Summary
ここでは、CD4 を識別するためにフロー フローサイトメトリーによるプロトコルを提案+および CD8+ T 細胞、γδ T 細胞、B 細胞、NK 細胞、7 つではなく 2 つだけ螢を用いたひと末梢血単球。このアプローチでは、5 つの追加のマーカーはほとんど流れの cytometers に記録できます。
Abstract
免疫細胞の特性は、表面マーカーの発現に基づく集団を識別するためにフローサイトメトリー マルチ カラーに大きく依存します。古典的な多色パネルのセットアップには、ハイエンド機器、カスタム標識抗体、およびスペクトル重複を最小限に抑える設計を慎重に検討が必要です。主要な人間の免疫個体を識別するために役立つ multiparametric 分析を開発した (CD4+および CD8+ T 細胞、γδ T 細胞、B 細胞、NK 細胞、単球) のみ 2 つの蛍光色素を使用して 7 つの系列マーカーを組み合わせることによって末梢血。当社の戦略は系統マーカーが各細胞集団で常にユニークな組み合わせで表現されます観察に基づいています。抗体の慎重な滴定で、この情報を組み合わせることにより、ほとんど流れの cytometers の光の限界を拡大して、5 つの追加マーカーを記録する捜査官。後者はまだ比較を示した手法と古典的な「1 つの螢光色素 1 つマーカーのアプローチ」、同等の精度で末梢血の免疫細胞群の大半を特徴づけることができます。NKT 細胞・ γδ T 細胞などの個体を識別するためのより正確です。種類の蛍光色素を用いた 7 つのマーカーを組み合わせる複雑な免疫細胞群と手頃な価格の 6-10 の螢光色素の流れの cytometers とも限られた資源と地域で 2-3 螢光色素フィールド機器臨床サンプルの解析できます。ハイエンド機器のこのアプローチからより深い流れフローサイトメトリー分析を達成するために余分な蛍光色素を使用していただけます。このアプローチはまた細胞の限られた数の臨床サンプルの場合いくつかの細胞集団をスクリーニングに適しています非常によくです。
Introduction
フローサイトメトリーは、1秒あたりのイベント数千の速度で単一の粒子に複数のパラメーターを分析するために開発された手法です。フローサイトメトリーで分析した試料の例などが、セル、ビーズ、細菌、小胞および染色体に限定されません。流体システムは、各パーティクルのパスと交差する 1 つ以上のレーザーさらに分析に複数のパラメーターが記録されます尋問時点で粒子を指示します。純粋なレーザ光の散乱によって生成された前方および側面分散はターゲット人口を識別し、それぞれの相対的なサイズおよび粒子の内部複雑さ/粒度に関する情報を取得に使用されます。すべて他のパラメーター、フローサイトメトリー解析データの大部分を占める、蛍光標識プローブを認識し興味の粒子に特定のターゲットをバインドによって派生します。
フローサイトメトリーは、識別し、特徴付ける細胞集団を免疫学的研究のための主要なツールです。免疫システムの複雑さを分析するには、多色パネルは同時にセル人口1の深い診療の記録のマーカーの数を拡大して常に進化してください。最近のハイエンドの流れの cytometers 20 蛍光パラメーターを超えるとより可能な器械と、蛍光色素の開発につながるためです。これは、結果、螢光色素のスペクトルの重なりによる複雑な研究デザインとカスタム抗体ラベル、熟練したオペレーターに関連付けられているコストが高くつきます。いくつかのインスタンスの異なる細胞集団のマーカーの別のパネルを使用して、複雑さとコストを削減することが。このアプローチは、エラーを起こしやすいは、各パネルの情報を削減し、細胞の限られた数のサンプルに適用することは困難。また、マーカーの数を増やすと、蛍光パラメーターを少なく楽器の深い診療ができなくなります。我々 は以前主要な人間の免疫の人口を識別する汚損のプロトコルを開発した (CD4+および CD8+ T 細胞、γδ T 細胞、B 細胞、NK 細胞、単球) を使用して 7 つの系列マーカーを組み合わせることによって末梢血単核球 (PBMCs) で7 つではなく 2 つだけ螢は、伝統的な「1 つの螢光色素 1 つマーカー」アプローチ (www.hcdm.org)2,3を使用して必要です。私たちの最初の報告は、探検し、深い診療の種類の蛍光色素で 7 マーカーを組み合わせることの概念を検証します。本報告では実用的な面に焦点を当て、汚損の成功を達成するために手順をトラブルシューティングの特定末梢血細胞を染色しステップバイ ステップ プロトコルを提案します。
このプロトコルは、系統マーカーが細胞表面に定数式をあることおよび各細胞集団が系統マーカーの排他的な組み合わせの観察に基づいています。PBMCs、CD3 式は 2 つの主要カテゴリに免疫細胞を細分化: CD3 陽性 T リンパ球と CD3 陰性細胞。CD4 CD3 陽性サブグループ+、CD8+ γδ T 細胞は CD4、CD8、γδ 受容体をもっぱら対象とする抗体を使用して分けることができます。CD3 陰性サブグループ内の同等の方法で B 細胞、NK 細胞、単球識別できます CD19、CD56 と、CD14 抗体をそれぞれ使用しています。標準的な 1 つの螢光色素 1 つマーカー アプローチで抗 CD3-CD4,-CD8、CD14、-7 つの異なる蛍光色素で CD19 の CD56 と TCR の γδ 抗体が検出されました。我々 のアプローチを組み合わせた抗 CD3-CD56、および 1 つの螢光色素 (利便性螢光色素 A のラベル付き) と抗 CD4, TCR γδ 抗体-CD8、CD14 と - 別の螢光色素 (螢光色素 B) CD19 抗体。これは差動抗原の発現と抗体価の組み合わせで可能です。CD4+および CD8+ T 細胞は螢光色素 B アドホックの滴定で、CD8 の間に CD4 信号を配置しながら CD8 信号の表現を最大化することで分離することができますが、螢光色素に抗 CD3 抗体陽性とCD3 陽性 cd4 陽性/陰性 CD8 陰性細胞。Γδ T 細胞は CD4、CD8 より高いレベルの CD3 を表現、したがって CD3 高い4として識別できます。ラベリングの γδ T 細胞の CD3 低 T 細胞, CD3 高 γδ T 細胞間の分離を向上させる、抗 TCR γδ 抗体を用いた螢光色素 A がこの信号を増幅さらに。B 細胞は CD3 として識別することができます-螢光色素 A と CD19+ B. 螢光色素でB 細胞から CD3 陰性 NK 細胞を分離するには、アンチ CD56 抗体は抗 CD3 として螢光色素 A で使用されました。CD56 は5T 細胞の CD3 よりもはるかに低いレベルで NK 細胞で表されるので、これは可能です。最後に、単球は前方側方散乱プロパティおよび螢光色素 B. の CD14 の式の組み合わせで識別できます。
種類の蛍光色素を使用して最大 4 つのマーカを組み合わせるアイデアは6、7、8、前に既に正常に試みられて、そして悪性リンパ球集団9 を識別するために臨床プロトコルで使用されています.以前のレポートはまた 7 つのマーカーを組み合わせる (マーカーから異なる特異性を持つプロトコルを用いてより)10螢光色素の変化量各抗体の複雑な分類に依存して 2 つ螢、このアプローチを使用して。これは市販の抗体を使用して私たちのメソッドとは対照的し楽器構成に合わせることができる、高分子螢の新世代の利点を取ることができます。
この方法論の全体的な目標は、複雑な細胞集団を尋問できるように 5 つの追加のマーカーの記録のほとんどの流れの cytometers の光の限界を拡大することです。結果として、手頃な価格の 6-10 の螢光色素の流れの cytometers で実行できる高度な免疫学的解析と 2-3 螢光色素フィールド機器が限られた資源での分野で顕著な結果を達成できます。ハイエンド機器のこのアプローチからより深い流れフローサイトメトリー分析を達成するために、同じ時間11時いくつかの系統をターゲット フローサイト メーター パネル モジュール フローを作成する余分な蛍光色素を使用していただけます。これは潜在的モジュラー診療フローサイトメトリーで使用されるパネルの数を削減し、コスト、エラーと処理時間を削減できます。このアプローチはまた細胞の限られた数の臨床サンプルの場合適しています非常によくです。
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Protocol
人間の材料研究のすべては、ジョンズ ・ ホプキンス制度審査会健康保険の携行性と責任に関する法律の下で承認されました。患者とコントロール サンプル デ識別されました。PBMCs と健全なコントロールから血がインフォームド コンセントが得られました。
注:このプロトコルがたてにテストされたり分離された冷凍末梢血細胞および全血。
1. セル準備
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末梢血細胞 (PBMC) 全血からの分離
- ヘパリン ナトリウムを含む 10 mL グリーン トップ チューブに血液を描画します。すぐに、チューブは、血液で満たされている後では数回凝固を防ぐために、チューブを反転します。
注:エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、クエン酸ナトリウムなど他の抗凝固剤入りチューブは、同等の結果を使用できます。血液の異なる量を収集すると、プロトコルの次の手順はそれに応じてスケーリングが必要があります。 - 慎重に 50 mL の円錐管に描かれた血を転送します。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) カルシウムとマグネシウムに等しい量で血液を希釈します。
- 新しい 50 mL の円錐管の底に密度勾配媒体 (例えば、Ficoll) の 15 の mL を追加し、混合を回避する密度勾配媒体上に希釈血液を慎重にオーバーレイ密度勾配媒体と希釈血液の間。
注:これは、赤血球から PBMCs の適切な分離のための重要なステップです。 - インターフェイスの混乱を避けるためにもブレーキ付け (RT)、室温で 30 分間 400 × gで遠心分離機します。
- 遠心分離の後慎重にピペットを使用して上位層を吸引、PBMCs が層別化するはプラズマと密度勾配媒体間のインターフェイスでのセルを削除しないように注意を払って捨てます。50 mL の円錐管と新しい 50 mL のコニカル チューブへの転送の下部に赤い細胞ペレットに触れることがなくインターフェイスからできるだけ多くの細胞を収集します。
- 25 mL に最終巻をもたらすとミックスする数回を反転する PBS を追加します。細胞懸濁液から、密度勾配中の汚染を削除するにブレーキを RT で 10 分の 300 × gで遠心分離機します。
- 慎重に不穏な細胞ペレットなし上清を吸引します。25 mL に最終巻をもたらすとミックスする数回を反転する PBS を追加します。削除血小板にブレーキ付け RT で 10 分の 200 × gで遠心分離機します。
- 慎重に細胞ペレットを乱すことがなく、上清を吸引します。PBS/0.1% アジ化ナトリウムの 1 mL の PBMCs を再懸濁します。キャッピング、流して、抗体、および増加細胞回復の内面にアジ化ナトリウムが低下しますが、その毒性がセル実行可能性を損なうことができます。このため、セルはその後の実験の培養する場合すべてのステップでアジ化ナトリウムは避けるべき。細胞分離および染色せず、アジ化ナトリウムは、アジ化ナトリウムの存在下で行われた染色に同様の結果を与えた。
注意:アジ化ナトリウムは、死を引き起こす中枢神経系に影響を与えることができます。接触皮膚や目に火傷があります。 - 1.5 mL 遠心チューブに PBMCs の 30 μ L を転送することによってカウントするため細胞を希釈します。120 μ L の PBS および細胞数と生存率を決定するためトリパン ブルーの 150 μ L を追加 (1:10 の希釈セル)。慎重に再懸濁します。
- 検定、数セルに応じて使用カウントに商工会議所および実行可能なセルの数を決定するのに 10 μ L を転送します。生菌トリパン ブルーの負のセル合計 x 10 (このプロトコルに使用する希釈ファクター) の数 = x 104。
注:平均、10 x 7-15 PBMCs の6は、10 mL の血液から収集すべき。 - 10 × 10 の6 PBS/0.1% のアジ化ナトリウムの mL あたりで細胞を再懸濁します
注:PBMC を凍結し、長期間液体窒素中で保存できます。ただし、ケモカイン受容体などのマーカーの発現は、このプロシージャによって変更できます。
- ヘパリン ナトリウムを含む 10 mL グリーン トップ チューブに血液を描画します。すぐに、チューブは、血液で満たされている後では数回凝固を防ぐために、チューブを反転します。
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冷凍 PBMC から細胞の調製
注:異なる凍結手順は細胞の回復と生存率12に影響を与えます。これらの実験の PBMCs は凍結メディアやウシ胎児血清 (FBS)/10% ジメチルスルホキシド (DMSO) と同様の結果特別に調合でフリーズしました。
注意:DMSO はことをやや有害吸入 (肺を刺激される) の場合、皮膚の接触 (刺激、permeator) の摂取 (刺激)、アイ ・ コンタクトの。- 液体窒素から冷凍 PBMC を削除し、氷の上に配置します。氷からのクリオバイアルを 37 ° C の水浴に直接転送します。水面でのクリオバイアルを保持し、小さな氷ペレットになるまでバイアルを軽く振る。氷の上に戻って、クリオバイアルを転送します。
- 70% エタノール スプレー ワイプですべての水を削除します。ゆっくりと 4 ° C で PBS/0.1% のアジ化ナトリウムの 1 つの mL を追加し、慎重に 15 mL の円錐管にセルを転送します。ゆっくりと最終的な量 15 mL に達する 4 ° C で冷たい PBS/0.1% のアジ化ナトリウムを追加します。
- 300 × gで 10 分間遠心する慎重に取り外します清、再懸濁しますセル PBS/0.1% アジ化ナトリウム 1 mL に。
注:セルは、RPMI でまた再停止することができます 10 %fbs と同様の結果。 - 1.5 mL 遠心チューブに PBMCs の 30 μ L を転送することによってカウントするため細胞を希釈します。120 μ L の PBS および細胞数と生存率を決定するためトリパン ブルーの 150 μ L を追加 (1:10 の希釈セル)。慎重に再懸濁します。
- 検定、数セルに応じて使用カウントに商工会議所および実行可能なセルの数を決定するのに 10 μ L を転送します。生菌トリパン ブルーの負のセル合計 x 10 (このプロトコルに使用する希釈ファクター) の数 = x 104。
- 10 × 10 の6 PBS/0.1% のアジ化ナトリウムの mL あたりで細胞を再懸濁します。
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全血から細胞の調製
- ヘパリン ナトリウムを含む 10 mL グリーン トップ チューブに血液を描画します。すぐに、チューブは、血液で満たされている後では数回凝固を防ぐために、チューブを反転します。
注:EDTA またはクエン酸ナトリウムを匹敵する結果と使用することができます他の抗凝固剤を含むチューブ。血液の異なる量を収集すると、プロトコルの次の手順はそれに応じてスケーリングが必要があります。 - 12 × 75 mm キャップ管に 200 μ L の全血を転送、アジ化ナトリウムと 2 のゆっくり渦を 2 μ l 添加 s。
- ヘパリン ナトリウムを含む 10 mL グリーン トップ チューブに血液を描画します。すぐに、チューブは、血液で満たされている後では数回凝固を防ぐために、チューブを反転します。
2. 細胞染色
注:事実上ないスペクトル重複螢のペアを選択するは、他の螢光検出器における螢光色素の高の波及によるデータの拡大を抑制することが重要です。細胞サブセットをアルの最適同定を達成するには、高い量子収率と螢光抗体ペア PE BV421 および PE APC など使用する必要があります。
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生鮮・冷凍の PBMC の染色
- PBMC (1 x 10 の6セル) を 100 μ l 添加を 96 ウェル V 底プレートに転送します。
注:1 x 106より低いセルの任意の数は、同様の結果2で使用できます。 - RT で 3 分のための 350 × gで遠心し、細胞ペレットを乱すことがなく慎重に上清を吸引します。死んだ細胞をラベルする 10 分のタンパク質の遊離アミンと反応して、ライブ/デッド修正可能な色素を含有した PBS の各も 100 μ L を加えます。
- すべての抗体を含むミックスの各サンプル 30 μ L の準備 (反-CD3。-CD56、蛍光 A と抗 CD4, CD8, CD19, 蛍光 B の CD14 TCRγδ)。抗体の濃度は表 1と表 2に示されます。この段階では、別のターゲット分子に対して、異なる蛍光色素で滴定された抗体は同様に追加することができます (例えば、表 3)。
注:抗体の濃度は、ロット ナンバーと製造元によって異なります。したがって、最適な信号を達成するために予備試験を行ってください。PBS、PBS/0.5% BSA、アジ化ナトリウム PBS/0.2% または PBS/0.5% BSA/0.1% アジ化ナトリウムは、抗体2を希釈するため同様の結果と使用されました。セルは、簡単に既存の方法論を統合する 30 μ L から別のボリュームに汚すことができるプロトコルを汚します。 - RT で 3 分のための 350 × gで遠心し、細胞ペレットを乱すことがなく慎重に上清を吸引します。各ウェルに抗体カクテルを追加し、泡を発生させることがなく慎重に再懸濁します。暗闇の中で室温で 30 分間インキュベートします。
注:同様の結果と 4 ° C でサンプルを染色することが可能です。 - RT で 3 分間 350 x gで染色バッファーおよび遠心分離機の 150 μ L を追加し、細胞ペレットを乱すことがなく慎重に上清を吸引します。200 μ L の PBS で細胞を再懸濁し、流れの cytometer でデータを取得します。染色のボリュームを変更する場合は、抗体の過剰を洗浄する使用オリジナル抗体ミックスの少なくとも 20 の希釈を確認してください。
注:陽性細胞は PBS/2% パラホルムアルデヒドで固定、4 ° C で冷蔵庫に一晩保管し、流れの cytometer で次の日を取得できます。
注意:パラホルムアルデヒドが飲み込まれ、皮膚の炎症を引き起こすことができる場合の有害性
- PBMC (1 x 10 の6セル) を 100 μ l 添加を 96 ウェル V 底プレートに転送します。
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全血の染色
- 各 12 × 75 mm キャップ チューブ追加抗体のカクテル (アンチ-CD3。-CD56、螢光色素 A と抗 CD4, CD8, CD19, 螢光色素の CD14 TCRγδ B) と RT で RT で暗闇の中で 30 分間インキュベートします。抗体の濃度は表 4に示されます。この段階で別のターゲット分子に対して抗体を滴定し、異なる蛍光色素で追加できるだけでなく。抗体濃度は、ロット ナンバーと製造元によって異なります。したがって、最適な信号を達成するために予備試験を行ってください。
注:同様の結果と 4 ° c のサンプルを染色することが可能です。 - RT で 3 分のための 350 × gで遠心し、細胞ペレットを乱すことがなく慎重に上清を吸引します。製造元の指示に従って赤い血セル換散バッファーの 1 x ソリューションを確認します。
注:換散ソリューションは使用する前に RT でする必要があります。 - 各管に赤血球細胞の換散バッファー x 1 の 2.0 mL を追加、よくキャップをミックスする数回を反転します。アルミホイルをかぶせて、15 分間放置します。
- 300 × gで 5 分は、慎重に、細胞ペレットを乱すことがなく、上清を吸引のスピンダウンします。
- 300 × gで 5 分で 2 mL の PBS と遠心分離機を追加します。
注: この時点で、細胞ペレット必要があります成功した赤血球細胞の換散を示す薄い白い色。慎重に細胞ペレットを邪魔しないように上清を吸引し、軽く 200 μ L の PBS で細胞を再懸濁します。 - 細胞凝集塊を取り除き、流れの cytometer でデータを集録 40 μ m のフィルター キャップ 12 × 75 mm チューブを介して細胞を痛めます。
- 各 12 × 75 mm キャップ チューブ追加抗体のカクテル (アンチ-CD3。-CD56、螢光色素 A と抗 CD4, CD8, CD19, 螢光色素の CD14 TCRγδ B) と RT で RT で暗闇の中で 30 分間インキュベートします。抗体の濃度は表 4に示されます。この段階で別のターゲット分子に対して抗体を滴定し、異なる蛍光色素で追加できるだけでなく。抗体濃度は、ロット ナンバーと製造元によって異なります。したがって、最適な信号を達成するために予備試験を行ってください。
3. 抗体の滴定
注:抗体価は、高品質で再現性のあるデータを取得する最も重要なステップです。抗 CD3 の滴定-CD8,-CD14-CD19 と TCR の γδ 最大指数13,14を染色によって派生した最適な正と負のピークを分離する抗体の濃度を標準的な手順に従います。ピークまたは汚れ指数曲線の立ち上がり側のピークに近いで希釈する必要があります (図 1 a C) を選択します。CD3 単一肯定的な人口と CD3 の CD4 の肯定的な人口のピークを配置する滴定は抗 CD4 抗体 + cd 8 + T 細胞、近い良い (cd8 陽性 γδ T 細胞および NK の T 細胞) の CD8dim 集団を差別する CD3 1 つの肯定的な信号。同じラインに沿って CD56 滴定を目指して位置 NK CD56+細胞 CD3 間+と CD3-の人口。
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最大汚れ指数曲線
注:抗 CD3 の滴定-CD8,-CD14-CD19 と TCR の γδ インデックス カーブ15を汚す最大派生は最適な正と負のピークを分離する抗体の濃度を標準的な手順に従います。他のマーカーに対する抗体をパネルに追加する場合彼らはまた最大染色指数曲線で滴定する必要があります。- 染色バッファーの 40 μ L で 96 ウェル プレートの 10 の井戸を埋めることで 2 倍の抗体希釈を準備します。最初よく染色バッファーの 80 μ L に最終的な音量を上げるし、製造元が推奨濃度の 4 倍の濃度で興味の抗体を追加します。
- よく混ぜるし、も 2 番目に 40 μ L を転送します。よく混合し、すべて、他の井戸のこの手順を繰り返します。
- PBMC または全血の抗体の前に説明されたプロトコルを次の 10 の異なる 2 倍希釈率の 30 μ L でのサンプル 10 を染色します。
- 流れの cytometer でデータを取得し、各希釈 (図 1 a) からの信号をプロットします。
- 各抗体濃度の正および負の集団のゲート。抗体の濃度を増加させると、高いバック グラウンドにつながります。したがって、負のゲートをサイズ変更します。
- 各抗体濃度の中央値と負の人口の蛍光強度の標準偏差および肯定的な人口の蛍光強度の中央値に関する情報を抽出します。各抗体濃度のためこの式で汚れ指数を計算する: (肯定的な人口の平均蛍光強度-否定的な人口の平均蛍光強度) ÷ (の蛍光強度の標準偏差を 2 倍、負の人口) (図 1 b)。
- ステイン インデックス vs.抗体希釈の割合として表される抗体濃度をプロット (例えば、1:10 希釈 = 0.1)、最大汚れインデックス値 (図 1) を持つ抗体の濃度を識別して。
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抗 cd4 抗体と CD56 の抗体価
注: 2 螢光パネルで他のマーカー前の滴定に依存して抗 cd4 抗体と CD56 抗体の滴定。滴定は、抗 cd4 抗体を配置することを目指す抗 CD4 抗体二重 CD8 間信号+/CD3+信号および CD3 単一肯定的な人口 (図 1)。- 滴定しなさい抗 cd4 抗体と前述の前に、2 倍希釈戦略と CD56 抗体濃度の範囲を細かく特定する間に CD4 を分離することができる追加の濃度を追加+ T 細胞と NK 細胞他の細胞から集団。
- ダブル CD8 間抗 cd4 抗体信号を配置することによって抗 CD4 抗体を滴定しなさい+/CD3+信号および CD3 単一肯定的な人口 (図 1)。
注:特別な注意は、CD4 を明確に行う必要があります+ T 細胞 CD8+の人口を暗きます。 - CD3 陰性と CD3 陽性個体群の NK 細胞を置くことによって抗 CD4 抗体価と同様の戦略に従う反 CD56 抗体を滴定しなさい。
4. ゲート戦略
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リンパ球・単球の細胞集団を識別し、解析から死んだ細胞や残留の赤い血球のほとんどを削除します。
- リンパ球と単球の前方対側の散布面積に基づくを含む母集団全体を選択 (FSC A 対 SSC A)。前方散乱高さ対前方散布幅 (FSC H 対 FSC W) による解析と散布高さ対側散布幅 (SSC H 対 SSC W) から細胞凝集塊を削除します。
- 明るく肯定的な死んだ細胞および残留赤血球分析から除外するのにには、ライブ/デッド差別マーカーを使用します。リンパ球や単球の異なる SSC、FSC のプロファイルに基づいてゲート。
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リンパ球の人口の 2-螢光色素 7 マーカー ゲーティング戦略。
注: CD4 CD3 陽性サブグループ+、CD8+ γδ T 細胞は CD4、CD8、γδ 受容体をもっぱら対象とする抗体を使用して分けることができます。CD3 陰性サブグループ内の同等の方法で B 細胞、NK 細胞、単球識別できます CD19、CD56 と、CD14 抗体をそれぞれ使用しています。- リンパ球ゲートを選択し、(図 2 b) このプロトコルで使われる 2 つの螢光色素の 1 つ各軸上でドット プロットを作成します。
- CD8 のゲート+ T 細胞の CD3 として識別される+/CD8+ドット プロット (図 2 b) の右上隅で陽性細胞を 2 倍します。NKT 細胞を含む可能性のある薄暗い CD8 人口を除外します。CD4 のゲート+ T 細胞 CD8 の間に人口として識別+ T 細胞および CD3 単一肯定的な人口。高 CD3 細胞として識別される γδ T 細胞のゲート。Γδ T 細胞 CD8 陽性および陰性 CD8 を分割します。
- CD3 陽性の間に人口として識別される NK 細胞の CD3 陰性細胞ゲート。CD8 陽性、CD8 陰性で NK 細胞を分割します。CD3 陰性 CD19 として識別される B 細胞のゲート+ドット プロットの右下の隅に人口。
- 単球は、ゲートを選択し、このプロトコル (図 2) で使われる 2 つの蛍光色素の 1 つ各軸上でドット プロットを作成します。CD3 のゲート-/CD14+の人口。
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Representative Results
7 系統マーカーとステンド グラスのセットアップとひと末梢血細胞の流れの cytometry 実験の解析 (抗 CD3-CD4,-CD8、CD14、-CD19 の CD56 と TCR の γδ 抗体) 2 つだけを使用して螢が表示されます。
抗 CD8 と CD56 抗体価の代表の結果のとおりです。各抗体 (この例では抗 CD8)、汚れ指数曲線 (図 1 a C) を計算する 10 の連続した 2 倍希釈のデータが記録されました。最適な抗体濃度は最大汚れインデックス信号13,14によって決定されました。ピークまたは汚れ指数曲線の立ち上がり側のピークに近い希薄を選択する必要があります。(以前は滴定) 2 螢光パネルで他のマーカーとともに末梢血細胞を染色によって抗 cd4 抗体と CD56 抗体で滴定します。抗 CD4 抗体の滴定の間二重 CD8 抗 cd4 抗体信号を配置することで目指すべき+/CD3+信号および CD3 単一肯定的な人口 (図 1)。特別な注意は、CD4 を明確に行う必要があります+ T 細胞 CD8+の人口を暗きます。PBMCs は示されたマーカーの最適濃度と抗 cd4 抗体濃度の異なる染色された.色の濃度のコード: 緑色 CD4 の最適な分離の結果濃度+ T 細胞その他の CD3 から+集団。橙色は許容できるが、理想的ではない分離; は、濃度赤字は CD4 の分離が不完全、濃度+ T 細胞から薄暗い CD8 細胞または CD4/CD8 二重否定の個体群。アンチ CD56 滴定として行われていた同様の方法で抗 CD4 抗体 CD3 間 NK 細胞を置くことによって-負と CD3 陽性集団。
戦略をゲートの代表は、リンパ球や単球の細胞集団を識別し、解析死んだ細胞残留の赤い血液細胞 (図 2 a) のほとんどからを削除する方法を示します。すべてのそれに続く分析は、このゲートの戦略に基づいていた。戦略をゲート代表は CD4 を識別するために使用+および CD8+ T 細胞、γδ T 細胞、B 細胞、NK 細胞、単球 (図 2 b C) 2 螢光色素 7 マーカー染色します。
代表的な否定的な結果は不適切なサンプル調製と抗 CD4 抗体 CD56 の滴定から派生します。CD4 の分離が不十分で cd4 陽性結果を適切な滴定に失敗した+ T 細胞 CD8+ T 細胞 (図 3 a)、貧しい CD56 の滴定は、B 細胞から NK の分離が不完全につながることができます、染色のパネル (のすべてのマーカーに対して負の細胞図 3 b)。全血を汚すと貧しい赤血球の溶解が起こります。プロトコルの主な目的は、異なる細胞集団の割合を計算する場合 (例えば、CD4 の %+ T 細胞)、二重否定の人口としてドット プロットで表示される、RBC 二重陰性細胞汚染から除外すべき分析 (図 3)。このプロトコルで我々 の経験に基づいて、我々 は B 細胞と NK CD8 とその正確な分離を気づいている+細胞は他のマーカーを使用して確認できます。例として、NK 細胞、HLA-DR の CCR6、二重否定 B 細胞が二重正 (図 3 D)。
本稿で提示されたプロトコルは細胞の限られた数のサンプルのいくつかの免疫集団を尋問する多色染色パネルの一部となるものです。このアプローチを使用して、多発性骨髄腫幹細胞移植 (Clinicaltrials.gov NCT0056609816) の受信にドナーから採取された縦の免疫個体群の動態を調べた。冷凍 PBMC を収集され、日 0、フローサイトメトリーで分析した 14、28、60、180、移植後 360。この方法により、活性化と細胞の枯渇状態の素朴な/メモリ プロファイル (CD45RA、CCR7) に焦点を当てていくつかのリンパ球集団を尋問することができました (HLA、cd57 陽性 CD45RA + エフェクター メモリー、CD16)、および T エフェクター表現型 (CCR4、CCR6、CXCR3) 単一の染色パネル17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. これは患者と時間のポイントのいくつかの収集した細胞数が単一の染色パネルのみのためかろうじて十分考慮して特に有用されています。時間をかけて戦略 (図 4)、再発患者の選択した細胞集団 (図 5) のダイナミクスをゲートの代表。多発性骨髄腫 B 細胞は NK マーカー CD56 を表現できます。この可能性を除外するには、さらに NK 細胞 (図 4 b) から B 細胞を区別する HLA および CCR6 を使いました。CD8+メモリとナイーブ T 細胞は CD45RA と CCR7 の式によって識別された: ナイーブ (CD45RA+/CCR7+)、中央メモリ (CM、CD45RA-/CCR7+)、エフェクター メモリー (EM、CD45RA-/CCR7-) とエフェクター メモリー CD45RA+ (EMRA、CD45RA+/CCR7+) (図 4)。HLA-DR および CD8 の cd57 陽性発現+ (占める CM、EM、EMRA) 合計メモリー T 細胞、素朴な CM、EM、EMRA (図 4)。CD4+メモリとナイーブ T 細胞は CD45RA と CCR7 の式によって識別された: ナイーブ (CD45RA+/CCR7+)、中央メモリ (CM、CD45RA-/CCR7+)、エフェクター メモリー (EM、CD45RA-/CCR7-) とエフェクター メモリー CD45RA+ (EMRA、CD45RA+/CCR7+) (図 4E)。Cd4 HLA-DR と CD57 式+ (占める CM、EM、EMRA) 世間知らずとメモリの人口、CM、EM、EMRA (図 4 階)。CCR4 および CCR6 はメモリ人口 Th9 CD4 内で識別マーカーとして使用された+ T 細胞 (図 4)。Th1、Th1/17、Th2、th17 細胞の CD4+ T ヘルパー集団は CCR4、CCR6 CXCR3 の式によって識別された (図 4 H)。CD16 と CD57 NK 細胞 (図 4I) で表現します。幹細胞移植は、持続的な CD4+および CD8+ T 細胞の活性化によって示すように、増加式 HLA-DR cd57 陽性、及び th1 細胞の表現型の T ヘルパーの傾斜。60 日目 B 細胞の割合は、(図 5) の患者の再発を予測を大幅に増強。
図 1: 代表的な抗体価。(A) ドット プロットを示しています新鮮な PBMC の CD8 式染色抗体の濃度が示されています。(B) 表は、中央と CD8 の蛍光強度の標準偏差を表す+、平均蛍光強度 CD8-の人口、およびテスト各濃度の派生染色インデックス。(C) グラフをどのように表示する派生物汚れ指数関数として最適な抗体濃度。(D) CD4 抗体の代表的な滴定パネル D は Boin ら 2017年2から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 代表戦略と個体識別の結果をゲーティングします。ダブレット排斥、生きているセルの差別、リンパ球と単球のゲート サイズ ベースの模式図 (A)。(B) リンパ球 2 つ螢光色素アプローチで識別されます。(C) 単球は 2 つの螢光色素アプローチに付いています。図は、Boin ら 2017年2から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 不適切なサンプルの分離と間違った抗体価から代表的な結果を取得します。CD4 抗体により、CD4 の解像度が低いの (A) 不適切な滴定+および CD8+集団。(B) 貧しい CD56 滴定は、B 細胞から NK の悪い分離につながることができます。(C) 集団差別 RBC 不完全な換散の効果.(D) B 細胞と NK 細胞との間の正確な分離を確認する他のマーカーの使用例: NK 細胞が二重否定に対し、B 細胞が HLA-DR と CCR6 二重陽性。パネル D は Boin ら 2017年2から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 多発性骨髄腫の患者からサンプルを分析するための戦略をゲーティングします。(A) リンパ球が、FSC A に基づいてゲートし、SSC 地域と 2 蛍光免疫細胞染色で流れフローサイトメトリー プロフィールが表示されます。(B) nk 細胞の分離および B 細胞 CD8 を識別する CCR6 と HLA 博士 (C) 戦略をゲートを使用して+メモリとナイーブ T 細胞。(D) 式の HLA-DR と CD8 の CD57+世間知らずと記憶 T 細胞。(E) CD4 を識別するための戦略をゲート+メモリとナイーブ T 細胞。Cd4 (F) HLA-DR と CD57 式+世間知らずと記憶 T 細胞。Th9 CD4 の (G) 識別+ T 細胞、NK 細胞の Thelper CD4+ T 細胞 (私) subpopulations CD16、CD57 式第識別 (H) です。図は、Boin ら 2017年2から採用されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 多発性骨髄腫患者の細胞集団ダイナミクス。(A) 動的 PBMC 分離および幹細胞移植 (SCT) 後示された日で凍結した主要なリンパ球集団の。CD8 集団の特性を時間をかけて (B)。CD4 集団の特性を時間をかけて (C)。NK サブセットの (D) 分析。データは、グラフパッド プリズムで描かれています。図は、Boin ら 2017年2から採用されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| ターゲット | クローン | 螢光色素 | ベンダー | 濃度 | 目的 |
| CD3 | UCHT1 | BV421 | BD | 1/20 | リネージュ |
| CD56 | NCAM16.2 | BV421 | BD | 1/900 | |
| TCRΓΔ | B1 | BV421 | バイオ | 1/30 | |
| CD4 | RPA T4 | PE | BD | 1/450 | |
| CD8 | RPA T8 | PE | BD | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | PE | BD | 1/15 | |
| CD19 | HIB19 | PE | BD | 1/300 | |
| 死んだ細胞 | L/D ブルー | LT | 1/300 | ライブ/デッド差別 | |
| BD = BD バイオ サイエンス、バイオ BioLegend、LT を = = 生活技術 | |||||
表 1:PBMC (BV421 PE の組み合わせ) の 2 蛍光免疫細胞染色用抗体パネル。
| ターゲット | クローン | 螢光色素 | ベンダー | 濃度 | 目的 |
| CD3 | UCHT1 | APC | BD | 1/20 | リネージュ |
| CD56 | NCAM16.2 | APC | BD | 1/60 | |
| TCRΓΔ | B1 | APC | バイオ | 1/30 | |
| CD4 | RPA T4 | PE | BD | 1/450 | |
| CD8 | RPA T8 | PE | BD | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | PE | BD | 1/15 | |
| CD19 | HIB19 | PE | BD | 1/300 | |
| 死んだ細胞 | L/D ブルー | LT | 1/300 | ライブ/デッド差別 | |
| BD = BD バイオ サイエンス、バイオ BioLegend、LT を = = 生活技術 | |||||
表 2: 抗体パネル PBMC (APC PE の組み合わせ) の 2 蛍光免疫細胞染色に使用します。
| ターゲット | クローン | 螢光色素 | カタログ | ベンダー | 濃度 | 目的 |
| CD3 | UCHT1 | BV421 | 562426 | BD | 1/20 | リネージュ |
| CD56 | NCAM16.2 | BV421 | 562751 | BD | 1/900 | |
| TCRΓΔ | B1 | BV421 | 331217 | バイオ | 1/30 | |
| CD4 | RPA T4 | PE | 555347 | BD | 1/450 | |
| CD8 | RPA T8 | PE | 555367 | BD | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | PE | 555398 | BD | 1/15 | |
| CD19 | HIB19 | PE | 555413 | BD | 1/300 | |
| CCR7 | G043H7 | AF647 | 353217 | バイオ | 1/30 | 分化 |
| CD45RA | HI100 | APC H7 | 560674 | BD | 1/60 | |
| CCR4 | 1 1 | PE Cy7 | 561034 | BD | 1/60 | 番目のサブセット |
| CCR6 | G034 E3 | BV605 | 353419 | バイオ | 1/30 | |
| CXCR3 | 1 C 6/CXCR3 | AF488 | 561730 | BD | 1/30 | |
| CD57 陽性 | NK 1 | PE CF594 | 562488 | BD | 1/900 | 活性化/疲労 |
| HLA | G46 6 | BV510 | 563083 | BD | 1/30 | |
| CD16 | 3 8 | BUV395 | 563784 | BD | 1/30 | NK、単球の活性化 |
| 死んだ細胞 | L/D ブルー | L-23105 | LT | 1/300 | ライブ/デッド差別 | |
| BD = BD バイオ サイエンス、バイオ BioLegend、LT を = = 生活技術 | ||||||
表 3: 抗体パネルを染色するために使用は、多発性骨髄腫患者の PBMC を凍結します。
| ターゲット | クローン | 螢光色素 | ベンダー | 濃度 | 目的 |
| CD3 | UCHT1 | BV421 | BD | 1/80 | リネージュ |
| CD56 | NCAM16.2 | BV421 | BD | 1/400 | |
| TCRΓΔ | B1 | BV421 | バイオ | 1/200 | |
| CD4 | RPA T4 | PE | BD | 1/1200 | |
| CD8 | RPA T8 | PE | BD | 1/100 | |
| CD14 | M5E2 | PE | BD | 1/80 | |
| CD19 | HIB19 | PE | BD | 1/300 | |
| 死んだ細胞 | L/D ブルー | LT | 1/300 | ライブ/デッド差別 | |
| BD = BD バイオ サイエンス、バイオ BioLegend、LT を = = 生活技術 | |||||
表 4: 抗体パネル全血 (BV421 PE の組み合わせ) の 2 蛍光免疫細胞染色に使用します。
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Discussion
ここで提示されたプロトコルは、非常に柔軟で染色バッファー、温度およびセル表面のマーカーを系列の高発現による末梢血細胞作製の変化に鈍感に示されています。高品質で再現性のあるデータを取得するための最も重要なステップは、抗体価は。注記のうち、抗体の滴定はフロー フローサイト メーター パネルのセットアップ中に常に実行する必要がありますのでこの手順に追加されませんベンチ延長戦 2 螢光色素取り組み。抗 CD3 の滴定-CD8,-CD14-CD19 と TCR の γδ 最大指数13,14を染色によって派生した最適な正と負のピークを分離する抗体の濃度を標準的な手順に従います。ピークまたは汚れ指数曲線の立ち上がり側のピークに近いで希釈する必要があります (図 1 a・ C) を選択します。その一方で、抗 cd4 抗体と抗 CD56 抗体のアドホック滴定を実行する必要。抗 CD4 抗体が CD3 単一肯定的な人口と CD3 の CD4 の肯定的な人口のピークを配置する滴定は+/CD8+ T 細胞、近い良い差別 CD8薄暗い集団 (CD3 単一肯定的な信号CD8+ γδ T 細胞と NK T 細胞)。同じラインに沿って CD56 滴定を目指して位置 NK CD56+細胞 CD3 間+と CD3 人口。CD56 の自然下の式は、この抗体の滴定を飽和曲線で得られる値に近い使用する濃度を容易になります。高い量子収率螢光色素を使用する同じ検出器における複数マーカー/個体群の最適な分離のためのもう一つの重要な要因です。APC、BV421 および PE の正常な結果を得たが、新世代のポリマー色素などの他の螢は、同等の結果を与える必要があります。補償によるアーティファクトの可能性を減少するもあれば、ほとんど、螢のペアを選択する重要です PE と APC、または PE BV421 などのスペクトル重複。ほぼ補正なしで螢のペアを選択するは、他の螢光検出器における螢光色素の高の波及によるデータの拡大を抑制することが重要です。削減を拡散信号歪みを最小限に抑えることで免疫のサブポピュレーションをゲーティングを容易し、補正コントロールを必要とせず、2 つの蛍光色素に制限されている場合、この方法を使用することができます。
提案したマーカーの組み合わせは、治験責任医師の要件に基づいて非常にカスタマイズ可能です。確かに、マーカーのいくつかは興味の人口を参照しない場合分析から除外することができます。たとえば、B 細胞を除外する抗 CD19 抗体または抗 CD4 抗体 CD8 にのみ焦点を当てるを削除することが可能です+ T 細胞。注記のうち、抗 CD8 抗体は CD8 を識別するために重要な+ NK 細胞・ γδ T 細胞、したがって、パネルから除去されるべきないです。珍しいセル人口の分離を改善するために 2 つ螢光染色によるマーカーのいくつかの他の螢/探知機を使用できます。例として、2 螢光パネルと不可能である NKT 細胞を検出する異なる検出器には、CD56 が移動できます。パネルからのマーカーの数を削減することが可能ですが、追加、変更、またはマーカーの切り替えの注意を出されなければ必要があります。
必要な計測器、抗体とスキル セット、標準 1 蛍光マーカー アプローチはまだを複数の免疫の人口を識別して nkt 細胞、γδ の T 細胞などの珍しい集団を区別する最も正確な方法です。ただし、このメソッドの主な目的は、古典的なアプローチの代わりにすることが複雑さを削減しながら、検出器の数が少ない楽器または細胞の限られた数のサンプルを扱う場合は、深い診療を達成するためにではなく実験システムのセットアップのコストします。多発性骨髄腫、全身性硬化症、皮膚筋炎、この染色の手順が限られたいくつかの集団の同時尋問を改善できることを示すライム病患者の臨床サンプルのスクリーニングを行っています。セルの数。この手順は慢性の免疫活性化または伝染病に敏感ですが、異なる病気の状態でこのプロトコルの精度を評価するための予備テストう結果が示されているところ。
今後このプロトコルの可能性をさらに強化するにはには、臨床検体からの主な組織内浸潤リンパ球の特徴を研究が含まれます。これは腫瘍や自己免疫疾患免疫学に関連するこのアプローチが限られた材料試験片の分析のための貴重な情報を提供できます。サイトカインの発現を検出する可能性を展開するグリセリンの細胞にこのパネルをテストする計画と同じ臨床サンプルの細胞します。最後に、書き込み可能なマーカーの数の拡大を目的とした、同様のアプローチが異なるマーカーのセットを使用して開発できるし、開発各動物モデルすることができます注意する必要があります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
本研究は国立関節炎研究所と筋骨格系と皮膚病によって支持された < https://www.niams.nih.gov/>、受賞番号 P30-AR053503;ステイブラー財団、www.stablerfoundation.org;国立研究所のアレルギー ・感染症、www.niaid.nih.gov、T32AI007247。ニーナ アイルランド プログラム肺健康 (NIPLH) の https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD3 | BD Biosciences | 562426 | Antibody for staining RRID: AB_11152082 |
| CD56 | BD Biosciences | 562751 | Antibody for staining RRID: AB_2732054 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331217 | Antibody for staining RRID: AB_2562316 |
| CD4 | BD Biosciences | 555347 | Antibody for staining RRID: AB_395752 |
| CD8 | BD Biosciences | 555367 | Antibody for staining RRID: AB_395770 |
| CD14 | BD Biosciences | 555398 | Antibody for staining RRID: AB_395799 |
| CD19 | BD Biosciences | 555413 | Antibody for staining RRID: AB_395813 |
| CD3 | BD Biosciences | 555335 | Antibody for staining RRID: AB_398591 |
| CD56 | BD Biosciences | 555518 | Antibody for staining RRID: AB_398601 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331211 | Antibody for staining RRID: AB_1089215 |
| CCR7 | Biolegend | 353217 | Antibody for staining RRID: AB_10913812 |
| CD45RA | BD Biosciences | 560674 | Antibody for staining RRID: AB_1727497 |
| CCR4 | BD Biosciences | 561034 | Antibody for staining RRID: AB_10563066 |
| CCR6 | BD Biosciences | 353419 | Antibody for staining RRID: AB_11124539 |
| CXCR3 | BD Biosciences | 561730 | Antibody for staining RRID: AB_10894207 |
| CD57 | BD Biosciences | 562488 | Antibody for staining RRID: AB_2737625 |
| HLA-DR | BD Biosciences | 563083 | Antibody for staining RRID: AB_2737994 |
| CD16 | BD Biosciences | 563784 | Antibody for staining RRID: AB_2744293 |
| Dead cells | Life technologies | L-23105 | Live/dead discrimination |
| Falcon 5 mL round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Falcon 5 mL round-bottom polystyrene test tube | BD Bioscience | 352001 | to stain whole blood |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo fisher | 12648010 | Freezing cells |
| 96-well V-bottom plate | Thermo fisher | 249570 | plate for staining |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| FCS Express 6 | De Novo Software | FACS analysis | |
| Graphpad Prism | GraphPad software | Data analysis |
References
- Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler's guide to cytometry. Trends in Immunology. 33 (7), 323-332 (2012).
- Boin, F., et al. Flow cytometric discrimination of seven lineage markers by using two fluorochromes. PLoS ONE. 12 (11), (2017).
- Zola, H., et al. Leukocyte and Stromal Cell Molecules: The CD Markers. , Wiley. (2007).
- Lambert, C., Genin, C. CD3 bright lymphocyte population reveal γδ T cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 61 (1), 45-53 (2004).
- Ginaldi, L., et al. Differential expression of T cell antigens in normal peripheral blood lymphocytes: a quantitative analysis by flow cytometry. Journal of Clinical Pathology. 49 (7), 539-544 (1996).
- Park, J., Han, K. Single-color Multitarget Flow Cytometry Using Monoclonal Antibodies Labeled with Different Intensities of the Same Fluorochrome. Annals of Laboratory Medicine. 32 (3), 171-176 (2012).
- Mansour, I., et al. Triple labeling with two-color immunoflorescence using one light source: A useful approach for the analysis of cells positive for one label and negative for the other two. Cytometry. 11 (5), 636-641 (1990).
- Bocsi, J., Melzer, S., Dähnert, I., Tárnok, A. OMIP-023: 10-Color, 13 antibody panel for in-depth phenotyping of human peripheral blood leukocytes. Cytometry Part A. 85 (9), 781-784 (2014).
- Van Dongen, J. J. M., et al. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia. 26 (9), 1908-1975 (2012).
- Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. Fluorescence-intensity multiplexing: Simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry. Cytometry Part A. 61 (2), 142-152 (2004).
- Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).
- Hønge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., Møller, B. K., Erikstrup, C. Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry. PLOS ONE. 12 (11), e0187440 (2017).
- Roederer, M. K. FACS analysis of lymphocytes. Handbook of Experimental Immunology. 49, Blackwell Science. (1997).
- Srivastava, P., Sladek, T. L., Goodman, M. N., Jacobberger, J. W. Streptavidin-based quantitative staining of intracellular antigens for flow cytometric analysis. Cytometry. 13 (7), 711-721 (1992).
- Maecker, H. T., et al. Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity. Cytometry Part A. , (2004).
- Noonan, K. A., et al. Adoptive transfer of activated marrow-infiltrating lymphocytes induces measurable antitumor immunity in the bone marrow in multiple myeloma. Science Translational Medicine. 7 (288), (2015).
- Mahnke, Y. D., Beddall, M. H., Roederer, M. OMIP-017: Human CD4+ helper T-cell subsets including follicular helper cells. Cytometry Part A. 83 (5), 439-440 (2013).
- Bonecchi, R., et al. Differential Expression of Chemokine Receptors and Chemotactic Responsiveness of Type 1 T Helper Cells (Th1s) and Th2s. The Journal of Experimental Medicine. 187 (1), 129-134 (1998).
- Acosta-Rodriguez, E. V., et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature Immunology. 8 (6), 639-646 (2007).
- Rivino, L., et al. Chemokine Receptor Expression Identifies Pre-T Helper (Th)1, Pre-Th2, and Nonpolarized Cells among Human CD4+ Central Memory T Cells. The Journal of Experimental Medicine. 200 (6), 725-735 (2004).
- Ye, Z. -J., et al. Differentiation and recruitment of Th9 cells stimulated by pleural mesothelial cells in human Mycobacterium tuberculosis infection. PloS One. 7 (2), e31710 (2012).
- Speiser, D. E., et al. Human CD8+ T cells expressing HLA-DR and CD28 show telomerase activity and are distinct from cytolytic effector T cells. European Journal of Immunology. 31 (2), 459-466 (2001).
- Caruso, A., et al. Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation. Cytometry. 27 (1), 71-76 (1997).
- Brenchley, J. M., et al. Expression of CD57 defines replicative senescence and antigen-induced apoptotic death of CD8+ T cells. Blood. 101 (7), 2711-2720 (2003).
- Palmer, B. E., Blyveis, N., Fontenot, A. P., Wilson, C. C. Functional and Phenotypic Characterization of CD57+CD4+ T Cells and Their Association with HIV-1-Induced T Cell Dysfunction. The Journal of Immunology. 175 (12), 8415-8423 (2005).
- Focosi, D., Bestagno, M., Burrone, O., Petrini, M. CD57+ T lymphocytes and functional immune deficiency. Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 107-116 (2010).
