Summary
מתוארים כאן היא שיטה פשוטה לטיהור של מוצר הגן ב סטרפטוקוקוס מויזוף. טכניקה זו עשויה להיות יתרון על טיהור של חלבונים, בעיקר חלבונים הממברנה וחלבונים המוניים גבוה המולקולרי, והוא יכול לשמש עם מינים שונים חיידקים אחרים.
Abstract
ההסבר של הפונקציה של הגן בדרך כלל כרוך השוואה של תכונות פנוטיפ של זנים סוג פראי וזנים שבו הגן של העניין שובשו. אובדן של פונקציה בעקבות הפרעה גנטית שוחזר לאחר מכן על ידי תוספת אקסודוגני של המוצר של הגן שיבש. זה עוזר לקבוע את התפקיד של הגן. שיטה שתוארה בעבר כרוכה ביצירת מתח Gtfc שיבש סטרפטוקוקוס השיזוף . כאן, שיטה בלתי תובענית מתוארת לטיהור המוצר הגנטי Gtfc מן המתח החדש שנוצר בעקבות הפרעה גנטית. זה כרוך תוספת של רצף polyhistidine-קידוד בסוף 3 ′ של הגן של עניין, אשר מאפשר טיהור פשוט של המוצר הגן באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה מתכת ללא קיבוע. אין תגובות אנזימטיות מלבד ה-PCR נדרשים לשינוי גנטי בשיטה זו. השחזור של מוצר הגן על ידי התוספת אקסוסוגני לאחר הפרעה גנטית היא שיטה יעילה לקביעת פונקציה גנטית, אשר עשוי גם להיות מותאם למינים שונים.
Introduction
ניתוח של הפונקציה של הגן בדרך כלל כרוך השוואה של תכונות פנוטיפ של זנים מסוג פראי לזנים בהם הגן של העניין שובשו. ברגע שהוא מופק זן גנטי, תוספת אקסוגני של המוצר הגן מאפשר שיקום פונקציונלי.
השיטה הנפוצה ביותר להשגת מוצרי גנים מטוהרים הנדרשים עבור שחזור שלאחר השחזור הוא על ידי ביצוע ביטוי הטרוולוגי בשנת הכלאיים קולי1. עם זאת, הביטוי של חלבונים הממברנה או חלבונים מסה גבוהה המולקולרי הוא לעתים קרובות קשה באמצעות מערכת זו1. במקרים אלה, חלבון היעד מבודד בדרך כלל מן התאים המהווה באופן מקורי את החלבון באמצעות סדרה מורכבת של צעדים, אשר עשוי להוביל לאובדן מוצר הגן. כדי להתגבר על בעיות אלה, הליך פשוט פותחה עבור טיהור מוצר גנטי בעקבות הפרעה גנטית שיטה2, pcr מבוססי DNA שילוב שיטה3 (המיועד היתוך שני שלבים PCR), ו אלקטרופורציה גנטית טרנספורמציה בתוך סטרפטוקוקוס. תוספת של תג polyhistidine (שלו-tag) כדי C-הטרמינוס של המוצר הגן מקלה על טיהור שלה על ידי קיבוע מתכת כרומטוגרפיה של זיקה (IMAC).
כדי לבודד את הטאג ' שלו-הבעת מאמץ, את ה-DNA כל גנומית של הגן של עניין (בתוך זה שלו-tag-הבעת זן גן שיבשו) מוחלף גנים סמן אנטיביוטי עמידים. ההליך ליצירת התגים שלו-ביטוי שהוניס כמעט זהה לזה ליצירת זן גנים שיבשו כפי שמתואר קודם לכן4,5. לכן, השיטות עבור שיבוש גנים ובידוד המוצר הגנטי יש לבצע כניסויים סדרתיים עבור ניתוח פונקציונלי.
בעבודה הנוכחית, רצף polyhistidine-קידוד מצורף לקצה של 3 ′ של Gtfc (מקום genbank תג SMU_1005) גן, קידוד glucosyltransferase-SI (gtfc-si) ב S. מוסטנים6. לאחר מכן, בוצעו לימודי ביטויים במינים מסוג streptococcal. השגת ביטוי הטרוולוגי ב- E. coli קשה, כנראה בגלל המסה המולקולרית הגבוהה של gtfc-SI. הנבגהזה נקרא . אס. תרשים סכמטי המתאר את הארגון של ה- gtfc וspectinomycin ההתנגדות הגנטית( spcr)7 הבית בסוג פראי . מוסטנים והנגזרים שלו מוצג ב איור 1. GTF-SI הוא חלבון הסוד שתורם להתפתחות של ביוגניים שיניים מקרגני6. תחת נוכחותו של סוכרוז, הארגון משקיף על משטח זכוכית חלק במתח של WT, אבל לא ב-s. המתח המובש(Δ gtfc)2,5 . היווצרות ביוגניים משוחזר ב -S. mutans gtfc בתוספת אקסוגני של רקומביננטי gtfc-SI. המתח, S. mutans שלו-gtfc, משמש לאחר מכן כדי לייצר את gtfc-SI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: דור של S. mutans gtfc, שבו כל אזור הקידוד של הג gtfc מוחלף עם spcr, יש להשלים לפני ביצוע פרוטוקולים אלה. עיין במאמר המתפרסם לקבלת פרטים על דור5.
1. פריימר עיצוב
-
הכן את התחל לבניית S. מוסטנים שלו-gtfc.
הערה: הרצפים הפריימר המשמשים בפרוטוקול זה מוצגים בטבלה 1. שיטת ה-PCR של שני השלבים עבור הדור של S. מוזטאן שלו-gtfc מומחש באיור 2.- עיצוב התחל (gtfc-הפוכה ו- spcr-קדימה) עבור הקובץ המצורף שלו-תג-קידוד רצף, מהתערב בין הגנים gtfc ו- spcr (איור 2a).
- כלול מקשר GS ו-תג שלו-coding רצף לתוך שניהם Gtfc-הפוכה ו spcr-קדימה התחל, שבו 24 בסיסים באזורים 5 ' משלימים אחד את השני.
הערה: רצף חומצת האמינו של GS המקשר והתג שלו (בסדר-בסדר-מאוד-מאוד-שלו-שלו-שלו-שלו) מחובר ל-C הטרמינוס של GTF-SI באמצעות תרגום גנטי. - עיצוב gtfc-קדימה לכוון את הגן Gtfc ב -S. מוסטטאן הגנום > 1 kb במורד הגן ו- spcr-הפוך פריימר למקד את אזור במורד הזרם של spcr ב -S. מוסטנים ∆gtfc. הגדר את טמפרטורת ההיתוך8 (Tm) של gtfc-קדימה ו- spcr-הפוך התחל להתאים עם טמפרטורות ההיתוך של gtfc-הפוכה ו- spcr- התחל קדימה, בהתאמה.
- כלול מקשר GS ו-תג שלו-coding רצף לתוך שניהם Gtfc-הפוכה ו spcr-קדימה התחל, שבו 24 בסיסים באזורים 5 ' משלימים אחד את השני.
- עצב צבעי יסוד מקוננים (מקוננים קדימה והפוך מקונן) עבור ה-PCR השני (איור 2B).
- עיצוב התחל (Gtfc-קדימה והמושבה-הפוך) מיוחד עבור ה-DNA הגנומי של הטרנספורנט (איור 2c; התחל משמש למושבה ה-PCR).
הערה: הגברה על הגבול בין Gtfc ו- spcr. ניתן להחיל את התחל הקדמי של Gtfcבתור התחל הקדמי. - עיצוב התחל (למעלה-קדימה ולמטה לאחור) לקבלת אישור סופי של הדור של ס. מוסיקה שלו-gtfc (איור 2c; מוצר ה-PCR המוגדל על ידי התחל משמש לרצפי DNA).
- עיצוב התחל (gtfc-הפוכה ו- spcr-קדימה) עבור הקובץ המצורף שלו-תג-קידוד רצף, מהתערב בין הגנים gtfc ו- spcr (איור 2a).
2. הפקת דנ א גנומית מ -S. מוסטנים
הערה: מאמץ של כל S. מוסטנים צריך להיות מתורבת בינוני בלב המוח (bhi) בינונית ב 37 ° c בתנאים אנאירובית. זנים מוטציה של s. מוסטנים ∆Gtfc ו ס מוסטנים שלו-gtfc הם מתורבתים ב bhi בתוספת עם 100 μg/mL spectinomycin.
- פס s. mutans WT ו -s. מוסטנים ∆gtfc בנפרד על כל הצלחות bhi אגר. מודאת אותם הלילה. ב-37 ° c
- בחר מושבות יחיד של s. mutans WT או s. מוסטנים ∆gtfc באמצעות קיסם שיניים מעוקר לתוך 1.5 mL של ציר bhi. מודאת אותם הלילה. ב-37 ° c
הערה: ניתן להשתמש במושבות כמקור ל-DNA של תבנית עבור ה-PCR הראשון (שלב 3.1). - העבר 1 מ ל של כל תרבות בקטריאלי לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. צנטריפוגה את התרבות עבור 1 דקות ב 15,000 x g.
- הסר את supernatant ולהוסיף 1 מ ל של מאגר טריס-EDTA (pH 8.0) כדי להשעות מחדש את הגלולה התא.
- צנטריפוגה את ההשעיה עבור 1 דקות ב 15,000 x g. . הסר את הסופרנטאנט להשעות מחדש את הגלולה תא ב 50 μL של מאגר טריס-EDTA (pH 8.0).
- לחמם את ההשעיה באמצעות אינקובטור בלוק עבור 5 דקות ב 95 ° c. צנטריפוגה את ההשעיה עבור 5 דקות ב 15,000 x g.
- העבר את הסופרנטאנט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 mL (הסופרנטאנט ישמש כ-DNA תבנית עבור ה-PCR הראשון).
3. הגברה של הPCR
הערה: טבלה 1, טבלה 2 ושולחן 3 מסכמים את מחזורי התחל, הריאגנטים והגברה של ה-PCR, בהתאמה.
- לבצע את ה-PCR הראשון באמצעות s. mutans WT ו -s. מוסטנים ∆gtfc הגנום כמו תבניות ה-PCR. הגבר את האזורים המהווים מחסה לחלק הזרם של גן Gtfc ואלה המהווים מחסה ב- spc באמצעות התחל המתואר בשלב 1.1.1.2 (איור 2a).
- כל מוצר של ה-PCR ב-1% העלה ג'ל. בלו את שברי ה-DNA הרצויים של כ 1,000 bp ו 2,000 bp. לטהר את השברים מן הג באמצעות ממברנה סיליקה מבוססי ג'ל שיטת החילוץ.
הערה: ההליכים הבסיסיים של PCR9, ה-dna ג'ל אלקטרופורזה10, ו-DNA טיהור11 מפורטים במקום אחר. - לבצע ה-PCR השני באמצעות המוצרים של ה-PCR הראשון (כ equimolar) כמו תבניות PCR עם ההתחלה המקוננת קדימה והמקוננת הפוכה (איור 2B).
- אלקטרופורסה עשירית מתערובת ה-PCR על ג'ל הצמח. לאשר את הדור של אמפליקון המתאים של כ 3,000 bp.
-
מזרז את מוצר ה-PCR הנותר.
הערה: הטיהור של מוצר ה-pcr אינו הכרחי, משום שהגברה שאינה ספציפית שנוצרת על ידי ה-pcr השני אינה מפריעה לשילוב מחדש של הומוולוגי.- הוסף nuclease-מים חינם לתערובת ה-PCR ולהביא את הנפח הכולל ל 100 μL, ואחריו 0.1 נפח (10 μL) של 3 מז נתרן אצטט (pH 5.2) ו 2.5 אמצעי אחסון (250 μL) של אתנול מוחלט. לערבב ולאחסן את התערובת עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- צנטריפוגה את המדגם עבור 20 דקות ב 15,000 x g ב 4 ° c. . מחק את הסופרנטאנט להוסיף 1 mL של 70% אתנול כדי לשטוף את הגלולה DNA.
- צנטריפוגה את המדגם עבור 5 דקות ב 15,000 x g ב 4 ° c. . מחק את הסופרנטאנט האוויר יבש ולפזר את הגלולה DNA עם 10 μL של nuclease-מים ללא תשלום.
4. המרת תאים
- הכנת המוצרים המוסמכים של s. mutans כדי להציג את מוצר ה-PCR השני על-ידי ביצוע השלבים המתוארים בפרסום הקודם5. אחסן את התאים בשעה-80 ° c.
הערה: לניסוי זה, התאים המוסמכים s. mutans WT כבר נשמרו ב-80 ° c כדי לייצר S. מוסטנים ∆gtfc. - מערבבים 5 μl של המוצר השני מרוכז PCR כדי 50 μl סדרת מחלקים של תאים קר קרח מוסמך קפואים בעבר. הוסיפו את התערובת לתוך כימיקלים אלקטרופורציה. לתת פולס חשמלי יחיד (1.8 kV, 2.5 ms, 600 Ω, 10 μF) לתאים באמצעות מנגנון אלקטרופורציה.
- השהה מחדש את התאים ב-500 Μi של ציר BHI. מיד, להפיץ 10 – 100 μL של ההשעיה אל BHI אגר צלחות המכילות spectinomycin. מודיית את הצלחות עבור 2 – 6 ימים ב 37 ° צ' עד המושבות גדלו מספיק כדי לקבל.
5. אימות של GEnome שילוב ואחסון
- בצעו את המושבה ה-PCR באמצעות gtfC-פורוורד והמושבה-היפוך התחל על המסך עבור השילוב החוזר. אלקטרופורז כל מושבה מתוצרת ה-PCR על ג'ל שנוצר. אשר את רסיס ה-DNA של כ 1,500 bp.
- בחר אחת המושבות החיוביות באמצעות קיסם ומתת תת התאים הלילה ב 2 מ ל של ציר BHI המכיל spectinomycin.
- מערבבים 0.8 mL של התרבות החיידקית עם 0.8 mL של מערך סטרילי 50% גליצרול ומלאי ב-80 ° c או-20 ° c.
- העבר את הנותרים 1 mL של השעיית התא לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. חזור על שלבים 2.3 – 2.7 כדי לחלץ את ה-DNA גנומית מן התאים.
- לבצע ה-PCR באמצעות למעלה-קדימה ולמטה לאחור ולמטה DNA גנומית כתבנית. חזור על שלב 3.2 כדי לטהר את מוצר ה-DNA הוגבר מן הג.
- לקבוע את רצף ה-dna של אמפליקון מטוהרים על ידי רצפי DNA.
הערה: הקפד לאשר את הדור של ה-S. השיזוף שלו-gtfc על ידי רצפי DNA.
6. טיהור של פוליהיסטידין-מתויג GTF-SI
- פס המכיל את ה -gtfc שלו לצלחת מspectinomycin המכילה את הלוח bhi אגר. מודאת אותם הלילה. ב-37 ° c
- להרים מושבה אחת באמצעות שיניים מעוקר ותאי תת-תרבות ב 3 מ ל של ציר BHI. המלון משלב בין לילה ב-37 ° c.
- להכין שני מבחנות חרוט עם 1 L של ציר BHI ללא spectinomycin. החזר 1 מ ל של תרבות הלילה ההשעיה לתוך 1 L של ציר BHI. המלון משלב בין לילה ב-37 ° c.
- לרכז חלבונים מן התרבות על ידי משקעים אמוניום גופרתי.
הערה: לחלץ מגופי תא אם חלבון היעד הוא תאיים. ההליכים הבסיסיים עבור משקעים אמוניום גופרתי מפורטים במקומות אחרים12.- צנטריפוגה את השעיית התרבות החיידקית במשך 20 דקות ב-10,000 x g ב -4 ° c. לשחזר את התרבות הסופרנטית לתוך מיכל זכוכית 3 L.
- הוסף 1,122 גרם של אמוניום גופרתי ל -2 ליטר של סופרנאטנט (80% רוויה) עם ערבוב נמרץ באמצעות מערבב מגנטי. הניחו לזרז להיווצר 4 שעות או יותר ב -4 ° c עם ערבוב.
הערה: ניתן להמשיך את היווצרות הזרז למשך הלילה. - צנטריפוגה את הפתרון אמוניום סולפט-זירז ב 15,000 x g עבור 20 דקות ב 4 ° c. . בסדר.
- לאסוף את הזרז עם מרית ולהעביר לתוך גביע זכוכית 200 mL. השהה מחדש את כדורי 35 mL של מאגר כריכה (50 mM נה2PO4, 300 מ"מ הנאל, 5 מ"מ הסרביאזול, pH 8.0).
- Dialyze ההשעיה נגד 2,500 mL של מאגר הכריכה באמצעות צינור דיאליזה שנוצר מחדש התאית, ב 4 ° c, עם ערבוב. החליפו את פתרון הדיאליזה לאחר 2 שעות והמשיכו בדיאליזה לילה.
- החלף שוב את פתרון הדיאליזה. המשך לdialyze עבור 2 שעות נוספות.
- צנטריפוגה את ההשעיה דיאליזה ב 20,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. מסננים את הסופרנטנט דרך מסנן קרום באמצעות ציוד סינון יניקה. העבר את פילטרט לבקבוקון 75 ס מ2 .
- אנגיופלסטיקה הפוליהיסטידין-מתויג GTF-SI מההשעיה המלאכותית על ידי קיבוע כרומטוגרפיה של זיקה מתכת (IMAC).
- העברה 2 מ ל של משקע ה-IMAC הטעון Ni (כ-1 מ ל שרף) ועד לטור כרומטוגרפי שהפורקן שלו מותאם לצינור סיליקון. הסר את פתרון האחסון על-ידי זרימת כבידה.
זהירות: אל תאפשר שרף להתייבש ברחבי IMAC. - הוסף 3 מ ל של מים מזוקקים לתוך הטור כדי לשטוף את שרף. הוסף 5 מ ל של מאגר הכריכה כדי לבטלת את השרף.
- תכבה את הזרם. עם הזין של הופמן הוסף 5 מ ל של ההשעיה מסוננים משלב 6.5 כדי להפוך את השאיפה.
- מוסיפים את כל השאיפה להשעיה המסוננת הנותרת. מערבולת בעדינות את התערובת למשך 30 דקות ב -4 ° c.
- העמיסו את התערובת בחזרה על הטור. להסיר את ההשעיה על ידי זרם הכבידה. שטוף את שרף ה-IMAC עם 20 מ ל של מאגר מחייב.
הערה: להתאים את קצב הזרימה כ 2 מ ל/דקה עם הזין קמצוץ הופמן לאורך ה-IMAC הבא. - אליוט רקומביננטי GTF-SI עם 20 מ ל של מאגר להתחמק (50 mM נה2PO4, 300 מ"מ הנאל, 500 מ"מ הסרמאזול, pH 8.0).
הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. יש לאחסן את החומק ב-4 ° c. שרף IMAC ניתן לשימוש חוזר. עיין בהוראות של שרף ה-IMAC.
- העברה 2 מ ל של משקע ה-IMAC הטעון Ni (כ-1 מ ל שרף) ועד לטור כרומטוגרפי שהפורקן שלו מותאם לצינור סיליקון. הסר את פתרון האחסון על-ידי זרימת כבידה.
- החלף את מאגר האגירה עם מאגר האחסון (מאגר פוספט 50 מ"מ, pH 6.5) ורכז את הפתרון רקומביננטי GTF-SI כ-1 mL באמצעות יחידת אולטרה-מיון צנטריפוגליים. אחסן את התמיסה הרקומביננטי GTF-SI ב -4 ° c.
הערה: לאשר את polyhistidine-מתויג GTF-SI טיהור באמצעות SDS-עמוד13 ו בלוק מערבי14 על ידי שימוש בחזרת peroxidase-מעלה מעלה אנטי פוליהיסטידין נוגדן חד שבטיים. תוספת של בחורים (ריכוז סופי, 0.1%) כדי למנוע את הצורך להימנע ספיחה ספציפי ליחידה, בהתאם חלבון היעד.
7. שחזור פונקציונלי על ידי רקומביננטי GTF-SI
- רצף כל s. mutans המתח על צלחת bhi אגר בנפרד. מודאת הצלחות לילה. ב-37 ° c
- באמצעות קיסם שיניים מעוקר, לאסוף מושבה אחת כדי לחסן ל 2 מ ל של ציר BHI. המלון משלב בין לילה ב-37 ° c.
- השתמש 20 μL של תרבות הלילה של S. mutans gtfc כדי לחסן 2 מ ל של ציר bhi המכיל 1% סוכרוז ללא אנטיביוטיקה בצינור מבחן זכוכית. הוסף את GTF-SI או נפח שווה ערך של הרכב ל -S. mutans gtf תרבות, ותרבות את התאים עם הצינור ממוקם בתנוחה נוטה לילה.
הערה: לחטא את הפתרון GTF-SI עם פילטר מזרק סטרילי ולקבוע ריכוז חלבונים באמצעות שימוש בחלבון חומצות בתוך שיטת הפרוטאין15 לפני השימוש. - מתפרעים את השעיות בתרבות עם מערבל מערבולת במשך 10 ס מ. הדנט את השעיות. רוחצים את צינורות הבדיקה בכמות מספקת של מים מזוקקים.
- הכתם את ביומאמים על קיר הצינור עם 1 מ ל של 0.25% Coomassie כחול מבריק (CBB).
- Decant הפתרון המכתים אחרי 1 דקות. שטוף את צינורות הבדיקה עם כמות מספקת של מים מזוקקים. . האוויר מתייבש את צינורות הבדיקה
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 3 מציג את הגודל של כל אמפליצין מ-pcr הראשון (איור 3a) ו-Pcr השני (איור 3a). הגודל של כל אמפליקון התכתב עם הגודל החזוי, כפי שמתואר בטבלה 1. איור 4A הופעות S. מושבות מוסדרות שינתה את המוצר השני של ה-PCR ומצופה בלוחות bhi אגר המכילים spectinomycin. מוצרי ה-PCR הושבה לאחר מכן הופעל על ג'ל הצמח (איור 4B). כל אמפליקון היה של הגודל החזוי, כפי שמתואר בטבלה 1. איור 5 מראה תמונות של sds-דף האבן החשופה המערבי. חלבון מטוהרים עם IMAC נצפתה כלהקה אחת על ידי SDS-PAGE (איור 5A). כתם מערבי בוצע באמצעות נוגדן אנטי polyhistidine כדי לוודא כי הלהקה נצפתה היה polyhistidine מתויג חלבון (איור 5B) של 160 kda. איור 6 מראה את היכולת הנגזרת של הכדאיות של כל ה-S. רק ש. מורדים ושאר החומות שלו-gtfc יכולים ליצור ביויונט מיוצר על קיר הצינור בנוכחות 1% סוכרוז. זה לא נצפה ב -S. מוסטטאן Δgtfc (איור 6a). עם זאת, התוספת של רקומביננטי GTF-SI שוחזר את היכולת היווצרות של הביוilm ב -S. מוסטנים Δgtf (איור 6b).
איור 1: ארגון הUA159 של Gtfc ו- spcr ב -S. מוסטטאן הגנום והנגזרים שלה. איור סכמטי של התגית שלו בין Gtfc ו- spcr. האורך של הגנים והפערים אינו מקנה מידה. הפנטגון מוצל: SMU_1004; פנטגון מוצק: SMU_1006. איור זה שונה מהפרסום הקודם2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אסטרטגיה ל-PCR בשני שלבים. איור סכמטי של S. מוסטנים . בניית הבניין שלו האורך של הגנים והפערים אינו מקנה מידה. אתרי הכריכה הפריימר בתבנית מצוינים על-ידי תבניות. (א) האזורים המהווים חלק מהגן gtfc בגנום s. mutans ו מחסה Spcr ב s. mutans gtfc הגנום היו מוגברת באמצעות ה-PCR הראשון. (ב) ה-PCR השני התבצע עם צבעי יסוד מקוננים באמצעות שני הקטעים שהיו מומצאים על-ידי ה-pcr הראשון כתבניות, ובניית DNA לשילוב מחדש של הומוולוגי הושגה. (ג) זן המוטציות נוצר על שילוב מחדש של הומוולוגי בחיידק. איור זה שונה מהפרסום הקודם2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אגבה ג'ל למוצרי PCR הראשון והשני. (א) מוצרים של ה-PCR הראשון של חלק של gtfC (gtfc; התמונה השמאלית) ואת האזור מחסה spcr (spcr; התמונה הנכונה) מוצגים. התמונה החד-אלקטרופיניטית מחולקת לתווית להקות הסמן. (ב) מוצגים מוצרי ה-PCR השני המוגדל בצבעי היסוד המקוננים. כל ראש חץ מציין את הגודל החזוי של כל מוצר PCR. M = סמן מולקולרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ה- PCR המושבה ליצירת הדור של הרשת. (א) המושבות האחרות שהפכו את מוצר ה -PCR השני מוצגות. מזהה המושבה מצוין על-ידי מספרים מוקפים בעיגול. (ב) אגג ג'ל למוצרי ה-PCR של המושבה. מספר הנתיב הקיפו את מזהה המושבה באיור 4A. M = סמן מולקולרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: אישור של polyhistidine-מתויג GTF-SI טיהור. (א) נציג תמונת עמוד מייצג sds. (ב) מוצג תמונת כתמי האבן המערבית המייצגת את הנציג. ממברנה ניטרותאית שעליה GTF-SI הועברה נחקר עם הperoxidase מעלה מעלה מעלה אנטי פוליהיסטידין נוגדן מונוטוני. מסגרות immunoreactive היו באמצעות תגובת כימית. ראשי החץ מציינים את הגודל החזוי של רקומביננטי GTF-SI. M: סמן מולקולרי; 1 = מדגם לפני IMAC; 2 = המדגם שהושג על ידי IMAC. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: שחזור פונקציונלי על ידי תוספת של רקומביננטי GTF-SI. (א) היכולתליצורמבנה של ביופלנים הנגזר ממנו מוצג עבור מאמץ של כל ס'. (ב) היכולת של יצירת ביומאמים שוחזר ב -S. Mutans gtfc בתוספת של רקומביננטי gtfc-SI (25 μg). WT מוסטנות ; Δgtfc =S. מוסטטאן Δgtfc; שלו-gtfc =S. מוטנים שלו-gtfc. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| זוגות פריימר | רצף (5 ′ עד 3 ′) | גודל הלהקה המצופה (bp) | ||
| 1st ה-PCR | ||||
|
Gtfc-פורוורד Gtfc- הפוך A, B |
הוראות הגנה מפני כוהל מיכל שגיא ליאת שאול |
1,090 | ||
|
spcr-קדימה A, C spcr-הפוך |
מיכל הגוקטקחתחתול CAT TAAATCGATTTTCGTTCGTGAAT ליאת הגוגאגאגאטאגאכאטאגאטוטקטיקיקוטבאץ |
2,232 | ||
| 2nd PCR | ||||
| מקונן-קדימה מקונן-הפוך |
מלון הובלה למטוס GCCATACTTAGAGAAATTTCTTTGCTAAATTCTTG |
3,179 | ||
| אימות שילוב מחדש | ||||
| המושבה ה-PCR | ||||
|
Gtfc-פורוורד המושבה-הפוכה |
הוראות הגנה מפני כוהל בעלי ה, מחלקה שלמה |
1,482 | ||
| אימות סופי | ||||
| למעלה-קדימה הפוך למטה |
האחים בעלי הגנה כיצד לשחק באמצעות מדריך |
6,173 | ||
שולחן 1: התחל בשימוש בפרוטוקול. מהווה הרצפים המסומנים בקו תחתון של ' gtfC-הפוך ו- spcr-forward ' משלימים, ואת הsequencescode המוקלדת בהדגשה עבור התגית שלו (gtfc-הפוכה; מעבר, spcr-קדימה; CATCATCATCATCAT) ו-GS מקשר (Gtfc-הפוכה; מרכז הפיתוח, spc r-forward; GGTGGTAGT). ב . הפסקת הדי. אנ. איי של Gtfc הוסרה ג הפסקת DNA קודון (TAA) נוספה מיד לאחר רצפי polyhistidine-קידוד.
| ריאגנט | ריכוז פתרון המלאי | אמצעי אחסון | ריכוז סופי |
| דנ א פולימראז | 2x | 25 μL | 1x |
| פריימר קדימה | 5 μM | 2 מיקרומטר | 0.2 μM |
| פריימר הפוכה | 5 μM | 2 מיקרומטר | 0.2 μM |
| דנ א של תבנית | שתנה | שתנה | שתנה |
| מים בדימוס | - | עד 50 μL | - |
טבלה 2: PCR ריאגנטים: עבור ה-PCR הראשון, 2 μL של תבנית ה-DNA נוספה. עבור ה-pcr השני, 0.5-2 μl של ה-pcr אמפליקון הראשון התווסף לתערובת התגובה. עבור המושבה ה-PCR, תאים חיידקיים. נוספו ישירות לתערובת הריאקציה
| צעד | טמפרטורה | זמן | מספר מחזורים |
| דנטורציה ראשונית | 98 ° c | 2 דקות | 1 |
| דנטורציה ריפוי סיומת |
98 ° c 50 ° c 72 ° c |
עשרה מנות 5 מנות אמפליצין תלוי (1 דקות/1 לחץ) |
35 |
| הארכה סופית | 72 ° c | אמפליצין תלוי (1 דקות/1 לחץ) |
1 |
שולחן 3: PCR מחזורי הגברה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עיצוב התחל הוא הצעד הקריטי ביותר בפרוטוקול. רצפי של Gtfc-הפוכה ו- spcr-קדימה נקבע באופן אוטומטי על בסיס רצפים של שניהם אזור סוף 3 ′ של gtfc ו 5 ′ קצה אזור של spcr. כל פריימר כולל 24 בסיסים משלימים הקודדים מקשר GS ורצף התגים שלו-coding באזורים 5 ' שלהם. שיבוש רצפי הרגולציה הילידים הממוקמים באזורים הנמצאים במעלה הזרם ניתן להימנע על ידי הוספת שלו-tag-קידוד רצפים לסוף 3 ′. את ה-DNA לעצור קודון יש להסיר מתוך ההילוך האחורי gtfcוהוסיף ל- spcr-קדימה פריימר. יתר על כן, Gtfc-קדימה ו- spcr-הפוך צריך להיות מיועד להגביר את האזורים האגפים של כ 1 kb במעלה הזרם של אזור היעד של שילוב של הומוולוגי בגנום S. מוסטנים , בהתאמה. תוספת של רצפים האגפים ארוך משפר את היעילות של שילוב מחדש של הומוולוגי. הצבעי היסוד המקוננים תוכננו לשימוש במקום הזוג החיצוני ביותר (Gtfc-קדימה ו- spcr-הפוך) בפרוטוקול זה. הכללת התחל המקונן נדרשת עבור ה-PCR השני, כמפורט במקום אחר5.
המרה על ידי אלקטרופורציה היא יעילה1 והליכים להכנת תאים מוכשרים לפני האלקטרופורציה הינם גם הרבה יותר פשוטים לעומת השיטות החלופיות16,17,18, למרות שנדרש מנגנון אלקטרופורציה. מומלץ מאוד להכין מוסמך s. mutans WT מחדש במקרה של מושבות חסרות על הצלחת לאחר האלקטרופורציה. למרות הדגירה של כמה שעות לאחר אלקטרופורציה עשוי לשפר את יעילות השינוי, הדגירה הנוספת אינה משפיעה על ההצלחה של השינוי. יש להשתמש בתאים בשלב הגידול של יומן הרישום עבור הכנת התא המוסמך, כמתואר בעבר5.
מכיוון שכמות החלבון הרקומביננטי תלויה בביטוי היליד של הגן, ייתכן שיהיה צורך בתרבות המדורגת במקרים של חלבונים עם ביטוי נמוך יותר. השיטה המוצגת כאן מוגבלת על-ידי היישום של שיקום שחזור פונקציונלי. הוספת גן הריבית אינה יכולה להיות מוחלת על חלבונים תאיים. עם זאת, השיטה המפותחת מציגה יתרונות ניכרים במונחים של מתקן, יעילות, ועלות (למשל, אין תגובות אנזימטיות השונה מ-PCR) כאשר עובדים עם חלבון היעד המיועד לחילוץ. בנוסף, הטיהור של חלבון רקומביננטי ואישור של ביטוי גנים בפועל ניתן לבצע פשוט באמצעות יישומים משותפים שלו-tag, כפי שמוצג באיור 5.
השיטה הנוכחית, כולל הפרעה גנטית ובידוד המוצר הגנטי, עשוי להיות מותאם לשימוש עתידי במינים אחרים כמו ניסויים סדרתיים עבור ניתוח פונקציונלי של גן של עניין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) (להעניק מספרים 16K15860 ו 19K10471 ל T. M, 17K12032 ל-M. I., ו 18K09926 ל N. H.) וקרן המדע והטכנולוגיה SECOM (SECOM) (גרנט מספר 2018.09.10 מס ' 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Nippon Genetics | NE-AG02 | For agarose gel electrophoresis |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Anti-His-Tag monoclonal antibody | MBL | D291-7 | HRP-conjugated |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Measurement of protein concentration |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture medium |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
| Centrifugal ultrafiltration unit | Sartorius | VS2032 | Buffer replacement and protein concentration |
| Centrifuge | Kubota | 7780II | |
| Chromatographic column | Bio-Rad | 7321010 | For IMAC |
| Dialysis membrane clamp | Fisher brand | 21-153-100 | |
| Dialysis tubing | As One | 2-316-06 | |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| DNA sequencing | Eurofins Genomics | ||
| ECL substrate | Bio-Rad | 170-5060 | For western blotting |
| EDTA (0.5 M pH 8.0) | Wako | 311-90075 | Tris-EDTA buffer preparation |
| Electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652086 | 0.2 cm gap |
| Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| EtBr solution | Nippon Gene | 315-90051 | For agarose gel electrophoresis |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Imager | GE Healthcare | 29083461 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Imidazole | Wako | 095-00015 | Binding buffer and elution buffer preparation |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | EZ-022 | Temperature setting: 4 °C |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | LH-100-RDS | Temperature setting: 37 °C |
| Membrane filter | Merck Millipore | JGWP04700 | 0.2 µm diameter |
| Microcentrifuge | Kubota | 3740 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaH2PO4·2H2O | Wako | 192-02815 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| (NH4)2SO4 | Wako | 015-06737 | Ammonium sulfate precipitation |
| Ni-charged resin | Bio-Rad | 1560133 | For IMAC |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | |
| Protein standard | Bio-Rad | 161-0381 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Solvent filtration apparatus | As One | FH-1G | |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics; use at 100 μg/mL |
| Sterile syringe filter | Merckmillipore | SLGV004SL | 0.22 µm diameter |
| Streptococus mutans ΔgtfC | Stock strain in the lab. | gtfC replaced with spcr | |
| Streptococus mutans UA159 | Stock strain in the lab. | S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain | |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| TAE (50 × ) | Nippon Gene | 313-90035 | For agarose gel electrophoresis |
| Thermal cycler | Bio-Rad | PTC-200 | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | Wako | 314-90065 | Tris-EDTA buffer preparation |
References
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
- Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product. Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).
- Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
- Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101 (2016).
- Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning. Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).
- Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).
- LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Database, J. S. E.
- Database, J. S. E.
- Database, J. S. E.
- Wingfield, P. T.
- Database, J. S. E.
- Database, J. S. E.
- Smith, P. K., et al.
- Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).
- Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
- Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
