Summary
Beskrivs här är en enkel metod för rening av en genprodukt i Streptococcus mutans. Denna teknik kan vara fördelaktigt vid rening av proteiner, särskilt membranproteiner och högmolekylära massa proteiner, och kan användas med olika andra bakteriearter.
Abstract
Klargörande av en gens funktion innebär vanligtvis jämförelser av fenotypiska egenskaper hos vildtyp stammar och stammar där genen av intresse har störts. Funktionsbortfall efter gen rubbning återställs därefter genom exogent tillägg av produkten av den störde genen. Detta hjälper till att bestämma funktionen av genen. En metod som tidigare beskrivits innebär att generera en Gtfc gen-störd Streptococcus mutans stam. Här beskrivs en krävande metod för rening av Gtfc -genprodukten från den nygenererade S. mutans stammen efter gen störningen. Det innebär tillsats av en polyhistidin-kodning sekvens vid 3 ′ slutet av genen av intresse, vilket möjliggör enkel rening av genprodukten med immobiliserade metallaffinitetskromatografi. Inga enzymatiska reaktioner än PCR krävs för den genetiska modifieringen i denna metod. Återställandet av genprodukten genom exogent tillägg efter gen rubbning är en effektiv metod för bestämning av genfunktion, som också kan anpassas till olika arter.
Introduction
Analys av en genfunktion innebär vanligtvis jämförelser av fenotypiska drag av vildtyp stammar till stammar där genen av intresse har störts. När den gen-störd stam produceras, exogent tillägg av genprodukten möjliggör funktionell restaurering.
Den vanligaste metoden för att erhålla renade genprodukter som krävs för efterföljande restaurerings analyser är genom att utföra heterologt uttryck i Escherichia coli1. Men, uttrycket av membranproteiner eller högmolekylära massa proteiner är ofta svårt att använda detta system1. I dessa fall är målproteinet vanligtvis isolerat från de celler som inbyggt syntetiserar proteinet genom en komplex serie av steg, vilket kan leda till förlust av genprodukten. För att övervinna dessa frågor har ett enkelt förfarande tagits fram för rening av genprodukter efter en gen störnings metod2, PCR-baserad DNA-skarvning metod3 (betecknat två-stegs fusion PCR) och elektroporation för genetiska omvandling i Streptococcus mutans. Tillsats av en polyhistidin tagg (his-tag) till C-terminus av genprodukten underlättar dess rening genom immobiliserade metallaffinitetskromatografi (IMAC).
För att isolera hans-tag-uttrycker stam, är hela genomisk DNA av genen av intresse (i detta hans-tag-uttrycker gen-störd stam) ersätts med en antibiotikaresistent markörgen. Förfarandet för att generera sin-tag-uttrycker strainis nästan identisk med den för att generera en gen-störd stam som beskrivs tidigare4,5. Därför bör metoderna för gen störningar och genprodukt isolering utföras som serie experiment för funktionell analys.
I det nuvarande arbetet, en polyhistidin-kodning sekvens är knuten till 3 ′ slutet av Gtfc (genbank Locus tag SMU_1005) gen, kodning glukosyltransferas-si (GTF-SI) i S. mutans6. Därefter utfördes uttrycks studier i en streptokockart. Att uppnå heterologa gtfc uttryck genom E. coli är svårt, sannolikt på grund av den höga molekylära massan av GTF-si. Denna stam heter S. mutans his-gtfc. En Schematisk illustration som skildrar organisationen av gtfc och Spektinomycin Resistance Gene kassett (SPCr)7 loci i Wild-Type S. mutans (s. mutans WT) och dess derivat visas i Figur 1. GTF-SI är ett sekretoriskt protein som bidrar till utvecklingen av cariogenic Dental biofilm6. Under närvaron av sackaros, en anhängare biofilmobserveras på en slät glasyta i WT S. mutans stam men inte i s. mutans gtfc-störd stam (s. mutans Δgtfc)2,5 . Biofilmformation återställs i S. mutans Δgtfc vid exogent tillägg av rekombinant GTF-si. Stammen, S. mutans his-gtfc, används sedan för att producera den rekombinanta GTF-si.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Anmärkning: Generering av S. mutans ∆gtfc, där hela kodnings området för gtfc -genen ersätts med SPCr, måste slutföras innan dessa protokoll utförs. Mer information om generering5finns i den publicerade artikeln.
1. primer design
-
Förbered primers för byggandet av S. mutans his-gtfc.
Anmärkning: De primer-sekvenser som används i detta protokoll visas i tabell 1. Tvåstegs fusion PCR-metod för generering av S. mutans his-gtfc illustreras schematiskt i figur 2.- Design primers (gtfc-Reverse och SPCr-forward) för fastsättning av hans-tag-kodning sekvens, mellanliggande mellan gtfc genen och SPCr (figur 2A).
- Inkludera GS Linker och his-tag-kodning sekvens i både Gtfc-Reverse och SPCr-Forward primers, där 24 baser i 5 ' regioner kompletterar varandra.
Obs: aminosyran sekvens av GS länkare och hans-tag (GLY-GLY-GLY-GLY-ser-hans-hans-hans-hans-hans-his-hans) är knuten till C-terminus av GTF-SI genom gen översättning. - Designa en gtfc-Forward primer för att rikta den gtfc genen i S. mutans WT genom > 1 KB nedströms av genen och SPCr-Reverse primer för att rikta den nedströms kompletterande regionen av SPCr i S. mutans ∆gtfc. Ställ in smälttemperaturen8 (Tm) på gtfc-forward och SPCr-Reverse primers för att matcha med smält temperaturerna för gtfc-Reverse och SPCr- respektive Forward primers.
- Inkludera GS Linker och his-tag-kodning sekvens i både Gtfc-Reverse och SPCr-Forward primers, där 24 baser i 5 ' regioner kompletterar varandra.
- Designa kapslade primers (kapslade-framåt och kapslade-Reverse) för den andra PCR (figur 2b).
- Design primers (Gtfc-forward och Colony-Reverse) specifikt för GENOMISKT DNA av Transformanten (figur 2C; PRIMERS används för Colony PCR).
Anmärkning: Amplikonerna grenslar gränsen mellan gtfc och SPCr. Den Gtfc-Forward Primer kan appliceras som framåt primer. - Design primers (upp-framåt och ned-Reverse) för slutlig bekräftelse av generering av S. mutans his-gtfc (figur 2C; PCR-produkten som FÖRSTÄRKS av primers används för DNA-sekvensering).
- Design primers (gtfc-Reverse och SPCr-forward) för fastsättning av hans-tag-kodning sekvens, mellanliggande mellan gtfc genen och SPCr (figur 2A).
2. genomisk DNA-extraktion från S. mutans
Anmärkning: Varje S. mutans stam bör odlas i hjärnan hjärta infusion (BHI) medium vid 37 ° c under anaeroba förhållanden. Mutant stammar av s. mutans ∆gtfc och s. mutans his-gtfc odlas i BHI kompletterat med 100 μg/ml spectinomycin.
- Streak s. mutans WT och s. mutans ∆gtfc separat på var och en av BHI-agarplattorna. Inkubera dem över natten vid 37 ° c.
- Välj enstaka kolonier av s. mutans WT eller s. mutans ∆gtfc med en steriliserad tandpetare och INOKULERA i 1,5 ml BHI-buljong. Inkubera dem över natten vid 37 ° c.
Anmärkning: Kolonierna kan användas som en källa till mallDNA för den första PCR (steg 3,1). - Överför 1 mL av varje bakteriekultur till ett 1,5 mL microcentrifugerör. Centrifugera kulturen i 1 min vid 15 000 x g.
- Avlägsna supernatanten och tillsätt 1 mL av Tris-EDTA-bufferten (pH 8,0) för att Återsuspendera cellpelleten.
- Centrifugera fjädringen i 1 min vid 15 000 x g. Ta bort supernatanten. Omsuspendera cellpelleten i 50 μL av Tris-EDTA-bufferten (pH 8,0).
- Värm suspensionen med hjälp av en blockinkubator i 5 min vid 95 ° c. Centrifugera fjädringen i 5 minuter vid 15 000 x g.
- Överför supernatanten till ett nytt 1,5 mL microcentrifugerör (supernatanten kommer att fungera som mall-DNA för den första PCR).
3. PCR-amplifiering
Anmärkning: Tabell 1, tabell 2och tabell 3 sammanfattar PCR-primers, reagenser och amplifieringscykler.
- Utför den första PCR- filen med s. mutans WT och s. mutans ∆GTFC genomet som PCR-mallar. Förstärka de regioner som härbärgera nedströms delen av genen Gtfc och de härbärgera SPCr med hjälp av primers som beskrivs i steg 1.1.1.2 (figur 2A).
- Elektroforese varje PCR-produkt på 1% aguppkom gel. Punktskatter de önskade DNA-fragmenten på cirka 1 000 BP och 2 000 BP. renar fragment från geler med kiseldioxid membran-baserade gel utvinning metod.
Anmärkning: De grundläggande förfarandena för PCR9, DNA gel elektrofores10, och DNA rening11 beskrivs på annat håll. - Utför en andra PCR med hjälp av produkterna från den första PCR (ungefär equimolar) som PCR-mallar med kapslade-framåt och kapslade-omvänd primers (figur 2b).
- Elektroforese en tiondel av PCR-blandningen på agaros-gelen. Bekräfta uppkomsten av en lämplig amplikon på cirka 3 000 BP.
-
Den återstående PCR-produkten fälls ut.
Anmärkning: rening av PCR-produkten är inte nödvändig, eftersom icke-specifika amplikoner som genereras av den andra PCR inte stör homolog rekombination.- Tillsätt Nuclease-fritt vatten till PCR-blandningen och ta den totala volymen till 100 μL, följt av 0,1 volym (10 μL) av 3 M natriumacetat (pH 5,2) och 2,5 volymer (250 μL) av absolut etanol. Blanda och förvara blandningen i 10 min vid rumstemperatur (RT).
- Centrifugera provet i 20 min vid 15 000 x g vid 4 ° c. Kassera supernatanten. Tillsätt 1 mL 70% etanol för att tvätta DNA-pelleten.
- Centrifugera provet i 5 minuter vid 15 000 x g vid 4 ° c. Kassera supernatanten. Lufttorka och lös upp DNA-pelleten med 10 μL nukleasfritt vatten.
4. cell omvandling
- Förbered den behöriga s. mutans WT för att introducera den andra PCR-produkten genom att följa stegen som beskrivs i föregående publikation5. Förvara cellerna vid-80 ° c.
Anmärkning: För detta experiment har de behöriga s. mutans WT-cellerna redan bevarats i-80 ° c för att generera S. mutans ∆gtfc. - Blanda 5 μL av den koncentrerade andra PCR-produkten på den 50 μL alikvot av iskall kompetenta celler som tidigare har frysts. Tillsätt blandningen i elektroporation cuvettes. Ge en enda elektrisk puls (1,8 kV, 2,5 MS, 600 Ω, 10 μF) till cellerna med hjälp av elektroporation apparaten.
- Omsuspendera cellerna i 500 μL BHI-buljong. Fördela omedelbart 10 – 100 μL av suspensionen på BHI-agar-plattor som innehåller spectinomycin. Inkubera plattorna i 2 – 6 dagar vid 37 ° c tills kolonierna har vuxit tillräckligt för att plockas upp.
5. verifiering av rekombination och lagring av G enome
- Utför Colony PCR, med gtfC-forward och Colony-Reverse primers till Screen för rekombination. Electrophorese varje koloni PCR produkt på en agaros gel. Bekräfta DNA-fragmentet på cirka 1 500 BP.
- Välj en av de positiva kolonierna med hjälp av en steriliserad tandpetare och subkultur cellerna över natten i 2 mL BHI buljong som innehåller spectinomycin.
- Blanda 0,8 mL av bakteriekulturen med 0,8 mL steril 50% glycerol och lager vid-80 ° c eller-20 ° c.
- Överför resterande 1 mL cellsuspension till ett 1,5 mL microcentrifugerör. Upprepa steg 2.3 – 2.7 för att extrahera genomiskt DNA från cellerna.
- Utför PCR med uppåtriktade och nedåtvända primers och genomiskt DNA som mall. Upprepa steg 3,2 för att rena den amplifierade DNA-produkten från gelen.
- Bestäm DNA-sekvensen av den renade amplikon genom DNA-sekvensering.
Anmärkning: Se till att bekräfta generering av S. mutans his-GTFC genom DNA-sekvensering.
6. rening av Polyhistidin-märkta GTF-SI
- Streak S. mutans his-gtfc på en spectinomycin-innehållande BHI agar tallrik. Inkubera dem över natten vid 37 ° c.
- Plocka upp en enda koloni med hjälp av en steriliserad tandpetare och subkultur celler i 3 mL BHI buljong. Inkubera över natten vid 37 ° c.
- Bered två koniska kolvar med 1 L BHI buljong utan spectinomycin. Inokulera 1 mL av natten kultur suspensionen i 1 L av BHI buljong. Inkubera över natten vid 37 ° c.
- Koncentrera proteiner från kultursupernatanten genom ammoniumsulfatnederbörd.
Anmärkning: utdrag ur cell kroppar om ett målprotein är intracellulär. De grundläggande förfarandena för ammoniumsulfatnederbörd beskrivs på annat håll12.- Centrifugera bakteriekulturen suspensionen i 20 min vid 10 000 x g vid 4 ° c. Återvinna kulturen supernatanten i en 3 L glasbägare.
- Tillsätt 1 122 g ammoniumsulfat till 2 L av supernatanten (80% mättnad) med kraftig omrörning med magnetomrörare. Låt fällningen bildas i 4 h eller mer vid 4 ° c under omrörning.
Notera: utfällningen kan fortsätta över natten. - Centrifugera ammoniumsulfatutfälld lösning på 15 000 x g i 20 min vid 4 ° c. Dekanera supernatanten.
- Samla upp fällatet med en spatel och överför till en 200 mL glasbägare. Omsuspendera pelletar i 35 mL bindningsbuffert (50 mM NaH2Po4, 300 mm NaCl, 5 mm imidazol, pH 8,0).
- Dialysera suspensionen mot 2 500 mL av bindningsbufferten med hjälp av en regenererad cellulosa dialys slang, vid 4 ° c, under omrörning. Byt ut dialys lösningen efter 2 timmar och fortsätt dialys över natten.
- Byt ut dialys lösningen igen. Fortsätt att dialysera för ytterligare 2 h.
- Centrifugera den dialyserade suspensionen vid 20 000 x g i 10 min vid 4 ° c. Filtrera supernatanten genom ett membranfilter med sug filtreringsutrustning. Överför filtratet till en 75 cm2 kolv.
- Fraktionera den polyhistidin-märkta GTF-SI från den filtrerade suspensionen genom immobiliserad metallaffinitetskromatografi (IMAC).
- Överför 2 ml av den ni-laddade iMac Resin flytgödsel (ca 1 ml harts) till en kromatografisk kolonn vars utlopp är monterat på ett Silikonrör. Ta bort lagringslösningen med gravitationens flöde.
Försiktighet: Låt inte hartset torka ut i hela IMAC. - Tillsätt 3 mL destillerat vatten i kolonnen för att tvätta hartset. Tillsätt 5 ml av bindningsbufferten för att jämvikt hartset.
- Stäng av flödet med en Hoffmann nypa kuk. Tillsätt 5 mL av den filtrerade suspensionen från steg 6,5 för att göra slurry.
- Tillsätt all flytgödsel till resterande filtrerad suspension. Snurra blandningen försiktigt i 30 min vid 4 ° c.
- Lägg tillbaka blandningen på kolonnen. Ta bort suspensionen genom gravitationens flöde. Tvätta IMAC-harts med 20 mL bindningsbuffert.
Anmärkning: Justera flödet till cirka 2 mL/min med en Hoffmann nypa kuk hela den efterföljande IMAC. - Eluera det rekombinanta GTF-SI: et med 20 mL av elutionsbufferten (50 mM NaH2Po4, 300 mm NaCl, 500 mm Imidazol, pH 8,0).
Anmärkning: Protokollet kan pausas här. Eluatet ska förvaras vid 4 ° c. IMAC Resin kan återanvändas. Se instruktionerna för IMAC-kådan.
- Överför 2 ml av den ni-laddade iMac Resin flytgödsel (ca 1 ml harts) till en kromatografisk kolonn vars utlopp är monterat på ett Silikonrör. Ta bort lagringslösningen med gravitationens flöde.
- Byt ut elueringbufferten mot lagringbufferten (50 mM fosfatbuffert, pH 6,5) och koncentrera den rekombinanta GTF-SI-lösningen till cirka 1 mL med en centrifugalultrafiltrationsenhet. Förvara den rekombinanta GTF-SI-lösningen vid 4 ° c.
Anmärkning: Bekräfta polyhistidine-Tagged GTF-SI rening med hjälp av SDS-PAGE13 och Western blotting14 genom att använda en pepparrot peroxidaskonjugerad anti-polyhistidin monoklonal antikropp. Tillsats av käkar (slutkoncentration, 0,1%) till eluenten kan krävas för att undvika ospecifik adsorption till enheten, beroende på målproteinet.
7. funktionell restaurering med rekombinant GTF-SI
- Streak varje s. mutans stam på en BHI agar plattan individuellt. Inkubera plattorna över natten vid 37 ° c.
- Med hjälp av en steriliserad tandpetare, plocka upp en enda koloni att Inokulera i 2 mL BHI buljong. Inkubera över natten vid 37 ° c.
- Använd 20 μL av natten kultur S. mutans ∆gtfc att Inokulera 2 ml BHI buljong som innehåller 1% sackaros utan antibiotika i ett glas provrör. Lägg till GTF-SI eller en motsvarande volym av fordonet till S. mutans ∆gtfc kultur, och kultur cellerna med röret placeras i en lutande position över natten.
Anmärkning: Sterilisera GTF-si-lösningen med ett sterilt spruta filter och bestäm protein koncentrationen med hjälp av ett och Acid protein test15 före användning. - Agitera kultur upphängningarna med en Vortex mixer för 10 s. Decant upphängningarna. Tvätta provrören med en tillräcklig mängd destillerat vatten.
- Fläcka biofilmerna på rörväggen med 1 mL 0,25% Coomassie Brilliant Blue (CBB).
- Häll av infärgnings lösningen efter 1 min. Tvätta provrör med en tillräcklig mängd destillerat vatten. Lufttorka provrör.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3 visar storleken på varje amplikon från den första PCR (figur 3a) och den andra PCR (figur 3b). Storleken på varje amplikon motsvarade den förväntade storleken, enligt beskrivningen i tabell 1. Figur 4a visar S. mutans kolonier transformerade med den andra PCR-produkten och pläterade på BHI-agar-plattorna som innehåller spectinomycin. Kolonin PCR-produkter kördes sedan på agaros-gelen (figur 4b). Varje amplikon var av förväntad storlek, som beskrivs i tabell 1. Figur 5 visar bilder av SDS-Page och Western blot. Protein som renas med IMAC observerades som ett enda band av SDS-PAGE (figur 5a). Western blot utfördes med anti-polyhistidin-antikropp för att bekräfta att det observerade bandet var det förväntade polyhistidinmärkta proteinet (Figur 5b) av 160 kDa. Figur 6 visar den sackaros-härledda biofilmbildande förmågan hos varje S. mutans stam. Endast s. mutans WT och s. mutans his-gtfc kan bilda en anhängare biofilm på röret väggen i närvaro av 1% sackaros. Detta observerades inte i S. mutans Δgtfc (figur 6a). Tillsatsen av det rekombinanta GTF-SI-programmet återställde dock den adherenta biofilmformationen i S. mutans Δgtfc (figur 6b).
Figur 1: organisation av Gtfc och SPCr loci i S. mutans UA159 Genome och dess derivat. En Schematisk illustration av his-tag mellan Gtfc och SPCr. Längderna på gener och luckor är inte att skala. Skuggad Pentagon: SMU_1004; fast Pentagon: SMU_1006. Denna siffra har ändrats från en tidigare publikation2. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: strategi för två-stegs fusion PCR. En Schematisk illustration av S. mutans Hans-Gtfc konstruktion. Längderna på gener och luckor är inte att skala. De primer-bindande platserna i mallen indikeras av mönster. (A) de regioner som härbärgade en del av genen gtfc i s. mutans WT genom och hyser SPCr i s. mutans Δgtfc -arvsmassan förstärkallades med hjälp av den första PCR. (B) den andra PCR utfördes med kapslade primers med hjälp av de två fragment som förstärkallades av den första PCR som mallar, och en DNA-konstruktion för homolog rekombination erhölls. Cden muterade stammen genererades vid homolog rekombination i bakterierna. Denna siffra har ändrats från en tidigare publikation2. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: agaros gel elektrofores av första och andra PCR-produkter. A) produkterfrån den första PCR-delen av en del av gtfc (gtfc; vänster bild) och regionen hyser SPCR (SPCR; höger bild) visas. Den enda elektroforetiska bilden är uppdelad för att märka markör banden. B) de andra PCR-produkterna som förstärks med de kapslade primersarna visas. Varje pilspets anger den förväntade storleken för varje PCR-produkt. M = molekyl markör. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: kolonin PCR till avskärma utvecklingen av S. mutans his-gtfc. (A) S. mutans kolonier som TRANSFORMERAS av den andra PCR-produkten visas. Koloni-ID anges med inringade siffror. B) aguppkom gel-elektrofores av kolonin PCR-produkter visas. Cirklade Lane nummer motsvarar kolonin ID i figur 4a. M = molekyl markör. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: bekräftelse av polyhistidin-märkt GTF-si rening. (A) representativ SDS-Page bild visas. (B) representativ Western blot-bild visas. En nitrocellulosa membran som GTF-si överfördes var sonderade med en pepparrot peroxidaskonjugerad anti-polyhistidin monoklonal antikropp. Immunoreaktiva band visualiserades med hjälp av en kemiluminiscensreaktion. Pilspetsen indikerar den förväntade storleken på den rekombinanta GTF-SI. M: molekylär markör; 1 = prov före IMAC; 2 = prov hämtat från IMAC. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: funktionell restaurering genom tillsats av rekombinant GTF-si. A) förmågan att bilda sackaros-härledda vidhäftande biofilmsbildning visas för varje S. mutans stam. B) förmågan att bilda anhängare av biofilmer återställdes i S. mutans Δgtfc genom tillsats av rekombinant GTF-si (25 μg). WT = S. mutans WT; Δgtfc = S. mutans δgtfc; Hans-gtfc = S. mutans his-gtfc. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Primer par | Sekvens (5 ′ till 3 ′) | Förväntad band storlek (BP) | ||
| 1: a PCR | ||||
|
Gtfc-Forward Gtfc-omvänd A, B |
TAAAGGTTATGTTTATTATTCAACGAGTGGTAACC Atgatgatgatgactaccaccacctcc AAATCTAAAGAAATTGTCAA |
1 090 | ||
|
SPCr-framåt A, C SPCr-omvänd |
Mer från Ggtggtagtcatcatcatcat Katten TAAATCGATTTTCGTTCGTGAAT TTAAGAGCAAGTTTAAGATAGAACATGTTACTCAC |
2 232 | ||
| 2: a PCR | ||||
| Kapslade-framåt Kapslade-omvänd |
TGGTATTATTTCGATAATAACGGTTATATGGTCAC GCCATACTTAGAGAAATTTCTTTGCTAAATTCTTG |
3 179 | ||
| Verifiering av rekombination | ||||
| Colony PCR | ||||
|
Gtfc-Forward Koloni-omvänd |
TAAAGGTTATGTTTATTATTCAACGAGTGGTAACC CCACTCTCAACTCCTGATCCAAACATGTAAGTACC |
1 482 | ||
| Slutlig kontroll | ||||
| Upp-vidarebefordra Ned-omvänd |
TACGGCCGTATCAGTTATTACGATGCTAACTCTGG TTGTCCACTTTGAAGTCAACGTCTTGCAAGGCATG |
6 173 | ||
Tabell 1: primers som används i protokollet. En en De understrukna sekvenser av "gtfC-Reverse och SPCr-Forward" är kompletterande, och fetstil-typad Sequencescode för hans-tagg (gtfc-Reverse; ATGATGATGATGATG, SPCr-Forward; CATCATCATCATCATCAT) och GS Linker (Gtfc-omvänd; ACTACCACCTCC, SPCr-Forward; GGTGGTAGT). B DNA-stoppet kodon av Gtfc har tagits bort. C En DNA-stopp kodon (TAA) har lagts till omedelbart efter polyhistidin-kodning sekvenser.
| Reagens | Koncentration av stamlösning | Volym | Slutliga koncentrationen |
| DNA-polymeras premix | 2x | 25 μL | 1x |
| Framåt primer | 5 μM | 2 μL | 0,2 μM |
| Omvänd primer | 5 μM | 2 μL | 0,2 μM |
| Mall-DNA | Variabel | Variabel | Variabel |
| Avjoniserat vatten | - | Upp till 50 μL | - |
Tabell 2: PCR-reagens: För den första PCR-filen lades 2 μL av DNA-mallen till. För den andra PCR sattes 0,5-2 μl av den första PCR-amplikon till reaktionsblandningen. För kolonin PCR, bakterieceller sattes direkt till reaktionsblandningen.
| Steg | Temperatur | Tid | Antal cykler |
| Initial denaturering | 98 ° c | 2 min | 1 |
| Denaturering Glödgning Förlängning |
98 ° c 50 ° c 72 ° c |
10 s 5 s Amplicon-beroende (1 min/1 KBP) |
35 |
| Final extension | 72 ° c | Amplicon-beroende (1 min/1 KBP) |
1 |
Tabell 3: PCR-amplifieringscykler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utformningen av primers är det mest kritiska steget i protokollet. Sekvenser av gtfc-Reverse och SPCr-Forward primers bestämdes automatiskt baserat på sekvenser av både 3 regionen gtfc och 5 region SPCr. Varje primer innehåller 24 kompletterande baser som kodar en GS-länkare och en his-tag-kodning sekvens i deras 5 ' regioner. Störningar av de infödda reglerande sekvenser som finns i uppströms kompletterande regioner kan undvikas genom tillägg av hans-tag-kodning sekvenser till 3 ′. DNA-stoppkodon måste avlägsnas från Gtfc-Reverse primer och läggas till SPCr-Forward primer. Dessutom bör Gtfc-forward och SPCr-Reverse utformas för att förstärka kompletterande regioner på cirka 1 KB uppströms och nedströms i målregionen för homolog rekombination i S. mutans WT-arvsmassa, Respektive. Tillsats av långa kompletterande sekvenser förbättrar effektiviteten av homolog rekombination. Kapslade primers utformades för att användas i stället för det yttersta primerparet (Gtfc-forward och SPCr-Reverse) i detta protokoll. Inkludering av kapslade primers krävs för den andra PCR, som beskrivs någon annanstans5.
Omvandling genom elektroporation är effektiv1 och förfaranden för kompetent cell beredning före elektroporation är också mycket enklare jämfört med de alternativa metoderna16,17,18, även om en elektroporation apparat krävs. Det rekommenderas starkt att förbereda kompetent s. mutans WT på nytt i händelse av saknade kolonier på plattan efter elektroporation. Även om inkubering för ett par timmar efter elektroporation kan förbättra omvandlings effektiviteten, påverkar den extra inkubationen inte framgången för omvandlingen. Celler i log tillväxtfasen bör användas för den behöriga cell beredning, som beskrivs tidigare5.
Eftersom mängden rekombinant protein beror på den infödda uttryck av genen, kan skala upp kulturen krävas i fall av proteiner med lägre uttryck. Den metod som presenteras här begränsas av tillämpningen av den funktionella restaurerings analysen. Tillsats av genen av intresse kan inte tillämpas på intracellulära proteiner exogent. Den utvecklade metoden ger dock avsevärda fördelar när det gäller anläggning, effektivitet och kostnad (t. ex. inga enzymatiska reaktioner än PCR) när man arbetar med det extracellulära målproteinet. Dessutom kan rening av rekombinant protein och bekräftelse av faktiska genuttryck utföras helt enkelt med hjälp av vanliga his-tag-program, som visas i figur 5.
Den nuvarande metoden, inklusive gen störningar och isolering av genprodukter, kan anpassas för framtida användning i andra arter som serie experiment för funktionell analys av en gen av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av det japanska sällskapet för främjande av vetenskap (JSPS) (Grant nummer 16K15860 och 19K10471 till T. M., 17K12032 till M. I. och 18K09926 till N. H.) och SECOM Science and Technology Foundation (SECOM) (bidrags nummer 2018.09.10 nr 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Nippon Genetics | NE-AG02 | For agarose gel electrophoresis |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Anti-His-Tag monoclonal antibody | MBL | D291-7 | HRP-conjugated |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Measurement of protein concentration |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture medium |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
| Centrifugal ultrafiltration unit | Sartorius | VS2032 | Buffer replacement and protein concentration |
| Centrifuge | Kubota | 7780II | |
| Chromatographic column | Bio-Rad | 7321010 | For IMAC |
| Dialysis membrane clamp | Fisher brand | 21-153-100 | |
| Dialysis tubing | As One | 2-316-06 | |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| DNA sequencing | Eurofins Genomics | ||
| ECL substrate | Bio-Rad | 170-5060 | For western blotting |
| EDTA (0.5 M pH 8.0) | Wako | 311-90075 | Tris-EDTA buffer preparation |
| Electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652086 | 0.2 cm gap |
| Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| EtBr solution | Nippon Gene | 315-90051 | For agarose gel electrophoresis |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Imager | GE Healthcare | 29083461 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Imidazole | Wako | 095-00015 | Binding buffer and elution buffer preparation |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | EZ-022 | Temperature setting: 4 °C |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | LH-100-RDS | Temperature setting: 37 °C |
| Membrane filter | Merck Millipore | JGWP04700 | 0.2 µm diameter |
| Microcentrifuge | Kubota | 3740 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaH2PO4·2H2O | Wako | 192-02815 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| (NH4)2SO4 | Wako | 015-06737 | Ammonium sulfate precipitation |
| Ni-charged resin | Bio-Rad | 1560133 | For IMAC |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | |
| Protein standard | Bio-Rad | 161-0381 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Solvent filtration apparatus | As One | FH-1G | |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics; use at 100 μg/mL |
| Sterile syringe filter | Merckmillipore | SLGV004SL | 0.22 µm diameter |
| Streptococus mutans ΔgtfC | Stock strain in the lab. | gtfC replaced with spcr | |
| Streptococus mutans UA159 | Stock strain in the lab. | S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain | |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| TAE (50 × ) | Nippon Gene | 313-90035 | For agarose gel electrophoresis |
| Thermal cycler | Bio-Rad | PTC-200 | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | Wako | 314-90065 | Tris-EDTA buffer preparation |
References
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
- Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product. Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).
- Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
- Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101 (2016).
- Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning. Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).
- Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).
- LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Database, J. S. E.
- Database, J. S. E.
- Database, J. S. E.
- Wingfield, P. T.
- Database, J. S. E.
- Database, J. S. E.
- Smith, P. K., et al.
- Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).
- Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
- Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
