Summary
Vi præsenterer her, en standardiseret række protokoller at observere den overlegne okulære sulcus, en nylig identificeret, evolutionært bevaret struktur i hvirveldyr øje. Bruger zebrafisk larver, vise vi teknikker nødvendige for at identificere faktorer, der bidrager til dannelse og lukning af den overlegne okulære sulcus.
Abstract
Medfødt okulær coloboma er en genetisk lidelse, der er typisk bemærket som en kløft i ringere aspekt af øjet som følge af ufuldstændig plexus revne lukning. For nylig, identifikation af personer med coloboma i den overlegne aspekt af iris, nethinden, og linse førte til opdagelsen af en ny struktur, omtales som den overlegne revne eller superior okulær sulcus (SOS), der er forbigående til stede på den dorsale aspekt af den optiske kop under hvirveldyr øje udvikling. Selv om denne struktur er bevaret på tværs af mus, kylling, fisk og newt, er vores nuværende forståelse af SOS begrænset. For at belyse faktorer, der bidrager til dens dannelse og lukning, er det bydende nødvendigt at kunne observere det og identificere abnormiteter, såsom forsinkelse i lukningen af SOS. Her, satte vi sig for at skabe en standardiseret serie af protokoller, der kan bruges til at effektivt visualisere SOS ved at kombinere bredt tilgængelige mikroskopi-teknikker med fælles molekylærbiologiske teknikker såsom immunfluorescent farvning og mRNA overekspression. Mens dette sæt af protokoller, der fokuserer på evnen til at iagttage SOS lukning forsinkelse, det kan tilpasses til eksperimentatorens behov og nemt kan redigeres. Samlet set håber vi at skabe en imødekommende metode, hvorigennem vores forståelse af SOS kan være avanceret for at udvide den nuværende viden om hvirveldyr øje udvikling.
Introduction
Dannelsen af de hvirveldyr øje er en yderst velbevarede proces hvor omhyggeligt orkestreret intercellulære signaling veje etablere vævstyper og angive regionale identitet1. Perturbationer til tidlig øje morfogenese medføre dybtgående defekter på arkitekturen i øjet og blændende ofte2. En sådan sygdom skyldes undladelse af at lukke den plexus okulære revne i den ventrale side af optik cup3. Denne lidelse, kendt som okulær coloboma, skønnes for at forekomme i 1 ud af 4-5000 levendefødte og årsag 3-11% af pediatric blindhed, almindeligt manifesterer sig som et nøglehul-lignende struktur, der stikker inferiorly fra elev i midten af øjet4, 5,6. Den plexus revne funktion er at give et indgangspunkt for tidlige Vaskulaturen vokser ind i optiske kop, hvorefter siderne af revne vil sammensmelte for at omslutte fartøjer7.
Mens okulær coloboma har været kendt siden oldtiden, har vi for nylig identificeret en roman undersæt af coloboma patienter med væv tab påvirker den superior/dorsale del af øjet. Seneste arbejde i vores lab har ført til opdagelsen af en okulær struktur i zebrafisk dorsale øje, som vi refererer til som den overlegne okulær sulcus (SOS) eller overlegne revne8. Det er vigtigt at bemærke, at strukturen har karakteristika af både en sulcus og en revne. Svarende til en sulcus, det er en løbende væv lag, der strækker sig fra nasale til tidsmæssige nethinden. Derudover lukningen af strukturen er ikke formidlet af en fusion af de to modsatrettede basalmembranen, og det synes at kræve en morfogenetiske proces som strukturen er befolket af celler. Dog ligner en revne, det udgør en struktur, der adskiller de nasale og tidsmæssige sider af den dorsale øje med basalmembranen. For konsistens, vil vi henvise til det som SOS i denne tekst.
SOS er evolutionært bevaret på tværs af hvirveldyr, kan ses under øjet morfogenese i fisk, kylling, newt og mus8. I modsætning til den plexus revne, som er til stede fra 20-60 timer efter befrugtningen (hpf) i zebrafisk, SOS er meget flygtig, at være let synlige fra 20-23 hpf og fraværende af 26 hpf8. Nyere forskning i vores lab har fundet, at ligner den plexus revne, SOS spiller en rolle i vaskulære vejledning under øjet morfogenese8. Selv om de faktorer, der styrer dannelsen og lukning af SOS ikke er endnu fuldt forstået, vores data fremhæve roller for dorsal-ventral øjet mønster gener8.
Zebrafisk er en fremragende model organisme at studere SOS. Som en modelsystem, det giver en række fordele i at studere øjet udvikling: det er en hvirveldyr model; hver generation udstiller høj frugtbarhed (~ 200 embryoner); dens genom har været fuldt sekventeret, som letter genetisk manipulation; og ca. 70% af menneskelige gener har mindst én zebrafisk orthologue, hvilket gør det en ideel genetik-baseret model for menneskelig sygdom9,10. Vigtigst, dens udvikling finder sted eksternt til moderen, og dens larver er gennemsigtig, hvilket giver mulighed for visualisering af den tredje øjet med relativ lethed11.
I dette sæt af protokoller beskriver vi de teknikker, gennem hvilke SOS kan visualiseres i zebrafisk larver. Vifte af visualiseringsteknikker, der anvendes i denne rapport vil give mulighed for klart observation af SOS under normale øjes udvikling, såvel som evnen til at opdage SOS lukning fejl. Vores eksempel protokoller vil indslag undersøgelser af Gdf6, en BMP lokaliseret til den dorsale øje og kendte regulator af SOS lukning. Yderligere, disse teknikker kan kombineres med eksperimentelle manipulationer til at identificere genetiske faktorer eller farmakologiske stoffer, der påvirker ordentlig SOS dannelse og lukning. Derudover har vi inkluderet en protokol, hvorigennem de fluorescerende billeddannelse af alle cellemembraner er muligt, tillader eksperimentatoren at observere morfologiske ændringer i cellerne omkring SOS. Vores mål er at etablere et sæt standardiserede protokoller, der kan bruges i hele den videnskabelige samfund til at tilbyde nye indsigter i denne nye struktur af det tredje øje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af University of Alberta Animal Care og brug udvalget.
1. protokol 1: Visualisering af SOS ved hjælp af stereomicroscopy og differential interferens kontrast (DIC) imaging
- Embryonerne blev indsamlet
- I en tank af dechlorinated vand, forberede krydsninger af gdf6a+/- zebrafisk om aftenen ved at parre en mandlig zebrafisk med en kvindelig zebrafisk. Sørg for at adskille mandlige fra kvinden ved hjælp af en skillevæg til at sikre, at embryonerne er født inden for et lille interval af tid.
- Den følgende morgen, trække adskilleren og tillade zebrafisk til arten nemlig ikke længere end 30 min. indsamle embryoner i petriskåle med E3 medier, beskrevet i zebrafisk bogen12, og placere dem i en 28,5 ° C inkubator.
- Fjerne ubefrugtede æg eller døde embryoner, der vises hvide og uigennemsigtige.
- Forberedelse og live-imaging af zebrafisk embryoner
- På 20 hpf, Erstat E3 medier med E3 medier indeholdende 0,004% 1-phenyl 2-thiourinstof (PTU) at forhindre pigment produktion.
Bemærk: Tilsætning af PTU på et lidt senere tidspunkt, såsom 22-24 hpf, er usandsynligt at forstyrre eksperimentet på grund af tidlig alder af embryoner på tidspunktet for billeddannelse. Det anbefales dog at behandle embryoner tidligt for at helt for at forhindre pigmentering, som der er et band af pigmentering, der vises i den dorsale øje, som kan forstyrre billeddannelse af SOS. - Sikre, at alle embryoner på den korrekte udviklingsstadier på forskellige punkter fører op til tidspunktet for observation. Det anbefales, at dette sker på et trin, på hvilket somite antallet er klart synlig, som skitseret af Kimmel et al.13. Fjerne dem, der er udviklingsmæssigt umodne.
- Placer embryoner under et dissekere mikroskop, og dechorionate embryoner af forsigtigt trække fra hinanden chorion ved hjælp af fine pincet. Visualisere SOS i den dorsale øje. SOS kan vises som en fordybning på den dorsale margen i øjet, og en linje skal være synlige på tværs af den dorsale øje. For normale SOS lukning, observere embryoner på omkring 20-23 hpf. Til undersøgelse af forsinket SOS lukning fænotyper, observere embryoner på 28 hpf eller senere.
- Sortere de embryoner, der viser SOS lukning forsinkelse fra dem, der ikke gør.
- For at fotografere disse embryoner ved hjælp af en dissekere mikroskop, forberede en petriskål, som indeholder 1% Agarosen i E3. Let punktere midten af Agarosen til at oprette et lavvandet hul hvor blommesækken af fosteret kan sidde når fosteret er placeret på agarosegelelektroforese. Dette vil sikre, at embryoet ikke er i en skrå vinkel, når at blive fotograferet.
- Bedøver embryoner med 0,003% tricaine i E3 og sted lateralt på agarosegelelektroforese.
- For at billede af embryoner ved hjælp af en sammensat eller Konfokal mikroskop, overføre embryonet til 35 mm petriskål indeholdende et lille bolus af ikke-geléagtig 1% lav-smeltende punkt Agarosen i E3 (w/v). Hurtigt placere embryonet lateralt ved hjælp af en fint fiskeri linje eller en øjenvipper og vente på Agarosen køle. Når Agarosen er fast, hæld parabol til at dække Agarosen nok E3. For flere detaljer, se Distel og Köster14.
Bemærk: Hvis du bruger en omvendt mikroskop, fosteret kan placeres mod en glas-coverslip-nederste skål glas og afbildet med en standard 20 X objektive linse. - Bruge en vand fordybelse 20 x mål linse til at visualisere SOS med et sammensat mikroskop. Efter visualisering, forsigtigt trække Agarosen fra embryoner og lave i 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) eller give mulighed for at fortsætte deres udvikling.
- På 20 hpf, Erstat E3 medier med E3 medier indeholdende 0,004% 1-phenyl 2-thiourinstof (PTU) at forhindre pigment produktion.
2. protokol 2: Hele-mount immunfluorescent farvning af laminin
- Hele-mount immunfluorescent farvning af laminin: dag 1
- Dechorionate embryoner som beskrevet i trin 1.2.3, hvis ikke allerede har gjort. Fix embryoner i et microcentrifuge rør på det ønskede tidspunkt i frisklavet 4% PFA i 2 timer på en stuetemperatur (22-25 ° C) shaker. Vask i 1 x PBST i 5 min, fire gange.
Bemærk: Efter gastrulation, embryoner kan lave bedre efter dechorionation. - Permeabilize embryoner i 10 mg/mL proteinase K ved stuetemperatur for 5 min. inkubationstiden vil afhænge af udviklingsstadiet hvor embryonerne er fast (Se Thisse og Thisse15).
- Vask i 1 x PBST i 5 min, fire gange.
- Blokere embryoner i en opløsning på 5% ged serum og 2 mg/mL bovint serumalbumin (BSA) i 1xPBST for 1-2 h på en stuetemperatur shaker.
- Forberede primære antistof løsning ved at fortynde kanin anti-laminin antistof i blok løsning ved 1:200.
- Inkuber embryoner i anti-laminin primære antistof natten på en 4 ° C shaker.
- Dechorionate embryoner som beskrevet i trin 1.2.3, hvis ikke allerede har gjort. Fix embryoner i et microcentrifuge rør på det ønskede tidspunkt i frisklavet 4% PFA i 2 timer på en stuetemperatur (22-25 ° C) shaker. Vask i 1 x PBST i 5 min, fire gange.
- Hele-mount immunfluorescent farvning af laminin: dag 2
- Vask i 1 x PBST for 15 min, fem gange.
- Forberede sekundær antistof løsning ved at fortynde ged anti-kanin Alexa Fluor 488 antistof i 1 x PBST til en fortynding af 1:1000.
Bemærk: Det er muligt at tilpasse dette trin passer til de disponible ressourcer til eksperimentatoren ved hjælp af en anden sekundær antistof. - Inkuber embryoner i sekundær antistof natten på en 4 ° C shaker. Skjold fra lys så meget som muligt fra dette trin og fremefter.
- Vask i 1 x PBST for 15 min, fire gange. Embryoner kan opbevares ved 4 ° C i op til en uge, hvis det er nødvendigt.
- Dissektion og montering af embryonale øjne
- Hvis det ønskes, placere embryonerne i en lille petriskål og deyolk embryoner i 1 x PBST. Gør dette ved forsigtigt forstyrre æggeblomme med fine pincet og fjerne æggeblomme celler gennem mild skrabning af blommesækken.
- Forbered de følgende koncentrationer af PBS-glycerol serie løsninger i microcentrifuge rør: 30%, 50% og 70% glycerol i PBS. Overføre embryoner til 30% glycerol/PBS, og sørg for at placere embryoner oven på løsningen og overføre så lidt af den tidligere løsning som muligt. Vente på embryoner til at synke til bunden af røret.
- Når embryoner er sunket til bunds, overføre dem til 50% glycerol/PBS. Gentag og overføre til 70% glycerol/PBS.
- Når embryoner er sunket i 70% glycerol/PBS, skal du flytte dem til en lille plastik skål til dissektioner.
- Sever embryo posteriort for baghjernen, og bruge den bageste væv til genotypebestemmelse, hvis nødvendigt.
- Flytte hovedet til et glas dias, overførsel af som lille glycerol som muligt. Bruge pincet eller andre fine dissektion værktøjer til at holde fast i den bageste ende at holde hovedet stationære. Brug en fin minutien pin eller andre fine dissektion værktøjer til forsigtigt indsætte i forhjernen ventrikel fra den forreste og tryk nedad for at adskille den højre og venstre halvdel af hovedet fra hinanden. Gentag dette mens du flytter posteriort gennem midthjernen og ind i baghjernen hjertekammer, hovedsagelig fileting hovedet ned midterlinjen. Dette minimerer manuel manipulation af øjet og omkringliggende væv, dermed forlader SOS ubeskadiget.
- Montere hver side af hovedet midterlinjen ned, øjet op. Position fire stillinger af vakuum fedt i hjørnerne (en passende afstand fra hinanden for coverslip bliver brugt) og dække med et glas coverslip, skubbe sekventielt på hver post indtil coverslip gør kontakt med prøverne. Afpipetteres 70% glycerol på kanten af coverslip, således at glycerol er trukket nedenunder, fylde rummet mellem coverslip og diasset.
- Billede prøver inden for en dag, eller forsegling omkring coverslip med neglelak og billede prøver kun efter neglelak er tørret. Opbevares i mørke ved 4 ° C.
3. protokol 3: Visualisering af SOS ved hjælp af eGFP-CAAX mRNA
- Syntese af eGFP-CAAX mRNA
- Linearize 1 mg af pCS2-eGFP-CAAX plasmid16 med NotI i en reaktion volumen på 40 mL i 4 timer ved 37 ° C.
- For at stoppe restriktion digest reaktionen, tilsættes 10 mL RNase-fri vand, 2,5 mL 10% SDS og 2,0 mL 10 mg/mL Proteinase K.
- Inkubér 1 time ved 50 ° C.
- Tilføje følgende til reaktionen (samlet mængde 200 mL) og Fortsæt til næste trin: 50 mL RNase-fri vand, 20 mL 3 M natrium acetat pH 5,2 og 75,5 mL RNase-fri vand
Bemærk: RNase-fri vand er tilføjet i to separate lejligheder at forhindre overdreven fortynding af natriumacetat.
- Oprensning af DNA gennem fenol/chloroform udvinding og ethanol fældning
- Tilføje 200 mL phenol: chloroform: isoamyl alkohol og vortex for 20 s. særskilt vandige og den organiske faserne ved centrifugering ved 18.000 x g i 5 min.
- Overføre den øverste vandige lag til et nyt microcentrifuge rør, og sørg for at undgå overførsel af økologisk bundlag. Tilføje et lige saa stort volumen af chloroform til den nye rør.
Bemærk: Tilsætning af chloroform er valgfri, men det anbefales at sikre fuldstændig fjernelse af phenol fra prøven. - Vortex for 20 s. særskilt vandige og den organiske faserne ved centrifugering ved 18.000 x g i 5 min.
- Som før, overføre den øverste vandige lag til et nyt microcentrifuge rør, og sørg for at undgå overførsel af økologisk bundlag.
- Tilføj 1/10 bind af 3 M natrium acetat pH 5,2.
- Udfældes DNA ved at tilføje 3 bind af 100% fri for RNase ethanol og chill ved-20 ° C i 15 min. Centrifuge på 18.000 x g i 20 min. ved 4 ° C. En pellet skal være synlige. Dekanteres.
- Vask pellet med 100 mL koldt 70% ethanol/RNase-fri vand. Efter forsigtigt blandingen for at bryde pille løs, centrifugeres ved 18.000 x g i 15 min. ved 4 ° C. En pellet skal være synlige. Dekanteres.
- Lufttørre pellet i 5 min og resuspend DNA i 7 mL vand.
Bemærk: Pellet kan skal tørres længere end 5 min afhængigt af luftstrømmen tilgængelige.
- Transskription og rensning af eGFP-CAAX mRNA
- I en RNase-fri måde, forberede en in vitro- transskription reaktion med en kommercielt tilgængelig Sp6 RNA polymerase kit, ved hjælp af ca. 1 mg renset lineariseret plasmid DNA fremstillet i trin 3.2. Der inkuberes i 2 timer ved 37 ° C.
Bemærk: Sp6 RNA polymerase skal anvendes til fremstilling af udjævnede mRNA. - Der tilsættes 1 mL af DNase (2 U/mL; RNase gratis) og Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C.
- Rense mRNA med ethvert kommercielt tilgængelige RNA oprensning kit. Alikvot mRNA at undgå gentagne fryse-tø, og opbevares ved-80 ° C.
- I en RNase-fri måde, forberede en in vitro- transskription reaktion med en kommercielt tilgængelig Sp6 RNA polymerase kit, ved hjælp af ca. 1 mg renset lineariseret plasmid DNA fremstillet i trin 3.2. Der inkuberes i 2 timer ved 37 ° C.
- Injektion og visualisering
- Få embryoner, som skitseret i protokollen 1.1.
- Med en mikroinjektion apparatur, injicere 300 pg af eGFP-CAAX mRNA på 1-celle stadium.
- Skærm for embryoner med den lyse udtryk for eGFP i øjnene ved hjælp af et fluorescens Stereoskopet.
- Billede af embryoner, som beskrevet i protokollen 1.2.
- Alternativt, dechorionate og fastsætte embryoner på det ønskede tidspunkt i 4% PFA i 4 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4° C. Vask af embryoner i 1 x PBST i 5 min, fire gange og dechorionate, hvis ikke tidligere har gjort. Dissekere øjnene og montere dem på dias, som beskrevet i protokollen 2.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zebrafisk SOS vises på 20 hpf i den formodede dorsale nethinde8. 23 hpf SOS overgange fra sin oprindelige arkitektur, smalle til en bred fordybning og 26 hpf det er ikke længere synlig8. Derfor, for at undersøge SOS under normale zebrafisk øje udvikling, at embryonerne skal overholdes mellem 20-23 hpf. I denne periode er SOS observerbare gennem dissekere mikroskop og via DIC imaging som en tynd linje i den dorsale øje, der adskiller de nasale og tidsmæssige halvdele af udvikle nethinden (figur 1). Derudover kan en subtil indrykning ses i den dorsale grænse af øjet (figur 1). Efter immunfluorescent farvning af laminin, den tynde linje kan bekræftes for at være basalmembranen (figur 1).
For at undersøge molekylære veje resulterer i forsinket SOS lukning, valgte vi at observere embryoner på 28 hpf som dette er et tidspunkt, der er tilstrækkeligt fjernet fra tidspunktet for normale SOS lukning og er derfor en pålidelig markør for SOS lukning forsinkelse på grund af eksperimentelle manipulationer. Gennem direkte visualisering af 28 hpf zebrafisk dissekere mikroskopet er det muligt at evaluere SOS lukning forsinkelse på grund af eksperimentelle manipulation. Når SOS lukning er forsinket, kan sin langvarige tilstedeværelse ses som en markant kløft i den dorsale side af øjet under dissekere mikroskop (figur 2). Når observeret under sammensat mikroskop ved hjælp af DIC eller Nomarski optik, denne funktion er endnu mere fremtrædende, og nasal og tidsmæssige siderne af øjnene er adskilt af SOS, hvilket ses tydeligt som en linje i den dorsale øjet (figur 3).
SOS er foret med basal lamina komponenter, herunder laminin. Derfor giver immunfluorescent farvning en supplerende metode til evaluering af SOS lukning i faste embryoner. Når imaging embryonale øjet fra en lateral udsigt, basal lamina afgrænser den udvendige margen i øjet, både okulær sprækker, og grænsen mellem linsen og nethinden (figur 4). SOS er orienteret direkte modsat den plexus revne i den dorsale del af øjet. Hele embryoner kan monteres sideværts, med lidt bedre optisk klarhed opnås, hvis øjne er tidligere microdissected. Af 28 hpf, i vildtype zebrafisk, laminin farvning, viser tydeligt, at SOS er helt lukket, hvilket gør dette den ideelle scenen for overvågning forsinkelser i revne lukning.
Injektion af eGFP-CAAX mRNA giver mulighed for visualisering af cellemembraner af en levende eller faste embryo (figur 5). Vellykket én-celle stadium injektion er tilstrækkelige til at fremstille embryoner med komplet cellemembranen fluorescens. I visningen laterale alle cellulære grænser bør være præget af normal god landbrugspraksis fluorescens, og som sådan celle morfologi også tydeligt observeres. Dette giver mulighed for visualisering af de morfologiske forandringer i de celler, der fører til SOS lukning.
Figur 1: Observation af SOS under normale zebrafisk øje udvikling. Zebrafisk embryoner blev indsamlet og afbildet på 22 hpf. A-B. Lateral udsigt over 22 hpf embryoner live-afbildet med dissekere mikroskop (A) og via DIC imaging (B), henholdsvis. SOS er markeret med en rød stjerne. C. Laminin immunfluorescent farvning af en 22 hpf embryo. Embryoner blev fastsat i 4% PFA og indhentet for hele-mount immunfluorescent farvning af laminin. Embryoner blev fileted og monteret i 70% glycerol/PBS. Enkelt skive billeder blev opnået gennem Konfokal imaging med en software. SOS er markeret med en hvid stjerne. Alle tal, der blev kommenteret og samles ved hjælp af Adobe Illustrator-software. Skala søjler repræsenterer 50 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: dissekere mikroskop billeder af SOS lukning forsinkelse i zebrafisk larver. Vildtype og gdf6a- / - embryoner blev indsamlet og live-afbildet på 28 hpf. A. Lateral udsigt over en vildtype embryo med en lukket SOS. B. Lateral udsigt over en gdf6a- / - embryo med en SOS lukning forsinkelse (stjerne). En skarp depression er observerbare i den dorsale aspekt for øje på grund af svigt af SOS at lukke korrekt. Skala søjler repræsenterer 50 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentant DIC billeder af SOS i zebrafisk embryonale øje. Vildtype og gdf6a- / - embryoner blev indsamlet, bedøvede og placeret sideværts i 1% ultrarent lav-smeltende punkt Agarosen i E3 på en 35 mm petriskål. Fadet blev fyldt med E3, og en sammensat mikroskop med en 20 x vand-dypning mål blev brugt til DIC billeddannelse. A. Lateral udsigt over en vildtype embryo med en lukket SOS. B. Lateral udsigt over en gdf6a- / - embryo med en SOS lukning forsinkelse (stjerne). SOS er observerbare som en tynd linje i den dorsale del af øjet. Skala søjler repræsenterer 50 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentative billeder af laminin immunfluorescent farvning i embryonale zebrafisk øje. Vildtype og gdf6a- / - embryoner blev indsamlet og fast i 4% PFA på 28 hpf. Basal lamina var immunostained, og embryonerne blev fileted og monteret i 70% glycerol/PBS for Konfokal billeddannelse. Enkelt skive billeder blev opnået ved hjælp af ZEN software. A. Lateral udsigt over en vildtype embryo med en lukket SOS. B. Lateral udsigt over en gdf6a- / - embryo med en SOS lukning forsinkelse (stjerne). Basal lamina er vist skitserer øjet i grøn med SOS synlige i den dorsale del af øjet i gdf6a- / - embryoner. Skala søjler repræsenterer 50 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Imaging af zebrafisk embryonale øjet efter eGFP-caax mRNA injektion. Vildtype embryoner blev sprøjtet med 300 pg af eGFP-caax mRNA på 1-celle stadium. På 22 hpf og 28 hpf, henholdsvis embryoner blev bedøvede og monteret sideværts i 1% ultrarent lav-smeltende punkt Agarosen i E3 på en 35 mm petriskål. En Konfokal mikroskop med en 20 x vand-dypning mål blev brugt til billedbehandling, og enkelt skive billeder blev opnået ved hjælp af en software. A. Lateral udsigt over en gdf6a- / - embryo på 22 hpf med en synlig åben SOS (stjerne). B. udvidet paneler af et gdf6a- / - embryo på 22 hpf. C. Lateral udsigt over en gdf6a- / - embryo på 28 hpf med en SOS lukning forsinke. D. udvidet paneler af et gdf6a- / - embryo på 28 hpf. Skala søjler repræsenterer 50 mm og 10 mm i paneler A og C, og B og D, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenterer vi en standardiseret række protokoller at observere SOS i udviklingslandene zebrafisk embryo. For at bestemme lukning forsinkelse fænotyper, har vores protokoller fokuseret på evnen til at skelne adskillelse af to diskrete lapper i de dorsale nasal og dorsal-temporale sider af øjet, svarende til teknikker, der anvendes til at visualisere plexus revne lukning forsinkelse fænotyper i ventrale øjet.
Disse visualiseringsteknikker kan bruges sammen med en række genetiske manipulation teknikker til at undersøge virkningerne af hæmme eller inducerende udtryk for visse gener at studere deres roller i lukningen af SOS. Vi har valgt at vise disse protokoller ved hjælp af gdf6a- / - embryoner, som vi har tidligere vist, at dets tab kan påvirke korrekt lukning af SOS, men protokollerne, der kan bruges til at studere virkningerne af manipulere udtryk for enhver gene som kræves. Det anbefales, at den dorsale øje morfologiske ændringer studeres foreløbigt med observationer ved hjælp af den dissekere mikroskop. De andre teknikker skal bruges, når en indledende link er etableret endeligt, da de er mere tidskrævende og lavere overførselshastighed.
Mens protokollerne kan let modificeret til at passe til behovene hos eksperimentatoren, er der flere aspekter, der skal følges nøje. På grund af den forbigående karakter af denne struktur er det bydende nødvendigt at sikre, at alle observerede embryoner er af den samme udviklingsstadiet. For vores arbejde finder vi det vigtigt at give kun et lille vindue i yngletiden og periodisk sortere embryoner i hele tidlige udvikling. Det vigtigste skridt af equalizing faser er på 20 hpf, når du regne stadig nøjagtig somites (24)17, og vi finder dette meget mere pålidelige end midlertidige kendetegnende, at afgrænse tid på 28 hpf. Derudover pigmentering hæmmede eller fjernes for at sikre en vellykket visualisering af strukturen. Vi har observeret pigmentering i øjet begynder at starte omkring 22 hpf, og der er et mønster af pigmentering i den dorsale øje, der kan forstyrre ordentlig visualisering af SOS. Derfor er det stærkt anbefales at behandle embryoner med PTU forud for pigmentering at sikre en vellykket visualisering. Derudover kræver dissektion af embryonale øjet før dias montering uden at forårsage skade nogle praksis. Det er også bydende nødvendigt at sideværts montere øjne så parallelt som muligt til diaset. Det anbefales, at eksperimentatoren praksis disse teknikker med ekstra embryoner før eksperimentet.
Med undtagelse af immunfluorescent farvning af basal lamina, kan alle de protokoller, der er beskrevet her fuldføres ved hjælp af levende embryoer. Dette giver mulighed for løbende visualisering af SOS i hele tidlige embryogenese, tillader eksperimentatoren at gennemføre time-lapse undersøgelser af de morfologiske ændringer, der er involveret i lukningen af SOS. I fortiden, har vi brugt nethinden-specifikke transgener, såsom Tg(rx3:eGFP), som markerer den neurale nethinden i den tidlige udvikling. Selv om det mangler evnen til at visualisere cellemembraner, brugen af Tg(rx3:eGFP) har fordelen, der ikke kræver microinjections og har været vores primære metode til at visualisere brutto morfologiske ændringer til SOS arkitektur i realtid. Denne protokol er ikke medtaget her, som lignende metoder har været drøftet tidligere i dette tidsskrift18,19. Undersøgelse af SOS dannelse og lukning celle biologiske grundlag kræver dog membran fluorescerende proteiner. Specifikt, injektion af eGFP-CAAX mRNA giver mulighed for visualisering af cellemembraner omkring SOS som det ses i figur 5, som gør det muligt for os at studere dynamikken i celle figur ændringer i den dorsale øje, der kræves til korrekt SOS lukning. Mens eGFP-CAAX kan være nyttige til at udføre live-imaging af SOS lukning, gøres det vanskeligt af tilstedeværelsen af det omsluttende lag i zebrafisk. Derudover skal pleje tages når analyserer resultaterne fra mRNA indsprøjtninger, fordi det kan resultere i mosaicisme, hvilket gør det vanskeligt at direkte sammenligne embryoner baseret på kvantificering af eGFP udtryk styrke. Dette kunne blive forbedret ved hjælp af transgene zebrafisk linjer, at fluorescently mærke cellemembraner specielt i udviklingslande nethinden, såsom Tg(vsx2.2:GFP-caax).
En af udfordringerne for vores protokoller ligger med nogen form for behandling, ikke der er fuldt penetrant. Vi har tidligere bemærket at SOS forsinkelser kan ses i omkring 10% af kontrol embryoner på 28 hpf8, og denne underliggende tilstedeværelsen af embryoner med en SOS inden for enhver given eksperimentelle gruppe kunne gøre det vanskeligt at observere subtile effekter af eksperimentelle manipulation. Dette kunne løses af blændende eksperimentatoren at reducere eksperimentatoren bias og ved at øge antallet af embryoner bruges inden for hver eksperimentelle gruppe til at øge styrken i eksperimentet. Desuden, kunne fase af analyse flyttes til 29-30 hpf.
Med dette sæt af protokoller søger vi at standardisere den måde, hvorigennem SOS lukning forsinkelser er visualiseret. De teknikker, der er beskrevet ovenfor har vist sig at være troværdige i opdage og visualisere SOS lukning forsinkelser i en række eksperimentelle indstillinger og kan tilpasses til eksperimentatorens behov. Mens vi har brugt teknikker såsom scanning elektronmikroskopi eller time-lapse billeddannelse af transgene embryoner til at visualisere SOS nærmere, er vores mål her at skabe et standardiseret sæt af protokoller, der er indstillet til høj overførselshastighed eksperimentelle design til at visualisere et stort antal embryoner i en enkelt dag med vægt på evnen til at score lukning forsinkelse fænotyper. Ud over dets anvendelse med gdf6a- / - embryoner, har vi kunnet observere SOS lukning forsinkelse fænotyper ved hjælp af disse visualiseringsteknikker sammen med farmakologiske behandlinger, morpholino injektioner og RNA overekspression undersøgelser. Da rollen for SOS i øjet udvikling er belyst yderligere gennem forskellige midler, vi håber at denne standardiseret sæt af protokoller giver forskerverdenen et fælles sprog, som denne nye struktur er undersøgt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen modstridende interesser at erklære.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af canadiske institutter for sundhed Research (CIHR), naturvidenskab og Engineering Research Rådet (NSERC), Alberta innoverer teknologi Futures, og kvinder og børns sundhed Research Institute (WCHRI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl 2-thiourea | Sigma Aldrich | P7629-10G | |
| 100 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 35 mm Petri dish | Corning | CLS430588 | |
| Agarose | BioShop Canada Inc. | AGA001.1 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| DIC/Fluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z1 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX12 | |
| Dissection microscope camera | Qimaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Dow Corning High-vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma Aldrich | A5040-25G | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150077 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Image capture software | Zeiss | ZEN | |
| Incubator | VWR | Model 1545 | |
| Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Minutien pin | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148-500G | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2 | Fisher Scientific | BP1752-100 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P4850 | |
| Rabbit anti-laminin antibody | Millipore Sigma | L9393 | |
| TURBO Dnase (2 U/µL) | Invitrogen | AM2238 | |
| Ultrapure low-melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525017 |
References
- Chow, R. L., Lang, R. A. Early eye development in vertebrates. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, (2001).
- Slavotinek, A. M. Eye development genes and known syndromes. Molecular Genetics and Metabolism. 104 (448-456), (2011).
- Gregory-Evans, C. Y., Williams, M. J., Halford, S., Gregory-Evans, K. Ocular coloboma: a reassessment in the age of molecular neuroscience. Journal of Medical Genetics. 41 (12), (2004).
- Onwochei, B. C., Simon, J. W., Bateman, J. B., Couture, K. C., Mir, E. Ocular colobomata. Survey of Ophthalmolgy. 45, 175-194 (2000).
- Williamson, K. A., FitzPatrick, D. R. The genetic architecture of microphthalmia, anophthalmia and coloboma. European Journal of Medical Genetics. 57, 369-380 (2014).
- Chang, L., Blain, D., Bertuzzi, S., Brooks, B. P. Uveal coloboma: clinical and basic science update. Current Opinion in Ophthalmology. 17, 447-470 (2006).
- Kaufman, R., et al. Development and origins of Zebrafish ocular vasculature. BMC Developmental Biology. 15 (18), (2015).
- Hocking, J. C., et al. Morphogenetic defects underlie Superior Coloboma, a newly identified closure disorder of the dorsal eye. PLOS Genetics. 14 (3), (2018).
- Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Developmental Cell. 21 (1), (2011).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. International Journal of Developmental Neuroscience. 19, 621-629 (2001).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edition, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
- Kwan, K. M., Otsuna, H., Kidokoro, H., Carney, K. R., Saijoh, Y., Chien, C. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139, 359-372 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. Stages of Embryonic Development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (79), e50525 (2013).
- Percival, S. M., Parant, J. M. Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (113), e54218 (2016).
