Summary
Описан опростываемый здесь простой метод очистки генного продукта в Streptococcus mutans. Этот метод может быть выгодным в очищении белков, особенно мембранных белков и белков высокой молекулярной массы, и может быть использован с различными другими бактериальными видами.
Abstract
Разочаивание функции гена обычно включает в себя сравнение фенотипических признаков штаммов дикого типа и штаммов, в которых ген интереса был нарушен. Потеря функции после нарушения гена впоследствии восстанавливается экзогенным добавлением продукта нарушенного гена. Это помогает определить функцию гена. Метод, описанный ранее включает в себя генерацию gtfC гена нарушенных Streptococcus мутанов штамма. Здесь описан нетребовательный метод для очистки генного продукта gtfC от недавно сгенерированного штамма S. mutans после нарушения гена. Она включает в себя добавление последовательность полихиститидина кодирования на 3 "конец гена интереса, что позволяет простой очистки гена продукта с использованием иммобилизованных хроматографии сродства металла. Для генетической модификации этого метода не требуется никаких ферментативных реакций, кроме ПЦР. Восстановление генного продукта путем экзогенного добавления после нарушения гена является эффективным методом определения функции гена, который также может быть адаптирован к различным видам.
Introduction
Анализ функции гена обычно включает в себя сравнение фенотипических признаков штаммов дикого типа с штаммами, в которых ген интереса был нарушен. Как только ген-нарушенный напряжение произведено, экзогенное добавление продукта гена позволяет функциональное восстановление.
Наиболее распространенным методом получения очищенных генных продуктов, необходимых для последующего восстановления анализов является выполнение гетерологического выражения в Escherichia coli1. Однако, выражение мембранных белков или белков высокой молекулярной массы часто трудно использовать эту систему1. В этих случаях, целевой белок, как правило, изолированы из клеток, которые родно синтезирует белок через комплекс ряд шагов, которые могут привести к потере генного продукта. Чтобы преодолеть эти проблемы, простая процедура была разработана для очистки генного продукта после метода нарушения гена2,ПЦР на основе метода сращивания ДНК3 (обозначенный двухступенчатый фьюжн ПЦР), и электропорации для генетической преобразование в Streptococcus mutans. Добавление тега полихистидина (His-tag) к C-термину с генным продуктом облегчает его очистку путем обездвижения хроматографии сродства металла (IMAC).
Чтобы изолировать его-тег-выражение штамма, вся геномная ДНК гена интереса (в этом Его-тег-выражение гена нарушенных штамма) заменяется антибиотикорезистентный маркер гена. Процедура для генерации Его-тег-выражение strainis почти идентичны, что для генерации гена нарушенных штамма, как описано ранее4,5. Поэтому методы нарушения генов и изоляции генного продукта должны выполняться в качестве последовательных экспериментов для функционального анализа.
В настоящей работе, последовательность политистидина-кодирования прилагается к 3 "конец gtfC (GenBank локус тег SMU-1005) ген, кодирование glucosyltransferase-SI (GTF-SI) в S. mutans6. Затем были проведены экспрессионные исследования стрептококковых видов. Достижение гетерологичного выражения gtfC E. coli затруднено, вероятно, из-за высокой молекулярной массы GTF-SI. Этот штамм называется S. mutans His-gtfC. Схематическая иллюстрация, изображающая организацию кассеты гена gtfC и spectomycin resistance(spcr)7 локусов в диком типе S. mutans (S. mutans WT) и его производных показана в Рисунок 1. GTF-SI является секреторным белком, который способствует развитию кариогенной стоматологической биопленки6. При наличии сахарозы, адепт биопленка наблюдается на гладкой стеклянной поверхности в WT S. mutans штамма, но не в S. mutans gtfC-нарушенныйштамм (S. mutans s gtfC)2,5 . Формирование биопленки восстанавливается в S. mutans sgtfC при экзогенном добавлении рекомбинантного GTF-SI. Штамм, S. mutans His-gtfC, затем используется для производства рекомбинантных GTF-SI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Поколение S. mutans sgtfC, в котором вся область кодирования гена gtfC заменяется spcr, должна быть завершена до выполнения этих протоколов. Обратитесь к опубликованной статье для получения подробной информации о поколении5.
1. Дизайн Праймера
-
Подготовка грунтовки для строительства S. mutans Его-gtfC.
ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности праймеров, используемые в этом протоколе, отображаются в таблице 1. Двухступенчатый метод фьюжн ПЦР для генерации S. mutans His-gtfC схематично иллюстрируется на рисунке 2.- Дизайн праймеров (gtfC-обратнойи spcr-forward)для крепления его-тег-кодирования последовательности, вмешиваясь между геном gtfC и spcr (Рисунок 2A).
- Включите GS linker и его-тег-кодирования последовательности в обоих gtfC-обратнойи spcr-впередпраймеры, в которых 24 баз в 5 'регионов дополняют друг друга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Аминокислотная последовательность связующим GS и его-тег (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His- His) прилагается к C-термину gtF-SI через перевод генов. - Дизайн gtfC-впередгрунтовка для целевой gtfC гена в геноме S. mutans WT в S. mutans Установите температуру плавления8 (Tм) gtfC-впереди spcr-обратныйгрунтовки в соответствии с температурой плавления gtfC-обратнойи spcr- вперед грунтовки, соответственно.
- Включите GS linker и его-тег-кодирования последовательности в обоих gtfC-обратнойи spcr-впередпраймеры, в которых 24 баз в 5 'регионов дополняют друг друга.
- Дизайн вложенных грунтовок (вложенных вперед и вложенных обратного) для второго ПЦР(рисунок 2B).
- Дизайн праймеров(gtfC-впереди колонии-обратного) конкретные для геномной ДНК трансформаторов(Рисунок 2C; праймеры используются для колонии PCR).
ПРИМЕЧАНИЕ: Ампромсоны пересекают границу между gtfC и spcr. GTfC-впередгрунтовка может быть применена в качестве переднего грунтовки. - Дизайн праймеров (вверх-вперед и вниз-обратно) для окончательного подтверждения поколения S. mutans His-gtfC (Рисунок 2C; пЦР продукт усиливается грунтовки используется для секвенирования ДНК).
- Дизайн праймеров (gtfC-обратнойи spcr-forward)для крепления его-тег-кодирования последовательности, вмешиваясь между геном gtfC и spcr (Рисунок 2A).
2. Геномная ДНК Извлечение из S. mutans
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый штамм S. mutans должен быть культивирован в инфузии сердца головного мозга (BHI) среде при 37 градусах Цельсия в анаэробных условиях. Штаммы мутантов S. mutans и S. mutans His-gtfC культивируются в BHI, дополненных 100 мкг/мл спектриномицина.
- Streak S. mutans WT и S. mutans -gtfC отдельно на каждую из тарелок BHI. Инкубировать их на ночь при 37 градусах Цельсия.
- Выберите одиночные колонии S. mutans WT или S. mutans sgtfC с помощью стерилизованной зубочистки и привить в 1,5 мл бульона BHI. Инкубировать их на ночь при 37 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Колонии могут быть использованы в качестве источника шаблона ДНК для первого ПЦР (шаг 3.1). - Перенесите 1 мл каждой бактериальной культуры в микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 мл. Центрифуги культуры в течение 1 мин на 15000 х г.
- Удалите супернатант и добавьте 1 мл буфера Tris-EDTA (pH 8.0), чтобы повторно приостановить действие клеточной гранулы.
- Centrifuge подвески в течение 1 мин на 15000 х г. Удалите супернатант. Повторное увеличение количества клеточных гранул в 50 зликатбуфера Tris-EDTA (pH 8.0).
- Нагрейте подвеску с помощью блока инкубатора в течение 5 мин при температуре 95 градусов по Цельсию. Centrifuge подвески в течение 5 мин на 15000 х г.
- Перенесите супернатант в новую микроцентрифуговую трубку мощностью 1,5 мл (супернатант будет служить шаблоном ДНК для первого ПЦР).
3. Усиление ПЦР
ПРИМЕЧАНИЕ: Таблица 1, Таблица 2и таблица 3 обобщены праймеры ПЦР, реагенты и циклы усиления, соответственно.
- Выполните первый ПЦР с использованием S. mutans WT и S. mutans sgtfC в качестве шаблонов ПЦР. Усиль регионы укрывательство вниз по течению часть гена gtfC и тех, укрывательство spcr с помощью грунтовки описаны в шаге 1.1.1.2(Рисунок 2A).
- Электрофорез каждый продукт ПЦР на 1% агарозный гель. Акциз желаемых фрагментов ДНК около 1000 bp и 2000 bp. Очистите фрагменты из гелей с помощью кремнезема мембраны на основе метода извлечения геля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Основные процедуры для ПЦР9,электрофорус днк-геля10и очистки ДНК11 подробно описаны в других местах. - Выполните второй ПЦР с использованием продуктов первого ПЦР (приблизительно эквимолярных) в качестве шаблонов ПЦР с вложенными вперед и вложенными обратной праймеры(рисунок 2B).
- Электрофорезоднаодная одна десятая смеси ПЦР на геле агарозы. Подтвердите генерацию соответствующего ампликона примерно 3000 б.п.
-
Осаждает оставшийся продукт ПЦР.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очистка продукта ПЦР не требуется, так как неспецифические ампликоны, генерируемые вторым ПЦР, не мешают гомологическому рекомбинации.- Добавьте в смесь ПЦР воду без нуклеайза и доведите общий объем до 100 кв.м., а затем 0,1 объема (10 л) 3 М ацетата натрия (pH 5.2) и 2,5 тома (250 л) абсолютного этанола. Смешайте и храните смесь в течение 10 минут при комнатной температуре (RT).
- Центрифуги образца в течение 20 мин при 15000 х г при 4 градусах Цельсия. Отбросьте супернатант. Добавьте 1 мл 70% этанола для мытья гранул ДНК.
- Центрифуги образца в течение 5 мин при 15000 х г при 4 градусах Цельсия. Отбросьте супернатант. Воздух-сухой и растворить гранулы ДНК с 10 зл и без нуклеазы воды.
4. Преобразование клеток
- Подготовьте компетентный S. mutans WT, чтобы представить второй продукт ПЦР, следуя шагам, описанным в предыдущей публикации5. Храните ячейки при -80 градусах По Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого эксперимента компетентные клетки S. mutans WT уже сохранились в -80 градусах по Цельсию для генерации S. mutans . - Смешайте 5 qL концентрированного второго продукта ПЦР с 50 qL аликот ледяных компетентных клеток, замороженных ранее. Добавить смесь в электропорации кюветы. Дайте один электрический импульс (1,8 кВ, 2,5 мс, 600,0, 10 кВ) клеткам с помощью электропорационного аппарата.
- Приостановите действие клеток в 500 л бульона BHI. Немедленно, распространение 10-100 л суспензии на BHI агар пластин, содержащих спектромицин. Инкубировать пластины в течение 2-6 дней при 37 градусах Цельсия, пока колонии не выросли достаточно, чтобы быть подобраны.
5. Проверка Genome рекомбинации и хранения
- Выполните колонии PCR, используя gtfC-вперед и колонии-обратной грунтовки для экрана для рекомбинации. Электрофорез ы каждой колонии ПЦР продукт на агарозный гель. Подтвердите фрагмент ДНК примерно 1500 bp.
- Выберите одну из положительных колоний с помощью стерилизованной зубочистки и субкультуры клеток на ночь в 2 мл бульона BHI, содержащего спектромицин.
- Смешайте 0,8 мл бактериальной культуры с 0,8 мл стерильного 50% глицерола и бульон при -80 градусах или -20 градусов по Цельсию.
- Перенесите оставшийся 1 мл клеточной подвески в микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 мл. Повторите шаги 2.3-2.7 для извлечения геномной ДНК из клеток.
- Выполните ПЦР с использованием вверх вперед и вниз-обратно грунтовки и геномной ДНК в качестве шаблона. Повторите шаг 3.2 для очищения усиленного продукта ДНК от гелей.
- Определите последовательность ДНК очищенного ампромликона по секвенированию ДНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, чтобы подтвердить поколение S. mutans Его-gtfC по секвенированию ДНК.
6. Очистка полистицидина по метке GTF-SI
- Streak S. mutans His-gtfC на спектромицин-содержащую BHI агар пластины. Инкубировать их на ночь при 37 градусах Цельсия.
- Возьмите одну колонию с помощью стерилизованной зубочистки и субкультуры клеток в 3 мл бульона BHI. Инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия.
- Приготовьте две конические колбы с 1 l бульона BHI без спектромицина. Прививать 1 мл ночной культуры подвески в 1 л бульона BHI. Инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия.
- Концентрируйте протеины от supernatant культуры высыпанием сульфата аммония.
ПРИМЕЧАНИЕ: Извлекайте из клеточных тел, если целевой белок внутриклеточного. Основные процедуры для осадков сульфат аммония подробно в другом месте12.- Центрифуги бактериальной культуры суспензии в течение 20 мин при 10000 х г при 4 c. Восстановить культуры supernatant в 3 L стеклянный стакан.
- Добавьте 1122 г сульфата аммония в 2 л супернатанта (80% насыщения) с энергичным перемешиванием с помощью магнитного мешалки. Разрешить осадок сформировать в течение 4 ч или более при 4 градусах Цельсия с перемешиванием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Формирование осадка может быть продолжено в одночасье. - Центрифуги аммиак сульфат-осаждаемый раствор при 15000 х г в течение 20 мин при 4 градусах Цельсия. Декант супернатант.
- Соберите осадок шпателем и перенесите в стеклянный стакан 200 мл. Отрептутивать гранулы в 35 мл связывающего буфера (50 мм2PO4,300 мМ NaCl, 5 мМ имидазола, pH 8.0).
- Диализировать подвеску против 2500 мл связывающего буфера с помощью регенерированной целлюлозы диаметра трубки, при 4 кв С, с перемешиванием. Замените диализный раствор после 2 ч и продолжайте диализ на ночь.
- Замените раствор диализа снова. Продолжайте диализ для дополнительных 2 ч.
- Центрифуга диализированной подвески на 20000 х г в течение 10 мин при 4 c. Фильтр супернатант через мембранный фильтр с помощью всасывающего фильтрационного оборудования. Перенесите фильтрат на колбу 75 см2.
- Фракция пополистидин-тегами GTF-SI от фильтрообразной подвески с помощью обездвиженной хроматографии сродства металла (IMAC).
- Передача 2 мл суспензии с госраствором IMAC (примерно 1 мл из мина семы) в хроматографическую колонку, розетка которой установлена на силиконовую трубку. Удалите решение для хранения с помощью гравитационного потока.
ПРЕДЕКТО: Не допускайте высыхания по всему IMAC. - Добавьте 3 мл дистиллированной воды в колонку, чтобы помыть посуду. Добавьте 5 мл связывающего буфера, чтобы уравновесить пошельнку.
- Выключите поток с Hoffmann щепотку петух. Добавьте 5 мл отфильтроченной подвески со ступени 6.5, чтобы сделать суспензию.
- Добавьте всю суспензию в оставшуюся отфильтрованную подвеску. Закрутите смесь осторожно в течение 30 мин при 4 градусах По Цельсию.
- Загрузите смесь обратно на столбец. Удалите подвеску гравитационным потоком. Вымойте resin IMAC с 20 мл связывающего буфера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте скорость потока примерно до 2 мл/мин с помощью рваного петуха Хоффмана на протяжении всего последующего IMAC. - Выявите рекомбинантный GTF-SI с 20 мл элютионного буфера (50 мМ2PO4,300 мМ NaCl, 500 мМ имидазол, pH 8.0).
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. Элуат должен храниться при 4 градусах Цельсия. Resin IMAC можно использовать повторно. Обратитесь к инструкциям для мизины.
- Передача 2 мл суспензии с госраствором IMAC (примерно 1 мл из мина семы) в хроматографическую колонку, розетка которой установлена на силиконовую трубку. Удалите решение для хранения с помощью гравитационного потока.
- Замените буфер elution буфером хранения (50 мМ фосфатный буфер, pH 6.5) и концентрируйте рекомбинантный раствор GTF-SI примерно на 1 мл с помощью центробежного ультрафильтрационного блока. Храните рекомбинантный раствор GTF-SI при 4 градусах По Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подтвердите политистидин помечены GTF-SI очистки с помощью SDS-PAGE13 и западной blotting14, используя хрен пероксидазы-конъюгированные анти-полихистидин моноклональных антител. Добавление CHAPS (окончательная концентрация, 0.1%) к eluent может быть необходимо во избежание nonspecific adsorption к блоку, в зависимости от протеина цели.
7. Функционная реставрация рекомбинантной GTF-SI
- Полоса каждого S. Mutans деформации на BHI агар пластины индивидуально. Инкубировать тарелки на ночь при 37 градусах Цельсия.
- Используя стерилизованные зубочистки, подобрать одну колонию, чтобы привить в 2 мл бульона BHI. Инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия.
- Используйте 20 зЛ ночной культуры S. mutans и gtfC, чтобы привить 2 мл бульона BHI, содержащего 1% сахарозы без антибиотиков в стеклянной пробирке. Добавьте GTF-SI или эквивалентный объем транспортного средства к культуре S. mutans иgtfC, и культурные клетки с трубкой, помещенной в наклонное положение, на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизовать раствор GTF-SI с помощью стерильного фильтра шприца и определить концентрацию белка с помощью анализа белка бисинхониновой кислоты15 перед использованием. - Агитировать культуры подвески с вихрем смеситель для 10 s. Decant подвески. Вымойте пробирки достаточным количеством дистиллированной воды.
- Пятно биопленок на трубчатой стене с 1 мл 0,25% Coomassie блестящий синий (CBB).
- Декантирование окрашивающий раствор после 1 мин. Вымойте пробирки с достаточным количеством дистиллированной воды. Воздушно-сухие пробирки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 3 показан размер каждого ампромтона от первого ПЦР(рисунок 3A)и второго ПЦР(рисунок 3B). Размер каждого амблона соответствовал прогнозируемому размеру, как описано в таблице 1. На рисунке 4A показаны колонии S. mutans, преобразованные со вторым продуктом ПЦР и покрытые на агарных пластинах BHI, содержащих спектромицин. Продукция колонии ПЦР затем запускались на геле агарозы(рисунок 4B). Каждый ампикон был прогнозируемого размера, как описано в таблице 1. На рисунке 5 показаны изображения SDS-PAGE и западного подавили. Белок, очищенный iMAC, был замечен в качестве одной полосы SDS-PAGE(рисунок 5A). Западная поместье была выполнена с использованием антиполититидиновых антител, чтобы подтвердить, что наблюдаемая полоса была ожидаемым полихисттидином-тегами белка(рисунок 5B) 160 kDa. На рисунке 6 показана биопленка, полученная из сахарозы, способность каждого штамма S. mutans. Только S. mutans WT и S. mutans His-gtfC могли образовывать адепт биопленку на трубчатой стене в присутствии 1% сахарозы. Этого не наблюдалось в S. mutans s gtfC (рисунок 6A). Тем не менее, добавление рекомбинантных GTF-SI восстановила способность формирования адептов биопленки в S. mutans s gtfC (Рисунок 6B).
Рисунок 1: Организация gtfC и spcr loci в геноме S. mutans UA159 и его производных. Схематическая иллюстрация Его-тег между gtfC и spcr. Длина генов и пробелов не масштабируются. Затененный пятиугольник: СМУ-1004; твердый пятиугольник: SMU-1006. Эта цифра была изменена по сравнению с предыдущей публикацией2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Стратегия двухступенчатого слияния ПЦР. Схематическая иллюстрация S. мутаны Его-gtfC строительство. Длина генов и пробелов не масштабируются. Сайты, связывающие грунтовки в шаблоне, указаны шаблонами. (A) Регионы, укрывающие часть гена gtfC в геноме S. mutans WT и укрывающие spcr в геноме S. mutans иgtfC были усилены с помощью первого ПЦР. (B) Второй ПЦР был выполнен с вложенными грунтовки с использованием двух фрагментов, которые были усилены первым ПЦР в качестве шаблонов, и днк-конструкция для гомологивой рекомбинации была получена. (C) штамм мутантов был создан при гомологивой рекомбинации в бактериях. Эта цифра была изменена по сравнению с предыдущей публикацией2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Электрофорус геля Агарозе первого и второго ПЦР. (A)Показаны продукты первого ПЦР части gtfC (gtfC; левое изображение) и области укрывательства spcr (spcr; правое изображение). Одно электрофоретическое изображение делится на обозначения маркерных полос. (B) Показаны вторые продукты ПЦР, усиленные вложенными грунтовками. Каждая наконечник стрелы указывает на прогнозируемый размер каждого продукта ПЦР. М и молекулярный маркер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Колония PCR для экрана поколения S. mutans его-gtfC. (A) S. mutans колоний преобразован ы второй продукт ПЦР показаны. Идентификатор колонии указан по кружевным числам. (B) Агарозгель электрофорез колонии ПЦР продуктов показано. Номер кольцевой полосы соответствует идентификатору колонии на рисунке 4А. М и молекулярный маркер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Подтверждение очистки GTF-SI с тегами погиститидин. (A) Отображается репрезентативное изображение SDS-PAGE. (B) Представитель западного поблужки изображение показано. Мембрана нитроцеллюлозы, на которую был перенесен GTF-SI, была исследована с помощью хрена пероксидазы-конъюгированного моноклонального антитела антиполитистидина. Иммунореактивные полосы были визуализированы с помощью реакции хемилюминесценции. Наконечники стрел указывают на прогнозируемый размер рекомбинантного GTF-SI. M: молекулярный маркер; 1 - выборка до IMAC; 2 - образец, полученный IMAC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Функциональная реставрация путем добавления рекомбинантного GTF-SI. (A) Способность сахарозы полученных адепта биопленки формирования показано для каждого штамма S. mutans. (B) Способность формирования адепт биопленок была восстановлена в S. mutans s gtfC путем добавления рекомбинантных GTF-SI (25 мкг). WT и С. мутаны WT; гтфС иС. мутаны гтфК; Его-gtfC s.mutans Его-gtfC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Праймер пары | Последовательность (от 5 до 3") | Ожидаемый размер полосы (bp) | ||
| 1-й ПЦР | ||||
|
gtfC- вперед gtfC-реверс A,B |
ТААГГГТТАТТАТТЦААКГАГТГТЯАКК АТГАТАГАТАГАТАЦАККАККАККАКК АААТКТАААААААААТЦЦАА |
1,090 | ||
|
spcr-forward A,C spcr-обратное |
GGTGGTAGTCATCATCATCATCATCATCATCAT КОШКА ТАААТГГАТТКГТГГГААТ TTAAGAGCAAGTTAGAACATGTACTCAC |
2,232 | ||
| 2-й ПЦР | ||||
| Вложенный вперед Вложенный реверс |
TGGTATTTCGATAATAACGGTATATTTCAC GCCATACTTAGAGAAATTCTTTGCTAAATCTTTTGG |
3,179 | ||
| Проверка рекомбинации | ||||
| Колония ПЦР | ||||
|
gtfC- вперед Колония-реверс |
ТААГГГТТАТТАТТЦААКГАГТГТЯАКК CCACTCTCAACTTGATTGATCCAACATGTAGTAGTACC |
1,482 | ||
| Окончательная проверка | ||||
| Вверх-вперед Вниз-обратно |
TACGGCCGTATCAGTTTTACGATGTAACTAACTCTGG TTGTCCACTTGAAGTCAACCTCTTGCAAGGCATG |
6,173 | ||
Таблица 1: Праймеры, используемые в протоколе. A Подчеркнутые последовательности 'gtfC-реверс и spcr-forward'дополняют друг друга, и жирный-типированный последовательности для Его-тега(gtfC-обратно; АТГАГАТАГАГ, spcr-forward; CATCATCATCATCATCATCAT) и GS связующее звено(gtfC-реверс; ACTACCACCACCTCC, spcr-forward; GGTGGTAGT). B Кодон остановки ДНК gtfC был удален. C Кодон-стоп ДНК (TAA) был добавлен сразу после последовательности полигиститидина кодирования.
| Реагента | Концентрация биржевого раствора | Объем | Окончательная концентрация |
| Премикс ДНК-полимераза | 2x | 25 зл. | 1x |
| Передняя грунтовка | 5 км | 2 л | 0,2 мкм |
| Обратная грунтовка | 5 км | 2 л | 0,2 мкм |
| Шаблон ДНК | Переменной | Переменной | Переменной |
| Деионизированная вода | - | До 50 л л | - |
Таблица 2: РЦП реагенты: Для первого ПЦР было добавлено 2 злиц шаблона ДНК. Для второго ПЦР в реакционную смесь был добавлен 0,5-2 л первого ампликона ПЦР. Для колонии ПЦР, бактериальные клетки были непосредственно добавлены в реакционную смесь.
| Шаг | Температура | Время | Количество циклов |
| Первоначальная денатурация | 98 кв. c | 2 мин. | 1 |
| Денатурация Отжига Расширение |
98 кв. c 50 кв. c 72 кк с |
10 с 5 с Ампликон-зависимый (1 мин/1 кбитт) |
35 |
| Окончательное расширение | 72 кк с | Ампликон-зависимый (1 мин/1 кбитт) |
1 |
Таблица 3: Циклы усиления ПЦР.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Конструкция грунтовок является наиболее важным шагом в протоколе. Последовательности gtfC-обратнойи spcr-forwardпраймеры были автоматически определены на основе последовательностей как 3 "конец области gtfC и 5" конец области spcr. Каждый праймер включает в себя 24 дополнительных баз, которые кодируют gs linker и его-тег-кодирования последовательности в их 5 'регионов. Нарушения местных регулятивных последовательностей, расположенных в восходящих фланговых регионах, можно избежать путем добавления последовательностей кодирования его тегов к концу 3 '. Кодон остановки ДНК должны быть удалены из gtfC-обратныйгрунт овтер и добавлены в spcr-forwardгрунтовки. Кроме того, gtfC-forwardи spcr-реверсдолжны быть разработаны для усиления фланговых областей примерно 1 кб вверх по течению и вниз по течению целевой области гомологичная рекомбинация в геноме S. mutans WT, Соответственно. Добавление длинных фланговых последовательностей повышает эффективность гомологивой рекомбинации. Вложенные грунтовки были разработаны для использования вместо внешней пары грунтовок(gtfC-forwardи spcr-reverse)в этом протоколе. Включение вложенных грунтовок требуется для второго ПЦР, как подробно в другом месте5.
Преобразование путем электропорации является эффективным1 и процедуры для компетентного клеточного препарата, предшествующего электропорации также гораздо проще по сравнению с альтернативными методами16,17,18, хотя требуется электропорация аппарата. Настоятельно рекомендуется готовить компетентные S. mutans WT заново в случае отсутствия колоний на пластине после электропорации. Хотя инкубация в течение нескольких часов после электропорации может повысить эффективность преобразования, дополнительная инкубация не влияет на успех преобразования. Клетки в фазе роста журнала должны быть использованы для компетентного подготовки клеток, как описано ранее5.
Поскольку количество рекомбинантного белка зависит от родной экспрессии гена, в случаях белков с более низкой экспрессией может потребоваться культура масштабирования. Представленный здесь метод ограничен применением функционального восстановления. Добавление гена интереса не может быть применено к внутриклеточным белкам экзогенно. Тем не менее, разработанный метод представляет значительные преимущества с точки зрения объекта, эффективности и стоимости (например, никаких ферментативных реакций, кроме ПЦР) при работе с внеклеточным целевым белком. Кроме того, очистка рекомбинантного белка и подтверждение фактической экспрессии генов может быть выполнена просто с помощью общих применений Его тегов, как показано на рисунке 5.
Нынешний метод, включая нарушение генов и изоляцию генного продукта, может быть адаптирован для использования в будущем у других видов в качестве последовательных экспериментов для функционального анализа интересуемого гена.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Японским обществом содействия науке (JSPS) (гранты 16K15860 и 19K10471 до Т. М., 17K12032 до М. И., и 18K09926 н. Х.) и SECOM Научно-технический фонд (SECOM) (грант No 2018.09.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Nippon Genetics | NE-AG02 | For agarose gel electrophoresis |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Anti-His-Tag monoclonal antibody | MBL | D291-7 | HRP-conjugated |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Measurement of protein concentration |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture medium |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
| Centrifugal ultrafiltration unit | Sartorius | VS2032 | Buffer replacement and protein concentration |
| Centrifuge | Kubota | 7780II | |
| Chromatographic column | Bio-Rad | 7321010 | For IMAC |
| Dialysis membrane clamp | Fisher brand | 21-153-100 | |
| Dialysis tubing | As One | 2-316-06 | |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| DNA sequencing | Eurofins Genomics | ||
| ECL substrate | Bio-Rad | 170-5060 | For western blotting |
| EDTA (0.5 M pH 8.0) | Wako | 311-90075 | Tris-EDTA buffer preparation |
| Electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652086 | 0.2 cm gap |
| Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| EtBr solution | Nippon Gene | 315-90051 | For agarose gel electrophoresis |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Imager | GE Healthcare | 29083461 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Imidazole | Wako | 095-00015 | Binding buffer and elution buffer preparation |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | EZ-022 | Temperature setting: 4 °C |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | LH-100-RDS | Temperature setting: 37 °C |
| Membrane filter | Merck Millipore | JGWP04700 | 0.2 µm diameter |
| Microcentrifuge | Kubota | 3740 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaH2PO4·2H2O | Wako | 192-02815 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| (NH4)2SO4 | Wako | 015-06737 | Ammonium sulfate precipitation |
| Ni-charged resin | Bio-Rad | 1560133 | For IMAC |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | |
| Protein standard | Bio-Rad | 161-0381 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Solvent filtration apparatus | As One | FH-1G | |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics; use at 100 μg/mL |
| Sterile syringe filter | Merckmillipore | SLGV004SL | 0.22 µm diameter |
| Streptococus mutans ΔgtfC | Stock strain in the lab. | gtfC replaced with spcr | |
| Streptococus mutans UA159 | Stock strain in the lab. | S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain | |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| TAE (50 × ) | Nippon Gene | 313-90035 | For agarose gel electrophoresis |
| Thermal cycler | Bio-Rad | PTC-200 | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | Wako | 314-90065 | Tris-EDTA buffer preparation |
References
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
- Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product. Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).
- Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
- Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101 (2016).
- Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning. Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).
- Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).
- LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Database, J. S. E.
- Database, J. S. E.
- Database, J. S. E.
- Wingfield, P. T.
- Database, J. S. E.
- Database, J. S. E.
- Smith, P. K., et al.
- Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).
- Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
- Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
