Summary
Hier, muis bloed werd verzameld in de aanwezigheid van een anti-coagulant. De bloedplaatjes werden gezuiverd door iohexol gradiënt medium met behulp van lage snelheid centrifugeren. De bloedplaatjes werden geactiveerd met trombine om te onderzoeken of ze levensvatbaar waren. De kwaliteit van de gezuiverde bloedplaatjes werd geanalyseerd door stromings Cytometry en microscopie.
Abstract
De bloedplaatjes worden gezuiverd van geheel bloed om hun functionele eigenschappen te bestuderen, die van rode bloedcellen (RBC), witte bloedcellen (WBC), en plasmaproteïnen vrij zouden moeten zijn. We beschrijven hier zuivering van bloedplaatjes uit muis bloed met behulp van drie-voudige meer iohexol gradiënt medium ten opzichte van het bloedmonster volume en centrifugeren in een swingende emmer rotor op 400 x g voor 20 min bij 20 ° c. De terugwinning/opbrengst van de gezuiverde bloedplaatjes was 18.2-38.5%, en de gezuiverde bloedplaatjes waren in een rustende staat, die geen significant aantal van RBC en WBC bevatten. De gezuiverde bloedplaatjes behandeld met trombine toonde tot 93% activering, met vermelding van hun levensvatbaarheid. We hebben bevestigd dat de gezuiverde bloedplaatjes voldoende zuiver zijn met behulp van flow flowcytometrische en microscopische evaluatie. Deze bloedplaatjes kunnen worden gebruikt voor genexpressie, activering, granule release, aggregatie, en adhesie assays. Deze methode kan worden gebruikt voor de zuivering van bloedplaatjes uit het bloed van andere soorten ook.
Introduction
De bloedplaatjes zijn een component van bloed dat als initiator van bloed het klonteren als reactie op schade in het bloedvat functioneert. Zij verzamelen zich op de plaats van verwonding om de schipmuur1te stoppen. Bloedplaatjes zijn anucleate fragmenten van cytoplasma afgeleid van de megakaryocytes van het beenmerg onder invloed van thrombopoietin en voer de circulatie2. Ze worden beschouwd als metabolisch actief en kunnen sensing extracellulaire omgeving door het activeren van intracellulaire signalering Cascades die resulteren in bloedplaatjes verspreiden, aggregatie, en hemostatische plug vorming1,3. Naast hemostase/trombose en wondgenezing4, bloedplaatjes spelen een belangrijke rol in de gastheer inflammatoire reacties, bloedvat, en de substatis3,5,6,7, 8.
Plaatjes worden gezuiverd van bloed om hun biochemische en fysiologische eigenschappen, die moeten vrij zijn van andere bloedbestanddelen studie. Sinds rode bloedcellen (RBC) en witte bloedcellen (WBC) bevatten aanzienlijk meer RNA en eiwitten dan bloedplaatjes9,10, de aanwezigheid van zelfs een klein aantal van deze cellen kunnen interfereren met transcriptomics en Proteomic analyses van RNA en eiwitten afkomstig van bloedplaatjes. We vonden dat gezuiverde bloedplaatjes geactiveerd met trombine BIND antilichaam, zoals anti-GPIIb/IIIa (JON/A) en anti-P-selectine efficiënter dan hele bloedplaatjes.
Aangezien bloedplaatjes kwetsbaar zijn, is het belangrijk om de monsters zo licht mogelijk te behandelen. Als de bloedplaatjes zijn geactiveerd, ze vrij hun korrel inhoud en uiteindelijk afgebroken. Daarom, om te voorkomen dat de bloedplaatjes ' functionele eigenschappen intact, is het belangrijk om bloedplaatjes rust te handhaven tijdens isolatie. Verschillende protocollen hebben beschreven isolatie van bloedplaatjes van de mens, hond, rat, en niet-menselijke primaat door verschillende methoden1,10,11,12. Sommige van de methoden vereisen meerdere stappen, zoals het verzamelen van bloedplaatjes-rijk plasma door centrifugeren, filtratie door scheiding kolom, negatieve selectie van bloedplaatjes met RBC-en WBC-specifieke antilichaam geconjugeerd aan magnetische kralen, en zo verder, die tijdrovende en kan afgebroken bloedplaatjes en de inhoud ervan.
Ford en zijn collega's beschreven bloedplaatjes zuivering van menselijk bloed met behulp van iohexol medium11. Deze methode gebruikt een gelijkaardig volume van bloedsteekproef en middel tijdens reiniging. Aangezien de mens een hoger volume van bloed oplevert, is het vrij gemakkelijk om de bloedplaatjes te zuiveren.
Iohexol is een universele dichtheid gradiënt inert medium dat vrij oplosbaar is in water en gebruikt in de fractionering van nucleïnezuren, eiwitten, polysaccharide, en Nucleoproteins13,14. Het heeft een lage osmolaliteit en is niet giftig, waardoor het een ideaal medium voor de reiniging van intact levende cellen11. Het is een niet-zwevend medium; Daarom kan de verdeling van cellen in een gradiënt worden bepaald gebruikend hemocytometer, stroom cytometer, of spectrofotometer. Het interfereert niet met het merendeel van de enzymatische of chemische reactie van de cellen of cellulaire fragmenten na verdunning.
De muis fungeert als een belangrijk diermodel voor vele menselijke ziekten15,16,17,18. Er zijn een paar gepubliceerde artikelen die de zuivering van de muis plaatjes te beschrijven19,20. Echter, de muis levert een relatief kleiner volume van het bloed, waardoor het moeilijk is om bloedplaatjes te zuiveren. Als dezelfde kleine hoeveelheid gradiënt medium en bloedmonsters wordt gebruikt, kan de bloedplaatjes laag niet duidelijk worden gescheiden van RBC-WBC laag na centrifugeren. In dit artikel hebben we beschreven een snelle en eenvoudige methode van de muis bloedplaatjes zuivering met drie-voudige meer iohexol gradiënt medium ten opzichte van het bloedmonster volume en lage snelheid centrifugeren. We hebben ook geactiveerd de gezuiverde bloedplaatjes met trombine en onderzocht hun kwaliteit met Flow Cytometry en microscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Muis bloedafname moet worden uitgevoerd met de juiste institutionele zorg voor dieren en het gebruik Comite goedkeuring.
Opmerking: Het bloedplaatjes zuiverings protocol wordt beschreven in een stroomdiagram in Figuur 1.
1. inzameling van bloed
- Voeg 25 µ L van 3,2% natrium citraat (pH 7,2) toe als anti-coagulant en 0,4 mM van Gly-Pro-ARG-Pro (GPRP) in een polypropyleen buis.
-
Verzamel ongeveer 200 µ L van het bloed van de C57BL/6 muis met behulp van retro-orbitale bloeden.
Nota: het bloed kan van om het even welk type van muis spanning ongeacht leeftijd of geslacht worden verzameld.- Gebruik 2 mL Isofluraan in elk type kamer om de muis te verdoven.
Opmerking: De diepte van anesthesie wordt gecontroleerd door tekens van verhoogde ademhaling en verminderde beweging. De muis moet niet reageren op beweging van de anesthesie kamer, of te worden behandeld. Als de muis reageert op beweging of behandeling, dan is het meer tijd nodig om te houden in de anesthesie kamer. - 1.2.2 open ofwel rechts of links ooglid van de muis en plaats een 7,5 cm (0,12 cm diameter) capillaire buis in de vasculaire plexus van het oog.
- Draai de capillaire buis een halve bocht, terwijl de toepassing van druk op de capillaire buis om de schepen te breken en de bloedstroom te initiëren. Houd het dier ondersteboven over de collectie flacon te worden gevuld door capillaire werking.
- Zodra de juiste hoeveelheid bloed wordt verzameld, verwijder de capillaire buis en sluit het oog door de toepassing van milde druk voor 30 s op het ooglid met een gaasje. Zodra het aftappen wordt tegengehouden, terugkeer de muis aan zijn kooi en monitor voor het aftappen.
- Controleer de ogen voor trauma 1-2 dagen na retro-orbitale bloeden. Verwijder een muis uit de studie die tekenen van significante trauma aan het oog als gevolg van de procedure en euthanaseren.
Opmerking: De muis mag niet ondergaan elke vorm van behandeling die bloedplaatjes kan remmen gedurende ten minste twee weken voor de bloedafname. Het bloedmonster moet worden gebruikt voor het zuiveren van bloedplaatjes binnen een uur na het bloeden van de muis.
- Gebruik 2 mL Isofluraan in elk type kamer om de muis te verdoven.
2. bloedplaatjes zuivering
Opmerking: Bloedplaatjes zuivering moet worden uitgevoerd bij kamertemperatuur om hun afbraak te voorkomen. Zorg ervoor dat de temperatuur van de reagentia en de instrumenten tussen 18 tot 22 °C is. Om te voorkomen dat afbraak van bloedplaatjes, snel pipetten en krachtig schudden moet worden vermeden tijdens de procedure.
- Voeg 600 µ L van iohexol gradiënt medium (12% iohexol poeder in 0,85% natriumchloride, 5 mM Tricine, pH 7,2)11 in een 1,5 ml buis.
- Voeg 200 µ L van bloedmonster langzaam langs de zijkant van de buis op de top van de gradiënt medium met een brede boring pipet tip, zodat het bloed en iohexol medium niet mengen (Figuur 2a).
- Centrifugeer het monster met buis op 400 x g voor 20 min bij 20 °c in een slingerende emmer rotor met langzame acceleratie en vertraging.
- Verzamel de meeste van de bloedplaatjes-rijke laag en een kleine fractie van de bloedplaatjes-arme laag (totaal 300 tot 400 µ L) met behulp van een brede boring pipet Tip zonder verstoring van de RBC en WBC lagen (Figuur 2b). Breng het bloedplaatjes monster naar een nieuwe buis.
Opmerking: Als het aantal bloedplaatjes is minder in het bloed of een kleiner volume van het bloedvat wordt gebruikt, de bloedplaatjes-rijke laag en bloedplaatjes-arme laag kan worden gezien als een enkele laag. - Voeg 1 mL PBS toe aan het bloedplaatjes monster, Meng door omkeren en centrifugeer bij 800 x g gedurende 10 min bij 20 °c in een slingerende emmer rotor. Gooi de oplossing volledig weg en voeg 200 µ L van PBS toe om de bloedplaatjes met milde pipetten opnieuw op te schorten.
Opmerking: Deze stap is facultatief, aangezien het het gradiënt middel en de plasmaproteïnen verwijdert en de gevoeligheid van bloedplaatjes aan agonisten zoals trombine verhoogt. Aangezien de verschillende centrifuges verschillende programma's hebben, kan de langzame versnelling/de vertraging worden bepaald door de gebruikershandboek van de centrifuge te lezen. - Breng 30 µ L van dit monster in een nieuwe buis om bloedplaatjes te tellen. De resterende bloedplaatjes kunnen worden gebruikt voor biochemische en fysiologische analyses, zoals bloedplaatjes activering, aggregatie, granule release, enz.
- Voor RNA of EiwitExtractie, Centrifugeer het monster van bloedplaatjes bij 800 x g 10 min om de bloedplaatjes te pelletpen. Gooi bovendrijvende volledig zonder storende de pellet. Voeg het gewenste volume van RNA of proteïne lysis buffer toe om de bloedplaatjes te lyse.
3. het tellen van de bloedplaatjes
- Tel de hele bloedcellen zonder verdunning en gezuiverd bloedplaatjes (verdund 2 tot 5-voudig met PBS) met behulp van een geautomatiseerde cel Analyzer. Gebruik 30 tot 50 µ L monsters voor het tellen.
- Bereken het totale aantal bloedplaatjes door vermenigvuldiging met het volume van het monster.
- Bereken het percentage van de opbrengst/het herstel van gezuiverde bloedplaatjes.
- Tel de RBC en WBC in de gezuiverde bloedplaatjes monster (verdund 50 tot 100-voudig met PBS) met een hemocytometer en Microscoop.
4. de activering van bloedplaatjes
- In een buis, voeg 1 tot 2.000.000 gezuiverde bloedplaatjes in maximaal 100 µ L van kleuring buffer (PBS met 2% foetale boviene serum, FBS).
- Voor veelvoudige aantal steekproeven, maak een hoofd mengeling van antilichamen met 1 µ L (0,5 mg/mL) van het volgende: PE-Cy7 rat anti-Mouse TER 119, PE rat anti-muis CD45, FITC rat anti-muis CD41, en APC rat anti-muis/Human CD62P (P-selectine) op te sporen RBC, WBC, bloedplaatjes, en geactiveerde bloedplaatjes, respectievelijk. Voeg de Master mix aan de buizen voor het bevlekken van de cellen. Voeg geen trombine toe.
- In een andere buis, voeg 1 tot 2.000.000 van gezuiverde bloedplaatjes in maximaal 100 µ L van kleuring buffer, en 0,4 mM GPRP peptide. Voeg trombine toe om de bloedplaatjes te activeren en vlek de cellen na stap 4,2.
Opmerking: GPRP moet worden toegevoegd aan het monster voor het toevoegen van trombine om te voorkomen dat aggregaat of stolselvorming door middel van bloedplaatjes activering. Trombine concentratie moet worden geoptimaliseerd om een goede activatie van bloedplaatjes te verkrijgen. Na de activering van bloedplaatjes zijn de gebeurtenis tellingen verminderd tijdens de aankoop van monsters door flow Cytometry. - Als een positieve controle, voeg 1 µ L van geheel bloed in tot 100 µ L kleuring buffer in een buis en 0,4 mM GPRP peptide. Voeg trombine om bloedplaatjes te activeren. Als een negatieve controle, voeg 1 µ L van het hele bloed in maximaal 100 µ L van kleuring buffer. Voeg geen trombine toe in negatief controlemonster. Vlek de cellen na stap 4,2.
- Voor flow Cytometry Isotype Control, label 5 tubes met ongekleurd, PE-Cy7, PE, FITC, en APC. Voeg 100 µ L van het bevlekken buffer, 1 µ L van bloed, en 1 µ L van het respectieve antilichaam aan de geëtiketteerde buizen toe om de cellen te bevlekken.
- Incubeer monsters om vlek voor 30 min bij kamertemperatuur in het donker.
- Was de monsters door toevoeging van 1 mL van de kleur buffer aan elke buis. Centrifugeer bij 800 x g voor 5 min bij kamertemperatuur. Verwijder de kleur buffer zorgvuldig zonder de pellet te verhullen.
- Voeg 300 µ L van kleuring buffer aan elke buis, meng mild, en de overdracht aan een FACS buis. Bewaar de gekleurde monsters in het donker tot geanalyseerd met een stroom cytometer.
5. flow Cytometry analyses van bloedplaatjes
-
Maak een nieuw experiment en het genereren van log vooruit Scatter VS log kant Scatter dot percelen en poorten toewijzen voor Ter119 PE-Cy7 (RBC), CD45 PE (WBC), CD41 FITC (bloedplaatjes), en CD62P APC (geactiveerde bloedplaatjes) populaties volgens de gating strategie gekozen voor de Experimenteer in de FACS DIVA software.
- Open de bevolkings hiërarchie door de optie populatie hiërarchie weergeven te kiezen onder het tabblad populaties . Bewerk de bevolkings hiërarchie door de gating strategie te controleren en de poorten goed te hernoemen.
- Open statistieken weergave door te kiezen voor Create Statistics View. Bewerk statistieken weergave op basis van gebruikersvoorkeuren door met de rechtermuisknop op de statistieken weergave te klikken en Statistieken weergave bewerkente selecteren.
- Kies een kleur voor elke poort die het visuele aspect van de lay-out verbetert door te dubbelklikken op de doos die overeenkomt met de bevolking.
- In het cytometer venster, klik op het tabblad parameters en pas de spanningen voor parameters om de bevolking van belang op de percelen te visualiseren.
- Pas de spanningen voor elk van de parameters, zodat de negatieve populatie kan worden onderscheiden van de positieve populatie. Controleer vóór het opnemen van de monsters voor de compensatie controle of de enkelvoudige bevlekte positieve controles op schaal zijn (zorg ervoor dat de positieve pieken zichtbaar zijn en niet te ver naar rechts).
Opmerking: Als de positieve pieken zijn uit schaal, de spanningen moeten worden aangepast aan de positieve populaties te zien. - Noteer de gekleurde cellen met één kleur voor compensatie controles (ongekleurd, PE-Cy7, PE, FITC en APC).
- Als de positieve controlepoorten zijn niet goed ingesteld, passen ze door het veranderen van spanningen.
- Ga naar Experiment ≫ compensatie-instellingen ≫ compensatie berekenen. Kies alleen toepassen in het resulterende venster.
- Schakel over naar het globale werkblad door op de wisselknop boven aan de linkerkant van het werkbladvenster te klikken.
- Laad de positieve controlemonster en het verwerven van voldoende cellen om de compensatie en de poorten aan te passen.
- Laad het monster opnieuw en controleer of elke plot de verwachte populatie op basis van de fluorochrome gekleurd antilichaam toont. Verwerven en registreren 100.000 evenementen voor hele bloedmonsters en 10.000 evenementen voor gezuiverde bloedplaatjes. Laad de monsters een voor een tot de overname is voltooid.
- Analyseer de flow Cytometry gegevens met de software met de juiste percelen en poorten (Figuur 3)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De samenvatting van de bloed plaat zuivering wordt beschreven in een stroomdiagram (Figuur 1). De stappen omvatten inzameling van bloed van muis gebruikend het retro-orbitale aftappen in aanwezigheid van een antistollings, toevoeging van bloedsteekproef op het iohexol gradiënt middel, centrifugeren in een slingerende emmer rotor bij 400 x g 20 min bij 20 °c. De kwaliteit van de gezuiverde bloedplaatjes werd geëvalueerd met microscopie en Stroom Cytometry na het bevlekken met antilichaam om om het even welke vervuilende cellen en geactiveerde bloedplaatjes te ontdekken.
De iohexol gradiënt medium en het bloedmonster gevormd twee afzonderlijke lagen in de buis als het bloed werd langzaam toegevoegd op het medium (Figuur 2a). Echter, als er vertraging in deze stap, kan het grootste deel van het bloedmonster diffuse in het medium en het kan moeilijk zijn om de bloedplaatjes te zuiveren. De Wide-boring pipet uiteinden verzekerden geen fysieke spanning aan de bloedplaatjes die voor het handhaven van integriteit van de bloedplaatjes belangrijk is en hun degradatie verhinderen. Tijdens de centrifuge, langzame acceleratie hielp voorkomen dat onbedoeld mengen van het bloedmonster met iohexol medium en langzame vertraging geholpen handhaven van de gradiënt na centrifugeren. De top (stro kleur) laag bevatte het plasma en bevatte geen soorten van intacte bloedcellen, de tweede laag (wit) uit de top bevatte meerderheid van de bloedplaatjes die werd verzameld met behulp van een Wide-boring pipet tip, de derde laag (transparant) werd bloedplaatjes armen die deels zorgvuldig werd verzameld om aspiratie van de onderste laag (rood) RBC en WBC (Figuur 2b) te voorkomen. De bloedplaatjes-rijke laag en bloedplaatjes arme laag kon niet worden gezien gescheiden als het aantal bloedplaatjes waren laag in het bloedmonster. De RBC en WBC laag kon niet worden gezien als aparte lagen, omdat het bloedvolume klein was. Echter, WBC vormt een witte laag, genaamd Buffy jas tussen bloedplaatjes arme laag en RBC laag als een groter volume van het bloed wordt gebruikt voor de zuivering10, 11. Het is belangrijk om de gehele procedure bij 18 tot 22 °C uit te voeren. Zowel de hogere temperatuur en de koeling van de monsters leverde een lagere bloedplaatjes als gevolg van degradatie.
We vonden 18,2 tot 38,5% (27,1 ± 6,5%, n = 12) herstel/opbrengst van de gezuiverde bloedplaatjes. Om hun levensvatbaarheid te onderzoeken, werden de gezuiverde plaatjes monsters geactiveerd met trombine. Flow flowcytometrische analyse van bloedplaatjes monsters werden gedaan na kleuring met de markers voor bloedplaatjes, geactiveerde bloedplaatjes, RBC, en WBC. Het hele bloed toonde verschillende populaties van RBC, WBC, en bloedplaatjes op een logaritmische voorwaartse Scatter VS kant Scatter dot plot (Figuur 3a), terwijl de gezuiverde bloedplaatjes toonden een aparte populatie met verwaarloosbare aantallen van RBC en WBC (Figuur 3b ). Het hele bloed toonde RBC en WBC na kleuring ze met anti-muis Ter119 en anti-Mouse CD45 antilichaam (figuur 3c), terwijl de gezuiverde bloedplaatjes bleek verwaarloosbaar aantal RBC en WBC (figuur 3D). We evalueerden de gezuiverde bloedplaatjes monster met een microscoop en zag geen significant aantal intacte RBC en WBC. Daarom, de RBC en WBC gebeurtenissen die werden getoond in figuur 3D zou kunnen worden de FRAGMENTEN van RBC en WBC met TER119 en CD45, respectievelijk. De gezuiverde bloedplaatjes die niet met trombine werden behandeld toonden bijna geen activering die op hun rustende staat wijst (figuur 3e), terwijl de gezuiverde bloedplaatjes die met trombine worden behandeld toonden 71% activering (tot 93% de activering werd waargenomen in sommige steekproeven) ( Figuur 3F) die hun levensvatbaarheid aangeven. We hebben ook uitgevoerd microscopische evaluatie van gezuiverde bloedplaatjes monsters niet behandeld met trombine die geen plaatjes aggregatie toonde (figuur 4a), echter, gezuiverde bloedplaatjes gevormd aggregaten na te zijn behandeld met trombine (figuur 4b), die hun levensvatbaarheid verder aangeven. Gebaseerd op flow flowcytometrische en microscopische studies, hebben we bevestigd dat onze gezuiverde bloedplaatjes waren van goede kwaliteit.
Figuur 1: Schematisch diagram voor de zuivering van de muis plaatjes. Bloedmonster van de muis wordt verzameld in de aanwezigheid van een antistollings. Het bloedmonster wordt langzaam toegevoegd op de Iohexol gradiënt medium en centrifugeren bij 400 x g voor 20 min bij 20 ° c. De bloedplaatjes laag wordt overgebracht naar een nieuwe buis. De kwaliteit van de gezuiverde bloedplaatjes wordt gecontroleerd met microscopie en flow Cytometry. De bloedplaatjes kunnen onmiddellijk worden gebruikt of worden opgeslagen bij-80 °C. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2:. Muis bloed voor en na centrifugeren met Iohexol gradiënt medium. (A) Iohexol en bloedvorm twee afzonderlijke lagen vóór centrifugeren indien het bloedmonster wordt toegevoegd zorgvuldig. Het linkerpaneel toont schematisch diagram en het juiste paneel toont het daadwerkelijke beeld. (B) vier afzonderlijke lagen worden gezien na centrifugeren van geheel bloed met gradiënt middel. Linker paneel toont schematische diagram van de lagen en rechter paneel toont de werkelijke afbeelding. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: flow flowcytometrische analyse van gezuiverde bloedplaatjes. (A) hethele bloed toont RBC, WBC, en bloedplaatjes populaties. (B) gezuiverde bloedplaatjes tonen kleine aantallen RBC en WBC evenementen. (C) het gehele bloed toont RBC en WBC na het bevlekken met anti-muis Ter119 en anti-muis CD45. (D) gezuiverde bloedplaatjes tonen te verwaarlozen aantal RBC en WBC gebeurtenissen na kleuring met anti-muis Ter119 en anti-muis CD45. (E) gezuiverde bloedplaatjes gekleurd met anti-muis CD41 en anti-muis/mens P-selectine tonen bijna geen activering van bloedplaatjes. (F) gezuiverde bloedplaatjes behandeld met trombine en bevlekt met anti-muis CD41 en anti-muis/mens P-selectine Toon activering van bloedplaatjes. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: microscopische evaluatie van gezuiverde bloedplaatjes. Agezuiverde bloedplaatjes tonen geen aggregatie. (B) gezuiverde bloedplaatjes behandeld met trombine show aggregatie. Beide figuren zijn 200 x vergroting, oculaire lens 10x en objectief 20x objectief. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vaak worden bloedplaatjes geïsoleerd door lage snelheid centrifuges die bloedplaatjes-rijk plasma dat een aanzienlijk aantal bloedcellen, cellulaire puin, en plasma-eiwitten die kunnen interfereren met de biochemische en fysiologische analyses en behoeften bevat verdere reiniging21. Daarom is het belangrijk om een snelle en eenvoudige methode te gebruiken die zuivere bloedplaatjes zonder belangrijke verontreinigende stoffen kan opleveren. Het protocol hier gepresenteerd beschrijft de zuivering van bloedplaatjes van muis bloed met behulp van een gradiënt medium met lage snelheid centrifugeren. De parameters die in dit protocol worden gebruikt maximaliseren de opbrengst en minimaliseren de afbraak van bloedplaatjes. De gradiënt medium en plasma-eiwitten kunnen worden verwijderd door het opnemen van een wassen stap na de bloedplaatjes collectie die de gevoeligheid van de bloedplaatjes kan verhogen tot agonist of antilichaam. Belangrijker nog, de gezuiverde bloedplaatjes zijn in rusttoestand, maar ze kunnen worden geactiveerd in de aanwezigheid van een agonist, zoals trombine. We hebben geconstateerd dat trombine activiteit varieert van de ene bron naar de andere. Daarom moet trombine concentratie empirisch worden geoptimaliseerd om een goede activatie van bloedplaatjes te verkrijgen.
Door een klein volume van de muis bloed, is het lastig om bloedplaatjes te zuiveren, omdat bloedplaatjes kunnen worden gemengd met RBC en WBC tijdens aspiratie. We hebben dit probleem opgelost door het optimaliseren van de verhouding van bloedmonster en gradiënt medium. We hebben geconstateerd dat drie-voudige meer gradiënt medium ten opzichte van het bloedvolume kan duidelijk scheiden van de bloedplaatjes laag van het serum en RBC-WBC lagen die gemakkelijk verzamelen van zuivere bloedplaatjes vergemakkelijkt.
De zuivering van bloedplaatjes moet worden uitgevoerd bij kamertemperatuur tussen 18 en 22 °C om hun afbraak te voorkomen. Het is gemeld dat bloedplaatjes afgebroken indien opgeslagen in de koelkast of temperaturen boven 27 ° c11. Snel pipetten en krachtig schudden moet worden vermeden om bloedplaatjes degradatie te voorkomen tijdens de reiniging. Aangezien de verschillende centrifuges verschillende programma's hebben, zou de versnelling/de vertraging empirisch moeten worden bepaald om de gradiënt te handhaven.
Als er meerdere muizen bloedmonsters worden gebruikt in de zuivering, het bloeden moet worden gedaan in minder dan 1 uur en de zuivering moet worden voltooid binnen 1 uur. Als bloedmonsters worden overgelaten voor meer dan 2 uur, kunnen bloedplaatjes niet worden gezuiverd als gevolg van hun afbraak. Als er meer bloedplaatjes nodig zijn voor een studie, kan de muis bloed worden verzameld door Terminal procedures zoals cardiale punctie of inferieure Vena Cava bloeden, die 800 tot 1.000 µ L bloed, en de bloedplaatjes zuivering moet worden uitgevoerd in meerdere buizen en gecombineerd na reiniging.
Samenvattend, hebben wij een eenvoudig en snel protocol voor bloedplaatjes reiniging van een klein volume van muis bloed beschreven. Deze methode kan ook worden gebruikt voor de zuivering van bloedplaatjes van andere soorten ook. De gezuiverde bloedplaatjes kunnen worden gebruikt voor genexpressie, activering en granule release, aggregatie, en adhesie assays bij stimulatie met verschillende agonisten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een start-up financiering van Cincinnati Children's Research Foundation en een universiteit van Cincinnati pilot translationele Grant aan M.N. We willen graag de Cincinnati Children's Hospital Research flow Cytometry core bedanken voor hun diensten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin) | Thermoscientific | 17-0626-82 | Platelets activation marker |
| Eppendorf tube | Fisher Scientific | 14-222-166 | Tube for centifuge |
| FACS DIVA software | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FACS tube | Fisher Scientific | 352008 | Tubes for flow cytomtery |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | Ingredient for staining buffer |
| FITC rat anti-mouse CD41 | BD Biosciences | 553848 | Platelets marker |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FlowJo software | FlowJo, Inc. | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) | EMD Millipore | 03-34-0001 | Prevent platelet clot formation |
| Hematocrit Capillary tube | Fisher Scientific | 22-362566 | Blood collection capillary tube |
| Hemavet | Drew Scientific | Non-catalog item | Blood cell analyzer |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | Cell counting chamber |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Use to Anesthetize mouse |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Nycodenz (Histodenz) | Sigma-Aldrich | D2158 | Gradient medium |
| PE rat anti-mouse CD45 | BD Biosciences | 561087 | WBC marker |
| PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119 | BD Biosciences | 557853 | RBC marker |
| Pipet tips 200 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-1A | Transferring blood and platelet samples |
| Pipet tips 1000 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-2C | Transferring blood and platelet samples |
| Phosphate buffured saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14040-117 | Buffer for washing and dilution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Physiological saline |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | 02-688-26 | Anti-coagulant |
| Staining buffer | In-house | Non-catalog item | Wash and dilution buffer |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | Solvent |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Swinging bucket rotor centrifuge |
| Thrombin | Enzyme Research Laboratoty | HT 1002a | Platelet activation agonist |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | Buffer for Nycodenz medium |
References
- de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Insights into platelet-based control of coagulation. Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).
- Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E. Interpreting the developmental dance of the megakaryocyte: a review of the cellular and molecular processes mediating platelet formation. British Journal of Haematology. 165 (2), 227-236 (2014).
- Weyrich, A. S., Zimmerman, G. A. Platelets: signaling cells in the immune continuum. Trends in Immunology. 25 (9), 489-495 (2004).
- Nami, N., et al. Crosstalk between platelets and PBMC: New evidence in wound healing. Platelets. 27 (2), 143-148 (2016).
- Mancuso, M. E., Santagostino, E. Platelets: much more than bricks in a breached wall. British Journal of Haematology. 178 (2), 209-219 (2017).
- Hampton, T. Platelets' Role in Adaptive Immunity May Contribute to Sepsis and Shock. Journals of the American Medical Association. 319 (13), 1311-1312 (2018).
- Sabrkhany, S., Griffioen, A. W., Oude Egbrink, M. G. The role of blood platelets in tumor angiogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1815 (2), 189-196 (2011).
- Menter, D. G., et al. Platelet "first responders" in wound response, cancer, and metastasis. Cancer and Metastasis Reviews. 36 (2), 199-213 (2017).
- Fink, L., et al. Characterization of platelet-specific mRNA by real-time PCR after laser-assisted microdissection. Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 749-756 (2003).
- Trichler, S. A., Bulla, S. C., Thomason, J., Lunsford, K. V., Bulla, C. Ultra-pure platelet isolation from canine whole blood. BioMed Central Veterinary Research. 9, 144 (2013).
- Ford, T. C., Graham, J., Rickwood, D. A new, rapid, one-step method for the isolation of platelets from human blood. Clinica Chimica Acta. 192 (2), 115-119 (1990).
- Noisakran, S., et al. Infection of bone marrow cells by dengue virus in vivo. Experimental Hematolology. 40 (3), 250-259 (2012).
- Rickwood, D., Ford, T., Graham, J. Nycodenz: a new nonionic iodinated gradient medium. Analytical Biochemistry. 123 (1), 23-31 (1982).
- Graham, J. M., Ford, T., Rickwood, D. Isolation of the major subcellular organelles from mouse liver using Nycodenz gradients without the use of an ultracentrifuge. Analytical Biochemistry. 187 (2), 318-323 (1990).
- Milligan, G. N., et al. A lethal model of disseminated dengue virus type 1 infection in AG129 mice. Journal of General Virology. 98 (10), 2507-2519 (2017).
- Strassel, C., et al. Lentiviral gene rescue of a Bernard-Soulier mouse model to study platelet glycoprotein Ibbeta function. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (7), 1470-1479 (2016).
- Bergmeier, W., Boulaftali, Y. Adoptive transfer method to study platelet function in mouse models of disease. Thrombosis Research. 133, S3-S5 (2014).
- Bakchoul, T., et al. Recommendations for the use of the non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency mouse model in autoimmune and drug-induced thrombocytopenia: communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (5), 872-875 (2015).
- Aurbach, K., Spindler, M., Haining, E. J., Bender, M., Pleines, I. Blood collection, platelet isolation and measurement of platelet count and size in mice-a practical guide. Platelets. , 1-10 (2018).
- Jirouskova, M., Shet, A. S., Johnson, G. J. A guide to murine platelet structure, function, assays, and genetic alterations. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), 661-669 (2007).
- Birschmann, I., et al. Use of functional highly purified human platelets for the identification of new proteins of the IPP signaling pathway. Thrombosis Research. 122 (1), 59-68 (2008).
