Summary
Hier präsentieren wir eine standardisierte Reihe von Protokollen, die überlegene okuläre Sulcus zu beobachten eine kürzlich identifiziert, evolutionär konservierte Struktur in den Augen der Wirbeltiere. Verwendung von Zebrafischlarven zeigen wir Techniken notwendig, Faktoren zu identifizieren, die auf die Gründung und Schließung der überlegenen okuläre Sulcus beitragen.
Abstract
Angeborene okulären Kolobom ist eine genetische Erkrankung, die in der Regel als eine Spalte in der minderwertigen Aspekt des Auges infolge unvollständiger choroid Fissur Schließung beobachtet wird. Vor kurzem genannt die Identifikation von Personen mit Kolobom in der überlegene Aspekt der Iris, Netzhaut und Linse führte zur Entdeckung einer neuen Struktur, die überlegene Fissur oder überlegene okuläre Sulcus (SOS), die vorübergehend auf die dorsale vorhanden ist Aspekt der Optik-Cup während der vertebrate Augenentwicklung. Obwohl diese Struktur über Mäuse, Küken, Fisch und Newt konserviert ist, beschränkt sich unser heutiges Verständnis des SOS. Um Faktoren aufzuklären, die zu seiner Entstehung und Schließung beitragen, ist es unerlässlich, dass man es beobachten und erkennen Anomalien, wie Verzögerung bei der Schließung der SOS. Hier wollten wir eine standardisierte Reihe Protokolle erstellen, die verwendet werden, um effizient die SOS visualisieren durch die Kombination von allgemein verfügbaren Mikroskopiertechniken mit gemeinsamen molekularbiologische Techniken wie immunofluorescent Färbung und mRNA Überexpression. Während dieser Reihe von Protokollen konzentriert sich auf die Fähigkeit, SOS Verschluss Verzögerung zu beobachten, es ist anpassbar an die Bedürfnisse der Experimentator und kann leicht geändert werden. Alles in allem hoffen wir, eine zugängliche Methode zu erstellen, durch die unser Verständnis von der SOS vorangebracht werden kann, um das aktuelle Wissen der vertebrate Augenentwicklung zu erweitern.
Introduction
Die Bildung des vertebrate Auges ist ein hoch konservierte Prozess in dem sorgfältig orchestrierten interzelluläre Signalwege Gewebetypen zu etablieren und regionale Identität1angeben. Störungen zu frühen Auge Morphogenese häufig2Blenden und tiefgreifende Mängel an die Architektur des Auges führen. Einer solchen Krankheit ergibt sich aus der Nichtbeachtung der Aderhaut okulären Riss in der ventralen Seite des Optik-Cup3schließen. Diese Störung, bekannt als okulären Kolobom wird voraussichtlich auftreten bei 1 von 4-5000 Lebendgeburten und Ursache 3-11 % der pädiatrischen Blindheit, gemeinhin als ein Schlüsselloch-artige Struktur, die inferior aus der Pupille in der Mitte des Auges4ragt manifestieren, 5,6. Die Funktion der Aderhaut Fissur soll stellen einen Einstiegspunkt für frühen Gefäßsystem Hineinwachsen in den Optik-Cup, danach werden die Seiten des Risses Sicherung um die Schiffe7umschließen.
Während okulären Kolobom seit der Antike bekannt ist, haben wir vor kurzem eine neue Untergruppe von Kolobom Patienten mit Gewebeverlust beeinflussen den Superior/dorsalen Aspekt des Auges identifiziert. Neuere Arbeiten in unserem Labor führte zur Entdeckung einer okulären Struktur im Zebrafisch dorsalen Auge, die wir als die überlegene okuläre Sulcus (SOS) oder überlegene Fissur8bezeichnen. Es ist wichtig zu beachten, dass die Struktur verfügt über Eigenschaften von einem Sulcus und ein Riss. Ähnlich wie bei einem Sulcus, ist es eine ständige Gewebeschicht, die sich aus der Nasal der zeitlichen Netzhaut erstreckt. Darüber hinaus die Schließung der Struktur wird nicht durch eine Fusion der beiden gegnerischen Basalmembran vermittelt, und es scheint einen morphogenetischen Prozess zu verlangen, mit dem die Struktur von Zellen besiedelt ist. Jedoch ähnlich wie ein Riss, bildet es eine Struktur, die die nasalen und temporalen Seiten des dorsalen Auges mit der Basalmembran trennt. Aus Konsistenzgründen werden wir bezeichnen es als SOS in diesem Text.
Die SOS ist evolutionär über Wirbeltiere, wobei sichtbar, während Auge Morphogenese in Fische, Küken, Molch und Maus8erhalten. Im Gegensatz zu der Aderhaut Fissur, die von 20 bis 60 Stunden nach Befruchtung (hpf) im Zebrafisch vorhanden ist, die SOS ist sehr flüchtig, wird gut sichtbar von 20-23 hpf und abwesend von 26 hpf-8. Neuere Forschungen in unserem Labor hat festgestellt, dass ähnlich wie bei der Aderhaut Fissur, die SOS eine Rolle bei vaskulären Führung während Auge Morphogenese8 spielt. Obwohl die Faktoren, die die Gründung und Schließung der SOS noch nicht vollständig verstanden sind, unsere Daten für dorsal-Ventral Auge Musterung Gene8Rollen markieren.
Zebrafisch ist eine ausgezeichnete Modellorganismus der SOS zu studieren. Als Modellsystem, bietet es eine Reihe von Vorteilen bei der Untersuchung der Augenentwicklung: Es ist ein Wirbeltier Modell; Jede Generation weist hohe Fruchtbarkeit (~ 200 Embryonen); seines Genoms wurde vollständig sequenziert, erleichtert die Genmanipulation; und etwa 70 % der menschlichen Gene haben mindestens ein Zebrafisch orthologs, so dass es ein ideales Genetik-basierte Modell der menschlichen Krankheit9,10. Vor allem seine Entwicklung erfolgt extern an die Mutter, und seine Larven sind transparent, wodurch für die Visualisierung des dritten Auges mit relativer Leichtigkeit11.
In dieser Reihe von Protokollen beschreiben wir die Techniken, durch die die SOS im Zebrafischlarven visualisiert werden kann. Die Vielfalt der Visualisierungs-Techniken, die in diesem Bericht verwendeten ermöglicht klare Beobachtung von SOS während der normalen Augenentwicklung sowie die Fähigkeit, SOS Schließung Mängel zu erkennen. Unsere Beispiel-Protokolle werden Untersuchungen von Gdf6, einem BMP in dorsal lokalisiert Auge und bekannten Regulator der SOS-Verschluss. Darüber hinaus können diese Techniken mit experimentellen Manipulationen zu identifizieren genetische Faktoren oder pharmakologische Wirkstoffe, die richtige SOS-Gründung und Schließung beeinflussen kombiniert werden. Darüber hinaus haben wir ein Protokoll durch die fluoreszente-Bildgebung aller Zellmembranen möglich ist, so dass des Experimentators, morphologische Veränderungen an den Zellen rund um den SOS zu beobachten aufgenommen. Unser Ziel ist es, eine Reihe von standardisierten Protokollen zu etablieren, die in der wissenschaftlichen Gemeinschaft verwendet werden können, bieten neue Einblicke in diese neuartige Struktur des dritten Auges.
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Protocol
Alle hier beschriebene Methoden wurden von der University of Alberta Animal Care and Use Committee genehmigt.
1. Protokoll 1: Visualisierung von SOS Stereomikroskopie mit differential Interferenz Kontrast (DIC) Bildgebung
- Embryo-Sammlung
- Bereiten Sie in einem Tank ungechlortem Wasser Kreuze gdf6a+ / Zebrafisch am Abend durch die Kombination einer männlichen Zebrafisch mit einem weiblichen Zebrafisch. Achten Sie darauf, das Weibchen das Männchen trennen, mithilfe einer Trennlinie um sicherzustellen, dass die Embryonen innerhalb eines kleinen Bereichs der Zeit geboren werden.
- Am nächsten Morgen ziehen Sie die Trennlinie und erlauben Sie dem Zebrafisch, für nicht mehr als 30 min. sammeln die Embryonen in Petrischalen mit E3 Media, beschrieben in The Zebrafish Buch12, zu züchten und legen Sie sie in einem Inkubator 28,5 ° C.
- Entfernen Sie alle unbefruchtete Eier oder Toten Embryonen, die weiß und undurchsichtig erscheint.
- Vorbereitung und live-Imaging von Zebrafisch-Embryonen
- Um 20 Uhr hpf, ersetzen die E3 Medien mit E3 Media mit 0,004 % 1-Phenyl-2-Thioharnstoff (PTU), Pigment-Produktion zu verhindern.
Hinweis: Zugabe von PTU in einer etwas späteren Timepoint wie 22-24 hpf, ist unwahrscheinlich, dass das Experiment aufgrund des frühen Alters der Embryonen zum Zeitpunkt der Bildgebung stören. Es wird jedoch empfohlen, die Embryonen früh zu behandeln, um vollständig Pigmentierung zu verhindern, da gibt es eine Band der Pigmentierung, die in den Augen der dorsalen angezeigt wird, die mit der SOS-Bildgebung stören können. - Sicherzustellen Sie, dass alle Embryonen auf die richtige Entwicklungsstadien an verschiedenen Stellen im Vorfeld zu der Zeit der Beobachtung. Es wird empfohlen, dass dies in den Phasen die Somiten Anzahl deutlich sichtbar erfolgt wie Kimmel Et Al.13beschrieben ist. Entfernen Sie die, die entwicklungsgeschichtlich unreif sind.
- Legen Sie die Embryonen unter dem sezierenden Mikroskop und Dechorionate die Embryonen durch vorsichtig Auseinanderziehen der Chorion mit feinen Pinzette. Visualisieren Sie SOS im dorsalen Auge. Die SOS erscheinen als eine Einbuchtung am dorsalen Rand des Auges, und eine Linie über die dorsale Auge sichtbar sein soll. Für normale SOS-Verschluss, beobachten die Embryonen bei rund 20-23 hpf. Für die Prüfung der verzögerten SOS Schließung Phänotypen, beobachten die Embryonen bei 28 hpf oder später.
- Die Embryonen, die SOS Verschluss Verzögerung von denen zeigen, die nicht zu sortieren.
- Um diese Embryonen mit einem sezierenden Mikroskop zu fotografieren, bereiten Sie eine Petrischale mit 1 % Agarose in E3. Stechen Sie leicht das Zentrum der Agarose, ein flaches Loch zu schaffen, in dem das Eigelb des Embryos sitzen kann, wenn der Embryo in der Agarose platziert wird. Dadurch wird sichergestellt, dass der Embryo nicht schräg ist, wenn fotografiert wird.
- Embryonen mit 0,003 % Tricaine in E3 und seitlich auf die Agarose zu betäuben.
- Um die Embryonen mit einem zusammengesetzten oder confocal Mikroskop Bild, Übertragung des Embryos in 35 mm Petrischale mit einem kleinen Bolus nicht geliert 1 % niedrig schmelzende Punkt Agarose in E3 (w/V). Schnell positionieren Sie den Embryo seitlich mit einem feinen Angelschnur oder Wimper zu und warten Sie, bis die Agarose abkühlen. Sobald die Agarose fest ist, Gießen Sie genug E3 in das Gericht zur Deckung der Agarose. Für weitere Details siehe Distel und Köster14.
Hinweis: Wenn einem inversen Mikroskop verwenden, der Embryo kann gegen das Glas ein Glasboden Deckglas Teller gelegt und mit standard 20 X Objektiv Objektiv abgebildet. - Verwenden Sie ein Wasser eintauchen 20 X Objektiv, um SOS mit einem Compound-Mikroskop zu visualisieren. Ziehen Sie nach Visualisierung die Agarose von Embryonen und in 4 % Paraformaldehyd (PFA) zu beheben Sie oder erlauben Sie, ihre Entwicklung fortzusetzen.
- Um 20 Uhr hpf, ersetzen die E3 Medien mit E3 Media mit 0,004 % 1-Phenyl-2-Thioharnstoff (PTU), Pigment-Produktion zu verhindern.
2. Protokoll 2: Gesamte-Mount immunofluorescent Färbung des laminin
- Vollständig-hängen immunofluorescent Färbung des Laminin: Tag1
- Dechorionate Embryonen wie in Schritt 1.2.3, beschrieben, falls noch nicht geschehen. Beheben von Embryonen in einem Microcentrifuge Schlauch auf die gewünschte Timepoint in frisch zubereiteten 4 % PFA für 2 h auf Raumtemperatur (22-25 ° C) Shaker. Waschen, in 1 X PBST für 5 min, viermal.
Hinweis: Nach der Gastrulation, können Embryonen besser nach Dechorionation festsetzen. - Permeabilize Embryonen in 10 mg/mL Proteinase K bei Raumtemperatur für das Entwicklungsstadium 5 min. Inkubationszeit hängt an dem die Embryonen werden fixiert (siehe Thisse und Thisse15).
- Waschen, in 1 X PBST für 5 min, viermal.
- Embryonen in einer Lösung von 5 % Ziege Serum und 2 mg/mL Rinderserumalbumin (BSA) in 1xPBST für 1-2 h auf Raumtemperatur Shaker zu blockieren.
- Bereiten Sie Primärantikörper Lösung durch Verdünnung Kaninchen-Anti-Laminin-Antikörper in Block-Lösung bei einer Verdünnung von 1: 200.
- Inkubieren Sie die Embryonen in Anti-Laminin Primärantikörper Übernachtung im Shaker 4 ° C.
- Dechorionate Embryonen wie in Schritt 1.2.3, beschrieben, falls noch nicht geschehen. Beheben von Embryonen in einem Microcentrifuge Schlauch auf die gewünschte Timepoint in frisch zubereiteten 4 % PFA für 2 h auf Raumtemperatur (22-25 ° C) Shaker. Waschen, in 1 X PBST für 5 min, viermal.
- Vollständig-hängen immunofluorescent Färbung des Laminin: Tag2
- Waschen, in 1 X PBST für 15 min, fünfmal.
- Bereiten Sie Sekundärantikörper Lösung durch Verdünnung Ziege-Anti-Kaninchen-Alexa Fluor 488-Antikörper in 1 X PBST zu einer Verdünnung von 1: 1000.
Hinweis: Es ist möglich, diesen Schritt, um die verfügbaren Ressourcen der Experimentator Anzug mit verschiedenen Sekundärantikörper anzupassen. - Inkubieren Sie die Embryonen in Sekundärantikörper Übernachtung im Shaker 4 ° C. Schützen Sie vor Licht, so viel wie möglich von diesem Schritt ab.
- Waschen, in 1 X PBST für 15 min, viermal. Die Embryonen können bei 4 ° C bis zu einer Woche, bei Bedarf gespeichert werden.
- Zerlegung und Montage des embryonalen Augen
- Falls gewünscht, die Embryonen in eine kleine Petrischale und deyolk die Embryonen in 1 X PBST. Zu diesem Zweck sanft stören das Eigelb mit feinen Zangen und Entfernen der Eigelb-Zellen durch milde Schaben von dem Dottersack.
- Die folgenden Konzentrationen von PBS-Glycerin Serienlösungen in Mikrozentrifugenröhrchen vorbereiten: 30 %, 50 % und 70 % Glycerin in PBS. Transferieren Sie die Embryonen in 30 % Glycerin/PBS, sicherstellen, dass die Embryonen auf die Lösung und die Übertragung so wenig von der vorherigen Lösung wie möglich platzieren. Warten Sie, bis die Embryonen an der Unterseite des Rohres zu versenken.
- Wenn Embryonen nach unten versenkt haben, übertragen Sie sie auf 50 % Glycerin/PBS. Wiederholen Sie und übertragen Sie auf 70 % Glycerin/PBS.
- Sobald die Embryonen in 70 % Glycerin/PBS versenkt haben, verschieben Sie sie in einer kleinen Plastikschale für Sezierungen.
- Trennen des Embryos nach dem Hinterhirn, und der hintere Gewebe für die Genotypisierung, verwenden, wenn nötig.
- Bewegen Sie den Kopf auf einen Objektträger übertragen als wenig Glycerin wie möglich. Verwenden Sie Zange oder anderen feinen Dissektion Tools auf das hintere Ende des Kopfes stationär zu halten halten. Verwenden Sie eine feine Minutien Pin oder andere feine Dissektion Tools sanft in das Vorderhirn Ventrikel aus der vorderen einfügen und drücken Sie nach unten, um die linken und rechten Hälften des Kopfes von einander zu trennen. Wiederholen Sie diesen Vorgang während der Bewegung nach hinten durch das Mittelhirn und in dem Hinterhirn Ventrikel, im wesentlichen fileting der Kopf der Mittellinie. Dies minimiert die manuelle Manipulation des Auges und umliegende Gewebe, wodurch die SOS unbeschädigt.
- Jede Seite der Kopf Mittellinie nach unten Auge oben anbringen. Position vier Beiträge Vakuum Fett an den Ecken (einen entsprechenden Abstand für das Deckglas verwendet wird) und mit einem Glas Deckgläschen abdecken, drücken Sie nacheinander auf jeden Post bis das Deckglas nimmt Kontakt mit den Proben. 70 % Glycerin am Rande des Deckglases Pipette, so dass das Glycerin darunter gezogen wird, füllt den Raum zwischen dem Deckglas und der Folie.
- Bild Proben innerhalb eines Tages oder Dichtung um das Deckglas mit Nagellack und Bildbeispiele erst, nachdem der Lack getrocknet ist. Speichern Sie im Dunkeln bei 4 ° C.
3. Protokoll Nr. 3: Visualisierung der SOS mit eGFP-CAAX mRNA
- Synthese von eGFP-CAAX mRNA
- Linearisieren Sie 1 mg pCS2-eGFP-CAAX Plasmid16 mit NotI in einem Reaktionsvolumen von 40 mL für 4 Stunden bei 37 ° C.
- Um die Beschränkung Digest Reaktion zu stoppen, fügen Sie 10 mL RNase-freies Wasser, 2,5 mL 10 % SDS und 2,0 mL 10 mg/mL Proteinase K.
- 1 Stunde bei 50 ° c inkubieren
- Fügen Sie Folgendes in die Reaktion (Gesamtvolumen 200 mL) und gehen Sie zum nächsten Schritt: 50 mL RNase-freies Wasser, 20 mL 3 M Natrium Acetat pH 5.2 und 75,5 mL RNase-freies Wasser
Hinweis: RNase-freies Wasser wird in zwei verschiedenen Gelegenheiten zu verhindern übermäßige Verdünnung der Natriumacetat hinzugefügt.
- Reinigung der DNA durch Phenol/Chloroform Extraktion und Ethanol Niederschlag
- Fügen Sie 200 mL Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol und Wirbel für 20 S. getrennt die wässrigen und organische Phasen durch Zentrifugation bei 18.000 x g für 5 min.
- Übertragen Sie die obere wässrige Schicht zu einem neuen Microcentrifuge Schlauch, und achten Sie auf die Übertragung der unteren organische Schicht zu vermeiden. Die neue Röhre ein gleiches Volumen an Chloroform hinzufügen.
Hinweis: Zugabe von Chloroform ist optional, aber es wird empfohlen, die vollständige Entfernung von Phenol aus der Probe zu gewährleisten. - Vortex für 20 S. getrennt die wässrigen und organische Phasen durch Zentrifugation bei 18.000 x g für 5 Minuten.
- Nach wie vor Übertragung der oberen wässrigen Schicht zu einem neuen Microcentrifuge Schlauch, und achten Sie auf die Übertragung der unteren organische Schicht zu vermeiden.
- Fügen Sie 1/10 Volumen von 3 M Natrium Acetat pH 5.2.
- Überstürzen Sie DNA durch Zugabe von 3 Bände von 100 % RNase-freie Ethanol und Chill bei-20 ° C für 15 min. Zentrifugieren bei 18.000 x g für 20 min bei 4 ° C. Ein Pellet sollte sichtbar sein. Den Überstand abgießen.
- Waschen Sie die Tablette mit 100 mL kaltem 70 % Ethanol/RNase-freies Wasser. Zentrifugieren Sie nach vorsichtig mischen, um das Pellet losbrechen bei 18.000 x g für 15 min bei 4 ° C. Ein Pellet sollte sichtbar sein. Den Überstand abgießen.
- Das Pellet für 5 min an der Luft trocknen und die DNA in 7 mL Wasser Aufschwemmen.
Hinweis: Die Pellets müssen länger als 5 min, je nach den Luftstrom getrocknet werden.
- Transkription und Reinigung von eGFP-CAAX mRNA
- RNase-freie Weise bereiten Sie eine in-vitro- Transkription Reaktion mit einem handelsüblichen Sp6 RNA Polymerase-Kit, mit etwa 1 mg gereinigte linearisierten Plasmid DNA in Schritt 3.2 erhalten. 2 h bei 37 ° c inkubieren
Hinweis: Sp6-RNA-Polymerase muss für die Herstellung von angeschnittene Ärmel mRNA verwendet werden. - Fügen Sie 1 mL DNase (2 U/mL; RNase frei) und 30 min bei 37 ° c inkubieren
- Reinigen Sie die mRNA mit jeder handelsüblichen RNA Reinigung Kit. Aliquoten die mRNA zu vermeiden wiederholte Frost-Tau-wechseln, und bei-80 ° c lagern
- RNase-freie Weise bereiten Sie eine in-vitro- Transkription Reaktion mit einem handelsüblichen Sp6 RNA Polymerase-Kit, mit etwa 1 mg gereinigte linearisierten Plasmid DNA in Schritt 3.2 erhalten. 2 h bei 37 ° c inkubieren
- Injektion und Visualisierung
- Embryonen zu erhalten, wie im Protokoll 1.1 beschrieben.
- Injizieren Sie mit Hilfe einer Mikroinjektion Apparatur, 300 Pg eGFP-CAAX mRNA im 1-Zell-Stadium.
- Bildschirm für Embryonen mit dem hellen Ausdruck von eGFP in den Augen mit einem Fluoreszenz-Stereoskop.
- Bild der Embryonen, wie im Protokoll 1.2 beschrieben.
- Alternativ, Dechorionate und befestigen Sie die Embryonen an die gewünschte Timepoint in 4 % PFA für 4 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4° C. Waschen Sie die Embryonen in 1 x PBST für 5 min, viermal und Dechorionate, wenn nicht zuvor getan. Sezieren die Augen aus und klebe sie auf Folien, wie im Protokoll 2.3 beschrieben.
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Representative Results
Der Zebrabärbling SOS erscheint um 20 Uhr hpf in der mutmaßlichen dorsalen Netzhaut-8. Von 23 hpf SOS Übergänge von seiner ursprünglichen engen Architektur auf einen breiten Einzug und 26 hpf-es ist nicht mehr sichtbar8. Daher, um die SOS während der normalen Zebrafisch Augenentwicklung zu untersuchen, die Embryonen zwischen 20-23 hpf einzuhalten. Während dieser Zeit ist die SOS zu beobachten, durch die sezierenden Mikroskop und mittels DIC Imaging als dünne Linie im dorsalen Auge, das die nasalen und temporalen Hälften der entwickelnden Netzhaut (Abbildung 1) trennt. Darüber hinaus möglicherweise eine subtile Einbuchtung in der dorsalen Begrenzung des Auges (Abbildung 1) sichtbar. Nach immunofluorescent Färbung von Laminin, kann die dünne Linie bestätigt werden, zu der Basalmembran (Abbildung 1).
Um molekulare Signalwege was verzögerte Schließung der SOS zu untersuchen, wir entschieden uns für die Embryonen bei 28 beobachten hpf als dies ist ein Timepoint, die hinreichend aus der Zeit der normalen SOS Verschluss entfernt und ist daher ein verlässlicher Marker von SOS Verschluss Verzögerung aufgrund der experimentellen Manipulationen. Durch direkte Visualisierung der 28 hpf Zebrafisch unter dem sezierenden Mikroskop ist es möglich, SOS Verschluss Verzögerung durch experimentelle Manipulation zu bewerten. Wenn SOS Schließung verzögert wird, kann seine anhaltende Präsenz als ein ausgeprägter Spalt in der dorsalen Seite des Auges unter dem sezierenden Mikroskop (Abbildung 2) gesehen werden. Wenn unter dem Compound-Mikroskop mit DIC oder Nomarski-Optik beobachtet, diese Funktion ist noch mehr im Vordergrund, und die nasalen und temporalen Seiten des Auges sind getrennt, von der SOS, die deutlich sichtbar als eine Zeile in der dorsalen Auge (Abbildung 3).
Die SOS ist gesäumt von Basallamina Komponenten, einschließlich Laminin. Daher stellt die immunofluorescent Färbung eine ergänzende Methode der Bewertung der SOS-Schließung in festen Embryonen. Wenn das embryonale Auge aus seitlichem imaging, die Basallamina abgrenzt den äußeren Rand des Auges, okuläre Risse sowohl die Grenze zwischen der Linse und der Netzhaut (Abbildung 4). Die SOS orientiert sich direkt gegenüber der Aderhaut Fissur im dorsalen Aspekt des Auges. Ganze Embryonen können seitlich mit etwas bessere optische Klarheit erreicht, wenn die Augen vorher Microdissected sind montiert werden. Von 28 hpf, in Wildtyp Zebrafisch, Laminin Färbung zeigt deutlich, dass die SOS vollständig geschlossen ist, was macht dies die ideale Bühne für die Überwachung der Verzögerungen bei der Fissur Schließung.
Injektion von eGFP-CAAX mRNA ermöglicht die Visualisierung der Zellmembranen eines Live- oder festen Embryos (Abbildung 5). Erfolgreiche One-Zell-Stadium Injektion reicht, Embryonen mit komplette Zellmembran Fluoreszenz zu produzieren. In der seitlichen Ansicht alle zelluläre Grenzen durch GFP Fluoreszenz markiert werden, und als solche Zellmorphologie auch deutlich zu sehen. Dies ermöglicht die Visualisierung der morphologischen Veränderungen an den Zellen, die zu SOS Schließung führen.
Abbildung 1: Beobachtung der SOS während der normalen Zebrafisch Augenentwicklung. Zebrafisch-Embryonen wurden gesammelt und um 22 Uhr abgebildet hpf. A-B. Seitenansicht von 22 hpf-Embryonen live-Image erstellt mit dem sezierenden Mikroskop (A) und über DIC imaging (B), beziehungsweise. Die SOS ist durch ein rotes Sternchen gekennzeichnet. C. Laminin immunofluorescent Färbung eines 22 hpf-Embryos. Embryonen wurden in 4 % korrigiert PFA und für ganze-Mount immunofluorescent Färbung des Laminin erreicht. Die Embryonen wurden fileted und in 70 % Glycerin/PBS montiert. Einzelne Schnittbilder wurden durch konfokale Bildgebung mit einer Software erhalten. Die SOS zeichnet sich durch eine weiße Sternchen. Alle Figuren wurden kommentiert und mit Adobe Illustrator Software montiert. Maßstabsleisten sind 50 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Mikroskopaufnahmen von SOS Verschluss Verzögerung im Zebrafischlarven sezieren. Wildtyp und gdf6a- / - Embryonen wurden gesammelt und Leben-abgebildet in 28 hpf. A. seitliche Ansicht eines Wildtyp-Embryos mit einem geschlossenen SOS. B. seitliche Ansicht eines gdf6a- / - Embryos mit einer SOS-Verschluss-Verzögerung (Sternchen). Eine starke Depression ist zu beobachten, in den dorsalen Aspekt des Auges aufgrund des Ausfalls der SOS, entsprechend zu schließen. Maßstabsleisten sind 50 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Vertreter DIC-Bilder von der SOS im Zebrafish embryonale Auge. Wildtyp und gdf6a- / - Embryonen wurden gesammelt, betäubt und seitlich in 1 % Ultrapure niedrigschmelzende Punkt Agarose in E3 auf einem 35 mm Petrischale gelegt. Das Gericht war gefüllt mit E3, und ein Compound-Mikroskop mit einer 20 x Wasser eintauchen Ziel diente für DIC Bildgebung. A. seitliche Ansicht eines Wildtyp-Embryos mit einem geschlossenen SOS. B. seitliche Ansicht eines gdf6a- / - Embryos mit einer SOS-Verschluss-Verzögerung (Sternchen). Die SOS ist zu beobachten, als dünne Linie in der dorsalen Aspekt des Auges. Maßstabsleisten sind 50 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: repräsentative Bilder von Laminin immunofluorescent Färbung in embryonalen Zebrafisch Auge. Wildtyp und gdf6a- / - Embryonen wurden gesammelt und in 4 % fixiert PFA bei 28 hpf. Die Basallamina war Immunostained, und die Embryonen waren fileted und montiert mit 70 % Glycerin/PBS-Puffer für die konfokale Bildgebung. Einzelne Schnittbilder wurden mit ZEN-Software erhalten. A. seitliche Ansicht eines Wildtyp-Embryos mit einem geschlossenen SOS. B. seitliche Ansicht eines gdf6a- / - Embryos mit einer SOS-Verschluss-Verzögerung (Sternchen). Die Basallamina wird skizziert das Auge im Grünen mit der SOS in der dorsalen Teil des Auges in gdf6a- / - Embryonen sichtbar angezeigt. Maßstabsleisten sind 50 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Imaging des Zebrafisch embryonalen Auges nach eGFP-Caax mRNA Injektion. Wildtyp-Embryonen wurden mit 300 Pg eGFP-Caax mRNA im 1-Zell-Stadium injiziert. Um 22 Uhr hpf und 28 hpf, bzw. die Embryonen wurden betäubt und in 1 % Ultrapure niedrigschmelzende Punkt Agarose in E3 auf einem 35 mm Petrischale seitlich montiert. Ein confocal Mikroskop mit 20 x Wasser eintauchen Ziel war für die Bildgebung verwendet wurden, und einzelne Schnittbilder mit Hilfe einer Software. A. seitliche Ansicht eines gdf6a- / - Embryos um 22 Uhr hpf mit einer sichtbaren offenen SOS (Sternchen). B. vergrößert Platten des gdf6a- / - Embryos um 22 Uhr hpf. C. seitliche Ansicht eines gdf6a- / - Embryos bei 28 hpf mit einem SOS-Verschluss verzögern. D. vergrößert Platten des gdf6a- / - Embryos bei 28 hpf. Maßstabsleisten repräsentieren 50 mm und 10 mm Platten A und C, und B und D, beziehungsweise. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Hier präsentieren wir Ihnen eine standardisierte Reihe von Protokollen, die SOS im sich entwickelnden Zebrafischembryo zu beobachten. Ermitteln, Schließung Verzögerung Phänotypen, konzentrierten sich unsere Protokolle auf die Fähigkeit, die Trennung von zwei diskreten Lappen der dorsalen Nasal und dorsal-zeitliche Seiten des Auges, vergleichbar mit Techniken zur Aderhaut Fissur Verschluss Verzögerung visualisieren unterscheiden in den Augen der ventralen Phänotypen.
Diese Visualisierungs-Techniken können in Verbindung mit einer Vielzahl von Genmanipulation Techniken verwendet werden, Studie zu den Auswirkungen von hemmen oder induzieren die Expression bestimmter Gene, ihre Rollen in der Schließung der SOS zu studieren. Wir haben beschlossen, zeigen diese Protokolle mit gdf6a- / - Embryonen, wie wir bereits, dass gezeigt haben sein Verlust kann ordnungsgemäße Schließung der SOS beeinflussen, aber die Protokolle können zur Untersuchung der Auswirkungen der Manipulation des Ausdrucks jedes Gen als Erforderlich. Es wird empfohlen, dass morphologische Änderungen an der dorsalen Auge vorläufig mit Beobachtungen mit dem sezierenden Mikroskop untersucht werden. Die anderen Techniken sollte verwendet werden, sobald eine erste Verbindung endgültig feststeht, sind zeitaufwendig und niedriger Durchsatz.
Während die Protokolle leicht geändert werden, können um die Bedürfnisse des Experimentators, gibt es mehrere Aspekte, die sorgfältig befolgt werden müssen. Wegen der vorübergehenden Natur dieser Struktur ist es zwingend notwendig, um sicherzustellen, dass alle beobachtet, dass Embryonen sind von der gleichen Entwicklungsstufe. Für unsere Arbeit finden wir es wichtig, nur ein kleines Fenster der Brutzeit zu ermöglichen und in regelmäßigen Abständen die Embryonen während der frühen Entwicklung sortieren. Der wichtigste Schritt der Ausgleich Phasen ist um 20 Uhr hpf, wenn Sie noch genau Somiten (24)17zählen können, und wir finden dies sehr viel zuverlässiger als die Inszenierungen Markenzeichen, die Zeit um 28 abzugrenzen hpf. Darüber hinaus muss Pigmentierung gehemmt oder entfernt, um erfolgreiche Visualisierung der Struktur zu gewährleisten. Beobachten wir die Pigmentierung im Auge beginnt zu starten rund 22 hpf, und es gibt ein Muster der Pigmentierung im dorsalen Auge, die Visualisierung von der SOS beeinträchtigen kann. Daher ist es dringend empfohlen, die Embryonen mit PTU vor Pigmentierung darauf erfolgreiche Visualisierung zu behandeln. Darüber hinaus erfordert die Dissektion des embryonalen Auges vor der Montage der Folie ohne Schäden zu verursachen einige Übung. Es ist auch zwingend notwendig, um die Augen möglichst parallel zur Folie seitlich zu montieren. Es wird empfohlen, dass der Experimentator dieser Techniken mit zusätzlichen Embryonen vor dem Experiment Praktiken.
Mit Ausnahme der immunofluorescent Färbung der Basallamina, können alle der hier beschriebenen Protokolle mit live Embryonen abgeschlossen werden. Dies ermöglicht kontinuierliche Visualisierung von der SOS während der frühen Embryogenese, so dass des Experimentators, Time-Lapse Studien der morphologischen Veränderungen beteiligt die Schließung der SOS. In der Vergangenheit haben wir Netzhaut-spezifische transgene, z. B. Tg(rx3:eGFP), verwendet, die die neuronale Netzhaut während der frühen Entwicklung. markiert Obwohl es die Fähigkeit fehlt, die Zellmembranen zu visualisieren, die Verwendung von Tg(rx3:eGFP) hat den Vorteil, dass Mikroinjektionen und wurde unsere Hauptmethode Brutto morphologische Änderungen an SOS-Architektur in Echtzeit zu visualisieren. Dieses Protokoll wurde nicht hier aufgenommen wie ähnliche Methoden in dieser Zeitschrift18,19beschrieben wurden. Untersuchung der Zelle biologische Grundlagen der SOS-Gründung und Schließung erfordern jedoch fluoreszierende Membranproteine. Die Injektion von eGFP-CAAX mRNA kann insbesondere Visualisierung der Zellmembranen um die SOS wie in Abbildung 5 zu sehen das uns erlaubt, die Dynamik der Form Zellveränderungen im dorsalen Auge zu studieren, die für die ordnungsgemäße SOS Schließung erforderlich sind. Während eGFP-CAAX für die Durchführung von live-Darstellung der SOS Schließung nützlich sein kann, ist es durch das Vorhandensein der umhüllenden Schicht im Zebrafisch erschwert. Darüber hinaus muss darauf geachtet werden, wenn Ergebnisse von mRNA-Injektionen zu analysieren, weil dadurch Mosaikbildung, macht es schwierig, anhand der Quantifizierung von eGFP Ausdruck Stärke Embryonen direkt miteinander vergleichen können. Dies könnte durch den Einsatz von transgenen Zebrafisch Linien gelindert, das Eindringmittel Zellmembranen speziell in der Entwicklung Netzhaut, z. B. Tg(vsx2.2:GFP-caax)beschriften.
Eine der Herausforderungen für unsere Protokolle liegt bei jeder Behandlung, die nicht vollständig Penetranz ist. Bisher haben wir festgestellt, dass SOS Verzögerungen in etwa 10 % der Kontrolle Embryonen bei 28 hpf8gesehen werden können, und diese zugrunde liegenden Präsenz von Embryonen mit einer SOS innerhalb einer gegebenen experimentellen Gruppe es schwierig schaffte zu beobachten, subtile Effekte der experimentellen Manipulation. Dies könnte durch Blendung des Experimentators um Experimentator Voreingenommenheit zu reduzieren und durch Erhöhung der Anzahl der Embryonen verwendet zur Erhöhung der Leistung des Experiments innerhalb der experimentellen Gruppen behandelt werden. Darüber hinaus könnte die Phase der Analyse auf 29-30 hpf verlagert werden.
Mit diesem Satz von Protokollen versuchen wir, den Weg zu standardisieren, wodurch SOS Schließung Verzögerungen visualisiert werden. Die oben beschriebenen Techniken haben gezeigt, dass zuverlässige Ermittlung und Visualisierung von SOS Schließung Verzögerungen in einer Vielzahl von experimentellen Einstellungen werden und sind auf der Experimentator Bedürfnisse anpassbar. Während wir Techniken wie Scannen, Elektronenmikroskopie oder Zeitraffer Bildgebung von transgenen Embryonen verwendet, um die SOS ausführlicher zu visualisieren, ist unser Ziel hier einen standardisierten Satz von Protokollen, das Hochdurchsatz-experimentelle zugänglich sind entwirft eine große Anzahl von Embryonen an einem einzigen Tag mit Schwerpunkt auf der Fähigkeit, Schließung der Verzögerung Phänotypen Gäste zu visualisieren. Zusätzlich zu seiner Verwendung mit gdf6a- / - Embryonen konnten wir SOS Verschluss Verzögerung Phänotypen mit diesen Visualisierungstechniken neben pharmakologischen Behandlungen, Morpholino-Injektionen und RNA Überexpression Studien zu beobachten. Die Rolle der SOS in Augenentwicklung aufgeklärt wird weiter durch verschiedene Mittel, wir hoffen, dass dieser standardisierten Satz von Protokollen der wissenschaftlichen Gemeinschaft eine gemeinsame Sprache zur Verfügung stellen durch die diese neuartige Struktur untersucht.
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Disclosures
Die Autoren haben keine widerstreitenden Interessen zu erklären.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von kanadischen Institute der Gesundheit Forschung (CIHR), Naturwissenschaften und Engineering Research Council (NSERC), Alberta innoviert Technologie Futures, und Frauen und Kinder Health Research Institute (WCHRI) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl 2-thiourea | Sigma Aldrich | P7629-10G | |
| 100 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 35 mm Petri dish | Corning | CLS430588 | |
| Agarose | BioShop Canada Inc. | AGA001.1 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| DIC/Fluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z1 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX12 | |
| Dissection microscope camera | Qimaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Dow Corning High-vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma Aldrich | A5040-25G | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150077 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Image capture software | Zeiss | ZEN | |
| Incubator | VWR | Model 1545 | |
| Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Minutien pin | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148-500G | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2 | Fisher Scientific | BP1752-100 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P4850 | |
| Rabbit anti-laminin antibody | Millipore Sigma | L9393 | |
| TURBO Dnase (2 U/µL) | Invitrogen | AM2238 | |
| Ultrapure low-melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525017 |
References
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