Summary
I denne protokol, er baculovirus produceret af forbigående Transfektion af baculovirus plasmid i Sf9 celler og forstærket i et serumfrit suspension kultur. Supernatanten er renset af heparin affinitet kromatografi og yderligere koncentreret af ultracentrifugering. Denne protokol er nyttigt for produktion og oprensning af baculovirus for gen terapi program.
Abstract
Baculovirus har traditionelt været brugt til fremstilling af rekombinante protein og vaccine. Men mere for nylig, baculovirus fremstår som en lovende vektor for gen terapi program. Her, er baculovirus produceret af forbigående Transfektion af baculovirus plasmid DNA (bacmid) i en vedhængende kultur af Sf9 celler. Baculovirus er senere udvidet i Sf9 celler i et serumfrit suspension kultur, indtil den ønskede rumfang er opnået. Det er derefter renset fra kultur supernatanten ved hjælp af heparin affinitet kromatografi. Virus supernatanten er lastet på kolonnen heparin, som binder baculovirus partikler i supernatanten på grund af affinitet af heparin for baculovirus indhylle glycoprotein. Kolonnen er vasket med en buffer til at fjerne forurenende stoffer og baculovirus elueres af kolonnen med en høj-salt buffer. Eluatet er fortyndet til en isotonisk saltkoncentration og baculovirus partikler er yderligere koncentreret ved hjælp af ultracentrifugering. Du bruger denne metode, kan baculovirus være koncentreret op til 500-fold med en 25% genanvendelse af smitsomme partikler. Selv om protokollen beskrevet her viser produktion og rensning af baculovirus fra kulturer op til 1 L, metoden kan være skaleres op i et lukket system suspension kultur til at producere en klinisk-grade vektor for gen terapi program.
Introduction
Baculovirus bruges primært til produktion af rekombinante proteiner og vacciner i lepidopteran Spodoptera fugiperda (Sf) 9 insekt celler ved hjælp af rekombinante Autographa californica multicapsid nuclear polyhedrosevirus (AcMNPV) 1 , 2 , 3 , 4. for nylig, det er ved at opstå som en lovende vektor for gene therapy program5. Det er kendt for at have en bred vært og væv tropisme, inficerer inaktiv og prolifererende celler, er ikke-patogene og integrere ikke vært kromosom4,5,6. Derudover kan baculovirus fremstilles i serumfrit suspension kultur, som er skalerbar og giver mulighed for lukket system behandling for fremtidige kliniske produktion1.
Renheden af baculovirus partikler er vigtig for at opnå effektiv transduktion samtidig minimere cytotoksicitet7,8,9. Baculovirus kan være koncentreret af ultracentrifugering eller tangential flow filtrering (TFF) med begrænset indvirkning på dens smitteevne. Disse procedurer ikke kun koncentrere viruspartikler men også celleaffald og proteiner fra Sf9 kultur, som kan være giftige i vitro (personlige observation) og kan fremkalde betændelse eller en immunrespons, når de anvendes i vivo. For at undgå dette, især når ved hjælp af stærkt koncentreret viruslagrene, skal smitsomme baculovirus være renset og adskilt fra forurener partikler.
Flere metoder er blevet rapporteret til rensning og koncentration af baculovirus vektorer10,11,12. Af de tilgængelige metoder, heparin affinitet kromatografi giver mulighed for en trinvis højt niveau af rensning med den lave koncentration af forurenende proteiner12. Metoden er baseret på identificering af heparan sulfat som receptoren for baculovirus13,14. Efter indlæsning Sf9 celle supernatanten over på kolonnen og binding af baculovirus, kan kolonnen vaskes med fysiologisk (isotonisk) buffer til at fjerne ubundne eller løst bundet forurenende partikler. Da binding til heparin er reversible, kan baculovirus partikler elueret med et højt salt buffer, som er fortyndet straks til fysiologisk (isotonisk) salt koncentration at forhindre inaktivering af osmotisk chok12. Derudover kan produktion af baculovirus, såvel som opsamling på og eluering fra kolonnen kromatografi udføres ved hjælp af et lukket system proces, der er kompatible med aktuelle god fremstillingspraksis (cGMP).
Her give vi en detaljeret protokol til fremstilling, rensning og koncentration af smitsomme baculovirus ved hjælp af affinitet kromatografi og centrifugering. Kort, vi producere baculovirus af Transfektion af Sf9 celler med en baculovirus plasmid DNA i vedhængende kultur og yderligere udvide den smitsomme baculovirus i serumfrit suspension kultur. Vi rense baculovirus ved hjælp af heparin affinitet kromatografi og bruge ultracentrifugering som det sidste trin meget koncentrere vektor for gen terapi program.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Se figur 1 for en illustration, sammenfatter at protokollen.
1. rensning af Baculovirus Plasmid DNA
- Vokse bakteriekulturen indeholdende baculoviral plasmid DNA (bacmid)14 i 200 mL af LB bouillon med antibiotika; kanamycin (50 µg/mL), tetracyklin (10 µg/mL) og phosphatbufferet (7 µg/mL), i 16 timer ved 37 ° C på en orbitalryster indstilling på 300 rpm.
- Rense bacmid DNA fra bakteriekulturen ved hjælp af standard alkaline lysis protokol15, og Opløs bacmid i TE buffer.
2. fremstilling af Baculovirus
- Kultur Sf9 celler i en orbitalryster inkubator på 135 rpm og 28 ° C i en polycarbonat Erlenmeyer-kolbe indeholdende serumfrit insekt næringssubstratet1,2,3.
Bemærk: Hvis Sf9 celler er optøede frosne lager, tillade mindst to uger for cellerne til at genoprette og Angiv den eksponentielle fase af vækst. - Tælle de Sf9 celler høstet ved eksponentiel fase af vækst med en hemocytometer efter farvning med Trypan blå. Frø 1 x 106 levedygtige Sf9 celler pr. brønd i en 6-godt vævskultur-behandlet plade i 2 mL af medium. Tillad cellen at vedhæfte i 1 time ved 28 ° C i en inkubator.
- Erstatte vækstmediet med 1 mL serum-fri unsupplemented nåde insekt næringssubstratet.
- Transfect bacmid DNA i Sf9 celler ved hjælp af insekt celle Transfektion reagens.
- Mix 8 µL insekt celle Transfektion reagens med 100 µL af graces insekt medium.
- Fortyndes 2 µg af bacmid DNA i 100 µL af unsupplemented insekt middel, og bland forsigtigt af vortexing.
- Kombiner den fortyndede DNA med fortyndet insekt celle Transfektion reagens, og bland forsigtigt. Inkuber i 15-30 min. ved stuetemperatur.
- Tilføj DNA-lipid blandingen dråbevis på cellerne. Der inkuberes ved 28 ° C i en inkubator for ca 5 h.
- Fjern Transfektion blanding fra cellerne, og cellerne vaskes med 2 mL PBS.
- Der tilsættes 2 mL af insekt næringssubstratet og fortsat kultur ved 28 ° C i en inkubator uden at ændre medierne.
Bemærk: Hvis bacmid indeholder en fluorescerende proteiner, kan dens udtryk påvises i celler 48 h efter Transfektion. Baculovirus er produceret af transfekteret Sf9 celler og udskilles i substratet, som efterfølgende inficerer de untransfected celler. Hele cellen befolkningen bliver inficeret med baculovirus i 5 dage og viser tegn på viral infektion, også kaldet cytopatisk effekt. Disse omfatter øget celle diameter, vacuoles/granulat i cytoplasma, ophør af cellevækst og døde eller mængden celler findes i cellekultur. Men hvis Transfektion eller infektion effektivitet ikke er optimal, kan kulturen ikke viser en indlysende cytopatisk effekt. Den cytopatisk effekt kan visualiseres med en omvendt fase mikroskop på 200-400 X forstørrelse. Baculovirus inficeret celle kan påvises ved farvning med anti-gp64 antistof11. - Høste baculovirus supernatanten 5 dage efter Transfektion og etiket som P1 virus lager.
- Gemme baculovirus supernatanten, der er lysfølsomt, i mørke med 0,5% bovint serumalbumin (BSA) i PBS. Opbevares ved 4 ° C for på kort sigt (op til 90 dage) eller ved-80 ° C på lang sigt.
- Seed 6 × 106 Sf9 celler i en 10-cm vævskultur-behandlet plade i 10 mL af insekt næringssubstratet. Der tilsættes 1 mL af indledende baculovirus supernatanten (P1) til cellerne.
- Høste baculovirus supernatanten (P2) på 5th dagen efter infektionen.
- Frø 50 mL af Sf9 celler (3 x 106 celler/mL) i suspension kultur i insekt næringssubstratet i en 250 mL polycarbonat Erlenmeyer-kolbe og sted kolbe i en orbitalryster inkubator. Der tilsættes 2 mL af P2 lager til cellerne og ryste på 135 rpm samtidig opretholde en konstant temperatur på 28 ° C.
Bemærk: Tre eller fire dage efter infektion, vil hele Sf9 celle befolkning vise cytopatisk effekt, hvilket er tegn på high-titer baculovirus produktion. - Sekventielt forstærke baculovirus analysere, indtil den ønskede rumfang er opnået (P3, P4,...) ved at øge 10 50-fold mængde af cellekultur i hver efterfølgende infektion.
Bemærk: P3 er 3rd runde af infektion i hvilke 500 mL til 1 L af Sf9 cellekultur kan være inficeret med 10-20 mL af P2 baculovirus supernatanten; P4 er 4th runde af infektion i som 5-10 L i Sf9 cellekultur kan være inficeret med 100-200 mL Pedersen3 baculovirus supernatanten, og så videre. Typisk, Sf9 cellerne udsås på 3 × 106 celler/mL i serumfrit insekt dyrkningsmedier. - Der centrifugeres baculovirus supernatanten ved 1.000 x g i 30 min. ved 4 ° C for at fjerne celleaffald og behandle baculovirus supernatanten med 50 enheder/mL nukleasen (250 enheder/µL af bestanden) i 2 timer ved 37 ° C til at fordøje de genomisk DNA og RNA. Filtrer analysere gennem en 0,45 μm filtrering enhed.
3. forberedelse af kromatografi System
- Forberede kromatografi system af sekventielt skylning prøve buffer linjerne og hver med sterilt vand, 1 N natriumhydroxid, vand, og vaske buffer (20 mM natrium fosfat buffer indeholder 150 mM natriumchlorid, pH 7,0) på en lineær strømningshastighed af 50 mL/min.
- Forbered en heparin 50 µm kolonne (10 × 10 cm, 7,9 mL kolonne volumen (CV)) ved sekventielt kører kolonne rengøring buffer (5 CV sterile 20 mM natrium fosfat buffer indeholdende 2 M natriumchlorid, pH 7,0) og 5 CV wash buffer på en lineær strømningshastighed af 7 mL/min.
4. rensning af Baculovirus vektor
- Oprette kromatografi system som følger:
- Bruge eksemplet lastning indløbsstuds for lastning baculovirus supernatanten.
- Bruge buffer indløbsstuds A1 til indlæsning af wash buffer. Forberede en flaske med mindst 500 mL wash buffer og placere wash buffer linje i flasken.
- Bruge buffer indløbsstuds A2 for lastning eluering buffer (20 mM natrium fosfat med 1,5 M natriumchlorid, pH 8,0). Forberede en flaske med mindst 500 mL eluering buffer og placere eluering buffer linje i flasken.
- Indsætte flere 50 mL konisk rør i brøkdel Samleren til at indsamle den kolonne pass-through-baculovirus supernatanten, wash buffer og den eluted baculovirus.
- Blandingen henstår kolonnen heparin med fem 7,9 mL kolonne bind (CVs) af vaskebuffer (40 mL) på en lineær strømningshastighed af 7.0 mL/min.
- Indlæse 250 mL af baculovirus supernatanten heparin kolonne ved hjælp af prøven pumpe (inlet prøven port) af kromatografi system på en lineær strømningshastighed af 2,0 mL/min.
- Køre 10 CVs (80 mL) af vaskebuffer gennem heparin kolonne på en lineær strømningshastighed af 2,0 mL/min. indtil ultraviolet (UV) absorbans kurven (280 nm) er vendt tilbage til baseline og bliver stabil.
- Elueres baculovirus partikler fra 7,9 mL heparin kolonne med 5 CVs (40 mL) af eluering buffer på en lineær strømningshastighed af 4,0 mL/min. Watch for en skarp eluering peak af protein på kromatogrammet, når baculovirus partiklerne tage afstand fra kolonnen heparin.
- Efter eluering, straks fortyndes elueret baculovirus supernatanten 10-fold bruge 20 mM natrium fosfat buffer i vand for at forhindre inaktivering af baculovirus partikler fra osmotiske stød under efterfølgende centrifugering.
- Gemme 100 µL af hver af fraktioner, herunder den kolonne-gennemstrømnings indsamlet under indlæsning af baculovirus supernatanten, wash buffer og eluatet. Inficere disse baculovirus brøker til HT1080 at vurdere rensningsprocessen (Se afsnit 6).
- Rydde kolonnen med kolonne rengøring buffer og wash buffer. Til sidst skylles kolonnen med 5 CV sterile 20% ethanol i vand på en lineær strømningshastighed af 7.0 mL/min og opbevares ved 4 ° C.
- Rense kromatografi system med vand, 1 N natriumhydroxid, igen med vand, og 20% ethanol i vand ved en lineær strømningshastighed af 50,0 mL/min og gemme systemet i 20% ethanol.
5. koncentrering af Baculovirus
- Pre sterilisere centrifugeglas ved hjælp af autoklave. Tilføje et lige saa stort volumen af baculovirus supernatanten til hver ultracentrifuge rør i vævskultur hætte. Måle tube vægten af en balance og justere vægten af indholdet af ultracentrifuge rør med steril PBS.
- Placer hver af ultracentrifuge rør i modsatrettede spand af SW 32 Ti rotoren.
- Opstille ultracentrifuge på 80.000 × g i 90 min ved 4 ° C.
- Åbne ultracentrifuge rør i vævskultur hætte og aseptisk Aspirér væsken uden at fjerne baculovirus pelleten.
- Resuspenderes hver tube af energisk pipettering op og ned med 200 µL PBS indeholdende 0,5% (w/vol) BSA.
- Overføre den koncentrerede baculovirus til cryovials (50-100 µL pr. hætteglas) og opbevares ved-80 ° C.
6. titrering af Baculovirus
- Dagen før infektionen, tælle HT1080 celler ved hjælp af en hemocytometer efter farvning celler med Trypan blå. Frø 1 x 105 HT1080 celler pr. brønd i en 6-godt plade i 2 mL af Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) som indeholder 10% føtal bovint serum (FBS). Frø flere ekstra wells til at være i stand til at bestemme det nøjagtige antal celler til stede på tidspunktet for infektion. Kultur celler i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
Bemærk: HT1080 celler anvendes til titrering, som de giver udtryk for en højere grad af heparan sulfat i forhold til de andre celle linjer16. Da HT1080 celler er vedhængende, titrering er enklere og mindre tidskrævende i forhold til brug af den traditionelle Sf9-baserede titrering. - På dagen for infektion, bestemme antallet af celler pr. brønd ved at tælle celler fra brønde. Inficere cellerne ved at tilføje den fortyndede oprindelige baculovirus, som havde afsat kolonne rensning, og med prøver fra den kolonne gennemstrømning, vask og eluering fraktioner. For hver prøve, bestemme fortynding og volumen empirisk baseret på smitsomme baculovirus partikler, og inficere hver brønd i tre eksemplarer.
- To dage efter infektion, analysere celler for gen af interesse udtryk. Celler kan analyseres ved hjælp af en flow forskellige, hvis de udtrykker en fluorescerende proteiner (f.eks. normal god landbrugspraksis)17.
- Beregne titers (smitsomme enhed pr. mL) baseret på antallet af celler til stede på tidspunktet for infektion, fortyndingsfaktoren og procenter af fluorescerende proteiner i cellerne ved hjælp af formlen: (antal celler under infektion × procent af fluorescerende proteiner positive celler × fortyndingsfaktoren) / volumen af baculovirus i mL.
Bemærk: For eksempel, hvis antallet af celler pr. brønd på tidspunktet for infektion er 1,2 × 105, procentdelen af fluorescerende proteiner er 5%, fortyndingsfaktoren er 100, og volumen af fortyndet baculovirus tilføjet er 10 µL, er titer 6 × 107 smitsomme enheder (IU) /mL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen præsenteret er i flow-diagram (fig. 1). Skridt omfatter den forbigående Transfektion af Sf9 celler med bacmid DNA for at producere baculovirus i vedhængende kultur i en plade, den efterfølgende forstærkning i serumfrit suspension kultur, nukleasen behandling og afklaring af centrifugering og filtrering, og rensning ved hjælp af heparin affinitet kromatografi efterfulgt af koncentration med ultracentrifugering.
Efter optøning, Sf9 celler har brug for mindst to uger til at inddrive og komme ind i den eksponentielle fase af vækst. Aktivt voksende Sf9 er celler transfekteret med bacmid DNA i vedhængende kultur. To dage efter Transfektion, udtryk for baculovirus kuvert glykoproteiner, gp64 registreres og efterfølgende baculovirus produktion er indviede11. Da baculovirus er replikering kompetente, øges antallet af inficerede celler gradvist som følge af en progressiv infektion af celler med den nyligt producerede baculovirus, der udskilles i vækstmediet. Baculovirus som indeholder celle analysere er høstet 5 dage efter Transfektion når hele cellen befolkning er blevet smittet. Denne indledende virus supernatanten er udpeget som passage 1 (P1) lager. P1 stock bruges til den efterfølgende infektion af en nyligt seedede vedhængende kultur af Sf9 celler i en større plade. Hele cellen befolkningen viser tegn på infektion i 5 dage, som kaldes cytopatisk effekt (figur 2). Supernatanten fra det andet vedhængende cellekultur er høstet og er udpeget som P2 lager. Baculovirus supernatanten forstærkes yderligere i Sf9 suspension kultur gennem igangværende infektion af frisk tilføjet Sf9 celler i en shaker kolbe med serumfrit insekt cellekulturmedium. I slutningen af hver cyklus med infektion viser de fleste af cellerne cytopatisk effekt med en øget cellulær diameter og døde eller mængden celler, der er tegn til afslutning af baculovirus infektion. Baculovirus materiel forstærkes sekventielt, indtil den ønskede rumfang er opnået (P3, P4,...). Supernatanten er adskilt fra Sf9 cellerne ved lav hastighed centrifugering, behandlet med en nukleasen at reducere viskositeten, filtreres gennem et 0,45 μm membran, inden det anvendes i de efterfølgende oprensning og koncentration trin.
For at rense baculovirus, er supernatanten fra inficerede Sf9 celler lastet på en heparin kolonne. Kolonnen heparin bliver gradvist mættet med stærkt bundne baculovirus og løst bundet protein forurenende stoffer. Heparin kolonnen skylles med wash buffer til at fjerne forurenende stoffer indtil ultraviolet (UV) absorbans kurven (280 nm) vender tilbage til baseline og bliver stabil, med angivelse af fjernelse af ubundne og løst bundet materialer fra kolonnen. Baculovirus partikler binde på den anden side stærkt til kolonnen heparin. Derfor er ingen betydelig mængde af virus opdaget i kolonne wash buffer. Heparin-bundet baculovirus partikler er elueret med 1,5 M natriumchlorid på pH 8,0 og fortyndet 10-fold med buffer til at opnå isotonicity og forhindre virus inaktivering. En skarp peak af protein er iagttaget under eluering, somsvarertil baculovirus fraktion (figur 3). Optimeret betingelserne for prøven lastning, vask og eluering anvendes i denne kromatografi protokol udbytte i mere end 50% nyttiggørelse af renset smitsomme baculovirus partikler. Fortyndet analysere er yderligere koncentreret op til 500-fold med ultracentrifugering og formuleret i PBS, som indeholder 0,5% BSA, hvilket giver en netto 25% nyttiggørelse11.
Figur 1 . Skematisk diagram for produktion og rensning af baculovirus. Sf9 cellerne udsås i celle kultur-behandlet plade transfekteret med bacmid DNA. Baculovirus supernatanten er høstet og brugt til at inficere nye Sf9 celler i vedhængende kultur. Inficerede celler er efterfølgende opformeret i serumfrit suspension kultur. Baculovirus supernatanten er behandlet med en nukleasen, centrifugeres og filtreret. Baculovirus er renset af heparin affinitet kolonne kromatografi, fortyndet i buffer og koncentreret aseptisk ved ultracentrifugering. Endelig opbevares baculovirus supernatanten ved-80 ° C. (Tallet er blevet tilpasset fra Nasimuzzaman et al., 2016, Mol Ther metoder Clin Dev. 2016; 3: 16071 med tilladelse.) Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Cytopatisk effekt af baculovirus inficerede Sf9 celler. Baculovirus supernatanten blev brugt til at inficere Sf9 cellerne i en vævskultur behandlet plade. Fem dage efter infektion, blev celler visualiseret med en omvendt fase mikroskop. A) ikke-inficerede Sf9 celler som kontrol. B) Baculovirus inficerede Sf9 celler viser cytopatisk effekt. Celler er vist på 200 X forstørrelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Antallet af smitsomme baculovirus i gennemstrømnings under heparin affinitet kromatografi. Baculovirus titers blev anslået ved infektion af HT1080 celler. Testede prøver herunder kolonne gennemgangen, vask og eluat. Prøver var fortyndes efter behov. Linje (mørke ruder) viser de samlede smitsomme enheder (IE) af baculovirus i hver fraktion. Kolonne gennemstrømnings-prøven og vaskebuffer brøkdel størrelse var 40 mL i hver tube, og eluatet var 10 mL i hver tube. (Tallet er blevet tilpasset fra Nasimuzzaman et al., 2016, Mol Ther metoder Clin Dev. 2016; 3: 16071 med tilladelse.) Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen præsenteres her beskriver produktion af baculovirus i Sf9 celler i suspension kultur og rensning af baculovirus ved hjælp af en heparin affinitet kromatografi. De parametre, der anvendes i denne protokol maksimere udbyttet og minimere inaktivering af smitsomme baculovirus. Protokollen i henhold her viser et betydeligt bedre inddrivelse af baculovirus partikler i forhold til inddrivelse af andre9.
På grund af bred host range og væv tropisme, blev flere undersøgelser udført i centralnervesystemet, lever, øjet, æggestokkene, prostata og testiklerne med baculovirus-medieret gen levering5,6,7,8 . Baculovirus vektorer indeholdende terapeutiske gener, som selvmord gener, tumor suppressor gener og gener kodning tumor-specifik antigener har med succes gennemført i prækliniske modeller dyre18,19. Selv om baculovirus kan transduce menneskelige celler, det kan kun overføres i insekt celler, og som følge heraf udgør ikke en risiko for menneskers modtagere.
Baculovirus er produceret i insekt celler af forbigående Transfektion af bacmid DNA. Kvaliteten af bacmid er afgørende for produktion af high-titer baculovirus. Typisk, frisklavede bacmid udfører bedre end dem, der er gemt i køleskabet for lang periode. Aktivt voksende Sf9 er celler transfekteret effektivt som producerer high-titer baculovirus. Fasen forstærkning det er vigtigt at optimere koncentrationen af celler i suspension kultur og mængden af baculovirus supernatanten anvendes til infektion. Hvis forholdet mellem baculovirus partikler til celler ikke er optimal, kan udbyttet af baculovirus være lavere end de forventede (personlig bemærkning, MN).
Samtidigt med at ladning baculovirus supernatanten heparin kolonne, er det vigtigt at kontrollere gennemstrømnings for viruspartikler, der kan passere gennem kolonnen. Hvis det sker, et lavere kolonne køre hastighed kan være nødvendigt eller mindre mængde supernatant skal indlæses på kolonnen. De fleste af de forurenende stoffer i baculovirus analysere vaskes under trinnet til vask af kromatografi run. Vi evalueret renheden af baculovirus af sølv farvning af sodium dodecyl sulfat (SDS)-polyacrylamid gel elektroforese (side) gel og elektron mikroskopisk undersøgelse og fandt, at vores renset baculoviruses er god kvalitet12.
Vi har omhyggeligt optimeret bindende betingelser og fandt, at POROS heparin medium er overlegen i forhold til andre heparin medier (fx. HiTrap eller Capto heparin) i sin evne til at fange baculovirus partikler (personlige observation). Heparin evne til at binde baculovirus på højere prøve hastighed og kapacitet er vigtigt at minimere downstream behandlingstid for storstilet fremstillingsprocessen. Udover baculovirus binder heparin medium også andre forurenende proteiner, der har en affinitet for heparin. De fleste af lavmolekylære forureningen kan elimineres ved herunder en tangential flow filtrering (TFF) trin nedstrøms af heparin kromatografien køre. TFF bruges også som et alternativ til centrifugering for at koncentrere produktet20.
Denne protokol kan anvendes til rensning af andre virus og proteiner, som har en affinitet for heparin. Ændringer til vask og eluering buffer sammensætning og flowet kan dog kræves.
Rekombinante protein produktion fungerer godt ved hjælp af urenset baculovirus analysere direkte. Rå baculovirus kan derfor bruges til rekombinante protein produktion. Men hvis baculoviruses bruges som en vektor i vivo genoverførsel, eller som en vaccine, yderligere rensning foranstaltninger såsom kromatografi, gel filtrering og/eller ultracentrifugering er nødvendige for at få ren og koncentreret baculovirus partikler og minimere producent celle - og kultur medier-afledte urenheder for at undgå toksicitet, betændelse og en immunrespons.
Afslutningsvis har vi beskrevet en enkel protokol for produktion og oprensning af baculovirus, som kan være skaleres op til fremstilling rekombinante proteiner, vacciner og gen terapi vektorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde er delvist understøttet af Start-Up finansieringen fra Cincinnati children's Research Foundation (CCRF) til M.N. og Innovative Core Grant (regeringskonferencen) støttet af National Center for fremme translationel videnskab af National Institutes of Health under Award nummer UL1 TR001425. Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Akta Avant 150 | GE Healthcare | 28976337 | Chromatography system |
| POROS Heparin 50 µm Column | ThermoFisher Scientific | 4333414 | Heparin column |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Non-catalog item | Concentrates virus at high-speed |
| Polyallomer Ultracentrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 | Concentrates virus at high-speed |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| 250 mL Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| 1 L Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238072 | Flask for suspension culture |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of Baculovirus supernatant |
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Tissue culture treated plate |
| 10-cm plate | ThermoFisher Scientific | 08-772E | Tissue culture treated plate |
| Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF | EMD-Millipore | SCHVU05RE | Filtration unit |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | 15160-054 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| Bac-to-Bac Vector Kit | ThermoFisher Scientific | 10360-014 | Baculovirus expression system |
| DH10B-T1R Competent cell | ThermoFisher Scientific | 12331-013 | Competent cell for bacmid |
| TE buffer | In-house | Non-catalog item | 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. |
| Plasmid Maxiprep kit | ThermoFisher Scientific | K2100-06 | For bacmid purification |
| Sf9 Cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Grace’s Insect Cell Culture Medium | ThermoFisher Scientific | 11605-094 | Transfection medium |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012227 | Washing cells, diluting samples |
| HyClone SFX-Insect cell media | GE Healthcare | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Baculovirus plasmid (bacmid) DNA | In-house | Non-catalog item | Bacmid for Baculovirus Production |
| Cellfectin II | ThermoFisher Scientific | 10362 | Transfection reagent for insect cells |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4737 | Stabilizes Baculovirus |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For storage of Baculovirus |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Wash buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride |
| Column cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride |
| Sterile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For Akta Avant cleaning |
References
- Ikonomou, L., Schneider, Y. J., Agathos, S. N. Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins. Appl Microbiol Biotechnol. 62 (1), 1-20 (2003).
- Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
- Cox, M. M. Recombinant protein vaccines produced in insect cells. Vaccine. 30 (10), 1759-1766 (2012).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Airenne, K. J., et al. Baculovirus: an insect-derived vector for diverse gene transfer applications. Mol Ther. 21 (4), 739-749 (2013).
- Sung, L. Y., et al. Efficient gene delivery into cell lines and stem cells using baculovirus. Nat Protoc. 9 (8), 1882-1899 (2014).
- Zeng, J., Du, J., Lin, J., Bak, X. Y., Wu, C., Wang, S. High-efficiency transient transduction of human embryonic stem cell-derived neurons with baculoviral vectors. Mol Ther. 17 (9), 1585-1593 (2009).
- Zeng, J., Du, J., Zhao, Y., Palanisamy, N., Wang, S. Baculoviral vector-mediated transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25 (4), 1055-1061 (2007).
- Wu, C., Soh, K. Y., Wang, S. Ion-exchange membrane chromatography method for rapid and efficient purification of recombinant baculovirus and baculovirus gp64 protein. Hum Gene Ther. 18 (7), 665-672 (2007).
- Grein, T. A., Michalsky, R., Vega Lopez, M., Czermak, P. Purification of a recombinant baculovirus of Autographa californica M nucleopolyhedrovirus by ion exchange membrane chromatography. J Virol Methods. 183 (2), 117-124 (2012).
- Nasimuzzaman, M., Lynn, D., van der Loo, J. C., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16071 (2016).
- Makkonen, K. E., Turkki, P., Laakkonen, J. P., Yla-Herttuala, S., Marjomaki, V., Airenne, K. J. 6-o- and N-sulfated syndecan-1 promotes baculovirus binding and entry into Mammalian cells. J Virol. 87 (20), 11148-11159 (2013).
- Nasimuzzaman, M. Heparan sulfate in baculovirus binding and entry of mammalian cells. J Virol. 88 (8), 4607-4608 (2014).
- Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. J Virol. 80 (4), 1874-1885 (2006).
- Feliciello, I., Chinali, G. A modified alkaline lysis method for the preparation of highly purified plasmid DNA from Escherichia coli. Anal Biochem. 212 (2), 394-401 (1993).
- Nasimuzzaman, M., Persons, D. A. Cell Membrane-associated heparan sulfate is a receptor for prototype foamy virus in human, monkey, and rodent cells. Mol Ther. 20 (6), 1158-1166 (2012).
- Earl, P. L., Americo, J. L., Moss, B. Development and use of a vaccinia virus neutralization assay based on flow cytometric detection of green fluorescent protein. J Virol. 77 (19), 10684-10688 (2003).
- Kim, Y. K., et al. Suppression of tumor growth in xenograft model mice by programmed cell death 4 gene delivery using folate-PEG-baculovirus. Cancer Gene Ther. 17 (11), 751-760 (2010).
- Stanbridge, L. J., Dussupt, V., Maitland, N. J. Baculoviruses as vectors for gene therapy against human prostate cancer. J Biomed Biotechnol. 2003 (2), 79-91 (2003).
- Nasimuzzaman, M., et al. Production and purification of high-titer foamy virus vector for the treatment of leukocyte adhesion deficiency. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16004 (2015).
