Summary
여기에 기재된 것은 연쇄상 구균 뮤탄에서유전자 생성물의 정제를 위한 간단한 방법이다. 이 기술은 단백질, 특히 막 단백질 및 고분자 질량 단백질의 정제에 유리할 수 있으며, 다양한 다른 세균 종과 함께 사용될 수 있다.
Abstract
유전자의 기능의 해명이 전형적으로 관심의 유전자가 중단된 야생 형 긴장 및 긴장의 표현형 형질의 비교를 관련시킵니다. 유전자 중단 다음 기능의 손실은 이후에 중단된 유전자의 산물의 외인성 첨가에 의해 회복된다. 이것은 유전자의 기능을 결정하는 것을 돕습니다. 앞서 설명한 방법은 gtfC 유전자-중단된 연쇄상 구균 뮤탄스 균주를 생성하는 것을 포함한다. 여기서, 유전자 파괴 에 이어 새로 생성된 S. 뮤탄스 균주로부터 gtfC 유전자 생성물을 정제하기 위한 까다로운 방법이 기술된다. 그것은 관심있는 유전자의 3′끝에서 폴리히스티딘 코딩 서열을 첨가하는 것을 포함하며, 이는 고정 된 금속 친화성 크로마토그래피를 사용하여 유전자 생성물의 간단한 정제를 허용합니다. 이 방법의 유전자 변형에는 PCR 이외의 효소 반응이 필요하지 않습니다. 유전자 중단 후 외인성 첨가에 의한 유전자 생성물의 복원은 유전자 기능을 결정하는 효율적인 방법이며, 이는 또한 다른 종에 적용될 수 있다.
Introduction
유전자의 기능의 분석은 일반적으로 관심있는 유전자가 중단된 균주에 야생 형 긴장의 표현형 특성의 비교를 관련시킵니다. 유전자 중단 균주가 생성되면, 유전자 제품의 외인성 추가는 기능적 복원을 허용한다.
후속 복원 검사에 필요한 정제된 유전자 제품을 얻는 가장 일반적인 방법은 대장균1에서이종 발현을 수행하는 것이다. 그러나, 막 단백질 또는 고분자 질량 단백질의 발현은 종종 이 시스템을 사용하여 어렵다1. 이러한 경우에, 표적 단백질은 일반적으로 유전자 생성물의 손실로 이끌어 낼 수 있는 단계의 복잡한 시리즈를 통해 단백질을 기본적으로 종합하는 세포에서 단리됩니다. 이러한 문제점을 극복하기 위해 유전자 파괴 방법2,PCR 기반 DNA 접합 방법3(지정 2단계 융합 PCR) 및 유전적 용 전기 천공에 따른 유전자 생성물 정제를 위한 간단한 절차가 개발되었습니다. 연쇄상 구균 뮤탄의변환 . 유전자 생성물의 C-말단에 폴리히스티딘 태그(His-tag)를 첨가하면 고정화 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)에 의해 그 정제가 용이합니다.
그의 태그 발현 긴장을 격리하기 위하여는, 관심 있는 유전자의 전체 게놈 DNA (이 그의 꼬리표 발현 유전자 중단한 긴장에서)는 항생 저항하는 마커 유전자로 대체됩니다. 앞서 설명한 바와 같이 유전자 중단 균주를 생성하는 것과 거의 동일한 그의 태그 발현 균주를 생성하는 절차4,5. 따라서, 유전자 파괴 및 유전자 생성물 분리를 위한 방법은 기능분석을 위한 직렬 실험으로서 수행되어야 한다.
본 작에서, 폴리히스티딘 코딩 서열은 gtfC(GenBank 궤적 태그 SMU_1005) 유전자의 3′ 말단에 부착되고, 글루코실트랜스퍼라제-SI(GTF-SI)를 S. 뮤탄스6에인코딩한다. 이어서, 연쇄상 구균 종에서 발현 연구가 수행되었다. 대장균에 의한 이종 gtfC 발현을 달성하는 것은 어렵고, 이는 GTF-SI의 높은 분자량 때문에 가능성이 높다. 이 균주는 S. mutans 그의- gtfC라는 이름입니다. 야생형 S. 뮤탄스(S. 뮤탄스 WT)의 gtfC 및 스펙티노마이신 내성 유전자 카세트(spcr)7로 의 조직을 묘사한 개략적 그림과 그 유도체가 그림 1. GTF-SI는 카리오제닉 치과 용 생물막6의개발에 기여하는 분비 단백질입니다. 자당의 존재 하에, 부착 생물막은 WT S. 뮤탄스 균주에서 매끄러운 유리 표면에서 관찰되지만 S. 뮤탄스 gtfC-중단 균주(S. mutans ΔgtfC)2,5 . 생물막 형성은 재조합GTF-SI의 외인성 첨가 시 S. 뮤탄스 Δ gtfC에서 회복된다. 변형, S. 뮤탄스 그의-gtfC,다음 재조합 GTF-SI를 생산하는 데사용됩니다.
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Protocol
참고: gtfC 유전자의 전체 코딩 영역이 spcr로 대체되는 S. 뮤탄스 □gtfC의 생성은 이러한 프로토콜을 수행하기 전에 완료되어야 한다. 5세대에대한 자세한 내용은 게시된 문서를 참조하십시오.
1. 프라이머 디자인
-
S. 뮤탄스 그의gtfC의건설을위한 프라이머를 준비합니다.
참고: 이 프로토콜에 사용된 프라이머 시퀀스는 표 1에나와 있습니다. S. 뮤탄스-gtfC의 생성을 위한 2단계 융합 PCR 방법은 도 2에도시된 것이다.- 설계 프라이머(gtfC-reverse및 spcr-forward)그의 태그 코딩 서열의 부착에 대 한, gtfC 유전자와 spcr 사이 개입(그림 2A).
- GS 링커와 그의 태그 코딩 시퀀스를 gtfC-reverse및 spcr-forward프라이머에 포함하며, 5' 영역에서 24개의 베이스가 서로 보완됩니다.
참고 : GS 링커와 그의 태그의 아미노산 서열 (글리 글리 글리 - 글리 - 세르 - 그의 - 그의 - 그의 - 그의 - 그의 - 그의 - 그의) 유전자 번역을 통해 GTF-SI의 C 종점에 부착되어 있습니다. - S. 뮤탄스 WT 게놈 >1 kb 다운스트림의 유전자와 spcr-reverse프라이머에서 gtfC-forward 프라이머를 타겟팅하여 spc r의 하류 측면 영역을 타겟팅하는 gtfC-forward프라이머를 설계합니다. S. 뮤탄스 □gtfC에서. gtfC의용융 온도8 (Tm)를설정 -앞으로 및 spcr-역 프라이머는 gtfC의용융 온도와 일치 -reverse 및 spcr- 포워드 프라이머를 각각.
- GS 링커와 그의 태그 코딩 시퀀스를 gtfC-reverse및 spcr-forward프라이머에 포함하며, 5' 영역에서 24개의 베이스가 서로 보완됩니다.
- 두 번째 PCR(그림2B)에대해 중첩된 프라이머(중첩 포워드 및 중첩 역방향)를 디자인합니다.
- 변형제의 게놈 DNA에 특이적인 설계프라이머(gtfC-forward및 콜로니 리버스)(도2C;프라이머는 콜로니 PCR에 사용된다).
참고: 앰플리콘은 gtfC와 spcr사이의 경계를 가로질러. gtfC-포워드프라이머는 전진 프라이머로서 적용될 수 있다. - 설계 프라이머(위-전진 및 하향-반전)는 S. 뮤탄스-gtfC의 생성에 대한 최종 확인을 위한 것이다(도2C;프라이머에 의해 증폭된 PCR 생성물은 DNA 염기서열 분석에 사용된다).
- 설계 프라이머(gtfC-reverse및 spcr-forward)그의 태그 코딩 서열의 부착에 대 한, gtfC 유전자와 spcr 사이 개입(그림 2A).
2. S. 뮤탄에서 유전체 DNA 추출
참고: 각 S. 뮤탄스 균주는 혐기성 조건 하에서 37°C에서 뇌 심장 주입(BHI) 배지에서 배양되어야 합니다. S. 뮤탄스 □gtfC 및 S. 뮤탄스 그의-gtfC의 돌연변이 균주는 100 μg/mL 스펙티노마이신으로 보충된 BHI에서 배양된다.
- 줄무늬 S. 뮤탄s WT 및 S. 뮤탄스 □gtfC를 각각의 BHI 한천 플레이트에 별도로 상한다. 37 °C에서 밤새 배양하십시오.
- 살균 된 이쑤시개를사용하여 S. 뮤탄s WT 또는 S. 뮤탄의 단일 콜로니를 선택하고 BHI 국물의 1.5 mL로 접종하십시오. 37 °C에서 밤새 배양하십시오.
참고: 상기 콜로니는 제1 PCR에 대한 템플릿 DNA의 공급원으로 사용될 수 있다(단계 3.1). - 각 세균 배양액의 1 mL을 1.5 mL 마이크로원지 튜브로 옮김. 15,000 x g에서1 분 동안 배양하는 원심 분리기.
- 상급체를 제거하고 트리스-EDTA 버퍼(pH 8.0)의 1 mL을 추가하여 세포 펠릿을 다시 중단시된다.
- 15,000 x g에서1 분 동안 현탁액을 원심 분리기. 상급체를 제거합니다. 트리스-EDTA 완충액(pH 8.0)의 50 μL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.
- 95°C에서 5분 동안 블록 인큐베이터를 사용하여 현탁액을 가열합니다. 15,000 x g에서5 분 동안 현탁액을 원심 분리기.
- 상급체를 새로운 1.5 mL 미세 원심분리기 튜브로 옮김(상급체는 제1 PCR에 대한 템플릿 DNA로서 작용할 것이다).
3. PCR 증폭
참고: 표 1, 표 2및 표 3은 각각 PCR 프라이머, 시약 및 증폭 주기를 요약한다.
- PcR 템플릿으로서 S. 뮤탄의WT 및 S. 뮤탄스 □gtfC 게놈을 사용하여 제1 PCR을 수행한다. 1.1.1.2단계(도2A)에기재된 프라이머를 이용하여 gtfC 유전자및 그 항구 spcr의 하류 부분을 항재하는 영역을 증폭한다.
- 전기 조는 각 PCR 제품에 1% 아가로즈 젤. 약 1,000 bp 및 2,000 bp의 원하는 DNA 단편을 절제합니다. 실리카 막 기반 겔 추출 방법을 사용하여 겔에서 단편을 정화합니다.
참고: PCR9,DNA 겔 전기동10,DNA정제(11)에 대한 기본 절차는 다른 곳에서 상세히 설명되어 있다. - 중첩된 전진 및 중첩 역방향 프라이머(그림2B)를사용하여 첫 번째 PCR(약 등가)의 제품을 PCR 템플릿으로 사용하여 두 번째 PCR을 수행합니다.
- 아가로즈 겔 상에 PCR 혼합물의 1/10을 전기포르제. 약 3,000 bp의 적절한 앰플리온의 생성을 확인합니다.
-
나머지 PCR 제품을 침전시.
참고 : 두 번째 PCR에 의해 생성 된 비 특이적 앰플리콘도 상동 재조합을 방해하지 않기 때문에 PCR 제품의 정제가 필요하지 않습니다.- PCR 혼합물에 뉴클레아제 없는 물을 넣고 총 부피를 100 μL로 가져온 다음 3M 나트륨 아세테이트 (pH 5.2) 및 절대 에탄올 2.5 부피 (250 μL)의 0.1 부피 (10 μL)를 가져옵니다. 혼합물을 실온(RT)에서 10분 동안 혼합하고 보관합니다.
- 4 °C에서 15,000 x g에서 20 분 동안 샘플을 원심 분리합니다. 상급제는 버리십시오. DNA 펠릿을 세척하기 위해 70 % 에탄올 1 mL을 추가하십시오.
- 4 °C에서 15,000 x g에서 5 분 동안 샘플을 원심 분리합니다. 상급제는 버리십시오. 10 μL의 뉴클레아제 없는 물로 DNA 펠릿을 공기 건조하고 용해시다.
4. 세포 변환
- [5]앞서 간행물에 기재된 단계에 따라 제2 PCR 제품을 소개할 수 있는 유능한 S. mutans WT를 준비한다. 세포를 -80°C에 보관하십시오.
참고: 본 실험을 위해, 유능한 S. 뮤탄sWT 세포는 이미 -80°C에서 보존되어 S. 뮤탄스 □gtfC를생성한다. - 농축된 제2 PCR 생성물의 5 μL을 이전에 동결된 얼음 차가운 유능한 세포의 50 μL aliquot에 혼합한다. 혼합물을 전기 개화 큐벳에 추가합니다. 전기 천공 장치를 사용하여 셀에 단일 전기 펄스(1.8 kV, 2.5 ms, 600 Ω, 10 μF)를 부여합니다.
- BHI 국물의 500 μL에서 세포를 다시 중단하십시오. 즉시, 스펙티노마이신을 함유한 BHI 한천 플레이트에 현탁액의 10-100 μL을 퍼뜨리세요. 식민지가 충분히 자라날 때까지 37 °C에서 2-6 일 동안 접시를 배양하십시오.
5. Genome 재조합 및 보관 확인
- 재조합을 위해 gtfC-forward 및 콜로니 리버스 프라이머를 사용하여 콜로니 PCR을 수행합니다. 전기조 각 콜로니 PCR 제품을 아가로즈 겔 상에. 약 1,500 bp의 DNA 단편을 확인합니다.
- 멸균 된 이쑤시개를 사용하여 양성 콜로니 중 하나를 선택하고 스펙티노마이신을 함유한 BHI 국물 2 mL에서 밤새 세포를 배양합니다.
- 0.8 mL의 세균 배양을 멸균 50% 글리세롤 0.8 mL와 혼합하고 -80 °C 또는 -20 °C에서 스톡합니다.
- 나머지 1 mL의 세포 현탁액을 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 옮김. 2.3-2.7 단계를 반복하여 세포로부터 게놈 DNA를 추출합니다.
- 상향 및 하향-역방향 프라이머 및 게놈 DNA를 템플릿으로 사용하여 PCR을 수행합니다. 3.2 단계를 반복하여 겔로부터 증폭된 DNA 생성물을 정제한다.
- DNA 염기서열 분석으로 정제된 앰플리코의 DNA 서열을 결정합니다.
참고: DNA 염기서열분석으로 S. 뮤탄스 의 생성을 확인하십시오.
6. 폴리히스티딘 태그 GTF-SI의 정화
- Streak S. mutans His-gtfC를 스펙티노마이신 함유 BHI 한천 플레이트에. 37 °C에서 밤새 배양하십시오.
- BHI 국물의 3 mL에서 멸균 된 이쑤시개 및 하위 배양 세포를 사용하여 단일 콜로니를 선택합니다. 37 °C에서 하룻밤 배양.
- 스펙토마이신 없이 BHI 국물 1L로 원추형 플라스크 2개를 준비합니다. BHI 국물의 1 L에 하룻밤 배양 현탁액의 1 mL을 접종. 37 °C에서 하룻밤 배양.
- 황산 암모늄 침전으로 배양 상급단백질을 농축한다.
참고: 표적 단백질이 세포내인 경우 세포체에서 추출합니다. 황산 암모늄 강수량에 대한 기본 절차는다른 곳에서 자세히 설명되어 있습니다 12.- 4°C에서 10,000 x g에서 20분 동안 세균 배양 현탁액을 원심분리기. 배양부체를 3L 유리 비커로 회수한다.
- 마그네틱 교반기를 사용하여 격렬한 교반으로 황산 암모늄 1,122 g을 상급 (80 % 포화)의 2 L에 추가하십시오. 침전물 4°C에서 4시간 이상 교반하여 형성되도록 한다.
참고 : 침전물 형성은 하룻밤 동안 계속 될 수 있습니다. - 4 °C에서 20 분 동안 15,000 x g에서 황산 암모늄 침전 액을 원심 분리기. 상급자.
- 주걱으로 침전을 수집하고 200 mL 유리 비커로 전송합니다. 결합 완충액의 35 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단 (50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl, 5 mM imidazole, pH 8.0).
- 회생된 셀룰로오스 투석 튜브를 사용하여 결합 완충액의 2,500 mL에 대하여 현탁액을 투석, 4°C에서 교반하였다. 2 시간 후에 투석 용액을 교체하고 밤새 투석을 계속하십시오.
- 투석 용액을 다시 교체하십시오. 추가 2 시간 투석을 계속하십시오.
- 투석액을 20,000 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리한다. 흡입 여과 장비를 사용하여 멤브레인 필터를 통해 상류물을 필터링합니다. 여과액을 75cm2 플라스크로 옮김.
- 폴리히스티딘 태그가 있는 GTF-SI를 고정화 된 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC)에 의해 여과 된 현탁액으로부터 분별하십시오.
- Ni 충전 IMAC 수지 슬러리 2 mL(약 1 mL의 수지)를 실리콘 튜브에 장착된 크로마토그래피 컬럼으로 옮니다. 중력 흐름에 의해 저장 솔루션을 제거합니다.
주의 사항: 수지가 IMAC 전체에서 마르지 않도록 하십시오. - 3 mL의 증류수를 컬럼에 추가하여 수지세척합니다. 수지의 평형을 위해 바인딩 버퍼의 5 mL를 추가합니다.
- 호프만 핀치 수탉으로 흐름을 차단합니다. 슬러리를 만들기 위해 6.5 단계에서 여과 된 현탁액 5 mL을 추가하십시오.
- 모든 슬러리를 나머지 여과된 현탁액에 추가합니다. 혼합물을 4°C에서 30분 동안 부드럽게 돌이십시오.
- 혼합물을 열에 다시 로드합니다. 중력 흐름에 의해 현탁액을 제거합니다. IMAC 수지의 결합 버퍼 20 mL로 세척하십시오.
참고: 후속 IMAC 전체에서 호프만 핀치 콕으로 유량을 약 2mL/min으로 조정합니다. - 용출 완충제의 20 mL로 재조합 GTF-SI를 용출 완충한다(50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl, 500 mM 이미다졸, pH 8.0).
참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 용리수체는 4°C에서 보관해야 한다. IMAC 수지재사용이 가능합니다. IMAC 수지의 지침을 참조하십시오.
- Ni 충전 IMAC 수지 슬러리 2 mL(약 1 mL의 수지)를 실리콘 튜브에 장착된 크로마토그래피 컬럼으로 옮니다. 중력 흐름에 의해 저장 솔루션을 제거합니다.
- 용출 완충액을 저장 버퍼(50 mM 인산 완충제, pH 6.5)로 교체하고 원심 초여과 유닛을 사용하여 재조합 GTF-SI 용액을 약 1 mL에 농축한다. 재조합 GTF-SI 용액을 4°C에 저장합니다.
참고: 폴리히스티딘 태그가 있는 GTF-SI 정제를 SDS-PAGE13 및 서부블로팅(14)을 사용하여 고추냉이 과옥시다제-공액항 폴리히스티딘 모노클로날 항체를 채용하여 확인한다. CHAPS 추가 (최종 농도, 0.1%) 용리제는 표적 단백질에 따라 단위에 대한 비특이적 흡착을 피하기 위해 요구될 수 있다.
7. 재조합 GTF-SI에 의한 기능 복원
- 각 S. 뮤탄의변형을 BHI 한천 플레이트에 개별적으로 연속한다. 플레이트를 37°C에서 밤새 배양합니다.
- 살균 된 이쑤시개를 사용하여 단일 식민지를 집어 BHI 국물 2 mL로 접종하십시오. 37 °C에서 하룻밤 배양.
- 유리 시험관에서 항생제 없이 1% 자당을 함유하는 BHI 국물 2 mL을접종하기 위해 S. 뮤탄의 하룻밤 배양물 20 μL을 사용한다. GTF-SI 또는 이에 상응하는 부피를 S. 뮤탄스 □gtfC 배양에 추가하고, 하룻밤 동안 기울어진 위치에 놓인 튜브로 세포를 배양한다.
참고: 멸균 주사기 필터로 GTF-SI 용액을 살균하고 사용 전에 비신코닌산 단백질 분석법15를 사용하여 단백질 농도를 결정합니다. - 10s. 서스펜션을 10s. Decant에 대한 와류 믹서로 배양 현탁액을 교반한다. 충분한 양의 증류수로 시험관을 씻으십시오.
- 0.25 % 쿠마시 브릴리언트 블루 (CBB)의 1 mL로 튜브 벽에 생물 막을 얼룩.
- 염색 용액을 1분 후에 데낸트. 충분한 양의 증류수로 시험관을 세척한다. 시험관을 공기 건조시.
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Representative Results
도 3은 제1 PCR(도3A)및 제2 PCR(도3B)으로부터의각 앰플리컨의 크기를 나타낸다. 각 앰플리곤의 크기는 표 1에설명된 바와 같이 예측된 크기와 일치합니다. 도 4A는 S. 뮤탄스 콜로니가 두 번째 PCR 제품으로 변형되고 스펙토마이신을 함유하는 BHI 한천 플레이트상에 도금된 것을 나타낸다. 콜로니 PCR 제품은 아가로즈겔(도 4B)에서실행하였다. 각 앰플리톤은 표 1에기재된 바와 같이 예측된 크기였다. 그림 5는 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯의 이미지를 보여줍니다. IMAC로 정제된 단백질은 SDS-PAGE(도5A)에의해 단일 대역으로 관찰되었다. 웨스턴 블롯은 160 kDa의 폴리히스티딘 태그단백질(도5B)이예상되는 폴리히스티딘 태그단백질임을 확인하기 위해 항폴리히스티딘 항체를 사용하여 수행하였다. 도 6은 각 S. 뮤탄스 균주의 자당 유래 생물막 형성 능력을 나타낸다. 오직 S. 뮤탄스 WT 및 S. 뮤탄스 그의-gtfC만이 1% 자당의 존재 시 튜브 벽에 부착된 생물막을 형성할 수 있었다. 이것은 S. 뮤탄스 ΔgtfC (도 6A)에서관찰되지 않았다. 그러나, 재조합 GTF-SI의 첨가는 S. 뮤탄스 ΔgtfC(도 6B)에서부착생물막 형성 능력을 회복하였다.
도 1: S. 뮤탄스 UA159 게놈 및 그 유도체에서 gtfC 및 spcr loci의 조직. gtfC와 spcr사이의 그의 태그의 개략적 인 그림 . 유전자와 간격의 길이는 확장할 수 없습니다. 그늘진 오각형: SMU_1004; 솔리드 오각형: SMU_1006. 이 그림은 이전 발행물2에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 2단계 융합 PCR전략 S. 뮤탄 ()뮤탄 (것)들 그의gtfC 건설. 유전자와 간격의 길이는 확장할 수 없습니다. 템플릿의 프라이머 바인딩 사이트는 패턴으로 표시됩니다. (a) S. 뮤탄스 WT 게놈에서 gtfC 유전자의 일부를 포위한 영역과 S. 뮤탄스 ΔgtfC 게놈에서 spcr을 항재하는 부위는 제1 PCR을 사용하여 증폭되었다. (b)제2 PCR을 제1 PCR에 의해 증폭시킨 두 개의 단편을 이용하여 중첩프라이머로 수행하였고, 상동재조합을 위한 DNA 구조를 얻었다. (C)돌연변이 균주는 박테리아에서 상동 재조합시 생성되었다. 이 그림은 이전 발행물2에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 제 1 및 제 2 PCR 제품의 아가로즈 겔 전기 동동. (A)gtfC(gtfC; 왼쪽 이미지)의 일부부분의 첫 번째 PCR 제품과 spcr(spcr; 오른쪽 이미지)을 품고 있는 지역이 표시됩니다. 단일 전기 동화 이미지는 마커 밴드에 레이블을 지정하도록 분할됩니다. (B)중첩 프라이머로 증폭된 두 번째 PCR 제품이 도시되어 있습니다. 각 화살촉은 각 PCR 제품의 예상 크기를 나타냅니다. M = 분자 마커. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 콜로니 PCRS 의 생성을 뮤탄스 그의 -gtfC. (A) S. 2차 PCR 제품에 의해 변형된 뮤탄 콜로니가 도시되어 있다. 콜로니 ID는 동그라미 번호로 표시됩니다. (B)콜로니 PCR 제품의 아가로즈 겔 전기 동동이 도시되어 있습니다. 동그라미 차선 번호는 그림 4A의콜로니 ID에 해당합니다. M = 분자 마커. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 폴리히스티딘 태그GTF-SI 정제의 확인. (A)대표 SDS-PAGE 이미지가 표시됩니다. (B)대표적인 웨스턴 블롯 이미지가 표시됩니다. GTF-SI가 전달된 니트로셀룰로오스 멤브레인은 고추냉이 과산화 페옥시다제-공액 항폴리히스티딘 모노클로날 항체로 조사하였다. 면역 반응성 밴드는 화학발광 반응을 사용하여 가시화시켰다. 화살촉은 재조합 GTF-SI의 예측 크기를 나타낸다. M: 분자 마커; 1 = IMAC 이전의 샘플; 2 = IMAC에서 얻은 샘플. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 재조합 GTF-SI를 첨가하여 기능성 복원. (A)각 S. 뮤탄스 균주에 대해 자당 유래 생체막 형성 능력이 나타난다. (B)재조합 GTF-SI(25 μg)를 첨가하여 S. 뮤탄스 ΔgtfC에서 부착성 생물막 형성 능력을 회복하였다. WT = S. 뮤탄스 WT; ΔgtfC = S. 뮤탄스 ΔgtfC; 그의 -gtfC = S. 뮤탄스 그의 -gtfC. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 프라이머 쌍 | 시퀀스 (5′ 받는 번째 3′) | 예상 대역 크기(bp) | ||
| 1차 PCR | ||||
|
gtfC-앞으로 gtfC -역A, B |
타아그타트트타타타타그타크 ATGAT가가트가트가트가트가타카ACCACCTCC 아타타아가아아아아트트트카 |
1,090 | ||
|
spcr-앞으로 A, C spcR-역방향 |
GGGGTAGTCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATCAT 고양이 (미국) 타아츠가트트트트가트가트가트 TTAAGAGCAAGTTTAAAACATGTTACTCAC |
2,232 | ||
| 2차 PCR | ||||
| 중첩 된 앞으로 중첩 된 역방향 |
TGGTATTATTTATATATATATATATATATATTGGTCAC GCCATACTTA가가가가가가가타트TGCTTTTG |
3,179 | ||
| 재조합 검증 | ||||
| 콜로니 PCR | ||||
|
gtfC-앞으로 콜로니 리버스 |
타아그타트트타타타타그타크 CCACTCTCAACTCCTGATCCAAACATGTAAGTACC |
1,482 | ||
| 최종 확인 | ||||
| 업포워드 하향 식 역방향 |
타케그타트카그타타그가트타그타택트택트택트 TTGTCCACTTTGAGTCAACCTCTGCAAGGCATG |
6,173 | ||
표 1: 프로토콜에 사용되는 프라이머. A. 'gtfC-reverse 및 spcr-forward'의밑줄이 그어진 시퀀스는 보완적이며, His-tag(gtfC -reverse)에 대한 굵은 형식의 시퀀스코드; ATGATATGG, spcr-forward; CATCATCATCATCATCAT) 및 GS 링커(gtfC-역; ACTACCACCACCTCC, spcr-forward; GGGgtagT). B (주)b gtfC의 DNA 스톱 코돈이 제거되었습니다. C (것)에 DNA 스톱 코돈(TAA)은 폴리히스티딘 코딩 서열 직후에 첨가되었다.
| 시약 | 재고 용액의 농도 | 볼륨 | 최종 농도 |
| DNA 폴리머라제 프리믹스 | 2x | 25 μL | 1x |
| 전달 프라이머 | 5 μM | 2 μL | 0.2 μM |
| 역프라이머 | 5 μM | 2 μL | 0.2 μM |
| 템플릿 DNA | 변수 | 변수 | 변수 |
| 탈이온수 | - | 최대 50 μL | - |
표 2: PCR 시약: 제1 PCR의 경우, DNA 템플릿의 2 μL을 첨가하였습니다. 제2 PCR의 경우, 반응 혼합물에 제1 PCR 앰플리온의 0.5-2 μL을 첨가하였다. 콜로니 PCR의 경우, 세균 세포를 반응 혼합물에 직접 첨가하였다.
| 단계 | 온도 | 시간 | 사이클 수 |
| 초기 변성 | 98 °C | 2분 | 1 |
| 변성 어 닐 링 확장 |
98 °C 50 °C 72 °C |
10s 5s 앰플리곤 의존성 (1분/1kbp) |
35 |
| 최종 확장 | 72 °C | 앰플리곤 의존성 (1분/1kbp) |
1 |
표 3: PCR 증폭 주기.
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Discussion
프라이머의 설계는 프로토콜에서 가장 중요한 단계입니다. gtfC-reverse 및 spcr-forward프라이머의 시퀀스는 gtfC의 3′ 끝 영역과 spcr의5′ 끝 영역의 시퀀스에 따라 자동으로 결정되었습니다. 각 프라이머에는 GS 링커와 5' 영역에서 His-tag 코딩 시퀀스를 인코딩하는 24개의 보완 베이스가 포함되어 있습니다. 상류 측면 영역에 위치한 네이티브 조절 시퀀스의 중단은 3′ 끝에 His-tag 코딩 시퀀스를 추가하여 피할 수 있다. DNA 스톱 코돈은 gtfC-리버스프라이머로부터 제거하고 spcr-forward프라이머에 첨가해야 한다. 더욱이, gtfC-forward및 spcr-reverse는 S. 뮤탄스 WT 게놈에서 상동 재조합의 대상 영역의 약 1kb 상류 및 하류의 측면 영역을 증폭하도록 설계되어야 하며, 각각. 긴 측면 시퀀스의 추가는 상동 재조합의 효율을 향상시킵니다. 중첩된 프라이머는 이 프로토콜에서 가장 바깥쪽 프라이머쌍(gtfC-forward및 spcr-reverse)대신에 사용되도록 설계되었습니다. 중첩 프라이머의 포함은 다른 곳에서 자세히 설명 한 대로 두 번째 PCR에 필요한5.
전기천공에 의한 형광은효율적1이며, 전기포공에 앞서 유능한 세포 제제에 대한 절차도 대체방법16,17,18에비해 훨씬 간단하다. 전기 개화 장치가 필요하지만. 전기 천공 후 플레이트에 콜로니가 누락 된 경우 유능한 S. mutans WT를 새로 준비하는 것이 좋습니다. 전기 천공 후 몇 시간 동안 배양하면 변형 효율이 향상될 수 있지만, 추가 배양은 변환의 성공에 영향을 미치지 않습니다. 로그 성장 단계의 세포는 앞서 설명한 바와 같이 관할 세포 제제에 사용되어야한다.
재조합 단백질의 양은 유전자의 기본 발현에 의존하기 때문에, 스케일 업 배양은 낮은 발현을 가진 단백질의 경우에 요구될 수 있다. 여기서 제시된 방법은 기능성 복원 분석법의 적용에 의해 제한된다. 관심 유전자의 첨가는 외인성으로 세포내 단백질에 적용될 수 없다. 그러나, 개발된 방법은 세포외 표적 단백질로 작업할 때 시설, 효율성 및 비용(예를 들어, PCR 이외의 효소 반응 없음)의 측면에서 상당한 이점을 제시한다. 부가적으로, 재조합 단백질의 정제 및 실제 유전자 발현의 확인은 도 5에도시된 바와 같이 일반적인 His-tag 적용을 사용하여 간단하게 수행될 수 있다.
본 방법은, 유전자 파괴 및 유전자 생성물 분리를 포함하며, 관심 있는 유전자의 기능적 분석을 위한 직렬 실험으로서 다른 종에서 향후 사용을 위해 적응될 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 일본과학진흥회(JSPS)(교부금 번호 16K15860 및 19K10471~T.M., 17K12032~M.I., 18K0926~N.H.) 및 SECOM 과학기술재단(SECOM)(보조금 번호 2010.10.19.19.1.1.19)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Nippon Genetics | NE-AG02 | For agarose gel electrophoresis |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Anti-His-Tag monoclonal antibody | MBL | D291-7 | HRP-conjugated |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Measurement of protein concentration |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture medium |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
| Centrifugal ultrafiltration unit | Sartorius | VS2032 | Buffer replacement and protein concentration |
| Centrifuge | Kubota | 7780II | |
| Chromatographic column | Bio-Rad | 7321010 | For IMAC |
| Dialysis membrane clamp | Fisher brand | 21-153-100 | |
| Dialysis tubing | As One | 2-316-06 | |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| DNA sequencing | Eurofins Genomics | ||
| ECL substrate | Bio-Rad | 170-5060 | For western blotting |
| EDTA (0.5 M pH 8.0) | Wako | 311-90075 | Tris-EDTA buffer preparation |
| Electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652086 | 0.2 cm gap |
| Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| EtBr solution | Nippon Gene | 315-90051 | For agarose gel electrophoresis |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Imager | GE Healthcare | 29083461 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Imidazole | Wako | 095-00015 | Binding buffer and elution buffer preparation |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | EZ-022 | Temperature setting: 4 °C |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | LH-100-RDS | Temperature setting: 37 °C |
| Membrane filter | Merck Millipore | JGWP04700 | 0.2 µm diameter |
| Microcentrifuge | Kubota | 3740 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaH2PO4·2H2O | Wako | 192-02815 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| (NH4)2SO4 | Wako | 015-06737 | Ammonium sulfate precipitation |
| Ni-charged resin | Bio-Rad | 1560133 | For IMAC |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | |
| Protein standard | Bio-Rad | 161-0381 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Solvent filtration apparatus | As One | FH-1G | |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics; use at 100 μg/mL |
| Sterile syringe filter | Merckmillipore | SLGV004SL | 0.22 µm diameter |
| Streptococus mutans ΔgtfC | Stock strain in the lab. | gtfC replaced with spcr | |
| Streptococus mutans UA159 | Stock strain in the lab. | S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain | |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| TAE (50 × ) | Nippon Gene | 313-90035 | For agarose gel electrophoresis |
| Thermal cycler | Bio-Rad | PTC-200 | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | Wako | 314-90065 | Tris-EDTA buffer preparation |
References
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- Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).
- LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).
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