Summary
Burada, CD4 tanımlamak için bir akış sitometrik protokol mevcut+ ve CD8+ T hücreleri, γδ T hücreleri, B hücreler, NK hücreleri ve monosit yedi yerine sadece iki fluorochromes kullanarak insan periferik kan içinde. Bu yaklaşım ile beş ek işaretleri çoğu akışı cytometers üzerinde kaydedilir.
Abstract
Bağışıklık hücre karakterizasyonu ağır çok renkli Akış Sitometresi yüzey işaretlerinin fark ifadeye dayalı altgrupları tanımlamak için kullanır. Klasik bir çok renkli panel kurulumu high-end aletleri, özel etiketli antikorlar ve spektral örtüşme en aza indirmek için dikkatli bir çalışma tasarım gerektirir. Büyük insan bağışıklık nüfusu tanımlamak için multiparametric bir analiz geliştirdiğimiz (CD4+ ve CD8+ T hücreleri, γδ T hücreleri, B hücreler, NK hücreleri ve monosit) sadece iki fluorochromes kullanarak yedi sülale işaretleri birleştirerek periferik kan içinde. Bizim strateji lineage işaretleri sürekli her hücre nüfus tarafından benzersiz bir bileşimini ifade edilir gözlem temel alır. Bu antikorlar dikkatli bir titrasyon ile birleştirme müfettişler çoğu akışı cytometers optik sınırını genişletme beş ek işaretleri kaydetmek izin verir. Hala ikinci olmasına rağmen kafa kafaya karşılaştırma bağışıklık hücre popülasyonlarının periferik kan içinde büyük çoğunluğu bizim yöntem ve klasik "bir fluorochrome bir işareti yaklaşım", arasında karşılaştırılabilir doğruluk ile karakterize edilebilir gösterdi nüfus NKT hücreleri ve γδ T hücreleri gibi tanımlamak için daha kesin. Karmaşık bağışıklık hücre popülasyonlarının ve klinik örnekler uygun fiyatlı 6-10 fluorochrome akışı cytometers ve hatta 2-3 fluorochrome alan aletleri alanlarda sınırlı kaynakları ile çözümlenmesi için yedi işaretleri iki fluorochromes kullanarak birleştirme sağlar. High-End aletleri de derin Akış Sitometresi Analizi gerçekleştirmek için ilave fluorochromes kullanarak bu yaklaşımdan yararlanabilirsiniz. Bu yaklaşım aynı zamanda çok iyi birkaç hücre popülasyonlarının hücreler sınırlı sayıda klinik örnekler durumunda eleme için uygundur.
Introduction
Akış Sitometresi birden çok parametre birkaç bin olaylar başına ikinci1oranında tek parçacıklar analiz etmek için geliştirilmiş bir tekniktir. Akış Sitometresi tarafından analiz örnekleri örnekleri içerir, ancak hücreleri, boncuk, bakteri, veziküller ve kromozomlar için sınırlı değildir. Sıvı sistemi sorgulama nerede her parçacık yolunda bir veya daha fazla lazerler ile kesişiyor ve birden çok parametre daha fazla çözümleme için kaydedilir noktada parçacıklar yönlendirir. Ön ve yan scatter, saf lazer ışık saçılma tarafından oluşturulan hedef popülasyon tanımlamak ve sırasıyla göreli boyutu ve iç karmaşıklık/parçalı yapı parçacıkları, hakkında bilgi almak için kullanılır. En-in veri akış sitometrik analizinde için hesap, tüm diğer parametreler, tanıyıp faiz parçacıkların spesifik hedeflere bağlamak fluorochrome etiketli probları tarafından türetilmiştir.
Akış Sitometresi belirlemek ve hücre popülasyonlarının karakterize immünolojik araştırmalar için temel bir araçtır. Çok renkli panelleri bağışıklık sisteminin karmaşıklığı incelemek için sürekli aynı anda hücre nüfus1derin immunophenotyping için kaydedilen işaretleri sayısını artırmak için gelişmektedir. Bu 20 floresan parametreleri aşan son yüksek kaliteli akışı cytometers ile fluorochromes ve daha yetenekli aygıtlar gelişimine lider. Bu fluorochrome spektral çakışma nedeniyle karmaşık çalışma tasarım ve özel antikor etiketleme ve vasıflı operatörler ile ilgili daha yüksek maliyetler ile sonuçlanır. Birkaç durumlarda, karmaşıklığı ve maliyeti için farklı hücre popülasyonlarının işaretleri ayrı paneller kullanılarak azaltılır. Bu yaklaşım, ancak, hata eğilimli olduğunu, her panel bilgileri azaltır ve sınırlı sayıda hücre örnekleri uygulamak zor olabilir. Ayrıca, işaretçileri sayısını artırarak daha az floresan parametreleri ile aletleri üzerinde derin immunophenotyping engellemektedir. Daha önce büyük insan bağışıklık nüfusu tanımlamak için bir boyama protokol geliştirdiğimiz (CD4+ ve CD8+ T hücreleri, γδ T hücreleri, B hücreler, NK hücreleri ve monosit) yedi sülale işaretçileri kullanarak birleştirerek periferik kan mononükleer hücrelere (PBMCs) Sadece iki fluorochromes yedi yerine geleneksel "bir fluorochrome bir işareti" yaklaşım (www.hcdm.org)2,3kullanarak gerekli. Bizim ilk rapor araştırdı ve derin immunophenotyping için iki fluorochromes içinde yedi işaretleri birleştirme fikri doğrulanmış. Bu raporda, pratik yönü üzerinde odaklanan ve sorun giderme adımları başarılı bir boyama elde etmek için yalıtmak ve periferik kan hücreleri, leke için bir adım adım iletişim kuralı mevcut.
Bu iletişim kuralı gözlem lineage işaretleri hücre yüzeyinde bir sabit ifade var ve her hücre nüfus lineage işaretleri özel bir kombinasyonu vardır üzerinde temel alır. PBMCs içinde CD3 ifade subdivides bağışıklık hücreleri iki kategoriye ayrılır: CD3 pozitif T lenfositler ve CD3-negatif hücreleri. CD3 pozitif alt grubu, CD4 içinde+, CD8+ ve γδ T hücreleri CD4 ve CD8 γδ reseptör yalnızca hedef antikorları kullanarak ayrılabilir. Benzer bir şekilde, CD3 negatif alt grubu içinde B hücreler, NK hücreleri ve monosit benzersiz CD19, CD56 ve CD14, karşı antikor sırasıyla kullanarak tanımlanabilir. Standart bir fluorochrome bir işaretleyici yaklaşım, anti-CD3,-CD4,-CD8, - CD14,-CD19, - CD56 ve - TCR γδ antikorlar ile yedi farklı fluorochromes tespit edildi. Anti-CD3, - CD56 ve - TCR γδ antikorlar bir fluorochrome (kolaylık fluorochrome A için etiketli) ve anti-CD4, bizim yaklaşım birleştirir-CD8, - CD14 ve - farklı fluorochrome (fluorochrome B) CD19 antikor. Bu antikor titrasyonu ve diferansiyel antijen ifade birleşimi ile mümkündür. Her iki CD4+ ve CD8+ T hücre fluorochrome A anti-CD3 antikor pozitif olmakla birlikte, fluorochrome CD8 sinyal ifade yerleştirerek, bir geçici titrasyon ile CD4 sinyal CD8 arasında ise en üst düzeye çıkarma B ayrılmış ve CD3 pozitif-CD4/CD8 çift negatif hücreleri. γδ T hücreleri CD4 ve CD8 daha yüksek düzeyde CD3 ifade eder ve bu nedenle CD3 yüksek4tanımlanabilir. Bu sinyal daha da γδ T hücreleri fluorochrome A böylece CD3 düşük T hücreleri ile CD3 yüksek γδ T hücreleri arasındaki mesafeyi artırmak bir anti-TCR γδ antikorlar ile etiketleme tarafından artırdı. B hücreleri CD3 tanımlanan- fluorochrome A ve CD19+ fluorochrome d. içinde CD3 negatif NK hücreleri B hücreleri birbirinden ayırmak için bir anti-CD56 antikor fluorochrome A anti-CD3 kullanıldı. CD56 NK hücre CD3 T hücreleri5daha fazla alt düzeyde ifade edilen bu olanak sağlanır. Son olarak, monosit ileri tarafı dağılım özellikleri ve CD14 ifade fluorochrome B. içinde bir arada üzerinden tespit edilebilir
En çok dört işaretleri iki fluorochromes kullanarak birleştirme fikri6,7,8daha önce başarıyla denedi ve klinik protokolünde Malign lenfositik nüfus9 tanımlamak için kullanılan . Önceki bir rapor da yedi işaretleri kombine (veri işaretleyicilerini üzerinden farklı özgüllük ile daha bizim iletişim kuralında kullanılan) iki fluorochromes ama bu yaklaşım kullanarak dayanıyordu bir karmaşık her antikor fluorochrome10değişen miktarda, etiketleme üzerinde. Bu piyasada bulunan antikor kullanan bizim yöntemi aksine ve enstrüman yapılandırma için adapte edilebilir ve polimer fluorochromes yeni nesil yararlanabilirsiniz.
Bu metodoloji genel amacı karmaşık hücre popülasyonlarının sorguya çekmek için beş ek işaretleyiciler kayıt için izin çoğu akışı cytometers optik sınırlarını genişletmektir. Sonuç olarak, uygun fiyatlı 6-10 fluorochrome akışı cytometers üzerinde gelişmiş immünolojik analizi gerçekleştirilebilir ve 2-3 fluorochrome alan aletleri alanlarda sınırlı kaynaklara sahip çarpıcı sonuçlar elde edebilirsiniz. High-End aletleri de derin Akış Sitometresi Analizi gerçekleştirmek için ve modüler akış sitometrik paneller aynı saat11birkaç soy hedefleme için ilave fluorochromes kullanarak bu yaklaşımdan yararlanabilirsiniz. Bu potansiyel olarak modüler immunophenotyping Akış Sitometresi içinde kullanılan panellerin sayısını azaltmak ve maliyeti, hataları ve işlem süresi azaltır. Bu yaklaşım aynı zamanda çok iyi hücreler sınırlı sayıda klinik örnekler söz konusu olduğunda uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İnsan malzemelerin tüm çalışmaları Johns Hopkins kurumsal inceleme kurulu sağlık, sigorta taşınabilirlik ve Accountability Act altında tarafından kabul edildi. Hasta ve kontrol de-tespit edildi. PBMCs ve sağlıklı kontrol kan Onam tarafından elde edilmiştir.
Not: Bu protokol üzerinde taze test veya izole dondurulmuş periferik kan hücreleri ve tam kan.
1. hücre hazırlık
-
Yalıtım tam kan periferik kan hücre (PBMC)
- Kan sodyum heparin içeren bir 10 mL yeşil-tepe tüp çizmek. Hemen sonra tüp kan ile dolu, koagülasyon önlemek için birkaç kez tüp ters.
Not: Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) veya sodyum sitrat gibi diğer antikoagülan içeren tüpler ile karşılaştırılabilir sonuçlar kullanılabilir. Farklı bir miktar kan toplanır, iletişim kuralı aşağıdaki adımlarda buna göre ölçekli olmalıdır. - Özenle çizilmiş kan 50 mL konik tüp içine aktarın. Kalsiyum ve magnezyum fosfat tamponlu tuz (PBS) eşit miktarda kanla sulandırmak.
- Yoğunluk gradient orta (örneğin, Ficoll) 15 mL yeni 50 mL konik tüp altýna ekleyin ve dikkatlice yerleşimi herhangi bir karıştırma kaçınarak degrade Orta yoğunluk, üstüne seyreltilmiş kan yoğunluk gradient orta ve seyreltilmiş kan arasında.
Not: Bu PBMCs uygun bir ayırma kırmızı hücreleri için kritik bir adımdır. - 400 x g (RT), oda sıcaklığında 30 dakika, arabirimin bozulma önlemek için fren yok santrifüj kapasitesi.
- Santrifüjü sonra dikkatle bir pipet kullanarak üst katmanı Aspire edin ve, nerede PBMCs stratifies olduğunu plazma ve yoğunluk gradient orta arasında arayüz hücreleri değil çıkarmak için dikkat. Çok sayıda hücre 50 mL konik tüp ve yeni bir 50 mL konik tüp transfer altındaki kırmızı hücre Pelet dokunmadan arabirimden mümkün olduğunca toplamak.
- PBS son hacim için 25 mL getirmek ve karıştırmak için birkaç kez ters çevir'i ekleyin. 300 x g 10 dk RT az fren için de üzerinde herhangi bir yoğunluk gradient orta kirlenme--dan hücre süspansiyon kaldırmak için santrifüj kapasitesi.
- Dikkatli bir şekilde rahatsız edici hücre Pelet olmadan süpernatant Aspire edin. PBS son hacim için 25 mL getirmek ve karıştırmak için birkaç kez ters çevir'i ekleyin. Vasıl 200 x g üstünde-e doğru çıkarmak trombosit fren RT, 10 dk santrifüj kapasitesi.
- Dikkatle süpernatant hücre Pelet bozmadan Aspire edin. PBMCs PBS/0.1% sodyum azid 1 mL resuspend. Sodyum azid kapatma, dökülme, antikorlar ve artış hücre kurtarma içselleştirilmesi azaltır, ancak onun toksisite hücre canlılığı zarar verebilir. Hücreleri için sonraki deneyler kültürlü Eğer bu nedenle, sodyum azid tüm adımlarını kaçınılmalıdır. Hücre izolasyon ve sodyum azid boyama sodyum azid huzurunda gerçekleştirilen boyama için benzer sonuçlar verdi.
Uyarı: Sodyum azid merkezi sinir sistemini etkileyen tarafından ölüme neden olabilir. İletişim yanıklar deri ve göz için neden. - PBMCs 30 µL 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde aktararak sayımı için hücreleri oranında seyreltin. Sonra PBS 120 µL ve Trypan mavi cep telefonu numarasını ve canlılığı belirlemek için 150 µL ekleyin (1:10 hücre seyreltme). Dikkatli bir şekilde resuspend.
- 10 µL bir hemasitometre hücreleri buna göre için kullanılan sayım odası ve hücrelerin sayısını belirlemek sayısı aktarın. Hücrelerin = mavi negatif hücre x 10 (Bu protokol için kullanılan seyreltme faktörü) toplam Trypan sayısı x 104.
Not: Üstünde ortalama, 7-15 10 x6 PBMCs 10 mL kan toplanan. - 10 x 10 mL PBS/0.1% sodyum azid6 hücre resuspend
Not: PBMC donmuş ve uzun bir süre için sıvı azot içinde depolanır. Ancak, ifade işaretleri Kemokin reseptörleri gibi bu yordam tarafından değiştirilebilir.
- Kan sodyum heparin içeren bir 10 mL yeşil-tepe tüp çizmek. Hemen sonra tüp kan ile dolu, koagülasyon önlemek için birkaç kez tüp ters.
-
Donmuş PBMC hücrelerden hazırlanması
Not: farklı dondurucu yordamlar hücre kurtarma ve canlılığı12etkileyebilir. PBMCs bu deneyler için özel olarak formüle edilmiş dondurucu medya ve fetal sığır serum (FBS)/10% Dimetil sülfoksit (DMSO) benzer sonuçlarla. donduruldu
Uyarı: DMSO inhalasyon (akciğer tahriş edici) durumunda biraz tehlikeli, iletişim (tahriş edici, permeator), göz teması (tahriş edici), sindirim, Cilt.- Donmuş PBMC sıvı azot kaldırmak ve Buza koyun. Cryovial buz doğrudan 37 ° C su banyosu aktarın. Cryovial su yüzeyde tutmak ve küçük buz Pelet kalıncaya kadar şişeleri yavaşça çalkalanır. Cryovial buz aktarın.
- Herhangi bir su bir % 70 etanol püskürtülür bezle kaldırın. Yavaş yavaş PBS/0.1% sodyum azid 1 mL 4 ° C'de ekleyin ve dikkatlice hücreyi 15 mL konik tüp aktarın. Yavaş yavaş soğuk PBS/0.1% sodyum azid 4 ° C de 15 mL son hacmi ulaşmak için ekleyin.
- 10 dakika süreyle santrifüj 300 x g de dikkatli bir şekilde çıkarın süpernatant, resuspend hücreleri PBS/0.1% sodyum azid 1 mL.
Not: Hücreleri de RPMI içinde resuspended % 10 FBS benzer sonuçlar ile. - PBMCs 30 µL 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde aktararak sayım için hücreye sulandırmak. Sonra PBS 120 µL ve Trypan mavi cep telefonu numarasını ve canlılığı belirlemek için 150 µL ekleyin (1:10 hücre seyreltme). Dikkatli bir şekilde resuspend.
- 10 µL bir hemasitometre hücreleri buna göre için kullanılan sayım odası ve hücrelerin sayısını belirlemek sayısı aktarın. Hücrelerin = mavi negatif hücre x 10 (Bu protokol için kullanılan seyreltme faktörü) toplam Trypan sayısı x 104.
- 10 x 10 mL PBS/0.1% sodyum azid6 ' daki hücrelere resuspend.
-
Tam kan hücrelerinden hazırlanması
- Kan sodyum heparin içeren bir 10 mL yeşil-tepe tüp çizmek. Hemen sonra tüp kan ile dolu, koagülasyon önlemek için birkaç kez tüp ters.
Not: EDTA veya sodyum sitrat ile karşılaştırılabilir sonuçlar kullanılabilir gibi diğer antikoagülan içeren tüpler. Farklı bir miktar kan toplanır, iletişim kuralı aşağıdaki adımlarda buna göre ölçekli olmalıdır. - 12 x 75 şapkalı mm tüp için tam kan 200 µL aktarmak, sodyum azid ve hafifçe 2 için girdap 2 µL ekleyin s.
- Kan sodyum heparin içeren bir 10 mL yeşil-tepe tüp çizmek. Hemen sonra tüp kan ile dolu, koagülasyon önlemek için birkaç kez tüp ters.
2. hücre boyama
Not: Fluorochromes ile hemen hemen Hayır spektral örtüşme çiftlerini seçerek veri bir fluorochrome diğer fluorochrome Dedektör içinde yüksek yayılma nedeniyle yayılmasını azaltmak önemlidir. Al en uygun tanımlamasını hücre alt kümeleri elde etmek için fluorochromes bir yüksek kuantum verim ile antikor çiftleri PE-BV421 ve PE-APC gibi kullanılmalıdır.
-
Taze ve donmuş PBMC boyama
- PBMC (1 x 106 hücreleri) 100 µL bir 96-şey V-alt plaka aktarın.
Not: Hücreleri 1 x 106 ' dan daha düşük herhangi bir sayıda benzer sonuçlar2ile kullanılabilir. - Vasıl 350 x g RT, 3 dk santrifüj kapasitesi ve dikkatle süpernatant hücre Pelet bozmadan Aspire edin. PBS ile ücretsiz Amin proteinler ölü hücreleri etiketlemek 10 dakika için üzerinde tepki verir canlı/ölü tamir edilebilir bir boya içeren her şey 100 µL ekleyin.
- Tüm antikorlar içeren bir karışım için her örnek 30 µL hazırlamak (anti-CD3.-CD56, TCRγδ fluorchrome A ve anti-CD4, CD8, CD19, fluorchrome B CD14). Antikorlar konsantrasyon Tablo 1 ve Tablo 2belirtilir. Bu aşamada, titre antikorlar karşı farklı hedef molekülleri ve farklı fluorochromes de eklenebilir (örneğin, Tablo 3).
Not: Antikorlar konsantrasyon üretici ve lot numarası bağlı olarak değişebilir. Bu nedenle, en iyi sinyal elde etmek için Ön testler yapılmalıdır. PBS, PBS/0.5% BSA, PBS/0.2% sodyum azid veya PBS/0.5% BSA/0.1% sodyum azid benzer sonuçlar veren antikorlar2sulandırmak için kullanılmıştır. Hücre de lekeli cilt zaten varolan bu metodoloji kolayca tümleştirmek için 30 µL farklı protokolleri boyama. - Vasıl 350 x g RT, 3 dk santrifüj kapasitesi ve dikkatle süpernatant hücre Pelet bozmadan Aspire edin. Her şey için antikor kokteyl ekleyin ve dikkatle kabarcıkları oluşmadan resuspend. RT, 30 dk içinde belgili tanımlık karanlık için kuluçkaya.
Not: Benzer sonuçlar ile 4 ° C'de örnekleri leke mümkündür. - 350 x g RT, 3 dk de boyama arabellek ve santrifüj 150 µL ekleyin ve dikkatle süpernatant hücre Pelet bozmadan Aspire edin. PBS 200 µL hücrelerde resuspend ve veri akış sitometresi üzerinde elde etmek. Boyama birimleri değiştirdiyseniz, lütfen en az bir 20-fold seyreltme antikor fazlalığı yıkamak için kullanılan özgün antikor Mix emin olun.
Not: Lekeli hücreleri ile PBS/2% paraformaldehyde sabit, gecede bir buzdolabı 4 ° C'de muhafaza ve ertesi gün bir Akış Sitometresi satın aldı.
Uyarı: Paraformaldehyde yuttu ve cilt tahrişine neden olabilir zararlı olduğunu
- PBMC (1 x 106 hücreleri) 100 µL bir 96-şey V-alt plaka aktarın.
-
Tam kan boyama
- Her 12 x 75 şapkalı mm tüp için antikorlar kokteyl ekleyin (anti-CD3.-CD56, TCRγδ fluorochrome A ve anti-CD4, CD8, CD19, fluorochrome CD14 B) ve RT RT, 30 dk içinde belgili tanımlık karanlık için kuluçkaya. Antikorlar konsantrasyon Tablo 4' te belirtilir. Bu aşamada farklı hedef molekülleri karşı antikor titre ve farklı fluorochromes de eklenebilir. Antikor konsantrasyon üretici ve lot numarası bağlı olarak değişebilir. Bu nedenle, en iyi sinyal elde etmek için Ön testler yapılmalıdır.
Not: Örnekleri benzer sonuçlar ile 4 ° C'de leke mümkündür. - Vasıl 350 x g RT, 3 dk santrifüj kapasitesi ve dikkatle süpernatant hücre Pelet bozmadan Aspire edin. 1 x çözüm üretici talimatları kırmızı kan hücre lizis arabelleği olun.
Not: Lizis çözüm RT kullanmadan önce olmalıdır. - 1 kırmızı kan hücre lizis arabellek x 2.0 mL her tüpün ekleyin, de kap ve karıştırmak için birkaç kez tersine çevirin. Folyo ile kapatın ve 15 dakika için oturup bekleyin.
- 5 dk. dikkatle Aspire için süpernatant hücre Pelet rahatsız etmeden de 300 x g spin aşağı.
- PBS ve santrifüj 2 mL 300 x g 5 min için de ekleyin.
Not: Bu noktada, bir soluk beyaz renklendirme başarılı kırmızı kan hücre lizis gösteren hücre Pelet olmalıdır. Dikkatli bir şekilde hücre Pelet rahatsız etmek süpernatant Aspire ve yavaşça PBS 200 µL hücrelerde resuspend. - 12 x 75 mm tüpler hücre toplamları kaldırmak ve veri akış sitometresi üzerinde edinmek için 40 µm filtre kapakları ile hücreleri süzün.
- Her 12 x 75 şapkalı mm tüp için antikorlar kokteyl ekleyin (anti-CD3.-CD56, TCRγδ fluorochrome A ve anti-CD4, CD8, CD19, fluorochrome CD14 B) ve RT RT, 30 dk içinde belgili tanımlık karanlık için kuluçkaya. Antikorlar konsantrasyon Tablo 4' te belirtilir. Bu aşamada farklı hedef molekülleri karşı antikor titre ve farklı fluorochromes de eklenebilir. Antikor konsantrasyon üretici ve lot numarası bağlı olarak değişebilir. Bu nedenle, en iyi sinyal elde etmek için Ön testler yapılmalıdır.
3. antikor titrasyonu
Not: Antikor titrasyonu yüksek kaliteli, tekrarlanabilir veri elde etmek için en kritik bir adımdır. Anti-CD3, titrasyon-CD8,-CD14, - CD19 ve - TCR γδ izler hangi tarafından en iyi şekilde pozitif ve negatif doruklarına ayırmak için antikor konsantrasyonu ile maksimum dizin13,14boyama elde Standart prosedür. Dilutions tepe veya leke dizin eğri yükselen tarafındaki tepe daha yakın olmalıdır (Şekil 1A-C) seçili. CD4 pozitif nüfus CD3 tek olumlu nüfus ve CD3 arasında zirvesine yerleştirmek için anti-CD4 antikor titre +/ CD8 + T hücreleri, daha yakın daha iyi CD8dim nüfusu (CD8 + γδ T hücreleri ve NK T hücreleri) ayırımcılık CD3 tek olumlu sinyal için. Aynı hat boyunca CD56 titrasyon amaçları+ konuma NK CD56 hücrelerin CD3 arasında+ ve CD3- nüfus.
-
En fazla leke dizin eğrisi
Not: anti-CD3, titrasyon-CD8,-CD14, - CD19 ve - TCR γδ izler hangi tarafından en iyi şekilde pozitif ve negatif doruklarına ayırmak için antikor konsantrasyonu ile bir maksimum dizin eğrisi15boyama elde Standart prosedür. Diğer işaretleri karşı antikor Masası'na eklediyseniz, aynı zamanda en fazla bir boyama dizin eğrisi ile titre gerek.- Logosuna 2 kat antikor seyreltme arabellek boyama 40 µL ile 96-şey plaka 10 kuyu doldurarak hazırlayın. İlk iyi 80 µL boyama arabelleği için son hacim artırmak ve antikor ilgi bir konsantrasyon 4 kez konsantrasyon üretici tarafından önerilen ekleyin.
- İyice karıştırın ve ikinci 40 µL iyi transfer. Mix iyi ve tüm diğer kuyuları için bu adımı yineleyin.
- 10 örnekleriyle daha önce açıklanan protokol sonrası antikor 10 farklı logosuna 2 kat dilutions 30 µL PBMC veya tam kan lekesi.
- Veri akış sitometresi ile elde etmek ve her seyreltme (şekil 1A) sinyalini arsa.
- Negatif ve pozitif nüfusu her antikor yoğunlaşması kapıda. Antikorlar konsantrasyonu artırmak için daha yüksek bir arka plan yol açabilir. Bu nedenle, negatif kapı buna göre yeniden boyutlandırın.
- Her antikor konsantrasyon için medyan ve standart sapma için negatif nüfus floresan yoğunluğu ve olumlu nüfus floresan yoğunluğu için ortanca hakkında bilgi ayıklamak. Her antikor konsantrasyon için leke endeksi bu formül ile hesaplanır: (pozitif nüfusun ortanca floresan yoğunluğu — negatif nüfusun ortanca floresan yoğunluğu) ÷ (2 x standart sapması floresan yoğunluğu «negatif nüfus) (şekil 1B).
- Leke dizin vs. antikor seyreltme kesir olarak ifade edilen antikor konsantrasyon Arsa (örneğin, 1:10 seyreltme = 0.1) ve en fazla leke dizin değeri (şekil 1 c) ile antikor konsantrasyonu belirlemek.
-
Anti-CD4 ve - CD56 antikor titrasyonu
Not: ve Anti-CD4 - CD56 antikor titrasyonu dayanır önceki titrasyon iki-fluorochrome Masası'ndaki diğer işaretleri. Titrasyon amaçlamaktadır anti-CD4 yerleştirerek adlı anti-CD4 antikor için çift CD8 arasında sinyal+/CD3+ tek sinyal ve CD3 pozitif nüfus (şekil 1 d).- CD4 ayırmak için izin arasında ince konsantrasyon aralığı tanımlamak için ek konsantrasyonları ekleme anti-CD4 ve daha önce de açıklandığı gibi bir logosuna 2 kat seyreltme strateji ile CD56 antikor titre+ T hücreleri ve NK hücreleri diğer hücreden nüfus.
- Çift Kişilik CD8 arasında anti-CD4 sinyal yerleştirerek anti-CD4 antikor titre+/CD3+ tek sinyal ve CD3 pozitif nüfus (şekil 1 d).
Not: Özel bakım açıkça CD4 ayırmak için yapılması gereken+ T hücreleri CD8+ dim nüfus. - NK hücrelerin CD3-negatif ve CD3 pozitif nüfus arasında yerleştirerek anti-CD4 antikor titrasyonu için benzer bir strateji takip anti-CD56 antikor titre.
4. gating strateji
-
Lenfositik ve Monositik hücre popülasyonlarının belirlemek ve ölü hücreleri ve kalan kırmızı kan hücreleri çoğunu analiz kaldırmak.
- Lenfositler ve monosit ileri vs yan dağılım alana dayalı içeren tüm popülasyonun seçin (FSC-A vs SSC-A). Hücre toplamları ileri dağılım yükseklik vs ileri dağılım genişliği (FSC-H vs FSC-W) üzerinden analiz ve yan dağılım yükseklik vs yan dağılım genişliği (SSC-H vs SSC-W) çıkarın.
- Bir canlı/ölü ayrımcılık marker parlak pozitif ölü hücreleri ve kalan kırmızı kan hücreleri çözümleme dışı bırakmak için kullanın. Kapı lenfositler ve monosit farklı FSC-BIR ve SSC profiline dayalı.
-
İki-fluorochrome 7-marker lenfositik nüfus gating stratejisi.
Not: CD3 pozitif alt grubu, CD4 içinde+, CD8+ ve γδ T hücreleri CD4 ve CD8 γδ reseptör yalnızca hedef antikorları kullanarak ayrılabilir. Benzer bir şekilde, CD3 negatif alt grubu içinde B hücreler, NK hücreleri ve monosit benzersiz CD19, CD56 ve CD14, karşı antikor sırasıyla kullanarak tanımlanabilir.- Lenfosit kapısı seçin ve her eksen bu protokol (şekil 2B) için kullanılan iki fluorochromes biri üzerinde bir nokta komplo ile oluşturun.
- CD8 kapıya+ T hücrelerin CD3 tanımlanan+/CD8+ çift pozitif hücrelerinin üst sağ köşedeki nokta-Arsa (şekil 2B). NKT hücre içerebilen loş CD8 nüfus hariç. CD4 kapıya+ T hücreleri CD8 arasında nüfus olarak tanımlanan+ T hücreleri ve CD3 tek olumlu nüfus. γδ T hücreleri yüksek CD3 hücreleri olarak tanımlanan kapıda. γδ T hücreleri CD8 pozitif ve negatif CD8 alt bölümlere.
- NK hücrelerin CD3 pozitif arasında nüfus olarak tanımlanan ve CD3-negatif hücre kapısı. NK hücreleri CD8 pozitif ve negatif CD8 alt bölümlere. CD3-negatif CD19 tanımlanan B hücreleri kapıya+ sağ alt köşedeki nüfusu nokta arsa.
- Monosit gates seçin ve her eksen bu protokol (şekil 2C) için kullanılan iki fluorochromes biri üzerinde bir nokta komplo ile oluşturun. CD3 kapıya-/CD14+ nüfus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kurulum ve bir Akış Sitometresi deney insan periferik kan hücrelerinin analizini lekeli yedi sülale işaretleri ile (anti-CD3,-CD4,-CD8, - CD14,-CD19, - CD56 ve - TCR γδ antikorları) sadece iki fluorochromes sunulmaktadır.
Anti-CD8 ve CD56 antikor titrasyonu için - temsilcisi sonuçları açıklanmıştır. Her antikor için (Bu örnekte, anti-CD8), on ardışık logosuna 2 kat dilutions verilerden bir leke dizin eğrisi (Şekil 1A-C) hesaplamak için kaydedildi. En iyi antikor konsantrasyon tarafından en fazla leke dizin sinyal13,14tespit edilmiştir. Dilutions tepe veya leke dizin eğri yükselen tarafındaki tepe daha yakın seçilmesi gerekir. Anti-CD4 ve - CD56 antikorlar periferik kan hücreleri ile birlikte diğer işaretleri (daha önce titre) iki fluorochrome Masası'ndaki boyama tarafından titre. Anti-CD4 antikor için anti-CD4 sinyal arasında Çift Kişilik CD8 yerleştirerek titrasyon amacı olmalıdır+/CD3+ tek sinyal ve CD3 pozitif nüfus (şekil 1 d). Özel bakım açıkça CD4 ayırmak için yapılması gereken+ T hücreleri CD8+ dim nüfus. PBMCs belirtilen işaretlerinin en yüksek konsantrasyon ve anti-CD4 farklı konsantrasyonları ile lekeli. Renk kodu konsantrasyonları: yeşil gösterir CD4 en uygun bir ayrılma için neden konsantrasyonları+ T hücreleri diğer CD3+nüfus; turuncu bir kabul edilebilir ama ideal değil ayrılık neden konsantrasyonları gösterir; Kırmızı gösterir CD4 yoksul ayrımına neden konsantrasyonları+ T hücreleri loş CD8 hücreleri veya CD4/CD8 çift negatif nüfus. Anti-CD56 titrasyon NK hücrelerin CD3 arasında yerleştirerek benzer bir şekilde anti-CD4 antikor, yapılan-negatif ve CD3 pozitif nüfus.
Strateji çoğunluğuna temsilcisi, lenfositik ve Monositik hücre popülasyonlarının tanımlamak ve analiz ölü hücreleri ve kalan kırmızı kan hücreleri (şekil 2A) çoğunu kaldırmak gösterilmiştir. Daha sonraki analiz üzerinde perdeleme bu strateji dayanıyordu. Strateji çoğunluğuna temsilcisi CD4 tanımlamak için kullanılan+ ve CD8+ T hücreleri, γδ T hücreleri, B hücreler, NK hücreleri ve monosit iki fluorochrome yedi marker boyama (2B-C rakam) içinde.
Temsilcisi negatif sonuç uygunsuz numune hazırlama ve anti-CD4 ve - CD56 antikor titrasyonu kaynaklanan. Uygun CD4 zavallı ayrılması sonuçlarında CD4 titre açmamak+ T hücreleri CD8+ T hücreleri (şekil 3A), zavallı bir CD56 titrasyon NK bir zavallı ayrılması için B hücreleri açabilir ve hücre negatif boyama Masası (tüm işaretçileri için Şekil 3B). Zavallı RBC lizis tam kan boyama ile oluşabilir. Protokol birincil amacı farklı hücre popülasyon yüzdesini hesaplamak için ise (örneğin, CD4%+ T hücreleri), nokta arsa çift negatif nüfus olarak görünen, RBC çift negatif hücreleri ile kirlenme--dan hariç analiz (şekil 3 c). Bu iletişim kuralı ile bizim deneyime dayalı, biz B hücreleri ile NK CD8 arasındaki doğru o mesafeyi fark ettim+ hücreleri doğrulanmadı diğer işaretleri kullanarak. B hücreleri Çift Kişilik pozitif (şekil 3D) örnek olarak, NK hücreleri çift negatif HLA-DR ve CCR6, için ayrılmıştır.
Bu el yazması sunulan Protokolü örnekleri hücreler sınırlı sayıda birkaç bağışıklık nüfus sorguya çekmek için çok renkli bir boyama paneli parçası olmak içindir. Bu yaklaşımı kullanarak, biz Multipl Miyelom ile bir kök hücre nakli (Clinicaltrials.gov NCT0056609816) bağışçılardan boyuna örneklerinin bağışıklık nüfus dinamikleri araştırdık. Donmuş PBMC toplanmış ve Akış Sitometresi tarafından gün 0, analiz 14, 28, 60, 180, 360 nakli sonra. Bu yaklaşımı kullanarak, biz were güçlü-e doğru onların saf/bellek profili (CD45RA, CCR7), harekete geçirmek ve hücre bitkinlik durumu odaklanarak birkaç lenfosit nüfus sorgulamaya (HLA-DR, CD57, CD45RA + efektör bellek, CD16) ve T efektör fenotip (CCR4, CCR6, CXCR3) tek bir panel17,18,19,20,21,22,23,24,25 boyama , 26. bu bazı hastalar ve zaman puan için toplanan hücre sayısı çok az sadece tek bir boyama panel için yeterli olduğunu düşünüyor özellikle yararlı olmuştur. Strateji (şekil 4) ve seçili hücre popülasyonlarının (şekil 5) Relaps hastanın dinamikleri zamanla çoğunluğuna temsilcisi. Multipl Miyelom B hücreler NK işaret CD56 ifade edebilirim. Bu olasılığı dışlamak için biz HLA-DR ve CCR6 daha fazla B hücreleri NK hücreleri (şekil 4B) ayırt etmek için kullanılabilir. CD8+ bellek ve saf T hücreleri CD45RA ve CCR7 ifadesi tarafından tespit edildi: saf (CD45RA+/CCR7+), Merkezi bellek (CM, CD45RA-/CCR7+), efektör bellek (EM, CD45RA-/CCR7- ) ve efektör bellek CD45RA+ (EPDK, CD45RA+/CCR7+) (şekil 4 c). HLA-DR ve CD8 CD57 ifade+ saf, (oluşturan CM, EM ve EPDK) toplam bellek T hücreleri CM, EM ve EPDK (şekil 4 d). CD4+ bellek ve saf T hücreleri CD45RA ve CCR7 ifadesi tarafından tespit edildi: saf (CD45RA+/CCR7+), Merkezi bellek (CM, CD45RA-/CCR7+), efektör bellek (EM, CD45RA-/CCR7- ) ve efektör bellek CD45RA+ (EPDK, CD45RA+/CCR7+) (şekil 4E). CD4 HLA-DR ve CD57 ifadede+ (CM, EM ve EPDK'nı oluşturur) saf ve bellek nüfusu, CM, EM ve EPDK (şekil 4F). CCR4 ve CCR6 bellek nüfus Th9 CD4 içinde tanımlamak için işaretleri kullanılan+ T hücreleri (şekil 4 g). Th1 ve Th17 CD4 Th2 Th1/17+ T yardımcı altgrupları ifade CCR4, CCR6 ve CXCR3 tarafından tespit edildi (şekil 4 H). NK hücreleri (şekil 4I) CD16 ve CD57 ifade. Kök hücre nakli sonuçlandı sürdürülebilir bir CD4+ ve CD8+ tarafından gösterildiği gibi T hücre aktivasyonu ifade HLA-DR ve CD57 ve Th1 fenotip T yardımcıya eğme arttı. Gün 60 hasta relapse (şekil 5) tahmin B hücreleri yüzdesi önemli ölçüde artar.
Şekil 1: temsilcisi antikor titrasyonu. (A)nokta arsa gösterir CD8 ifade üzerinde taze PBMC antikor belirtilen konsantrasyon ile lekeli. (B) tablo temsil medyan ve CD8 floresan yoğunluğu olan standart sapma+, medyan floresan yoğunluğu CD8- nüfus ve test her konsantrasyon için türetilmiş leke dizin. (C) nasıl gösterileceğini grafik için kiralamamayı antikor en iyi konsantrasyon leke dizin bir fonksiyonu olarak. (D) CD4 antikor temsilcisi titrasyon. Panel D Boin ve ark. 20172den değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: temsilcisi strateji ve sonuçları subpopulation ayrımcılık geçişi. Gelir dışlama, canlı hücreleri ayrımcılık ve boyut tabanlı lenfositler ve monosit geçişi(a)şematik gösterimi. (B) iki fluorochrome yaklaşımı ile tanımlanan lenfosit altgrupları. (C) monosit iki fluorochrome yaklaşımı ile tespit edilmiştir. Şekil Boin ve ark. 20172den değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: temsilcisi sonuçlar elde yanlış örnek ayırma ve yanlış antikor titrasyonu. (A)yanlış titrasyon CD4 antikor sonuçlar CD4 arasında yanlış çözünürlükte+ ve CD8+ nüfus. (B) zavallı CD56 titrasyon B hücreleri NK kötü bir ayrılık için neden olabilir. (C) etkisi eksik RBC lizis altgrupları ayrımcılık. (D) örnek-in kullanım B hücreleri ve NK hücreleri arasında kesin bir ayrım doğrulamak için diğer işaretleri: B hücreleri, HLA-DR ve CCR6 Çift Kişilik pozitif, NK hücreleri çift negatif ise vardır. Panel D Boin ve ark. 20172den değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Multipl Miyelom ile bir hastadan örnekleri analiz etmek için strateji geçişi. (A)lenfositler temelinde kendi FSC-bir kapı ve SSC-alan ve akış sitometrik profillerini iki-fluorochrome bağışıklık-hücre boyama ile gösterilir. (B) ayırma NK ve B hücreleri CD8 tanımlamak için CCR6 ve HLA-Dr (C) strateji geçişi kullanarak+ bellek ve saf T hücreleri. (D) ifade HLA-DR ve CD8 CD57+ saf ve bellek T hücreleri. (E) CD4 tanımlamak için strateji çoğunluğuna+ bellek ve saf T hücreleri. CD4 (F) HLA-DR ve CD57 ifadede+ saf ve bellek T hücreleri. Th9 CD4, (G) kimlik+ T (H) kimlik, Thelper CD4+ T hücre altgrupları (Ben) CD16 ve CD57 ifade NK hücrelerindeki hücreleri. Şekil Boin ve ark. 20172den uyarlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: Multipl Miyelom olan hastada hücre nüfus dinamikleri. (A)dinamik izole ve kök hücre nakli (SCT) sonra belirtilen gün, cryopreserved PBMC büyük lenfosit nüfusun. CD8 altgrupları karakterizasyonu (B) Zaman içinde. CD4 altgrupları karakterizasyonu (C) Zaman içinde. NK alt kümeleri (D) analizi. Veri GraphPad prizma ile çizilen. Şekil Boin ve ark. 20172den uyarlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Hedef | Klon | Fluorochrome | Satıcı | Konsantrasyon | Amaç |
| CD3 | UCHT1 | BV421 | BD | 1/20 | Soy |
| CD56 | NCAM16.2 | BV421 | BD | 1/900 | |
| TCRγδ | B1 | BV421 | Biyo | 1/30 | |
| CD4 | RPA-T4 | PE | BD | 1/450 | |
| CD8 | RPA-T8 | PE | BD | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | PE | BD | 1/15 | |
| CD19 | HIB19 | PE | BD | 1/300 | |
| Ölü hücreleri | L/D mavi | LT | 1/300 | Canlı/ölü ayrımcılık | |
| BD = BD Biosciences, biyo BioLegend, LT = yaşam teknolojileri = | |||||
Tablo 1: İki fluorochrome bağışıklık-hücre PBMC (BV421-PE kombinasyonu) boyama için kullanılan antikor paneli.
| Hedef | Klon | Fluorochrome | Satıcı | Konsantrasyon | Amaç |
| CD3 | UCHT1 | APC | BD | 1/20 | Soy |
| CD56 | NCAM16.2 | APC | BD | 1/60 | |
| TCRγδ | B1 | APC | Biyo | 1/30 | |
| CD4 | RPA-T4 | PE | BD | 1/450 | |
| CD8 | RPA-T8 | PE | BD | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | PE | BD | 1/15 | |
| CD19 | HIB19 | PE | BD | 1/300 | |
| Ölü hücreleri | L/D mavi | LT | 1/300 | Canlı/ölü ayrımcılık | |
| BD = BD Biosciences, biyo BioLegend, LT = yaşam teknolojileri = | |||||
Tablo 2: iki fluorochrome bağışıklık-hücre PBMC (APC-PE kombinasyonu) boyama için kullanılan antikor paneli.
| Hedef | Klon | Fluorochrome | Katalog | Satıcı | Konsantrasyon | Amaç |
| CD3 | UCHT1 | BV421 | 562426 | BD | 1/20 | Soy |
| CD56 | NCAM16.2 | BV421 | 562751 | BD | 1/900 | |
| TCRγδ | B1 | BV421 | 331217 | Biyo | 1/30 | |
| CD4 | RPA-T4 | PE | 555347 | BD | 1/450 | |
| CD8 | RPA-T8 | PE | 555367 | BD | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | PE | 555398 | BD | 1/15 | |
| CD19 | HIB19 | PE | 555413 | BD | 1/300 | |
| CCR7 | G043H7 | AF647 | 353217 | Biyo | 1/30 | Farklılaşma |
| CD45RA | HI100 | APC-H7 | 560674 | BD | 1/60 | |
| CCR4 | 1G 1 | PE-Cy7 | 561034 | BD | 1/60 | İnci alt kümeleri |
| CCR6 | G034-E3 | BV605 | 353419 | Biyo | 1/30 | |
| CXCR3 | 1C 6/CXCR3 | AF488 | 561730 | BD | 1/30 | |
| CD57 | NK-1 | PE-CF594 | 562488 | BD | 1/900 | Harekete geçirmek/yorgunluk |
| HLA-DR | G46-6 | BV510 | 563083 | BD | 1/30 | |
| CD16 | 3 G 8 | BUV395 | 563784 | BD | 1/30 | NK, monosit etkinleştirme |
| Ölü hücreleri | L/D mavi | L-23105 | LT | 1/300 | Canlı/ölü ayrımcılık | |
| BD = BD Biosciences, biyo BioLegend, LT = yaşam teknolojileri = | ||||||
Tablo 3: Multipl Miyelom ile bir hastadan PBMC leke için kullanılan antikor paneli donmuş.
| Hedef | Klon | Fluorochrome | Satıcı | Konsantrasyon | Amaç |
| CD3 | UCHT1 | BV421 | BD | 1/80 | Soy |
| CD56 | NCAM16.2 | BV421 | BD | 1/400 | |
| TCRγδ | B1 | BV421 | Biyo | 1/200 | |
| CD4 | RPA-T4 | PE | BD | 1/1200 | |
| CD8 | RPA-T8 | PE | BD | 1/100 | |
| CD14 | M5E2 | PE | BD | 1/80 | |
| CD19 | HIB19 | PE | BD | 1/300 | |
| Ölü hücreleri | L/D mavi | LT | 1/300 | Canlı/ölü ayrımcılık | |
| BD = BD Biosciences, biyo BioLegend, LT = yaşam teknolojileri = | |||||
Tablo 4: iki fluorochrome bağışıklık hücreli tam kan (BV421-PE kombinasyonu) boyama için kullanılan antikor paneli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan Protokolü oldukça esnek ve duyarsız arabellek, sıcaklık ve periferik kan hücresi hazırlık lineage işaretleri hücre yüzeyindeki yüksek ifadesi nedeniyle boyama değişiklikler göstermiştir. Yüksek kaliteli, tekrarlanabilir veri elde etmek için en kritik antikor titrasyonu adımdır. Antikor titrasyonu her zaman bir akış sitometrik panel kurulumu sırasında gerçekleştirilmesi gereken bu yana belirtmek gerekirse bizim iki fluorochrome yaklaşım için ekstra tezgah-zaman bu adımı eklemez. Anti-CD3, titrasyon-CD8,-CD14, - CD19 ve - TCR γδ izler hangi tarafından en iyi şekilde pozitif ve negatif doruklarına ayırmak için antikor konsantrasyonu ile maksimum dizin13,14boyama elde Standart prosedür. Dilutions tepe veya leke dizin eğri yükselen tarafındaki tepe daha yakın olmalıdır (şekil 1A-C) seçili. Öte yandan, geçici bir titrasyon anti-CD4 ve anti-CD56 antikor yapılması gerekiyor. CD4 pozitif nüfus CD3 tek olumlu nüfus ve CD3 arasında zirvesine yerleştirmek için anti-CD4 antikor titre+/CD8+ T hücreleri, daha yakın daha iyi ayırımcılık CD8dim nüfus (CD3 tek olumlu sinyal için CD8+ γδ T hücreleri ve NK T hücreleri). Aynı hat boyunca CD56 titrasyon amaçları+ konuma NK CD56 hücrelerin CD3 arasında+ ve CD3 nüfus. CD56 doğal olarak alt ifade bu antikor titrasyonu yakın doygunluk eğrideki alınan değeri kullanmak için konsantrasyon ile daha kolay yapar. Yüksek kuantum verimi fluorochromes kullanarak birden çok işaretleri/nüfus aynı Dedektör üzerinde en iyi bir ayrılması için diğer kritik faktör olmasıdır. APC, BV421 ve PE ile başarılı sonuçlar elde, ama polimer boya, yeni nesil gibi diğer fluorochromes benzer sonuçlar verecektir. Eserler nedeniyle tazminat olasılığını azaltmak için aynı zamanda az, fluorochromes bir çifti varsa, seçmek önemlidir spektral örtüşme, PE ve APC, veya PE ve BV421 gibi. Fluorochromes ile hemen hemen hiçbir tazminat çiftlerini seçerek veri bir fluorochrome diğer fluorochrome Dedektör içinde yüksek yayılma nedeniyle yayılmasını azaltmak önemlidir. Azaltma yayılan sinyal bozulması en aza indirerek bağışıklık altgrupları geçişi kolaylaştırır ve tazminat denetimlerinin gerek kalmadan iki fluorochromes sınırlı Eğer bu yöntemi kullanmanızı sağlar.
Biz önerilen işaretleri araştırmacı gereksinimleri temel alarak son derece özelleştirilebilir birleşimidir. Gerçekten de, faiz bir popülasyon için başvuruda bazı işaretleri analizinden dışlanabilir. Örneğin, B hücreleri dışlamak için anti-CD19 antikor veya sadece CD8 üzerinde odaklanmak için anti-CD4 antikor kaldırmak mümkündür+ T hücreleri. Not, anti-CD8 antikor CD8 belirlemek önemlidir+ NK hücreleri ve γδ T hücreleri ve bu nedenle panelden kaldırılmaması gerekir. Nadir hücre popülasyonlarının ayrılması artırmak için diğer fluorochromes/dedektörleri bazı işaretleri iki-fluorochrome boyama için kullanılabilir. Örneğin, CD56 için farklı bir Dedektör NKT hücreleri, hangi iki-fluorochrome panel ile mümkün değil algılamak için taşınabilir. O işaretleri panelinden sayısını azaltmak mümkün olmakla birlikte, ekleme, değiştirme veya işaretçileri değiştirme dikkat sarf.
Gerekli araçları, antikorlar ve beceri seti standart fluorochrome bir işaretleyici yaklaşım hala en doğru şekilde birden çok bağışıklık nüfus tanımlamak ve NKT veya γδ T hücreleri gibi nadir altgrupları ayırımcılık olması koşuluyla. Ancak, birincil bu yöntemin için klasik yaklaşım yerine değil, ama oldukça az sayıda dedektörleri ile aletleri, veya hücreleri, sınırlı sayıda örnekleri karmaşıklığını azaltırken çalışırken derin bir immunophenotyping ulaşmak hedeftir ve deneysel sistemi ortamında maliyet. Multipl Miyelom, sistemik skleroz, Dermatomiyozit ve boyama bu yordamı aynı anda sorgulama limited ile birkaç örneğin alınma olasılığını artırabilir gösterilen Lyme hastalığı olan hastalarda klinik örneklerin geniş tarama yaptık hücre sayısı. Sonuçlarımız defa bu yordamı kronik immün harekete geçirmek ya da bulaşıcı hastalığı için duygusuz ama ön sınamaları bu protokol için farklı hastalık durumlarında doğruluğunu değerlendirmek yürütülen göstermiştir.
Bu iletişim kuralı potansiyelini daha da güçlendirmek için gelecekteki yön infiltre lenfosit birincil klinik örnekler dokulardan karakterize etmek için çalışmalar bulunmaktadır. Bu tümör ve Otoimmün hastalık İmmünoloji için ilgili nerede bu yaklaşım sınırlı malzeme ile örneklerin analizi için çok değerli bilgiler sağlayabilir. Biz bu panel sitokin ifade algılamak için potansiyelini genişletmek için permeabilized hücreleri üzerinde test etmek planlama ve moleküller aynı klinik örnekler üzerinde sinyal. Son olarak, benzer yaklaşımlar numarası kaydedilebilir işaretleyicisinden genişleyen amaçlayan, ayrıca işaretleri farklı kümeleri kullanarak geliştirilebilir ve gelişmiş fordifferent hayvan modelleri de olabilir unutulmamalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu çalışmada artrit Ulusal Enstitüsü ve Musculoskeletal ve deri hastalıkları, tarafından desteklenmiştir < https://www.niams.nih.gov/>, Ödülü numarası P30-AR053503; Stabler Vakfı, www.stablerfoundation.org; Ulusal Enstitüsü alerji ve enfeksiyon hastalıkları, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; Nina İrlanda Program için akciğer Sağlığı (NIPLH) https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD3 | BD Biosciences | 562426 | Antibody for staining RRID: AB_11152082 |
| CD56 | BD Biosciences | 562751 | Antibody for staining RRID: AB_2732054 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331217 | Antibody for staining RRID: AB_2562316 |
| CD4 | BD Biosciences | 555347 | Antibody for staining RRID: AB_395752 |
| CD8 | BD Biosciences | 555367 | Antibody for staining RRID: AB_395770 |
| CD14 | BD Biosciences | 555398 | Antibody for staining RRID: AB_395799 |
| CD19 | BD Biosciences | 555413 | Antibody for staining RRID: AB_395813 |
| CD3 | BD Biosciences | 555335 | Antibody for staining RRID: AB_398591 |
| CD56 | BD Biosciences | 555518 | Antibody for staining RRID: AB_398601 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331211 | Antibody for staining RRID: AB_1089215 |
| CCR7 | Biolegend | 353217 | Antibody for staining RRID: AB_10913812 |
| CD45RA | BD Biosciences | 560674 | Antibody for staining RRID: AB_1727497 |
| CCR4 | BD Biosciences | 561034 | Antibody for staining RRID: AB_10563066 |
| CCR6 | BD Biosciences | 353419 | Antibody for staining RRID: AB_11124539 |
| CXCR3 | BD Biosciences | 561730 | Antibody for staining RRID: AB_10894207 |
| CD57 | BD Biosciences | 562488 | Antibody for staining RRID: AB_2737625 |
| HLA-DR | BD Biosciences | 563083 | Antibody for staining RRID: AB_2737994 |
| CD16 | BD Biosciences | 563784 | Antibody for staining RRID: AB_2744293 |
| Dead cells | Life technologies | L-23105 | Live/dead discrimination |
| Falcon 5 mL round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Falcon 5 mL round-bottom polystyrene test tube | BD Bioscience | 352001 | to stain whole blood |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo fisher | 12648010 | Freezing cells |
| 96-well V-bottom plate | Thermo fisher | 249570 | plate for staining |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| FCS Express 6 | De Novo Software | FACS analysis | |
| Graphpad Prism | GraphPad software | Data analysis |
References
- Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler's guide to cytometry. Trends in Immunology. 33 (7), 323-332 (2012).
- Boin, F., et al. Flow cytometric discrimination of seven lineage markers by using two fluorochromes. PLoS ONE. 12 (11), (2017).
- Zola, H., et al. Leukocyte and Stromal Cell Molecules: The CD Markers. , Wiley. (2007).
- Lambert, C., Genin, C. CD3 bright lymphocyte population reveal γδ T cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 61 (1), 45-53 (2004).
- Ginaldi, L., et al. Differential expression of T cell antigens in normal peripheral blood lymphocytes: a quantitative analysis by flow cytometry. Journal of Clinical Pathology. 49 (7), 539-544 (1996).
- Park, J., Han, K. Single-color Multitarget Flow Cytometry Using Monoclonal Antibodies Labeled with Different Intensities of the Same Fluorochrome. Annals of Laboratory Medicine. 32 (3), 171-176 (2012).
- Mansour, I., et al. Triple labeling with two-color immunoflorescence using one light source: A useful approach for the analysis of cells positive for one label and negative for the other two. Cytometry. 11 (5), 636-641 (1990).
- Bocsi, J., Melzer, S., Dähnert, I., Tárnok, A. OMIP-023: 10-Color, 13 antibody panel for in-depth phenotyping of human peripheral blood leukocytes. Cytometry Part A. 85 (9), 781-784 (2014).
- Van Dongen, J. J. M., et al. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia. 26 (9), 1908-1975 (2012).
- Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. Fluorescence-intensity multiplexing: Simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry. Cytometry Part A. 61 (2), 142-152 (2004).
- Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).
- Hønge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., Møller, B. K., Erikstrup, C. Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry. PLOS ONE. 12 (11), e0187440 (2017).
- Roederer, M. K. FACS analysis of lymphocytes. Handbook of Experimental Immunology. 49, Blackwell Science. (1997).
- Srivastava, P., Sladek, T. L., Goodman, M. N., Jacobberger, J. W. Streptavidin-based quantitative staining of intracellular antigens for flow cytometric analysis. Cytometry. 13 (7), 711-721 (1992).
- Maecker, H. T., et al. Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity. Cytometry Part A. , (2004).
- Noonan, K. A., et al. Adoptive transfer of activated marrow-infiltrating lymphocytes induces measurable antitumor immunity in the bone marrow in multiple myeloma. Science Translational Medicine. 7 (288), (2015).
- Mahnke, Y. D., Beddall, M. H., Roederer, M. OMIP-017: Human CD4+ helper T-cell subsets including follicular helper cells. Cytometry Part A. 83 (5), 439-440 (2013).
- Bonecchi, R., et al. Differential Expression of Chemokine Receptors and Chemotactic Responsiveness of Type 1 T Helper Cells (Th1s) and Th2s. The Journal of Experimental Medicine. 187 (1), 129-134 (1998).
- Acosta-Rodriguez, E. V., et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature Immunology. 8 (6), 639-646 (2007).
- Rivino, L., et al. Chemokine Receptor Expression Identifies Pre-T Helper (Th)1, Pre-Th2, and Nonpolarized Cells among Human CD4+ Central Memory T Cells. The Journal of Experimental Medicine. 200 (6), 725-735 (2004).
- Ye, Z. -J., et al. Differentiation and recruitment of Th9 cells stimulated by pleural mesothelial cells in human Mycobacterium tuberculosis infection. PloS One. 7 (2), e31710 (2012).
- Speiser, D. E., et al. Human CD8+ T cells expressing HLA-DR and CD28 show telomerase activity and are distinct from cytolytic effector T cells. European Journal of Immunology. 31 (2), 459-466 (2001).
- Caruso, A., et al. Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation. Cytometry. 27 (1), 71-76 (1997).
- Brenchley, J. M., et al. Expression of CD57 defines replicative senescence and antigen-induced apoptotic death of CD8+ T cells. Blood. 101 (7), 2711-2720 (2003).
- Palmer, B. E., Blyveis, N., Fontenot, A. P., Wilson, C. C. Functional and Phenotypic Characterization of CD57+CD4+ T Cells and Their Association with HIV-1-Induced T Cell Dysfunction. The Journal of Immunology. 175 (12), 8415-8423 (2005).
- Focosi, D., Bestagno, M., Burrone, O., Petrini, M. CD57+ T lymphocytes and functional immune deficiency. Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 107-116 (2010).
