Успешное приобретение этого рефлекса происходит, когда оба передних лап возьмитесь за штангу в течение двух дней подряд.
- Оценка передних конечностей схватывания:
0 без всякой алчности
1 для успешного хватания по одной передней лапе (левое или гIGHT лапка может быть указана здесь)
2 для успешного хватания оба передних лап
- Захватывающие задних конечностей
- Начиная с ПД3, провести тест рефлекс задних конечностей хватательный. Поместите тупой стержень против подошвы каждой задней лапы и применить легкое давление вручную. Давление света должен слегка сместить заднюю лапу, чтобы обеспечить, что контакт сделан и детёныши могут почувствовать тягу. Успешное схватывание стержня появляется как сгибание цифр вокруг стержня. Успешное приобретение этого рефлекса происходит, когда оба задних лап возьмитесь за штангу в течение двух дней подряд.
- Оценка задних конечностей схватывания:
0 без всякой алчности
1 для успешного захвата одной задней лапы (левый или правая задняя лапа может быть указана здесь)
2 для успешного хватания оба задних лапами
- Восстанавливающий
- Начиная с ПД3, начать тест исправляя рефлекс. Крепко держите щенка в положении лежа на спине, со всеми четырьмя лапами в вертикальном положении. Отпусти ое щенок и сразу же запустить таймер. Восстанавливающий достигаются тогда, когда щенок способен перевернуть / перевернуться на все четыре лапы, и каждая лапу перпендикулярно к телу. Дайте каждому щенку максимум 15 с для достижения этой цели.
- Оценка выпрямления:
0 при положении лежа на спине (или 15 с для максимального времени выделено)
1 для лежа на боку (левая или правая сторона может быть указана здесь) или способность детеныша направо, но в неправильном положении (или 15 с для максимальной отведенного времени)
2 для успешных восстанавливающего и соответствующей позы
- размещение задних конечностей
- Начиная с PD4, начинает заднюю конечность размещения рефлекса теста. Держа щенка вертикально в воздухе, на туловище. Осторожно инсульт спинка задней лапы с тупой поверхностью (например, край стола). Правильное размещение рефлекс, когда щенок крысы изымает вынужденные задние конечности, а затем путем размещения задних конечностей вниз на этой поверхность.
- Оценка по задней конечности плрефлекс очка одним ударом:
0 для каких-либо успехов
1 для размещения одной задней лапы (левый или правая задняя лапа может быть указана здесь)
2 для успешного размещения задних конечностей для обеих задних лап
- Клифф Избежание
- Начиная с PD4, начинают испытывать избегание скалы. Поместите щенок крысы на крае плоской поверхности, таким образом, что передние лапы и морда щенка находятся над краем. Правильный результат является защитным ответом, где щенок крысы поворачивается в сторону от края обрыва. рука экспериментатора или пена посадка находится под обрывом, чтобы поймать щенок от падения.
- Оценка избегания скалы:
0 для движения или не упасть с края
1 для попытки отойти от скалы, но с висящими конечностями
2 для успешного движения от скалы
- походка
- Начните оценку походки на PD6. Место щенков в центре 15 см diametэр круг и позволить щенку 30 секунд, чтобы выполнить поставленную задачу. 14 Успешная походки выполняется , когда щенок крысы способен переместить обе передние лапы вне круга менее чем за 30 с.
- Оценка походку как время в секундах, которое принимает детеныша крысы, чтобы выйти за пределы круга. Регистрируют время, необходимое щенку двигаться как лапами за пределы круга. Запись 30 с, если щенок не в состоянии выполнить поставленную задачу в течение заданного времени
- слуховой испуг
- Начните анализ слухового испуга на PD10. Представьте громкий шум (звонок) непосредственно над детенышем, чтобы оценить, является ли или нет, присутствует испуг ответа. Положительный ответ на испуг наблюдается, когда щенок отображает «толчки» движение, от звука.
- Оценка слуховую испуга:
(Или вообще нет) для никакой реакции испуга
(Или да) для положительного ответа испуга
- осанка
- Начинают анализ осанки на PD12. Место щенки на нескользкую открытой поверхности, а также наблюдать за осанкой щенок имеет при движении. Незрелая поза отражается путем перетаскивания живота при перемещении, и перпендикулярных указывающих обоего передних лап и задних лапах по отношению к телу. Зрелая поза приобретаются, когда щенок может поднять живот с поверхности, и оба передних лапы и задние лапы указаны прямыми, или параллельно телу, при движении.
- Оценка осанки:
0 без всякого движения
1 для незрелой позы при перемещении
2 для зрелой позы во время движения
- Открытие глаз
- Начинает поучительный анализ на PD12. Записывают день оба глаза открытыми:
0 для без видимых глаз
1 для одного видимого глазом (левая или правая сторона может быть указана здесь)
2 для двух видимых глаз
- Начинает поучительный анализ на PD12. Записывают день оба глаза открытыми:
- Ускоренный восстанавливающий
- Начиная с PD14, начать ускоренную исправляя тестирование. Поместите щенка в положении лежа на спине 30,48 грentimeters выше пены посадки. Отбрось щенок и наблюдать за ее способность к праву себя. Восстанавливающих относится к тому, когда щенок может перевернуться в лежачем положении и земли на лапах.
- Оценка ускоренного восстанавливающий:
0 при падении на спине
1 для падения на его стороне (левой или правой стороны могут быть указаны здесь)
2 для посадки на лапах
Примечание: Различные типы количественных рефлексов доступны в зависимости от вопроса следователей. Количественное рефлексов может быть сделано в качестве первоначального наблюдения рефлекса, в первый день появления вплоть до исчезновения рефлекса, время, необходимое, чтобы успешно выполнить задачу, скорость выполнения и / или улучшение производительности с течением времени. 13, 14, 29, 30, 31 Для Cомер текущего исследования, в первый день появления был использован в качестве очков. При использовании повторнородящая моделей, щенков из одного помета , как правило , ведут себя подобным образом из - за их генетического состава, в утробе матери и после родов окружающей среды и пищевой доступности. 32 Таким образом, один щенок не может быть учтен как п = 1 из - за смещение помета. Щенки исследованных в помете могут быть усреднены , так что каждый помет представляет собой п = 1. 32, 33 Альтернативно, несколько щенков в пределах одного помета могут быть проанализированы с помощью модели смешанных эффектов, который принимает во внимание щенков в пределах одного помета. 32, 33
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сроки этого эксперимента представлены на рисунке 2. 30 Методы и результаты ранее были опубликованы. 30 Цель исследования заключалась в оценке защищена ли диетических добавок с брокколи во время беременности и период preweaning потомство от задержки развития нервной системы, вызванной внутриутробное воздействие LPS. Синхронизированные беременным крысам вводили внутрибрюшинно инъекции физиологического раствора (контроль, 100 мкл) или LPS (200 мкг / кг разбавляют в 100 мкл стерильного физиологического раствора) на E19 и E20 каждые 12 ч. Произвольно выбранные беременные плотины также получили пищевые добавки сушеных ростков брокколи (200 мг / день) от E14 до PD21. LPS был использован для имитации материнских воспалений и брокколи были даны в качестве потенциального терапевтического вмешательства для защиты потомства. Pups родились естественно на E23 (
Врожденные Веса
Анализ показал , массу тела при рождении основного эффекта лечения (F (1,23) = 18,5, 0,0003), диеты (F (1,23) = 6,5, р = 0,02), а также эффект взаимодействия (F (1,23) = 7,4, р = 0,01). ЛПС, как отражение материнского воспаления, в результате мышат (5,1 ± 0,2 г), рожденных значительно меньше по сравнению с засоленных щенков (6,3 ± 0,2 г, Тьюки р <0,001), физиологический раствор + брокколи щенков (6,2 ± 0,2 г, Тьюки р <0,001), и LPS + брокколи щенков (6.0 ± 0,1 г, Тьюки р <0,01). Врожденные Веса рассады мышат LPS + Брокколи не отличалось от контроля, что свидетельствует о том, что Брокколи Ростки избавлены от LPS щенков от ограничивается рост.
Неврологическое Reflex Тестирование
хватательный рефлекс
Не наблюдалось никаких эффектов лечения или диеты для обоих передних конечностей и задних конечностей хватания. Все щенки были в состоянии выполнить эти задачи.
Размещение задних конечностей
Основной эффект лечения (F (1,23) = 6,8, р = 0,02) был обнаружен для размещения задних конечностей. По сравнению с физиологическим раствором (4,3 ± 0,1 дня, Тьюки р <0,05) и Солевые + брокколи (4,3 ± 0,0 дней, Тьюки р <0,05), LPS щенков со значительной задержкой (5,1 ± 0,3дней). Хотя не производительность LPS + брокколи щенков не отличалась от LPS щенков, они больше не отличались от контроля, что свидетельствует об улучшении этой задаче рефлекторной от тех щенков, получавших LPS и никакого лечения.
Клифф Избежание
Основной эффект лечения (F (1,25) = 6,0, р = 0,02) был обнаружен следующие скалами анализа избегания. LPS щенки (5,8 ± 0,4 дней) были значительно скомпрометированы в получении этого рефлекса по сравнению с физиологическим раствором (4,4 ± 0,2 дней, Тьюки р <0,05). LPS + Брокколи рассада щенки не работают по-разному от какой-либо из групп, что указывает на улучшение производительности.
походка
Значительный эффект лечения (F (1,24) = 15,1, р = 0,0007), диеты (F (1,24) = 6,3, р = 0,02), а в томдействие между лечением и диетой (F (1,24) = 9,5, р = 0,005) было обнаружено следующее походки анализа. Задержанное приобретение походки было обнаружено в LPS щенках (9,7 ± 0,4 дней) по сравнению с физиологическим раствором (7,5 ± 0,3 дней, Тьюки р <0,001), физиологический раствор + брокколи (7,7 ± 0,3 дней, Тьюки р <0,001) и ЛПС + брокколи щенки (7,9 ± 0,2 дней, Тьюки р <0,01).
слуховой испуг
Не было обнаружено никаких различий.
Восстанавливающий
Половой эффект был обнаружен (F (1,43) = 16,3, р = 0,0002) для выпрямления, поэтому, мужские и женские щенков были рассмотрены отдельно. Никакие различия не были обнаружены у мужчин. У самок, основной эффект диеты (F (1,21) = 11,8, р = 0,002) , а также эффект взаимодействия (F (1,21) = 15,6,р = 0,0007) был найден. LPS + брокколи щенков (4,9 ± 0,4 дней) были в состоянии прямо раньше по сравнению с LPS щенков (6,7 ± 0,6 дней, р Тьюки <0,05).
Ускоренный восстанавливающий
Ускоренный восстанавливающий тест показал значительное основное влияние обработки (F (1,25) = 4,51, р = 0,04). ЛПС (17,4 ± 0,6 дней) и LPS + брокколи щенки (16,9 ± 0,2 дней) были задержаны в выполнении ускоряется восстанавливающий по сравнению с физиологическим раствором (16,0 ± 0,4 дней) и засоленным + брокколи (16,4 ± 0,5 дней).
осанка
Значительный эффект взаимодействия лечения и диеты (F (1,24) = 5,8, р = 0,02) был обнаружен следующий анализ осанки. LPS + брокколи щенков (14,9 ± 0,4 дней) имели зрелую позицию раньше, чем LPS (17,0 ± 0,4 дней, Тьюки р <0,05).
Открытие глаз
Значительный основной эффект диеты (F (1,23) = 4,71, р = 0,04) наблюдались в отношении открытия глаз. Оба Солевые + БРСП (15,9 ± 0,1 дней) и LPS + брокколи щенки (15,4 ± 0,2 дней) достигли этого рефлекс раньше, чем физиологический раствор (16,0 ± 0,2 дней) и LPS щенки (16,0 ± 0,1 дней).
В целом, потребление брокколи прорастают в конце беременности и в период preweaning был в состоянии позволить себе защиту от LPS-индуцированной задержки развития в ряде рефлексов исследованных. Пожалуйста, обратитесь к соответствующей статье для более подробно. 30
Рисунок 1. Поsitive влагалищного мазка. Пример влагалищного мазка полученный с 10-кратным объективом на световой микроскопе. Этот слайд представляет собой позитивный слайд, указанный в присутствии спермы (стрелка). При выполнении влагалищного мазка, то цикл течки у крыс может быть оценен либо как проэструс течка, metestrus или диэструс. Это помогает точно временной селекции на более высокий уровень успеха беременности.
Рисунок 2. Экспериментальный дизайн Timeline. Экспериментальный график для оценки потомства, рожденных плотины данных внутрибрюшинных инъекций ЛПСА. Диетические добавки с брокколи начинается E14 до PD21. Плотины впрыскивают на E19 и E20 каждые 12 ч (обозначаемые в виде желтых стрелок). Материнские веса записываются со шкалой веса и температурой тела с ректальным температурным зондом, покрытый смазкой. Щенки рождаются naturallу на E23 (обозначается как черная стрелка). Начиная с ПД3, щенки проходят несколько рефлекс тестирования. На PD21, щенки проходят проверку на открытом поле, чтобы оценить поведенческие реакции.
Рисунок 3. Пример временной шкалы для оценки психомоторного Рефлексы. Рефлексы появляются на разных стадиях развития, таким образом, захватывая приобретение этих рефлексов требует, чтобы испытания начинаются за несколько дней до этого. Это исследование использовало Long-Evans крысят, но существуют различия между штаммами и видами, поэтому предварительный эксперимент следует проводить с использованием этих дат в качестве общего руководства. Схватывание передних конечностей, задние конечности схватывания и восстанавливающий оцениваются на ПД3, размещение и задних конечностей скалы избегания на PD4, и походках на PD6. Слуховой испуг оценивается на PD10, осанка и глазных отверстия на PD12 и ускоренной восстанавливающий на PD14.
Рисунок 4. Изображение развивающего Рефлексы. Изображения рефлекторной испытания проводились на ПД3 в Лонг-Эванс крысят. Обхват передней лапы (А), обхват задних конечностей (В) и восстанавливающих (С) исследование начинается ПД3. Клифф избегание (D) , и размещение задних конечностей (Е) тестирование начинается PD4. Походка (F) анализ начинается PD6. Устройство для ускоренных восстанавливающего изображено (G). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Исследование параметров | Группы (среднее ± SEM) | Основные эффекты (р-значение) | |||||
| Помет Размер и вес | солончак | Солевые + Брокколи Ростки | LPS | LPS + Брокколи Ростки | лечение | Диета | взаимодействие |
| Помет Размер (количество щенков) | 13,3 ± 1,0 | 13,1 ± 1,0 | 10,3 ± 1,5 | 11 ± 1,2 | 0.03 | 0.8 | 0.7 |
| Врожденные Веса * # г | 6,3 ± 0,2 | 6,2 ± 0,2 | 5,1 ± 0,2 | 6,0 ± 0,1 | 0,0003 | 0.02 | 0,01 |
| PD7 Массы * г | 15,0 ± 0,5 | 15,5 ± 0,4 | 11,4 ± 1,1 | 13,6 ± 0,3 | 0,0006 | 0,09 | 0.2 |
| PD21 Массы d | 50,0 ± 1,4 | 48,7 ± 1,6 | 46,4 ± 1,2 | 48,2 ± 1,4 | 0.2 | 0.9 | 0,3 |
| Neurodevelop- ментальные Рефлексы | |||||||
| Передние конечности ухватиться за | 3.0 ± 0.0 | 3.0 ± 0.0 | 3.0 ± 0.0 | 3.0 ± 0.0 | н / | н / | н / |
| Задние конечности ухватиться за | 3,6 ± 0,3 | 3,5 ± 0,3 | 4,6 ± 0,6 | 3,3 ± 0,1 | 0,3 | 0,1 | 0,1 |
| Размещение задних конечностей * а | 4,3 ± 0,1 | 4,3 ± 0,0 | 5,1 ± 0,3 | 4,5 ± 0,2 0.02 | 0,07 | 0.2 | |
| Клифф Избежание * а | 4,4 ± 0,2 | 4,7 ± 0,2 | 5,8 ± 0,4 | 5,0 ± 0,4 | 0.02 | 0,4 | 0,1 |
| Походка * # | 7,5 ± 0,3 | 7,7 ± 0,3 | 9,7 ± 0,4 | 7,9 ± 0,2 | 0,0007 | 0.02 | 0,005 |
| Слуховой испуга | 11,5 ± 0,3 | 11,5 ± 0,1 | 12,0 ± 0,5 | 11,8 ± 0,2 | 0.2 | 0.8 | 0.9 |
| Осанка #a | 15,6 ± 0,5 | 15,9 ± 0,6 | 17,0 ± 0,4 | 14,9 ± 0,4 | 0.8 | 0,08 | 0.02 |
| Глазные Отверстия | 16,0 ± 0,2 | 15,9 ± 0,1 | 16,0 ± 0,1 | 15,4 ± 0,2 | 0,08 | 0.04 | 0.2 |
| Ускоренное Восстанавливающий | 16,0 ± 0,4 | 16,4 ± 0,5 | 17,4 ± 0,6 | 16,9 ± 0,2 | 0.04 | 1 | 0,3 |
| Восстанавливающий #A (женщины) | 4,9 ± 0,5 | 5,1 ± 0,4 | 6,7 ± 0,6 | 4,6 ± 0,4 | 0,09 | 0,003 | 0,0007 |
| Восстанавливающий А (мужчины) | 3,9 ± 0,2 | 4,6 ± 0,3 | 5,9 ± 1,9 | 4,2 ± 0,6 | 0,4 | 0.6 | 0.2 |
| День появления | * Существенно отличается между LPS и солевым раствором | ||||||
| б Количество раз активности проводили | # значительно отличается между LPS и LPS + БРСП | ||||||
| гр секунды | |||||||
| d грамм | |||||||
Таблица 1. Вес и Неврологические Reflex результаты. Результаты , полученные от потомства , подвергшихся внутриутробно воспаления и / или диетических добавок брокколи. 30 Веса , представленные здесь от рождения, PD7 и PD21. Моменты времени были отобраны для представления преждевременного, срока, и 1-2-летнего ребенка. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM. Статистический анализ, используемый в исследовании был двусторонний ANOVA с последующим постфактум тест Тьюки.а = день появления, б = число раз, активность была выполнена, и с = время (ы) активность была выполнена, * = значительная разница между LPS и контролем, # = существенной разницы между ЛПС и ЛПС + брокколи. п = 5 - 7 пометов в каждой группе (значения от четырех щенков, двух самцов и двух самок, в пределах помета были усреднены для представления помета).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Неврологическое тестирование рефлекса является прогностическим показателем ненормального коркового развития и созревания, которые могут иметь значение при обстоятельствах, когда откровенная невропатология не является очевидной. При психомоторном тестировании, важно, чтобы убедиться, что щенки рассматриваются в то же время ежедневно. Крысы являются ночными и, следовательно, их циркадный ритм может изменить производительность, если тестирование проводится в разное время в течение дня. 34 Тестирование должно быть завершено в тихой комнате , как громкие звуки могут добавить напряжение к щенкам. 35 Щенков требуется как минимум 1 ч , чтобы акклиматизироваться к новой окружающей среде, так как транспорт, человек обработки, и новые настройки могут вызвать стресс у щенков. 35 Щенков также должны быть проверены непосредственно под лампой с подогревом или на нагретую площадке. Чем моложе щенков, тем меньше в состоянии они способны регулировать температуру. 36 По этой причине, щенки приведены 15с и 30 с для выполнения восстанавливающих на ПД3 и походку на PD6, соответственно. 36 Кроме того, контроль щенки не должны быть ограничен рост при рождении, так как масса представляет собой сбивающий фактор. Пометы также должны быть забиты до 8 - 10, чтобы обеспечить равное питание и представление секса. После рождения щенков важно, чтобы в день для крысы, чтобы сформировать связь с плотиной для предотвращения материнской безнадзорности.
Щенки должны быть проверены в день или два до дня они приобретают рефлекс, чтобы захватить начало появления. В зависимости от экспериментальной модели, некоторые модификации могут быть необходимы. Новорожденные мыши значительно меньше, чем у крыс. Таким образом, размер используемого оборудования, возможно, придется быть доведен до размера новорожденных мышей. Некоторые устранения неполадок также может потребоваться. Различные штаммы и виды могут иметь несколько иной выбор времени начала рефлексов. 13 Время подробно в этом докладе Удельныйс до Лонг-Эванс щенков, с тестированием новых рефлексов , начинающихся с ПД3, 4, 6, 10, 12 и 14 (фиг.3). Следователю может потребоваться выполнить рефлекторные тесты на 2 - 3 пометов установить прогрессию естественного рефлекса перед экспериментальной проверкой. Кроме того, при выполнении статистического анализа собранных данных, экспериментатор должен использовать соответствующие методы для предотвращения смещения для мусора. Щенки из одного помета , как правило, выполняют аналогично друг друг, поэтому подстилка представляет собой N = 1, а не индивидуальный щенок. 32, 33
Тестирование психомоторных рефлексов важно, потому что это единственное испытание для новорожденных грызунов, так как более сложная поведенческая тестирование не представляется возможная в этих возрастах. Никакие другие меры не доступны в этот ранний период, кроме веса и внешности. Методы, приведенные здесь, были использованы несколькими исследователями, таким образом, поддерживаяиспользование неврологического тестирования рефлекс, особенно у молодых грызунов, где другие поведенческие тесты не представляется возможным. 13, 14, 29, 30, 31, 37, 38 Эти тесты параллельно рефлекс тестирование , проведенное в человеческих младенцах, являются предикторами расстройств нервной системы, таких как церебральный паралич, и предоставить дополнительную информацию относительно онтогенеза нейронных сетей. Появление рефлексов происходит в течение определенного времени в течение периода preweaning, что отражает созревание нервной системы. 39 Ограничение этого протокола заключается в том , что не все экспериментальные модели могут быть подвергнуты рефлекс тестирования. Грызуны рождаются незрелыми, таким образом, что их постнатальное развитие дает преимущество захвата начала рефлекторного развития. Другие модели животных, такиекак агнец рождаются зрелым и развиваются по-разному от грызунов, так что некоторые из рефлекторных испытаний не относятся к данной модели. Кроме того, рефлекс тестирование не является прямой мерой когнитивных или поведенческих аномалий, и неизвестно, является ли какие-либо наблюдаемые отклонения являются временными или постоянными.
Кроме рефлексы, поведенческие тесты могут быть выполнены для дополнительных анализов в пожилом возрасте. Это важно, потому что отклоняющиеся рефлексы задержка не всегда приводит к психомоторным расстройствам. 2, 40 Испытания , как правило , вводят начиная с PD21 (день отъема) , когда грызуны способны выполнять познавательные и двигательные задачи. Эти тесты включают в себя личинку не ограничивается Rotarod, Морриса водный лабиринт, и лабиринт повышенной плюс. Вкратце, тест Rotarod проводится путем размещения грызуна на вращающийся стержне, и записи его производительности на стержне в течение определенного периода времени или до грызунов паденийвыкл. Этот тест оценивает обучение двигателя и силу, а также целостность структур головного мозга, такие как базальные ганглии и мозжечок. 41 Моррис Водный лабиринт состоит из размещения грызуна в бассейне молочно - белой воды, и записывая время, затрачиваемое грызуна найти подводную платформу. Реплики могут быть размещены над каждым квадрантом бассейна с одной и той же репликой всегда над платформой. Это рассматривается эгоцентрично против allocentric форм гиппокампа опосредуется пространственного обучения и памяти. 42 приподнятый крестообразный лабиринт тест измеряет страх и беспокойство, а также присущее исследовательское поведение. Грызуны расположены в центре четырех рук, два закрытых и два открытых, приподнятом над землей. 43 Предотвращение и исследовательское поведение (оценивается как время , проведенное в каждой руке) из грызуны записаны. 43 Эти дополнительные тесты изучить сенсорно и когнитивных функций, что позволяет исследователю вSess продолжается ли обида во взрослую жизнь, или это преходяще.
Развивающие задержки предсказания, и дополнительные поведенческие тестировании требуются для обеспечения дополнительного доказательства наличия расстройства позже в жизни. Кроме того, ответы управления должны быть оптимизированы до экспериментирования с деформационных и видовых различий, генетических изменений, введения лекарственных средств и т.д. Несмотря на эти условия, описанные методы быстро научились, легко освоен, недороги, и предоставить важную информацию о развитии нервная система. Они дают возможность оценить онтогенез и созревание нервной системы у щенков в возрасте, когда они не в состоянии выполнять зрелые поведенческие задачи. Кроме того, человеческие младенцы часто подвергаются тестированию с развитием рефлекса, и, таким образом, тестирование грызунов рефлекса обеспечивает средство переводимости. В заключении, это отличный способ предварительного скрининга ненормальныхневрологическое развитие у новорожденного, что может привести к более позднему исследованию познания и поведения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить наши финансирующие учреждения, которые включают в себя NeuroDevNet (национальные центры передового опыта), то АЛВА фонд, Женские и научно-исследовательский институт охраны здоровья детей и Университет Альберты.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Breeding | |||
| Transfer pipettes | Fisherbrand | 12-711-9AM | Used for vaginal flushes. |
| Sterile Saline | Hospira | 7983254 | The solution used to collect cells during vaginal flushes. |
| 400 µL Microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-120 | Used to hold the saline solution. |
| Light microscope | Leica | Leica ATC 2000 | For observation of the saline solution. Can be any light microscope used in the lab. |
| Slides | Fisherbrand | 12-552-5 | The saline solution is placed on the slide. Can be any slides used in the lab. |
| Coverslips | Fisherbrand | 12-545-F | To coverslip the slides. Can use any coverslips used in the lab. |
| Dietary Supplementation | |||
| Broccoli Sprouts seeds | Mumm's Sprouting Seeds | Broccoli sprouts seeds are ordered and grown in the lab. | |
| Countertop Seed Sprouter Box | Mumm's Sprouting Seeds | A box is used to germinate and grow the seeds prior to harvest. | |
| 250 mL beaker | The beaker is used to soak the seed. Any size beaker that would fit can be used. | ||
| Maternal Inflammation | |||
| Lipoplysaccharide (LPS) | Sigma | L3129 | The endotoxin used to mimic maternal inflammation. |
| 1 mL Syringe | BD Syringe | 309659 | Used to inject the pregnant rat. |
| Gauge (30 G x 1/2) | BD PrecisionGlide Needle | 305106 | Use the smallest needle to avoid pain and discomfort. |
| Sterile Saline (0.9% Sodium Chloride, USP) | Hospira | Saline is used to dissolve LPS. | |
| Weights | |||
| Scale | Denver Instrument | For recording the weights. Can be any scale with 2 decimal places used in the lab. | |
| Neurodevelopmental Reflexes | |||
| Thin blunt rod | Can be a paperclip or toothpick. This is for forelimb and hindlimb grasping. | ||
| Round filter paper | Whatman | 1001 150 | 15 cm diameter paper used for gait analysis. |
| Timer | Fisher Scientific | 06-662-51 | For timing the time allocated to righting and gait. |
| Blunt surface | Can be an edge of a table. This is for hindlimb placing and cliff avoidance. | ||
| Foam landing | For when the pups perform accelerated righting. | ||
| Video recorder | Sony | VCT-D580RM | To record all reflexes tested. Must be able to record at 1/1,000 fps |
| Bell | For auditory startle. | ||
| Heat lamp or pad | To maintain the body temperature of the pups underoing examination. |
References
- Farber, J. M., Shapiro, B. K., Palmer, F. B., Capute, A. J. The diagnostic value of the neurodevelopmental examination. Clin Pediatr (Phila. 24 (7), 367-372 (1985).
- Zafeiriou, D. I. Primitive reflexes and postural reactions in the neurodevelopmental examination). Pediatr. Neurol. 31 (1), 1-8 (2004).
- Clancy, B., Finlay, B. L., Darlington, R. B., Anand, K. J. S. Extrapolating brain development from experimental species to humans. Neurotoxicology. 28 (5), 931-937 (2007).
- Dobbing, J., Sands, J.
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog. Neurobiol. , (2013).
- Dobbing, J., Sands, J. Quantitative growth and development of human brain. Arch. Dis. Child. 48 (10), 757-767 (1973).
- Tucker, A. M., Aquilina, K., Chakkarapani, E., Hobbs, C. E., Thoresen, M. Development of amplitude-integrated electroencephalography and interburst interval in the rat. Pediatr. Res. 65 (1), 62-66 (2009).
- Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with. Dev. Neurosci. 33 (3-4), 251-260 (2011).
- Back, S. A., Riddle, A., McClure, M. M. Maturation-dependent vulnerability of perinatal white matter in premature birth. Stroke. 38, 724-730 (2007).
- Back, S. A., et al. Late oligodendrocyte progenitors coincide with the developmental window of vulnerability for human perinatal white matter injury. J. Neurosci. 21 (4), 1302-1312 (2001).
- Downes, N., Mullins, P.
- Jakovcevski, I., Filipovic, R., Mo, Z., Rakic, S., Zecevic, N. Oligodendrocyte development and the onset of myelination in the human fetal brain. Front. Neuroanat. 3 (5), (2009).
- Fox, W. M. Reflex-ontogeny and behavioural development of the mouse. Anim. Behav. 13 (2), 234-241 (1965).
- Lubics, A., et al. Neurological reflexes and early motor behavior in rats subjected to neonatal hypoxic-ischemic injury. Behav. Brain Res. 157 (1), 157-165 (2005).
- Futagi, Y., Toribe, Y., Suzuki, Y. The grasp reflex and moro reflex in infants: hierarchy of primitive reflex responses. Int. J. Pediatr. , 191562 (2012).
- Hashimoto, R., Tanaka, Y. Contribution of the supplementary motor area and anterior cingulate gyrus to pathological grasping phenomena. Eur. Neurol. 40 (3), 151-158 (1998).
- Isaza Jaramillo, S. P., et al. Accuracy of the Babinski sign in the identification of pyramidal tract dysfunction. J. Neurol. Sci. 343 (1-2), 66-68 (2014).
- Donatelle, J. M. Growth of the corticospinal tract and the development of placing reactions in the postnatal rat. J. Comp. Neurol. 175 (2), 207-231 (1977).
- Palanza, P., Parmigiani, S., vom Saal, F. S. Effects of Prenatal Exposure to Low Doses of Diethylstilbestrol, o,p'DDT and Methoxychlor on Postnatal Growth and Neurobehavioral Development in Male and Female Mice. Horm. Behav. 40 (2), 252-265 (2001).
- Pantaleoni, G. C., et al. Effects of maternal exposure to polychlorobiphenyls (PCBs) on F1 generation behavior in the rat. Fundam. Appl. Toxicol. 11 (3), 440-449 (1988).
- Yeomans, J. S., Frankland, P. W. The acoustic startle reflex: neurons and connections. Brain Res. Rev. 21 (3), 301-314 (1995).
- Vinay, L., Brocard, F., Clarac, F. Differential maturation of motoneurons innervating ankle flexor and extensor muscles in the neonatal rat. Eur. J. Neurosci. 12 (12), 4562-4566 (2000).
- Geisler, H. C., Westerga, J., Gramsbergen, A.
- Heinen, K., et al. Gabaa receptor maturation in relation to eye opening in the rat visual cortex). Neuroscience. 124 (1), 161-171 (2004).
- Whishaw, I. Q., Gorny, B., Foroud, A., Kleim, J. A. Long-Evans and Sprague-Dawley rats have similar skilled reaching success and limb representations in motor cortex but different movements: some cautionary insights into the selection of rat strains for neurobiological motor research. Behav. Brain Res. 145 (1-2), 221-232 (2003).
- Prusky, G. T., Harker, K. T., Douglas, R. M., Whishaw, I. Q. Variation in visual acuity within pigmented, and between pigmented and albino rat strains. Behav. Brain Res. 136 (2), 339-348 (2002).
- Wu, L., et al. Dietary approach to attenuate oxidative stress, hypertension, and inflammation in the cardiovascular system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (18), 7094-7099 (2004).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- Rousset, C. I., et al. Maternal exposure to lipopolysaccharide leads to transient motor dysfunction in neonatal rats. Dev. Neurosci. 35 (2-3), 172-181 (2013).
- Nguyen, A. T., Bahry, A. M. A., Shen, K. Q., Armstrong, E. A., Yager, J. Y. Consumption of broccoli sprouts during late gestation and lactation confers protection against developmental delay induced by maternal inflammation. Behav. Brain Res. 307, 239-249 (2016).
- Black, A. M., Armstrong, E. A., Scott, O., Juurlink, B. J., Yager, J. Y. Broccoli sprout supplementation during pregnancy prevents brain injury in the newborn rat following placental insufficiency. Behav. Brain Res. 291, 289-298 (2015).
- Wainwright, P. E. Issues of design and analysis relating to the use of multiparous species in developmental nutritional studies. J. Nutr. 128 (3), 661-663 (1998).
- Lazic, S. E., Essioux, L. Improving basic and translational science by accounting for litter-to-litter variation in animal models. BMC Neurosci. 14, 14-37 (2013).
- Sergio, D. P., Sanchez, S., Ruben, V. R., Ana, B. R., Barriga, C. Changes in behaviour and in the circadian rhythms of melatonin and corticosterone in rats subjected to a forced-swimming test. J Appl Biomed. 1 (47), (2005).
- Castelhano-Carlos, M., Baumans, V. The impact of light, noise, cage cleaning and in-house transport on welfare and stress of laboratory rats. Lab. Anim. 43 (4), 311-327 (2009).
- Zimmerberg, B., Ballard, G. A., Riley, E. P. The development of thermoregulation after prenatal exposure to alcohol in rats. Psychopharmacology (Berl. 91 (4), 479-484 (1987).
- Fan, L. W., et al. Hypoxia-ischemia induced neurological dysfunction and brain injury in the neonatal rat). Behav. Brain Res. 165 (1), 80-90 (2005).
- Smart, J. L., Dobbing, J. Vulnerability of developing brain. VI. Relative effects of foetal and early postnatal undernutrition on reflex ontogeny and development of behaviour in the rat. Brain Res. 33 (2), 303-314 (1971).
- Fox, M. W. Neuro-Behavioral ontogeny: A synthesis of ethological and neurophysiological concepts. Brain Res. 2 (1), 3-20 (1966).
- Piper, M. C., Mazer, B., Silver, K. M., Ramsay, M. Resolution of neurological symptoms in high-risk infants during the first two years of life. Dev. Med. Child Neurol. 30 (1), 26-35 (1988).
- Shiotsuki, H., et al. A rotarod test for evaluation of motor skill learning. J. Neurosci. Methods. 189 (2), 180-185 (2010).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nat. Protoc. 1 (2), 848-858 (2006).
- Walf, A. A., Frye, C. A. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nat. Protoc. 2 (2), 322-328 (2007).
