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Immunology and Infection

दो-फ्लोरोक्रोम फ्लो साइटोमेट्री द्वारा सात प्रतिरक्षा सेल सबसेट का भेदभाव

Published: March 5, 2019 doi: 10.3791/58955
Automatic Translation
1, 2
1Oncology Research, Medimmune, LLC, 2Division of Rheumatology, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

यहां, हम एक प्रवाह cytometric प्रोटोकॉल प्रस्तुत करने के लिए सीडी 4+ और सीडी 8+ टी कोशिकाओं, γδ t कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, nk कोशिकाओं और मानव परिधीय रक्त में monocytes सात के बजाय केवल दो fluorochromes का उपयोग करके । इस दृष्टिकोण के साथ, पांच अतिरिक्त मार्कर सबसे फ्लो cytometers पर दर्ज किया जा सकता है ।

Abstract

प्रतिरक्षा सेल लक्षण वर्णन भारी बहुरंगा प्रवाह cytometry सतह मार्कर के अंतर अभिव्यक्ति के आधार पर उपआबादियों की पहचान करने पर निर्भर करता है । एक क्लासिक बहुरंगा पैनल के सेटअप उच्च अंत उपकरणों, कस्टम लेबल एंटीबॉडी, और सावधान अध्ययन डिजाइन स्पेक्ट्रल ओवरलैप को कम करने के लिए की आवश्यकता है. हम एक multiparametric विश्लेषण विकसित की पहचान करने के लिए प्रमुख मानव प्रतिरक्षा आबादी (सीडी 4+ और सीडी 8+ t कोशिकाओं, γδ t कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, nk कोशिकाओं और monocytes) परिधीय रक्त में सात वंश मार्करों के संयोजन के द्वारा केवल दो fluorochromes का उपयोग कर. हमारी रणनीति अवलोकन है कि वंश मार्करों लगातार प्रत्येक कोशिका जनसंख्या द्वारा एक अनूठा संयोजन में व्यक्त कर रहे है पर आधारित है । एंटीबॉडी के एक सावधान टाइट्रेट के साथ इस जानकारी के संयोजन जांचकर्ताओं के लिए पांच अतिरिक्त मार्कर रिकॉर्ड की अनुमति देता है, सबसे प्रवाह cytometers के ऑप्टिकल सीमा का विस्तार । सिर से सिर की तुलना का प्रदर्शन किया है कि परिधीय रक्त में प्रतिरक्षा कोशिका आबादी के विशाल बहुमत हमारे विधि और क्लासिक "एक fluorochrome-एक मार्कर दृष्टिकोण" के बीच तुलनीय सटीकता के साथ विशेषता हो सकती है, हालांकि बाद अभी भी ऐसे nkt कोशिकाओं और γδ T कोशिकाओं के रूप में आबादी की पहचान करने के लिए और अधिक सटीक । दो फ्लोरोक्रोम्स का उपयोग कर सात मार्कर का संयोजन सस्ती 6-10 fluorochrome प्रवाह cytometers पर जटिल प्रतिरक्षा कोशिका आबादी और नैदानिक नमूनों के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, और यहां तक कि सीमित संसाधनों के साथ क्षेत्रों में 2-3 fluorochrome क्षेत्र उपकरणों पर । उच्च अंत उपकरणों भी अतिरिक्त फ्लोरोक्रोमेज़ का उपयोग करने के लिए गहरी प्रवाह cytometry विश्लेषण को पूरा करके इस दृष्टिकोण से लाभ उठा सकते हैं । यह दृष्टिकोण भी बहुत अच्छी तरह से कोशिकाओं की सीमित संख्या के साथ नैदानिक नमूनों के मामले में कई कोशिका आबादी स्क्रीनिंग के लिए अनुकूल है ।

Introduction

प्रवाह cytometry एक तकनीक है कि प्रति सेकंड1घटनाओं के कई हजार की दर से एकल कणों पर कई मापदंडों का विश्लेषण करने के लिए विकसित किया गया था । प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण नमूनों के उदाहरणों में शामिल हैं, लेकिन करने के लिए सीमित नहीं हैं, कोशिकाओं, मोती, बैक्टीरिया, vesicles और गुणसूत्रों. एक fluidic प्रणाली पूछताछ बिंदु पर कणों निर्देश जहां प्रत्येक कण एक या एक से अधिक लेसरों के साथ अपने रास्ते intersects, और कई मापदंडों आगे के विश्लेषण के लिए दर्ज कर रहे हैं. आगे और पक्ष scatters, शुद्ध लेजर प्रकाश के प्रकीर्णन द्वारा उत्पंन, लक्ष्य जनसंख्या की पहचान करने और संबंधित आकार और आंतरिक जटिलता के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जाता है/ सभी अंय मापदंडों, कि एक प्रवाह cytometric विश्लेषण में डेटा के अधिकांश के लिए खाते, fluorochrome द्वारा व्युत्पंन-लेबल जांच कि पहचान और ब्याज के कणों पर विशिष्ट लक्ष्यों को बांध रहे हैं ।

प्रवाह cytometry प्रतिरक्षा अध्ययन के लिए एक प्राथमिक उपकरण की पहचान करने और कोशिका आबादी की विशेषता है । प्रतिरक्षा प्रणाली की जटिलता को काटना, बहुरंगा पैनलों लगातार एक साथ सेल आबादी1के गहरे immunophenotyping के लिए दर्ज मार्कर की संख्या का विस्तार करने के लिए विकसित कर रहे हैं । यह 20 फ्लोरोसेंट मापदंडों से अधिक हाल ही में उच्च अंत प्रवाह cytometers के साथ अधिक सक्षम उपकरणों और फ्लोरोक्रोमीस के विकास के लिए अग्रणी है । फ्लोरोक्रोम स्पेक्ट्रल ओवरलैप के कारण और कस्टम एंटीबॉडी लेबलिंग और कुशल ऑपरेटरों के साथ जुड़े उच्च लागत में जटिल अध्ययन डिजाइन में यह परिणाम है । कई उदाहरणों में, जटिलता और लागत अलग सेल आबादी के लिए मार्कर के अलग पैनलों का उपयोग करके कम कर रहे हैं । इस दृष्टिकोण, तथापि, त्रुटि प्रवण है, प्रत्येक पैनल में जानकारी कम कर देता है, और कोशिकाओं की सीमित संख्या के साथ नमूनों पर लागू करने के लिए मुश्किल हो सकता है. इसके अलावा, मार्करों की संख्या में वृद्धि कम फ्लोरोसेंट मापदंडों के साथ उपकरणों पर गहरी immunophenotyping precludes । हम पहले एक धुंधला प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए प्रमुख मानव प्रतिरक्षा आबादी की पहचान (सीडी 4+ और सीडी 8+ टी कोशिकाओं, γδ t कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, nk कोशिकाओं और monocytes) परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं में (pbmcs) के संयोजन के द्वारा सात वंश मार्कर का उपयोग सात के बजाय केवल दो fluorochromes पारंपरिक "एक fluorochrome-एक मार्कर" दृष्टिकोण (www.hcdm.org)2,3का उपयोग करने की आवश्यकता है । हमारी प्रारंभिक रिपोर्ट का पता लगाया और गहरी immunophenotyping के लिए दो फ्लोरोक्रोम में सात मार्कर के संयोजन की धारणा को मान्य. इस रिपोर्ट में, हम एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल को अलग करने और परिधीय रक्त कोशिकाओं दाग, व्यावहारिक पहलू पर ध्यान केंद्रित करने और एक सफल धुंधला प्राप्त करने के लिए समस्या निवारण कदम प्रस्तुत करते हैं ।

इस प्रोटोकॉल अवलोकन है कि वंश मार्कर कोशिका की सतह पर एक निरंतर अभिव्यक्ति है पर आधारित है और है कि प्रत्येक कोशिका आबादी वंश मार्कर का एक विशेष संयोजन है । pbmcs में, सीडी3 अभिव्यक्ति प्रतिरक्षा कोशिकाओं को दो मुख्य श्रेणियों में उपविभाजित करती है: cd3-पॉजिटिव टी लिम्फोसाइटों और सीडी3-निगेटिव सेल । CD3 सकारात्मक उपसमूह के भीतर, सीडी 4+, सीडी 8+ और γδ T कोशिकाओं एंटीबॉडी है कि केवल सीडी 4, सीडी 8 और γδ रिसेप्टर लक्ष्य का उपयोग कर अलग किया जा सकता है । एक तुलनीय तरीके में, CD3 नकारात्मक उपसमूह के भीतर, बी कोशिकाओं, nk कोशिकाओं और monocytes CD19, CD56 और CD14, क्रमशः के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर विशिष्ट रूप से पहचाना जा सकता है. एक मानक एक fluorochrome में-एक मार्कर दृष्टिकोण, विरोधी CD3,-सीडी 4,-सीडी 8,-CD14,-CD19,-CD56 और-tcr γδ एंटीबॉडी सात अलग fluorochromes के साथ पता चला रहे हैं । हमारे दृष्टिकोण विरोधी CD3,-CD56, और tcr γδ एंटीबॉडी एक फ्लोरोक्रोम में (सुविधा फ्लोरोक्रोम ए के लिए लेबल) और विरोधी सीडी 4,-सीडी 8, CD14 और-CD19 एक अलग fluorochrome (फ्लोरोक्रोम बी) में एंटीबॉडी । यह एंटीबॉडी टाइट्रेट और अंतर antigen अभिव्यक्ति का एक संयोजन के द्वारा संभव है । दोनों सीडी 4+ और सीडी 8+ टी कोशिकाओं fluorochrome एक में विरोधी CD3 एंटीबॉडी के लिए सकारात्मक हैं, लेकिन वे फ्लोरोक्रोम बी में अलग किया जा सकता है सीडी 8 संकेत की अभिव्यक्ति अधिकतम जबकि रखने, एक तदर्थ टाइट्रेट करने के साथ, में सीडी 4 संकेत सीडी 8 के बीच और इस CD3 सकारात्मक-सीडी 4/सीडी 8 डबल नकारात्मक कोशिकाओं । γδ T कोशिकाओं सीडी4और सीडी 8 से सीडी3 के उच्च स्तर को व्यक्त करता है, और इसलिए वे के रूप में पहचाना जा सकता है cd3 उच्च 4. इस संकेत को एक एंटी-टीसीआर γδ एंटीबॉडी के साथ फ्लोरोक्रोम ए में γδ टी कोशिकाओं को लेबलिंग द्वारा बढ़ाया जाता है, इस प्रकार cd3 कम टी कोशिकाओं और cd3 उच्च γδ टी कोशिकाओं के बीच जुदाई में सुधार होता है । बी कोशिकाओं के रूप में पहचाना जा सकता है CD3- में fluorochrome एक और CD19+ फ्लोरोक्रोम बी में । बी कोशिकाओं से CD3 नकारात्मक nk कोशिकाओं को अलग करने के लिए, एक anti-CD56 एंटीबॉडी का उपयोग फ्लोरोक्रोम ए में एंटी-सीडी3 के रूप में किया गया था । यह संभव है क्योंकि CD56 T कोशिकाओं पर सीडी3 की तुलना में एक बहुत निचले स्तर पर nk सेल पर व्यक्त किया है5. अंत में, monocytes फॉरवर्ड साइड तितर बितर गुण और CD14 की अभिव्यक्ति में fluorochrome बी के संयोजन के माध्यम से पहचाना जा सकता है ।

अप करने के लिए चार मार्कर का उपयोग करने के लिए संयोजन के विचार दो फ्लोरोक्रोम पहले से ही सफलतापूर्वक करने का प्रयास किया गया है6,7,8, और एक नैदानिक प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया है घातक लिम्फोसाईटिक आबादी 9 की पहचान करने के लिए . एक पिछली रिपोर्ट भी (मार्कर से हम हमारे प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया से अलग विशिष्टता के साथ) सात मार्कर संयुक्त दो fluorochromes का उपयोग कर, लेकिन इस दृष्टिकोण fluorochrome10की मात्रा बदलती के साथ प्रत्येक एंटीबॉडी के एक जटिल लेबलिंग पर भरोसा किया । यह हमारी विधि है जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी का उपयोग करता है और साधन विंयास के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और बहुलक fluorochromes की नई पीढ़ी का लाभ ले सकते है के विपरीत है ।

इस पद्धति का समग्र लक्ष्य के लिए सबसे अधिक प्रवाह cytometers पांच अतिरिक्त मार्कर की रिकॉर्डिंग के लिए जटिल सेल आबादी पूछताछ की अनुमति के ऑप्टिकल सीमा का विस्तार है । नतीजतन, उन्नत इम्यूनोलॉजिकल विश्लेषण सस्ती 6-10 फ्लोरोक्रोम फ्लो साइटोमीटर पर किया जा सकता है, और 2-3 फ्लोरोक्रोम फील्ड इंस्ट्रूमेंट्स सीमित संसाधनों वाले क्षेत्रों में उल्लेखनीय परिणाम प्राप्त कर सकते हैं । उच्च अंत उपकरणों को भी अतिरिक्त फ्लोरोक्रोमेन्स का उपयोग करने के लिए गहरी प्रवाह cytometry विश्लेषण को पूरा करने और एक ही समय में कई प्रजातियों को लक्षित करने के लिए मॉड्यूलर प्रवाह cytometry पैनलों बनाने के द्वारा इस दृष्टिकोण से लाभ कर सकते हैं11. यह संभावित मॉड्यूलर immunophenotyping प्रवाह cytometry में इस्तेमाल पैनलों की संख्या को कम करने और लागत, त्रुटियों और हैंडलिंग समय कम कर सकते हैं । यह दृष्टिकोण भी बहुत अच्छी तरह से कोशिकाओं की सीमित संख्या के साथ नैदानिक नमूनों के मामले में अनुकूल है ।

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Protocol

मानव सामग्रियों के सभी अध्ययनों को स्वास्थ्य बीमा पोर्टेबिलिटी और जवाबदेही अधिनियम के तहत जॉन्स हॉपकिंस इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया । मरीज व नियंत्रण के नमूने डी-पहचान के थे । pbmcs और स्वस्थ नियंत्रण से रक्त सूचित सहमति द्वारा प्राप्त किए गए ।

नोट: इस प्रोटोकॉल ताजा या जमे हुए पृथक परिधीय रक्त कोशिकाओं और पूरे रक्त पर परीक्षण किया गया है.

1. सेल तैयारी

  1. पूरे रक्त से परिधीय रक्त कोशिकाओं (pbmc) के अलगाव
    1. सोडियम हेपरिन युक्त 10 मिलीलीटर ग्रीन टॉप ट्यूब में रक्त ड्रा करें । ट्यूब के खून से भर जाने के बाद, कोएगुलेशन को रोकने के लिए तुरंत ट्यूब को कई बार पलटने दें ।
      नोट: इस तरह के एथिलिनेडिअम्मिनेटेट्राएसिटिक एसिड (edta) या सोडियम साइट्रेट के रूप में अन्य एंटीकोगुलेंट युक्त ट्यूब तुलनीय परिणामों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है । यदि रक्त की एक अलग राशि एकत्र की है, प्रोटोकॉल में निंनलिखित चरणों तदनुसार बढ़ाया जाना चाहिए ।
    2. ध्यान से एक ५० मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में खींचा रक्त हस्तांतरण । कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना फॉस्फेट buffered खारा (pbs) की एक बराबर राशि के साथ रक्त को पतला ।
    3. एक नया ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब के नीचे करने के लिए घनत्व ढाल मध्यम (जैसे, ficoll) के 15 मिलीलीटर जोड़ें और ध्यान से घनत्व ढाल मध्यम के शीर्ष पर पतला रक्त ओवरले, घनत्व ढाल मध्यम और पतला रक्त के बीच किसी भी मिश्रण से परहेज ।
      नोट: यह लाल कोशिकाओं से pbmcs की एक उचित जुदाई के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है ।
    4. ४०० एक्स जी में 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अपकेंद्रित्र (आरटी), कोई ब्रेक के साथ इंटरफेस के विघटन से बचने के लिए ।
    5. अपकेंद्रीकरण के बाद, ध्यान से ऊपरी परत एक पिपेट का उपयोग कर और इसे त्याग, प्लाज्मा और घनत्व ढाल माध्यम के बीच इंटरफेस पर कोशिकाओं को दूर नहीं करने के लिए ध्यान दे, कि जहां pbmcs stratifies. ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब के तल पर लाल सेल गोली को छूने के बिना इंटरफेस से संभव के रूप में कई कोशिकाओं को इकट्ठा करने और एक नया ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
    6. pbs 25 मिलीलीटर और मिश्रण करने के लिए कई बार पलटने के लिए अंतिम मात्रा लाने के लिए जोड़ें । ३०० एक्स जी पर ब्रेक के साथ आरटी में 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र सेल निलंबन से किसी भी घनत्व ढाल मध्यम प्रदूषण को दूर करने के लिए ।
    7. सावधानी से परेशान सेल गोली के बिना अधिप्लाव महाप्राण । pbs 25 मिलीलीटर और मिश्रण करने के लिए कई बार पलटने के लिए अंतिम मात्रा लाने के लिए जोड़ें । 10 मिनट के लिए २०० एक्स जी में अपकेंद्रित्र पर ब्रेक के साथ आरटी पर प्लेटलेट्स निकालने के लिए ।
    8. सावधानी से सेल गोली परेशान बिना अधिप्लाव के महाप्राण । पीबीएस/0.1% सोडियम एज़ाइड के 1 मिलीलीटर में resuspend pbmcs । सोडियम ऐज़ाइड कैपिंग कम कर देता है, बहा, एंटीबॉडी के internalization, और वृद्धि सेल वसूली, लेकिन इसकी विषाक्तता सेल व्यवहार्यता ख़राब कर सकते हैं. इस कारण से, यदि कोशिकाओं को बाद के प्रयोगों के लिए सुसंस्कृत किया जाएगा तो सोडियम ऐज़ाइड को सभी चरणों में टाला जाना चाहिए । सेल अलगाव और सोडियम ऐज़ाइड बिना धुंधला सोडियम ऐज़ाइड की उपस्थिति में प्रदर्शन धुंधला करने के लिए इसी तरह के परिणाम दिया ।
      सावधानी: सोडियम एज़ाइड केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को प्रभावित करके मौत का कारण बन सकता है । संपर्क त्वचा और आंखों को जलता कारण हो सकता है ।
    9. एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में pbmcs के 30 μl स्थानांतरित करके गिनती के लिए कोशिकाओं को पतला । तब सेल संख्या और व्यवहार्यता (1:10 सेल कमजोर पड़ने) का निर्धारण करने के लिए pbs और trypan नीला के १५० μl के १२० μl जोड़ें । ध्यान से resuspend ।
    10. एक hemocytometer के लिए 10 μl स्थानांतरण, इस्तेमाल किया गिनती चैंबर के अनुसार कोशिकाओं की गणना और व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या का निर्धारण. व्यवहार्य कोशिकाओं = trypan नीले नकारात्मक कोशिकाओं की संख्या कुल एक्स 10 (इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल कमजोर पड़ने कारक) x 104.
      नोट: औसत पर, 7-15 x 10 pbmcs के6 रक्त की 10 मिलीलीटर से एकत्र किया जाना चाहिए ।
    11. pbs/0.1% सोडियम ऐज़ाइड के 10 x 106 प्रति मिलीलीटर पर कोशिकाओं resuspend
      नोट: pbmc जमे हुए और समय की एक विस्तारित अवधि के लिए तरल नाइट्रोजन में संग्रहित किया जा सकता है । हालांकि, ऐसे chemokine रिसेप्टर्स के रूप में मार्कर की अभिव्यक्ति इस प्रक्रिया से बदला जा सकता है ।
  2. जमे हुए pbmc से कोशिकाओं की तैयारी
    नोट:     विभिन्न ठंड प्रक्रियाओं सेल वसूली और व्यवहार्यता12को प्रभावित कर सकते हैं । इन प्रयोगों के लिए pbmcs विशेष रूप से तैयार ठंड मीडिया या भ्रूण गोजातीय सीरम (fbs)/समान परिणामों के साथ 10% डाइमेथिल sulfoxide (dmso) में जमे हुए थे ।
    सावधानी: dmso साँस लेना के मामले में थोड़ा खतरनाक हो सकता है (फेफड़ों अड़चन), त्वचा से संपर्क करें (अड़चन, पारगमत्र), आँख से संपर्क की (अड़चन), घूस की.
    1. तरल नाइट्रोजन और बर्फ पर जगह से जमे हुए pbmc निकालें । ३७ ° c पानी स्नान में सीधे बर्फ से cryovial स्थानांतरण । पानी की सतह पर cryovial रखो और धीरे एक छोटे से बर्फ गोली रहने तक शीशियों हिला । cryovial वापस बर्फ पर स्थानांतरण ।
    2. एक ७०% इथेनॉल छिड़काव पोंछ के साथ किसी भी पानी निकालें । धीमी गति से 4 डिग्री सेल्सियस पर pbs/0.1% सोडियम ऐज़ाइड की 1 मिलीलीटर जोड़ें और ध्यान से एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब के लिए सेल हस्तांतरण । 15 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा तक पहुंचने के लिए धीरे-4 डिग्री सेल्सियस पर कोल्ड पीबीएस/0.1% सोडियम एज़ाइड जोड़ें ।
    3. 10 मिनट के लिए ३०० एक्स जी पर अपकेंद्रिका । ध्यान से supernatant निकालें, pbs/0.1% सोडियम azide की 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend ।
      नोट: कोशिकाओं को भी इसी तरह के परिणामों के साथ rpmi 10% fbs में सस्पेंड किया जा सकता है ।
    4. १.५ मिलीलीटर सूक्ष्मकेंद्रज ट्यूब में pbmcs के 30 μl को स्थानांतरित करके गणना के लिए सेल को पतला करता है । तब सेल संख्या और व्यवहार्यता (1:10 सेल कमजोर पड़ने) का निर्धारण करने के लिए pbs और trypan नीला के १५० μl के १२० μl जोड़ें । ध्यान से resuspend ।
    5. एक hemocytometer के लिए 10 μl स्थानांतरण, इस्तेमाल किया गिनती चैंबर के अनुसार कोशिकाओं की गणना और व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या का निर्धारण. व्यवहार्य कोशिकाओं = trypan नीले नकारात्मक कोशिकाओं की संख्या कुल एक्स 10 (इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल कमजोर पड़ने कारक) x 104.
    6. pbs/0.1% सोडियम azide में 10 x 106 प्रति मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend ।
  3. पूरे रक्त से कोशिकाओं की तैयारी
    1. सोडियम हेपरिन युक्त 10 मिलीलीटर ग्रीन टॉप ट्यूब में रक्त ड्रा करें । ट्यूब के खून से भर जाने के बाद, कोएगुलेशन को रोकने के लिए तुरंत ट्यूब को कई बार पलटने दें ।
      नोट: ऐसे edta या सोडियम साइट्रेट के रूप में अंय एंटीकोगुलेंट युक्त ट्यूब तुलनीय परिणामों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है । यदि रक्त की एक अलग राशि एकत्र की है, प्रोटोकॉल में निंनलिखित चरणों तदनुसार बढ़ाया जाना चाहिए ।
    2. एक 12 मिमी x ७५ mm कैप्ड ट्यूब के लिए पूरे रक्त का २०० μl स्थानांतरण, 2 एस के लिए धीरे सोडियम ऐज़ाइड और भंवर के 2 μl जोड़ें ।

2. सेल धुंधला

नोट: वस्तुतः कोई स्पेक्ट्रल ओवरलैप के साथ fluorochromes के जोड़े का चयन अन्य फ्लोरोक्रोम डिटेक्टर में एक फ्लोरोक्रोम के उच्च spillover के कारण डेटा के प्रसार को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है. अल सेल सबसेट की एक इष्टतम पहचान प्राप्त करने के लिए, एक उच्च क्वांटम उपज के साथ fluorochromes एंटीबॉडी जोड़े पीई-BV421 और पीई-apc के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

  1. ताजा और जमे हुए pbmc का धुंधला होना
    1. pbmc के १०० μl (1 x 106 कोशिकाओं) को ९६-वेल वी-नीचे प्लेट में ट्रांसफर करें ।
      नोट: 1 x 106 से कम कक्षों की किसी भी संख्या समान परिणाम2के साथ उपयोग किया जा सकता है ।
    2. ३५० एक्स जी आर टी में 3 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र और ध्यान से सेल गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला महाप्राण । मृत कोशिकाओं को लेबल करने के लिए 10 मिनट के लिए प्रोटीन पर मुक्त amine के साथ प्रतिक्रिया करता है कि एक जीवित/मृत fixable डाई युक्त pbs के प्रत्येक अच्छी तरह से १०० μl में जोड़ें ।
    3. एक मिश्रण के प्रत्येक नमूना 30 μl के लिए तैयार करें जिसमें सभी एंटीबॉडी (एंटी-सीडी3.-CD56, tcrγδ में फ्लोरोक्रोम ए, और एंटी-सीडी 4, सीडी 8, CD19, CD14 में फ्लोरोक्रोम बी) शामिल हैं । प्रतिपिंड की सांद्रता सारणी 1 और Table2में दर्शाई गई है । इस चरण में, विभिन्न लक्ष्य अणुओं के खिलाफ और विभिन्न फ्लोरोक्रोमेन्स में एंटीबॉडी को अलग किया जा सकता है (उदा., तालिका 3) ।
      नोट: एंटीबॉडी एकाग्रता निर्माता और बहुत संख्या के आधार पर भिन्न हो सकते हैं । इसलिए, प्रारंभिक परीक्षण इष्टतम संकेत प्राप्त करने के लिए किया जाना चाहिए । pbs, pbs/0.5% bsa, pbs/0.2% सोडियम ऐज़ाइड या pbs/0.5% bsa/0.1% सोडियम ऐज़ाइड समान परिणाम के साथ उपयोग किया गया एंटीबॉडी2को पतला करने के लिए । सेल भी आसानी से पहले से ही मौजूदा धुंधला प्रोटोकॉल के लिए इस पद्धति को एकीकृत करने के लिए 30 μl से अलग संस्करणों में दाग किया जा सकता है ।
    4. ३५० एक्स जी आर टी में 3 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र और ध्यान से सेल गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला महाप्राण । एक अच्छी तरह से एंटीबॉडी कॉकटेल जोड़ें और बुलबुले पैदा किए बिना ध्यान से resuspend । अंधेरे में आरटी में 30 मिनट के लिए सेते ।
      नोट: यह इसी तरह के परिणामों के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों दाग करने के लिए संभव है ।
    5. 3 मिनट के लिए आरटी में ३५० एक्स जी पर धुंधला बफर और अपकेंद्रित्र के १५० μl जोड़ें और ध्यान से सेल गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला महाप्राण । pbs के २०० μl में कोशिकाओं resuspend और एक प्रवाह cytometer पर डेटा प्राप्त । यदि धुंधला वॉल्यूम बदल रहे हैं, तो कृपया सुनिश्चित करें कि एंटीबॉडी की अधिकता को धोने के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले मूल एंटीशरीर मिश्रण का कम से कम 20 गुना कमजोर पड़ने वाला है ।
      नोट: दाग कोशिकाओं pbs/2% पैराफॉर्मालडिहाइड में, 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रेफ्रिजरेटर में रखा और फिर अगले दिन एक प्रवाह cytometer पर प्राप्त के साथ तय किया जा सकता है ।
      सावधानी: paraformaldehyde अगर निगल लिया और त्वचा की जलन पैदा कर सकता है हानिकारक है
  2. पूरे रक्त का धुंधला होना
    1. प्रत्येक के लिए 12 मिमी x ७५ मिमी छाया ट्यूब, एंटीबॉडी का कॉकटेल जोड़ें (विरोधी-CD3.-CD56, tcrγδ में फ्लोरोक्रोम एक, और विरोधी सीडी 4, सीडी 8, CD19, CD14 में फ्लोरोक्रोम बी) और आरटी में 30 मिनट के लिए आर टी पर ईंटो अंधेरे में आरटी । सारणी 4में एंटीबॉडी की सांद्रता दर्शाई गई है । इस चरण में, विभिन्न लक्ष्य अणुओं के खिलाफ और विभिन्न फ्लोरोक्रोमेन्स में एंटीबॉडी को टाइटरेटेड के रूप में अच्छी तरह से जोड़ा जा सकता है । एंटीबॉडी एकाग्रता निर्माता और बहुत संख्या के आधार पर भिन्न हो सकते हैं । इसलिए, प्रारंभिक परीक्षण इष्टतम संकेत प्राप्त करने के लिए किया जाना चाहिए ।
      नोट: यह इसी तरह के परिणामों के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों दाग करने के लिए संभव है ।
    2. ३५० एक्स जी आर टी में 3 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र और ध्यान से सेल गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला महाप्राण । लाल रक्त कोशिका lysis बफर के एक 1x समाधान निर्माता के निर्देशों का पालन करें ।
      नोट: lysis समाधान का उपयोग करने से पहले RT पर होना चाहिए ।
    3. प्रत्येक ट्यूब के लिए 1x लाल रक्त कोशिका lysis बफर की २.० मिलीलीटर जोड़ें, अच्छी तरह से टोपी और मिश्रण करने के लिए कई बार पलटन । पन्ना के साथ कवर और 15 मिनट के लिए बैठते हैं ।
    4. 5 मिनट के लिए ३०० एक्स जी पर नीचे स्पिन । ध्यान से सेल गोली परेशान बिना अधिप्लाव महाप्राण ।
    5. 5 मिनट के लिए ३०० एक्स जी में पीबीएस और सेंट्रेसेज के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
      नोट: इस बिंदु पर, कोशिका गोली एक पीला सफेद रंगाई एक सफल लाल रक्त कोशिका lysis का संकेत होना चाहिए. सावधानी से सतह पर तैरनेवाला कोशिका गोली परेशान नहीं करने के लिए महाप्राण और धीरे pbs के २०० μl में कोशिकाओं resuspend.
    6. सेल समुच्चय को हटाने और एक प्रवाह cytometer पर डेटा प्राप्त करने के लिए ४० μm फिल्टर कैप्स के साथ 12 मिमी x ७५ मिमी ट्यूबों के माध्यम से कोशिकाओं तनाव ।

3. एंटीबॉडी टाइट्रेट करना

नोट: एंटीबॉडी अनुमापन उच्च गुणवत्ता, पुनरुत्पादित डेटा प्राप्त करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम है । विरोधी के अनुमापन-CD3,-सीडी 8,-CD14,-CD19 और-tcr γδ मानक प्रक्रिया है जिसके द्वारा बेहतर अलग सकारात्मक और नकारात्मक चोटियों के लिए एंटीबॉडी की एकाग्रता अधिकतम धुंधला सूचकांक13,14द्वारा प्राप्त की है इस प्रकार है । चोटी पर या दाग सूचकांक वक्र के बढ़ते पक्ष पर चोटी के करीब dilutions चयनित किया जाना चाहिए (चित्र 1a-सी) । विरोधी-सीडी 4 एंटीबॉडी के लिए cd3 एकल सकारात्मक आबादी और cd3 +/cd8 + टी कोशिकाओं के बीच सीडी 5-4 सकारात्मक आबादी के शिखर जगह titrated है, CD8dim आबादी (सीडी 8 + γδ टी कोशिकाओं और nk टी कोशिकाओं) बेहतर भेदभाव करने के लिए CD3 एकल सकारात्मक संकेत करने के लिए करीब । एक ही पंक्ति के साथ, CD56 अनुमापन के लिए सीडी3+ और cd3- जनसंख्या के बीच nk CD56+ कोशिकाओं की स्थिति करना है ।

  1. अधिकतम दाग सूचकांक वक्र
    ध्यान दें:     विरोधी के अनुमापन-CD3,-सीडी 8,-CD14,-CD19 और-tcr γδ मानक प्रक्रिया है जिसके द्वारा बेहतर अलग सकारात्मक और नकारात्मक चोटियों के लिए एंटीबॉडी की एकाग्रता एक अधिकतम धुंधला सूचकांक वक्र15द्वारा व्युत्पंन है इस प्रकार है । यदि अंय मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी पैनल में जोड़ा जाता है, वे भी एक अधिकतम धुंधला सूचकांक वक्र के साथ titrated की जरूरत है ।
    1. दाग बफर के ४० μl के साथ एक ९६-अच्छी थाली के 10 कुओं को भरने के द्वारा एक 2 गुना एंटीबॉडी कमजोर पड़ने की तैयारी । पहले अच्छी तरह से, अंतिम मात्रा को धुंधला करने वाले बफर के ८० μl में वृद्धि करें और एक एकाग्रता में 4 बार एकाग्रता निर्माता द्वारा सुझाए गए ब्याज की एंटीबॉडी जोड़ें ।
    2. अच्छी तरह मिलाएं और दूसरी अच्छी तरह से ४० μl हस्तांतरण । अच्छी तरह मिलाएं और सभी अंय कुओं के लिए इस कदम को दोहराएं ।
    3. पहले वर्णित प्रोटोकॉल के बाद एंटीबॉडी के 10 विभिन्न 2-गुना dilutions के 30 μl के साथ pbmc या पूरे रक्त के 10 नमूने दाग.
    4. एक प्रवाह साइटोमीटर के साथ डेटा प्राप्त करने और प्रत्येक कमजोर पड़ने से संकेत प्लॉट (चित्रा 1a).
    5. प्रत्येक एंटीबॉडी एकाग्रता के लिए नकारात्मक और सकारात्मक आबादी पर गेट. एंटीबॉडी की बढ़ती एकाग्रता एक उच्च पृष्ठभूमि के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसलिए, तदनुसार नकारात्मक फाटक का आकार बदलें ।
    6. प्रत्येक एंटीबॉडी एकाग्रता के लिए, नकारात्मक आबादी की फ्लोरोसेंट तीव्रता के लिए औसत और मानक विचलन के बारे में जानकारी निकालें, और सकारात्मक आबादी के फ्लोरोसेंट तीव्रता के लिए औसत । प्रत्येक एंटीबॉडी एकाग्रता के लिए गणना इस सूत्र के साथ दाग सूचकांक: (सकारात्मक जनसंख्या का औसत फ्लोरोसेंट तीव्रता-नकारात्मक आबादी का औसत फ्लोरोसेंट तीव्रता) ÷ (2 x के फ्लोरोसेंट तीव्रता के मानक विचलन ऋणात्मक जनसंख्या) (चित्र 1b) ।
    7. विरोधी शरीर कमजोर पड़ने के अंश के रूप में व्यक्त की एंटीबॉडी एकाग्रता बनाम दाग सूचकांक प्लॉट (उदाहरण के लिए, 1:10 कमजोर पड़ने = ०.१), और अधिकतम दाग सूचकांक मूल्य के साथ एंटीबॉडी की एकाग्रता की पहचान (चित्रा 1c).
  2. विरोधी सीडी 4 और-CD56 एंटीबॉडी टाइट्रेट करना
    नोट:     विरोधी सीडी 4 और-CD56 एंटीबॉडी टाइट्रेट करने वाले दो-fluorochrome पैनल में अंय मार्करों पिछले टाइट्रेट पर निर्भर करता है । विरोधी के लिए-4 डी एंटीबॉडी टाइट्रेट करने के लिए डबल सीडी 8+/cd3+ संकेत और CD3 एकल सकारात्मक जनसंख्या (चित्रा 1d) के बीच विरोधी सीडी 4 संकेत रखने का लक्ष्य है ।
    1. titrate विरोधी सीडी 4 और एक 2 गुना कमजोर पड़ने की रणनीति के साथ CD56 एंटीबॉडी के रूप में पहले वर्णित है, के बीच में अतिरिक्त सांद्रता जोड़ने पतले एकाग्रता की सीमा है कि अलग करने की अनुमति की पहचान करने के लिए सीडी 5+ टी कोशिकाओं और nk अंय सेल से कोशिकाओं आबादी.
    2. titrate विरोधी सीडी 4-डबल सीडी 8+/cd3+ संकेत और CD3 एकल सकारात्मक जनसंख्या (चित्रा 1d) के बीच विरोधी 4-5 संकेत रखने के द्वारा एंटीबॉडी ।
      नोट: विशेष देखभाल स्पष्ट रूप से अलग करने के लिए किया जाना चाहिए सीडी 4+ सीडी 8+ मंद आबादी से टी कोशिकाओं ।
    3. titrate विरोधी CD56 एंटीबॉडी विरोधी के समान एक रणनीति-4-4 एंटीबॉडी टाइट्रेट करने के बाद, के बीच nk कोशिकाओं रखकर cd3-नकारात्मक और cd3-सकारात्मक आबादी ।

4. गेटिंग स्ट्रैटेजी

  1. लिम्फोसाईटिक और monocytic सेल आबादी की पहचान और मृत कोशिकाओं को हटाने और विश्लेषण से अवशिष्ट लाल रक्त कोशिकाओं के अधिकांश.
    1. आगे बनाम साइड कैटरिंग क्षेत्र (एफएससी-ए बनाम एसएससी-ए) के आधार पर लिम्फोसाइटों और मोनोसाइट्स युक्त संपूर्ण जनसंख्या का चयन करें । आगे तितर बितर ऊंचाई बनाम आगे तितर बितर चौड़ाई (fsc-एच बनाम fsc-w) और पक्ष तितर बितर ऊंचाई बनाम पक्ष तितर बितर चौड़ाई (ssc-h बनाम ssc-w) के माध्यम से विश्लेषण से सेल समुच्चय निकालें ।
    2. विश्लेषण से उज्ज्वल सकारात्मक मृत कोशिकाओं और अवशिष्ट लाल रक्त कोशिकाओं को बाहर करने के लिए एक लाइव/मृत भेदभाव मार्कर का उपयोग करें । लिम्फोसाइटों और monocytes पर गेट अलग fsc-ए और एसएससी-एक प्रोफ़ाइल के आधार पर ।
  2. लिम्फोसाईटिक आबादी के दो-फ्लोरोक्रोम सात-मार्कर गेटिंग स्ट्रैटेजी ।
    नोट:     CD3 सकारात्मक उपसमूह के भीतर, सीडी 4+, सीडी 8+ और γδ T कोशिकाओं एंटीबॉडी है कि केवल सीडी 4, सीडी 8 और γδ रिसेप्टर लक्ष्य का उपयोग कर अलग किया जा सकता है । एक तुलनीय तरीके में, CD3 नकारात्मक उपसमूह के भीतर, बी कोशिकाओं, nk कोशिकाओं और monocytes CD19, CD56 और CD14, क्रमशः के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर विशिष्ट रूप से पहचाना जा सकता है.
    1. लिम्फोसाइट गेट का चयन करें और इस प्रोटोकॉल (चित्रा 2b) में प्रयुक्त दो फ्लोरोक्रोम में से प्रत्येक अक्ष पर एक डॉट प्लॉट बनाएं ।
    2. सीडी 8+ T कोशिकाओं पर Gate के रूप में पहचाने गए CD3+/cd8+ डबल सकारात्मक कोशिकाओं के ऊपरी दाएँ कोने में डॉट-प्लॉट (चित्रा 2b). जिसमें nkt कक्ष हो सकता है मंद सीडी 8 जनसंख्या को शामिल न करें । सीडी 8+ t कोशिकाओं और CD3 एकल सकारात्मक आबादी के बीच में जनसंख्या के रूप में पहचान की सीडी 4+ टी कोशिकाओं पर गेट । γδ T कोशिकाओं पर गेट उच्च CD3 कोशिकाओं के रूप में पहचान की । सकारात्मक और सीडी 8 नकारात्मक सीडी 8 में γδ टी कोशिकाओं को प्रतिभाग ।
    3. के बीच में जनसंख्या के रूप में पहचान nk कोशिकाओं पर गेट cd3-सकारात्मक और cd3-नकारात्मक कोशिकाओं. सकारात्मक और सीडी 8 नकारात्मक में सीडी 8 nk कोशिकाओं प्रतिभाग । बी कोशिकाओं पर Gate के रूप में पहचाने गए CD3-नकारात्मक CD19+ जनसंख्या डॉट प्लॉट के दाएँ निचले कोने पर.
    4. मोनोसाइट गेट्स का चयन करें और प्रत्येक धुरी पर एक दो इस प्रोटोकॉल (चित्रा 2c) में इस्तेमाल किया फ्लोरोक्रोम के साथ एक डॉट प्लॉट बनाएं । CD3-/cd14+ जनसंख्या पर गेट ।

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Representative Results

सेटअप और मानव परिधीय रक्त कोशिकाओं के एक प्रवाह cytometry प्रयोग के विश्लेषण सात वंश मार्करों के साथ दाग (विरोधी CD3,-सीडी 4,-सीडी 8,-CD14, CD19,-CD56 और-tcr γδ एंटीबॉडी) का उपयोग कर केवल दो fluorochromes प्रस्तुत कर रहे हैं ।

प्रतिनिधि परिणाम anti-सीडी 8 और-CD56 एंटीबॉडी टाइट्रेट करने के लिए बताए गए हैं । प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए (इस उदाहरण में, anti-सीडी 8), दस क्रमिक 2-गुना dilutions से डेटा एक दाग सूचकांक वक्र की गणना करने के लिए दर्ज किए गए (चित्र 1a-C) । इष्टतम एंटीबॉडी एकाग्रता अधिकतम दाग सूचकांक13,14संकेत द्वारा निर्धारित किया गया था । शिखर पर या दाग सूचकांक वक्र के बढ़ते पक्ष पर चोटी के करीब dilutions चयनित किया जाना चाहिए । विरोधी सीडी 4 और-CD56 एंटीबॉडी दो फ्लोरोक्रोम पैनल (पहले से titrated) में अंय मार्कर के साथ एक साथ परिधीय रक्त कोशिकाओं को धुंधला द्वारा titrated थे । विरोधी-सीडी 4 एंटीबॉडी के लिए, टाइट्रेट करने के लिए डबल सीडी 8+/cd3+ संकेत और CD3 एकल सकारात्मक जनसंख्या (चित्रा 1d) के बीच विरोधी 4/ विशेष देखभाल स्पष्ट रूप से अलग करने के लिए किया जाना चाहिए सीडी 4+ सीडी 8+ मंद आबादी से टी कोशिकाओं । pbmcs संकेत मार्करों और विरोधी सीडी 4 के विभिंन सांद्रता की इष्टतम एकाग्रता के साथ दाग रहे थे । सांद्रता का रंग कोड: ग्रीन अन्य CD3+आबादी से सीडी 4+ टी कोशिकाओं की एक इष्टतम जुदाई में परिणाम सांद्रता इंगित करता है; ऑरेंज सांद्रता है कि एक स्वीकार्य है लेकिन आदर्श जुदाई में परिणाम इंगित करता है; लाल कि मंद सीडी 8 कोशिकाओं या सीडी 4/सीडी 8 दोहरी नकारात्मक आबादी से सीडी 4+ टी कोशिकाओं के गरीब जुदाई में परिणाम सांद्रता इंगित करता है । विरोधी CD56 टाइट्रेट विरोधी के रूप में एक समान तरीके में किया गया था-सीडी 4 एंटीबॉडी, के बीच nk कोशिकाओं रखकर cd3-नकारात्मक और cd3-सकारात्मक आबादी.

प्रतिनिधि gating रणनीति दिखाता है कि लिम्फोसाईटिक और monocytic सेल आबादी की पहचान करने के लिए और विश्लेषण मृत कोशिकाओं और अवशिष्ट लाल रक्त कोशिकाओं (चित्रा 2a) के अधिकांश से हटा दें । बाद में सभी विश्लेषण इस गेटिंग स्ट्रैटेजी पर आधारित थे । प्रतिनिधि gating रणनीति के लिए सीडी 4+ और सीडी 8+ टी कोशिकाओं, γδ t कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, nk कोशिकाओं और दो fluorochrome-सात मार्कर धुंधला (चित्रा 2b-C) में monocytes की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।

प्रतिनिधि नकारात्मक परिणाम अनुचित नमूना तैयार करने और विरोधी की अनुमापन-सीडी 4 और-CD56 एंटीबॉडी से संस्थाओ हैं । सीडी 8+ टी कोशिकाओं (चित्रा 3a) से सीडी 4+ टी कोशिकाओं के गरीब जुदाई में उचित अनुमापन सीडी 5 के परिणाम में नाकाम रहने, जबकि एक गरीब CD56 टाइट्रेट करने के लिए बी कोशिकाओं से nk के एक गरीब जुदाई के लिए नेतृत्व कर सकते है और कोशिकाओं को धुंधला पैनल में सभी मार्करों के लिए नकारात्मक ( चित्रा 3b). गरीब आरबीसी lysis पूरे रक्त धुंधला के साथ हो सकता है । यदि प्रोटोकॉल का प्राथमिक लक्ष्य विभिन्न सेल जनसंख्या (उदाहरण के लिए, सीडी 4+ टी कोशिकाओं का%) के प्रतिशत की गणना करना है, आरबीसी डबल नकारात्मक कोशिकाओं के साथ संदूषण, जो डॉट प्लॉट में दोहरी नकारात्मक आबादी के रूप में दिखाई देगा, से बाहर रखा जाना चाहिए विश्लेषण (चित्रा 3c) । इस प्रोटोकॉल के साथ हमारे अनुभव के आधार पर, हमने देखा है कि बी कोशिकाओं और nk सीडी 8+ कोशिकाओं के बीच सटीक जुदाई अन्य मार्कर का उपयोग करके सत्यापित किया जा सकता है. एक उदाहरण के रूप में, nk कोशिकाओं hla के लिए डबल नकारात्मक-DR और CCR6 हैं, जबकि बी कोशिकाओं को डबल सकारात्मक (चित्र 3 डी) हैं ।

इस पांडुलिपि में प्रस्तुत प्रोटोकॉल कोशिकाओं की सीमित संख्या के साथ नमूनों में कई प्रतिरक्षा आबादी पूछताछ करने के लिए एक बहुरंगा धुंधला पैनल का हिस्सा होने का मतलब है. इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, हम कई मायलोमा के साथ दानदाताओं से अनुदैर्ध्य नमूनों की प्रतिरक्षा आबादी में गतिशीलता की जांच की एक स्टेम सेल प्रत्यारोपण प्राप्त (Clinicaltrials.gov NCT0056609816) । जमे हुए pbmc एकत्र की और प्रत्यारोपण के बाद 0, 14, 28, ६०, १८०, ३६० दिन में फ्लो cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया । इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, हम अपने भोले पर ध्यान केंद्रित कर कई लिम्फोसाइट आबादी से पूछताछ करने में सक्षम थे/स्मृति प्रोफ़ाइल (CD45RA, CCR7), सक्रियण और सेल थकावट स्थिति (hla-डॉ, CD57, CD45RA + effector स्मृति, CD16), और टी effector phenotype (CCR4, CCR6, CXCR3) एक एकल धुंधला पैनल में17,18,19,20,21,22,23,24,25 , 26. यह विशेष रूप से है कि रोगियों और समय अंक में से कुछ के लिए एकत्र कोशिकाओं की संख्या केवल एक ही धुंधला पैनल के लिए बमुश्किल पर्याप्त था पर विचार उपयोगी रहा है । प्रतिनिधि gating रणनीति (चित्रा 4) और चयनित सेल आबादी की गतिशीलता (चित्रा 5) समय के साथ एक पलटा रोगी की. एकाधिक मायलोमा बी कोशिकाओं में nk मार्कर CD56 व्यक्त कर सकते हैं । इस संभावना को बाहर करने के लिए, हम एचएलए-DR और CCR6 nk कोशिकाओं से बी कोशिकाओं को और अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया (चित्रा 4b). सीडी 8+ स्मृति और भोले टी कोशिकाओं CD45RA और CCR7 की अभिव्यक्ति द्वारा पहचाने गए थे: भोली (CD45RA+/ccr7+), केंद्रीय स्मृति (सेमी, CD45RA-/ccr7+), effector स्मृति (EM, CD45RA-/ccr7- ) और effector स्मृति CD45RA+ (emra, CD45RA+/ccr7+) (चित्रा 4c). hla की अभिव्यक्ति-DR और सीडी 8+ भोली में CD57, कुल स्मृति टी कोशिकाओं (जो मुख्यमंत्री, em और emra शामिल), मुख्यमंत्री, em और emra (चित्रा 4d) । सीडी 4+ स्मृति और भोले टी कोशिकाओं CD45RA और CCR7 की अभिव्यक्ति द्वारा पहचाने गए थे: भोली (CD45RA+/ccr7+), केंद्रीय स्मृति (सेमी, CD45RA-/ccr7+), effector स्मृति (EM, CD45RA-/ccr7- ) और effector स्मृति CD45RA+ (emra, CD45RA+/ccr7+) (चित्रा 4e). एचएलए-DR और CD57 अभिव्यक्ति में सीडी 4+ भोली और स्मृति जनसंख्या (जो मुख्यमंत्री, em और emra शामिल), मुख्यमंत्री, em और emra (चित्रा 4f) । CCR4 और CCR6 स्मृति जनसंख्या Th9 सीडी 4+ टी कोशिकाओं (चित्रा 4g) के भीतर की पहचान करने के लिए मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया । Th1, Th1/17, Th2 और Th17 सीडी 4+ टी हेल्पर उपआबादियों को CCR4, CCR6 और CXCR3 (चित्रा 4h) की अभिव्यक्ति द्वारा पहचाना गया । CD16 और nk कोशिकाओं में CD57 अभिव्यक्ति (चित्रा 4i) । स्टेम सेल ट्रांसप्लांटेशन के परिणामस्वरूप एक निरंतर सीडी 4+ और सीडी 8+ टी सेल सक्रियण के रूप में hla की वृद्धि हुई अभिव्यक्ति द्वारा दिखाए गए-DR और CD57, और एक Th1 phenotype करने के लिए टी हेल्पर के तिरछा में. दिन में ६० बी कोशिकाओं का प्रतिशत नाटकीय रूप से रोगी पतन की भविष्यवाणी संवर्धित (चित्रा 5) ।

Figure 1
चित्र 1: प्रतिनिधि एंटीबॉडी टाइट्रेट करना । (क) डॉट प्लॉट ताजा pbmc पर एंटीबॉडी के संकेत एकाग्रता के साथ दाग सीडी 8 अभिव्यक्ति से पता चलता है । (ख) सारणी का प्रतिनिधित्व औसत और मानक विचलन की फ्लोरोसेंट तीव्रता का सीडी 8+, माध्य फ्लोरोसेंट तीव्रता सीडी 8 जनसंख्या, और प्रत्येक एकाग्रता परीक्षण के लिए व्युत्पन्न दाग सूचकांक. (ग) ग्राफ दिखाया कैसे दाग सूचकांक के एक समारोह के रूप में एंटीबॉडी के इष्टतम एकाग्रता derivate । (घ) सीडी 4 एंटीबॉडी के प्रतिनिधि टाइट्रेट करना । पैनल डी boin एट अल. २०१७2से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि gating रणनीति और उपजनसंख्या भेदभाव के परिणाम । (क) द्वा बहिष्करण, लाइव सेल भेदभाव और लिम्फोसाइटों और monocytes के आकार आधारित gating के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. (ख) लिम्फोसाइट उपआबादियों दो fluorochrome दृष्टिकोण के साथ की पहचान की । (ग) दो फ्लोरोक्रोम दृष्टिकोण के साथ पहचान की monocytes । यह आंकड़ा boin एट अल. २०१७2से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिनिधि अनुचित नमूना जुदाई और गलत एंटीबॉडी अनुमापन से प्राप्त परिणाम. (एक) सीडी 4+ और सीडी 8+ आबादी के बीच गरीब संकल्प में 4/ (ख) गरीब CD56 टाइट्रेट बी कोशिकाओं से nk के एक बुरा जुदाई के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । (ग) उपआबादियों के भेदभाव पर आरबीसी अपूर्ण lysis का प्रभाव । (घ) अन्य मार्करों के उपयोग का उदाहरण बी कोशिकाओं और nk कोशिकाओं के बीच सटीक जुदाई सत्यापित करने के लिए: बी कोशिकाओं hla हैं-DR और CCR6 डबल सकारात्मक, जबकि nk कोशिकाओं डबल नकारात्मक हैं. पैनल डी boin एट अल. २०१७2से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: गेटिंग रणनीति एकाधिक myeloma के साथ एक रोगी से नमूनों का विश्लेषण करने के लिए । (क) लिम्फोसाइटों को उनके एफएससी-ए और एसएससी-क्षेत्र के आधार पर इकट्ठा किया गया था और दो-फ्लोरोक्रोम इम्यून-सेल धुंधला के साथ उनके प्रवाह साइटोमेट्रिक प्रोफाइल को दिखाया गया है । (ख) एनके और बी कोशिकाओं का पृथक्करण CCR6 और hla-डॉ (ग) सीडी 8+ स्मृति और भोली टी कोशिकाओं की पहचान करने के लिए रणनीति Gating । (घ) hla की अभिव्यक्ति-DR और सीडी 8+ भोली और स्मृति टी कोशिकाओं में CD57 । (ई) Gating रणनीति सीडी 4+ स्मृति और भोली टी कोशिकाओं की पहचान करने के लिए । (च) एचएलए-DR और CD57 अभिव्यक्ति में सीडी 4+ भोली और स्मृति टी कोशिकाओं । (छ) Th9 सीडी 4+ टी कोशिकाओं की पहचान (एच) ठेपर सीडी 4 की पहचान+ टी सेल उपआबादियों (I) CD16 और nk कोशिकाओं में CD57 अभिव्यक्ति । यह आंकड़ा boin एट अल. २०१७2से अनुकूलित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: एकाधिक myeloma के साथ रोगी में सेल जनसंख्या की गतिशीलता । (क) पीबीएमसी में प्रमुख लिम्फोसाइट आबादी के गतिशील अलग और स्टेम सेल प्रत्यारोपण (sct) के बाद संकेत दिन में cryopreserved । (ख) समय के साथ सीडी 8 उपजनसंख्या का लक्षण वर्णन. (ग) समय के साथ सीडी 4 subpopulations का लक्षण वर्णन । (घ) एनके उपसेटों का विश्लेषण. डेटा को ग्रापड प्रिज्म के साथ प्लॉट किया गया है । यह आंकड़ा boin एट अल. २०१७2से अनुकूलित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

लक्ष्य क्लोन फ्लुओरोक्रोम विक्रेता एकाग्रता उद्देश्य
CD3 UCHT1 BV421 Bd 1/20 वंश
CD56 ncam 16.2 BV421 Bd 1/900
tcrγδ B1 BV421 जैव 1/30
सीडी 4 rpa-T4 पीई Bd 1/450
सीडी 8 rpa-T8 पीई Bd 1/20
CD14 M5E2 पीई Bd 1/15
CD19 HIB19 पीई Bd 1/300
मृत कोशिकाओं एल/डी ब्लू लेफ्टिनेंट 1/300 Live/मृत भेदभाव
bd = बीडी बायोसाइंसेज, बायो = बायोलीजेंड, LT = लाइफ टेक्नोलॉजीज

तालिका 1: एंटीबॉडी पैनल दो फ्लोरोक्रोम प्रतिरक्षा-pbmc (BV421-पीई संयोजन) के सेल धुंधला के लिए इस्तेमाल किया ।

लक्ष्य क्लोन फ्लुओरोक्रोम विक्रेता एकाग्रता उद्देश्य
CD3 UCHT1 Apc Bd 1/20 वंश
CD56 ncam 16.2 Apc Bd 1/60
tcrγδ B1 Apc जैव 1/30
सीडी 4 rpa-T4 पीई Bd 1/450
सीडी 8 rpa-T8 पीई Bd 1/20
CD14 M5E2 पीई Bd 1/15
CD19 HIB19 पीई Bd 1/300
मृत कोशिकाओं एल/डी ब्लू लेफ्टिनेंट 1/300 Live/मृत भेदभाव
bd = बीडी बायोसाइंसेज, बायो = बायोलीजेंड, LT = लाइफ टेक्नोलॉजीज

तालिका 2: एंटीबॉडी पैनल दो-फ्लोरोक्रोम प्रतिरक्षा-pbmc के सेल धुंधला (एपीसी-पीई संयोजन) के लिए इस्तेमाल किया जाता है ।

लक्ष्य क्लोन फ्लुओरोक्रोम कैटलॉग विक्रेता एकाग्रता उद्देश्य
CD3 UCHT1 BV421 ५६२४२६ Bd 1/20 वंश
CD56 ncam 16.2 BV421 ५६२७५१ Bd 1/900
tcrγδ B1 BV421 ३३१२१७ जैव 1/30
सीडी 4 rpa-T4 पीई ५५५३४७ Bd 1/450
सीडी 8 rpa-T8 पीई ५५५३६७ Bd 1/20
CD14 M5E2 पीई ५५५३९८ Bd 1/15
CD19 HIB19 पीई ५५५४१३ Bd 1/300
CCR7 G043H7 AF647 ३५३२१७ जैव 1/30 भेदभाव
CD45RA HI100 apc-H7 ५६०६७४ Bd 1/60
CCR4 1g1 पे-Cy7 ५६१०३४ Bd 1/60 Th सबसेट
CCR6 G034-E3 BV605 ३५३४१९ जैव 1/30
CXCR3 1c6/CXCR3 AF488 ५६१७३० Bd 1/30
CD57 nk-1 पे-CF594 ५६२४८८ Bd 1/900 सक्रियण/थकावट
हला-डॉ G46-6 BV510 ५६३०८३ Bd 1/30
CD16 3g8 BUV395 ५६३७८४ Bd 1/30 nk, monocyte सक्रियण
मृत कोशिकाओं एल/डी ब्लू एल-२३१०५ लेफ्टिनेंट 1/300 Live/मृत भेदभाव
bd = बीडी बायोसाइंसेज, बायो = बायोलीजेंड, LT = लाइफ टेक्नोलॉजीज

तालिका 3: एंटीबॉडी पैनल एकाधिक myeloma के साथ एक रोगी से जमे हुए pbmc दाग करने के लिए इस्तेमाल किया ।

लक्ष्य क्लोन फ्लुओरोक्रोम विक्रेता एकाग्रता उद्देश्य
CD3 UCHT1 BV421 Bd 1/80 वंश
CD56 ncam 16.2 BV421 Bd 1/400
tcrγδ B1 BV421 जैव 1/200
सीडी 4 rpa-T4 पीई Bd 1/1200
सीडी 8 rpa-T8 पीई Bd 1/100
CD14 M5E2 पीई Bd 1/80
CD19 HIB19 पीई Bd 1/300
मृत कोशिकाओं एल/डी ब्लू लेफ्टिनेंट 1/300 Live/मृत भेदभाव
bd = बीडी बायोसाइंसेज, बायो = बायोलीजेंड, LT = लाइफ टेक्नोलॉजीज

तालिका 4: एंटीबॉडी पैनल के लिए इस्तेमाल किया दो-fluorochrome प्रतिरक्षा-पूरे रक्त (BV421-पीई संयोजन) की कोशिका धुंधला ।

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Discussion

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल काफी लचीला और धुंधला बफर, तापमान और परिधीय रक्त कोशिका सेल सतह पर वंश मार्करों की उच्च अभिव्यक्ति की वजह से तैयारी में परिवर्तन के लिए असंवेदनशील होना दिखाया गया है । उच्च गुणवत्ता, पुनरुत्पादित डेटा प्राप्त करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम एंटीबॉडी अनुमापन है । ध्यान दें की, के बाद से एंटीबॉडी के टाइट्रेट हमेशा एक प्रवाह cytometric पैनल के सेटअप के दौरान प्रदर्शन किया जाना चाहिए, यह कदम अतिरिक्त बेंच-समय हमारे दो-fluorochrome दृष्टिकोण करने के लिए जोड़ नहीं है । विरोधी के अनुमापन-CD3,-सीडी 8,-CD14,-CD19 और-tcr γδ मानक प्रक्रिया है जिसके द्वारा बेहतर अलग सकारात्मक और नकारात्मक चोटियों के लिए एंटीबॉडी की एकाग्रता अधिकतम धुंधला सूचकांक13,14द्वारा प्राप्त की है इस प्रकार है । चोटी पर या दाग सूचकांक वक्र के बढ़ते पक्ष पर चोटी के करीब dilutions चयनित किया जाना चाहिए (चित्र 1a-सी) । दूसरी ओर, विरोधी सीडी 4 और विरोधी CD56 एंटीबॉडी के एक तदर्थ टाइट्रेट करने के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए । विरोधी-सीडी 4 एंटीबॉडी के लिए सीसीडी एक सकारात्मक आबादी और cd3+/cd8+ टी कोशिकाओं, बेहतर भेदभाव करने के लिए cd3 एकल सकारात्मक संकेत करने के लिए करीब है सीडी 8मंद आबादी के बीच 5/ सीडी 8+ γδ टी कोशिकाओं और nk टी कोशिकाओं) । एक ही पंक्ति के साथ, CD56 अनुमापन के लिए सीडी3+ और cd3 जनसंख्या के बीच nk CD56+ कोशिकाओं की स्थिति करना है. CD56 के स्वाभाविक रूप से कम अभिव्यक्ति एक संतृप्ति वक्र में प्राप्त मूल्य के करीब का उपयोग करने के लिए एकाग्रता के साथ इस एंटीबॉडी का टाइट्रेट करना आसान बनाता है । एक ही डिटेक्टर पर कई मार्कर/आबादियों का इष्टतम पृथक्करण के लिए उच्च क्वांटम उपज फ्लोरोक्रोन्स का उपयोग करना एक और महत्वपूर्ण कारक है । हम apc, BV421 और पीई के साथ सफल परिणाम प्राप्त किया है, लेकिन इस तरह के बहुलक डाई की नई पीढ़ी के रूप में अन्य fluorochromes, तुलनीय परिणाम देना चाहिए. मुआवजे के कारण कलाकृतियों की संभावना को कम करने के लिए, यह भी महत्वपूर्ण है के साथ फ्लोरोक्रोम की एक जोड़ी का चयन थोड़ा, यदि कोई हो, स्पेक्ट्रल ओवरलैप, जैसे पीई और एपीसी, या पीई और BV421. वस्तुतः कोई मुआवजा के साथ fluorochromes के जोड़े का चयन अंय fluorochrome डिटेक्टर में एक fluorochrome के उच्च spillover के कारण डेटा के प्रसार को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है । प्रसार कमी संकेत विरूपण को कम करने से प्रतिरक्षा subपॉपुलेशन gating की सुविधा और दो fluorochromes करने के लिए सीमित है, तो मुआवजा नियंत्रण की जरूरत के बिना, इस पद्धति का उपयोग करने की अनुमति देता है.

मार्कर है कि हम प्रस्ताव के संयोजन उच्च अन्वेषक आवश्यकताओं के आधार पर अनुकूलन है. वास्तव में, मार्कर के कुछ विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता है अगर वे ब्याज की आबादी का उल्लेख नहीं है । उदाहरण के लिए, यह एंटी-CD19 एंटीबॉडी बी कोशिकाओं को बाहर निकालने के लिए संभव है, या केवल सीडी 8+ T कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करने के लिए विरोधी सीडी 4 एंटीबॉडी. नोट की, एंटी-सीडी 8 एंटीबॉडी सीडी 8+ nk कोशिकाओं और γδ T कोशिकाओं की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है, और इसलिए पैनल से नहीं हटाया जाना चाहिए. दुर्लभ कोशिका आबादी के पृथक्करण में सुधार करने के लिए, अन्य fluorochromes/डिटेक्टरों दो-fluorochrome धुंधला के मार्कर में से कुछ के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक उदाहरण के रूप में, CD56 nkt कोशिकाओं का पता लगाने के लिए एक अलग डिटेक्टर के लिए ले जाया जा सकता है, जो दो-fluorochrome पैनल के साथ संभव नहीं है. हालांकि यह पैनल से मार्कर की संख्या को कम करने के लिए संभव है, सावधानी जोड़ने में exerted किया जाना चाहिए, बदलने या मार्कर स्विचन.

प्रदान की आवश्यक उपकरण, एंटीबॉडी और कौशल सेट, मानक एक-fluorochrome-एक मार्कर दृष्टिकोण अभी भी सबसे सही तरीका है कई प्रतिरक्षा आबादी और भेदभाव दुर्लभ subपॉपुलेशन, जैसे nkt या γδ T कोशिकाओं की पहचान है । हालांकि, इस विधि का प्राथमिक लक्ष्य क्लासिक दृष्टिकोण के लिए स्थानापन्न करने के लिए नहीं है, लेकिन एक गहरी immunophenotyping प्राप्त करने के लिए जब डिटेक्टरों की एक कम संख्या के साथ उपकरणों के साथ काम कर रहा है, या कोशिकाओं की सीमित संख्या के साथ नमूने, जबकि जटिलता को कम करने और प्रायोगिक प्रणाली स्थापित करने में लागत । हम कई myeloma के साथ रोगियों से नैदानिक नमूनों की व्यापक स्क्रीनिंग किया है, प्रणालीगत स्केलेरोसिस, dermatomyositis और lyme रोग दिखा रहा है कि इस धुंधला प्रक्रिया सीमित के साथ कई आबादी के एक साथ पूछताछ में सुधार कर सकते है कक्षों की संख्या । हमारे अब तक के परिणामों से पता चला है कि यह प्रक्रिया पुरानी प्रतिरक्षा सक्रियण या संक्रामक रोग के प्रति असंवेदनशील है, लेकिन विभिन्न रोग राज्यों में इस प्रोटोकॉल की सटीकता का आकलन करने के लिए प्रारंभिक परीक्षण किया जाना चाहिए ।

भविष्य की दिशा में आगे इस प्रोटोकॉल की क्षमता को मजबूत करने के लिए नैदानिक नमूनों से प्राथमिक ऊतकों में लिम्फोसाइटों में घुसपैठ की विशेषता के लिए अध्ययन शामिल हैं । यह ट्यूमर और स्व-प्रतिरक्षित रोग इम्यूनोलॉजी जहां इस दृष्टिकोण सीमित सामग्री के साथ नमूनों के विश्लेषण के लिए अमूल्य जानकारी प्रदान कर सकता है के लिए प्रासंगिक है । हम permeabilized कोशिकाओं पर इस पैनल का परीक्षण करने की क्षमता का विस्तार करने के लिए साइटोकाइन अभिव्यक्ति का पता लगाने और एक ही नैदानिक नमूनों पर अणुओं संकेतन की योजना बना रहे हैं । अंत में, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इसी तरह के दृष्टिकोण, अभिलेखीय मार्कर की संख्या का विस्तार करने के उद्देश्य से, भी मार्कर के विभिन्न सेट का उपयोग कर विकसित किया जा सकता है और भी fordifferent पशु मॉडल विकसित किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन में गठिया और मस्कुलोस्केलेटल और त्वचा रोगों के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था, < https://www.niams.nih.gov/>, पुरस्कार संख्या P30-AR053503; stabler फाउंडेशन, www.stablerfoundation.org; राष्ट्रीय एलर्जी और संक्रामक रोग संस्थान, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; नीना आयरलैंड फेफड़ों के स्वास्थ्य के लिए कार्यक्रम (niplh), https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CD3 BD Biosciences 562426 Antibody for staining
RRID: AB_11152082
CD56 BD Biosciences 562751 Antibody for staining
RRID: AB_2732054
TCRgd BD Biosciences 331217 Antibody for staining
RRID: AB_2562316
CD4 BD Biosciences 555347 Antibody for staining
RRID: AB_395752
CD8 BD Biosciences 555367 Antibody for staining
RRID: AB_395770
CD14 BD Biosciences 555398 Antibody for staining
RRID: AB_395799
CD19 BD Biosciences 555413 Antibody for staining
RRID: AB_395813
CD3 BD Biosciences 555335 Antibody for staining
RRID: AB_398591
CD56 BD Biosciences 555518 Antibody for staining
RRID: AB_398601
TCRgd BD Biosciences 331211 Antibody for staining
RRID: AB_1089215
CCR7 Biolegend 353217 Antibody for staining
RRID: AB_10913812
CD45RA BD Biosciences 560674 Antibody for staining
RRID: AB_1727497
CCR4 BD Biosciences 561034 Antibody for staining
RRID: AB_10563066
CCR6 BD Biosciences 353419 Antibody for staining
RRID: AB_11124539
CXCR3 BD Biosciences 561730 Antibody for staining
RRID: AB_10894207
CD57 BD Biosciences 562488 Antibody for staining
RRID: AB_2737625
HLA-DR BD Biosciences 563083 Antibody for staining
RRID: AB_2737994
CD16 BD Biosciences 563784 Antibody for staining
RRID: AB_2744293
Dead cells Life technologies L-23105 Live/dead discrimination
Falcon 5 mL round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap BD Bioscience 352235 to filter cell suspension before passing though the flow cytometer
Falcon 5 mL round-bottom polystyrene test tube BD Bioscience 352001 to stain whole blood
Recovery Cell Culture Freezing Medium Thermo fisher 12648010 Freezing cells
96-well V-bottom plate Thermo fisher 249570 plate for staining
FACSAria IIu Cell Sorter BD Biosciences Flow cytometer
FCS Express 6 De Novo Software FACS analysis
Graphpad Prism GraphPad software Data analysis

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References

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Torchia, M. L. G., Cimbro, R.… More

Torchia, M. L. G., Cimbro, R. Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (145), e58955, doi:10.3791/58955 (2019).

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