Ici, un protocole est présenté pour produire et élever des poissons électriques KNOCKOUT génome CRISPR/Cas9. Les exigences requises en matière de biologie moléculaire, de reproduction et d'élevage pour un gymnotiforme et un mormyride, ainsi que les techniques d'injection pour produire des larves d'indel F0 induites par Cas9 sont décrites en détail.
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Article de méthode
Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish
Dans cet article
Résumé
Résumé
L'électroréception et l'électrogenèse ont changé dans l'histoire évolutive des vertébrés. Il y a un degré frappant de convergence dans ces phénotypes dérivés indépendamment, qui partagent une architecture génétique commune. C'est peut-être mieux illustré par les nombreuses caractéristiques convergentes des gymnotiformes et des mormyrides, deux clades de téléostriche d'espèces qui produisent et détectent les champs électriques faibles et sont appelés poissons faiblement électriques. Au cours des 50 années qui se sont écoulés depuis la découverte que les poissons faiblement électriques utilisent l'électricité pour sentir leur environnement et communiquer, une communauté croissante de scientifiques a acquis d'énormes connaissances sur l'évolution du développement, des systèmes et des circuits de neurosciences, physiologie cellulaire, l'écologie, la biologie évolutive et le comportement. Plus récemment, il y a eu une prolifération des ressources génomiques pour le poisson électrique. L'utilisation de ces ressources a déjà facilité d'importantes connaissances en ce qui concerne le lien entre le génotype et le phénotype chez ces espèces. Un obstacle majeur à l'intégration des données génomiques avec des données phénotypiques de poissons faiblement électriques est un manque actuel d'outils de génomique fonctionnelle. Nous rapportons ici un protocole complet pour effectuer la mutagénèse DE CRISPR/Cas9 qui utilise des mécanismes endogènes de réparation d'ADN dans les poissons faiblement électriques. Nous démontrons que ce protocole est également efficace dans les deux espèces mormyrides Brienomyrus brachyistius et le brachyhypopomus gauderio gymnotiforme en utilisant CRISPR/Cas9 pour cibler des indels et des mutations ponctuelles dans le premier exon de la gène du canal de sodium scn4aa. À l'aide de ce protocole, des embryons des deux espèces ont été obtenus et génotypes pour confirmer que les mutations prédites dans le premier exon du canal de sodium scn4aa étaient présentes. Le phénotype de succès knock-out a été confirmé avec des enregistrements montrant des amplitudes réduites de décharge électrique d'organe comparées aux contrôles non injectés de taille-assortis.
Introduction
L'électroréception et l'électrogenèse ont changé dans l'histoire évolutive des vertébrés. Deux lignées de poissons teleost, ostéoglossiformes et siluriformes, électroréception évoluée en parallèle, et cinq lignées de teleosts (gymnotiformes, mormyrides, et les genres Astroscopus, Malapterurus, et Synodontis) l'électrogenèse évoluée en parallèle. Il y a un degré frappant de convergence dans ces phénotypes dérivés indépendamment, qui partagent une architecture génétique commune1,2,3.
C'est peut-être mieux illustré par les n....
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Protocole
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université d'État du Michigan.
1. Sélection des cibles sgRNA
REMARQUE: Un protocole est prévu pour la conception manuelle des sgRNAs à l'étape 1.1. Ceci a été utilisé pour la sélection de la cible scn4aa. Un protocole supplémentaire est fourni pour faciliter ce processus (étape 1.2) à l'aide du portail Web EFISHGENOMICS. Il est conseillé aux utilisateurs de sélectionner le protocole 1.2, qui comporte plusieurs « vérifications » automatisées pour assurer le suc....
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Résultats
Les sites cibles de sgRNA ont été identifiés dans l'exon 1 de scn4aa dans B. gauderio et B. brachyistius comme décrit dans la section 1. Les sgRNAs ont été générés comme décrit à la section 2. Après une sélection et une synthèse réussies de l'ARSS (Figure 1), le clivage in vitro a été testé (Figure 2). Les sgRNAs démontrant la coupe in vitro ont ensuite été sélectionnés pour des microinjections à cellule unique.
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Discussion
La richesse phénotypique des poissons faiblement électriques, ainsi qu'une prolifération récente des ressources génomiques, motivent un fort besoin d'outils génomiques fonctionnels dans le modèle de poisson faiblement électrique. Ce système est particulièrement attrayant en raison de l'évolution convergente de nombreux traits phénotypiques dans les lignées parallèles de poissons, qui sont facilement conservés en laboratoire.
Le protocole décrit ici démontre l'efficacité de la technique CRISPR/.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Les auteurs reconnaissent les efforts héroïques de Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud et Hope Healey pour obtenir de l'aide pour l'élevage des poissons, la collecte de données et le développement précoce du protocole. Nous tenons également à remercier les trois évaluateurs pour leurs suggestions au manuscrit. Nous croyons que le produit final est de meilleure qualité après avoir répondu à leurs commentaires. Ces travaux ont été financés par le soutien de la National Science Foundation #1644965 et #1455405 à JRG, et la subvention du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie DG à VLS.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 20 mg/mL Glycogène de qualité ARN | Thermo Scientific | R0551 | |
| 50 pb Échelle d’ADN | NEB | N3236L | |
| Capillaire en verre borosilicaté avec filament | Sutter Instrument | BF100-58-10 | (D.E. 1,0 mm, D.I. 0,58 mm, longueur 10 cm) |
| Protéine Cas9 avec NLS ; 1 mg/mL | PNA Biology | CP01 | |
| Dneasy Blood & Kit de mouchoirs | Qiagen | 69506 | |
| Eppendorf FemptoJet 4i Micro-injecteur | Fisher Scientific | E5252000021 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Scientific | 10289651 | |
| Hamilton Seringue | Fisher Scientific | 14-824-654 | dénommée « seringue en verre de précision » dans le protocole |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666 | est appelé « delicate task wipe » dans le protocole |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| NEBuffer 3 NEB | B7003S | utilisé pour le test de clivage in vitro | |
| OneTaq DNA kit | NEB | M0480L | |
| Ovaprim | Syndel USA | https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html | appelé « agent de reproduction » dans le protocole |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | appelé « thermoplastique » dans le protocole |
| Extracteur de pipette | WPI | SU-P97 | marque |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Aiguille réutilisable - nécessite une personnalisation | Fisher Scientific | 7803-02 | Personnaliser à 0,7 pouces de long ; point de style 4 et angle 25 |
| T4 ADN polymérase | NEB | M0203L | utiliser avec le tampon NEB 10x inclus |
| revêtus de téflon | bonefolder.com | T-SPATULA4PIECE | appelés « polytétrafluoroéthylène » dans le protocole |
Références
- Gallant, J. R., et al. Genomic basis for the convergent evolution of electric organs. Science. 344 (6191), 1522-1525 (2014).
- Zakon, H. H., Lu, Y., Zwickl, D. J., Hillis, D. M.
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Réimpressions et autorisations
