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Article de méthode

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

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DOI :

10.3791/60253

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27 octobre 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Integrative Biology, Michigan State University, 2Faculty of Life Sciences, Unit of Biology and Ecology of Fishes, Humboldt University, 3Department of Biology, Cape Breton University

Dans cet article

Résumé

Ici, un protocole est présenté pour produire et élever des poissons électriques KNOCKOUT génome CRISPR/Cas9. Les exigences requises en matière de biologie moléculaire, de reproduction et d'élevage pour un gymnotiforme et un mormyride, ainsi que les techniques d'injection pour produire des larves d'indel F0 induites par Cas9 sont décrites en détail.

Résumé

L'électroréception et l'électrogenèse ont changé dans l'histoire évolutive des vertébrés. Il y a un degré frappant de convergence dans ces phénotypes dérivés indépendamment, qui partagent une architecture génétique commune. C'est peut-être mieux illustré par les nombreuses caractéristiques convergentes des gymnotiformes et des mormyrides, deux clades de téléostriche d'espèces qui produisent et détectent les champs électriques faibles et sont appelés poissons faiblement électriques. Au cours des 50 années qui se sont écoulés depuis la découverte que les poissons faiblement électriques utilisent l'électricité pour sentir leur environnement et communiquer, une communauté croissante de scientifiques a acquis d'énormes connaissances sur l'évolution du développement, des systèmes et des circuits de neurosciences, physiologie cellulaire, l'écologie, la biologie évolutive et le comportement. Plus récemment, il y a eu une prolifération des ressources génomiques pour le poisson électrique. L'utilisation de ces ressources a déjà facilité d'importantes connaissances en ce qui concerne le lien entre le génotype et le phénotype chez ces espèces. Un obstacle majeur à l'intégration des données génomiques avec des données phénotypiques de poissons faiblement électriques est un manque actuel d'outils de génomique fonctionnelle. Nous rapportons ici un protocole complet pour effectuer la mutagénèse DE CRISPR/Cas9 qui utilise des mécanismes endogènes de réparation d'ADN dans les poissons faiblement électriques. Nous démontrons que ce protocole est également efficace dans les deux espèces mormyrides Brienomyrus brachyistius et le brachyhypopomus gauderio gymnotiforme en utilisant CRISPR/Cas9 pour cibler des indels et des mutations ponctuelles dans le premier exon de la gène du canal de sodium scn4aa. À l'aide de ce protocole, des embryons des deux espèces ont été obtenus et génotypes pour confirmer que les mutations prédites dans le premier exon du canal de sodium scn4aa étaient présentes. Le phénotype de succès knock-out a été confirmé avec des enregistrements montrant des amplitudes réduites de décharge électrique d'organe comparées aux contrôles non injectés de taille-assortis.

Introduction

L'électroréception et l'électrogenèse ont changé dans l'histoire évolutive des vertébrés. Deux lignées de poissons teleost, ostéoglossiformes et siluriformes, électroréception évoluée en parallèle, et cinq lignées de teleosts (gymnotiformes, mormyrides, et les genres Astroscopus, Malapterurus, et Synodontis) l'électrogenèse évoluée en parallèle. Il y a un degré frappant de convergence dans ces phénotypes dérivés indépendamment, qui partagent une architecture génétique commune1,2,3.

C'est peut-être mieux illustré par les nombreuses caractéristiques convergentes des gymnotiformes et des mormyrides, deux clades de téléost, riches en espèces, qui produisent et détectent des champs électriques faibles et sont appelés poissons faiblement électriques. Dans les 50 ans depuis la découverte que les poissons faiblement électriques utilisent l'électricité pour sentir leur environnement et de communiquer4, une communauté croissante de scientifiques a acquis des connaissances énormes dans l'évolution du développement1,5 ,6, systèmes et circuitsneurosciences 7,8,9,10, physiologie cellulaire11,12, écologie et énergie13 ,14,15,16,17, comportement18,19, et macroévolution3,20,21 .

Plus récemment, il y a eu une prolifération des ressources génomiques, transcriptomiques et protéomiques pour les poissons électriques1,22,23,24,25,26, 27,28. L'utilisation de ces ressources a déjà produit des informations importantes sur le lien entre le génotype et le phénotype chez ces espèces1,2,3,28,29 ,30. Un obstacle majeur à l'intégration des données génomiques avec des données phénotypiques de poissons faiblement électriques est un manque actuel d'outils de génomique fonctionnelle31.

L'un de ces outils est la technique récemment développée clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats jumelée à la technique de l'endoucase Cas9 (CRISPR/Cas9, CRISPR). CRISPR/Cas9 est un outil d'édition du génome qui est entré dans une utilisation généralisée dans les deux modèles32,33,34 et les organismes non-modèles35,36,37 de même. La technologie CRISPR/Cas9 a progressé à un point tel qu'un laboratoire capable de biologie moléculaire de base peut facilement générer des sondes spécifiques aux gènes appelées ARN à guide court (sgARN), à faible coût en utilisant une méthode de non-clonage38. CRISPR a des avantages par rapport à d'autres stratégies knock/knockdown, telles que les morpholinos39,40, les nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALENs), et les nucléases de doigts de zinc (ZNNs), qui sont coûteuses et temps à générer pour chaque gène cible.

Le système CRISPR/Cas9 fonctionne pour créer des kogènes en ciblant une région spécifique du génome, dirigée par la séquence sgRNA, et en provoquant une rupture à double brin. La rupture à double brin est détectée par la cellule et déclenche des mécanismes de réparation de l'ADN endogène de préférence en utilisant la voie de jointure non-homologue (NHEJ). Cette voie est très sujette aux erreurs : pendant le processus de réparation, la molécule d'ADN incorporera souvent des insertions ou des suppressions (indels) sur le site de rupture à double brin. Ces indels peuvent entraîner une perte de fonction due soit à (1) des changements dans le cadre de lecture ouverte, (2) l'insertion d'un codon d'arrêt prématuré, ou (3) des changements dans la structure primaire critique du produit génique. Dans ce protocole, nous utilisons l'édition CRISPR/Cas9 pour cibler les mutations ponctuelles dans les gènes cibles à l'aide du NHEJ chez les espèces de poissons faiblement électriques. Bien que plus simple et plus efficace que d'autres techniques, cette méthode de mutagénèse devrait se traduire par une gamme de séquilosités phénotypiques en F0, qui est attribuée au mosaïsme génétique41,42,43 ,44.

Sélection d'organismes
Afin de faciliter les études futures sur la génomique comparative des poissons faiblement électriques, une espèce représentative des gymnotiformes et des mormyrides pour le développement du protocole devait être sélectionnée. À la suite des discussions qui ont eu lieu lors de la réunion 2016 sur les poissons électriques à Montevideo, en Uruguay, il y a eu consensus communautaire pour utiliser des espèces qui pouvaient déjà être élevées en laboratoire et qui disposaient de ressources génomiques. Le gymnotiforme Brachyhypopomus gauderio et le mormyrid Brienomyrus brachyistius ont été sélectionnés comme espèces qui correspondent à ces critères. Chez les deux espèces, les indices naturels pour induire et maintenir les conditions de reproduction sont faciles à imiter en captivité. B. gauderio, une espèce de gymnotiforme d'Amérique du Sud, a l'avantage de faibles exigences d'élevage : les poissons peuvent être maintenus à densité relativement élevée dans des réservoirs relativement petits (4 L). B. gauderio a également un chiffre d'affaires générationnel rapide dans des conditionscaptives. Dans des conditions de laboratoire, B. gauderio peut se développer de l'œuf à l'adulte en environ 4 mois.

B. brachyistius, une espèce de poisson mormyride d'Afrique centrale de l'Ouest, se reproduit facilement en captivité. B. brachyistius est facilement disponible dans le commerce de l'aquarium, a été largement utilisé dans de nombreuses études, et dispose maintenant d'un certain nombre de ressources génomiques disponibles. Leur cycle de vie s'étend sur 1 à 3 ans, selon les conditions de laboratoire. Les exigences en matière d'élevage sont un peu plus intenses pour cette espèce, ce qui nécessite des réservoirs de taille moyenne (50 à 100 L) en raison de leur agressivité pendant la reproduction.

Les laboratoires qui étudient d'autres espèces de poissons électriques devraient être en mesure d'adapter facilement ce protocole tant que l'espèce peut être élevée, et que les embryons à cellule unique peuvent être recueillis et élevés à l'âge adulte. Les taux de logement, d'élevage larvaire et de fécondation in vitro (FIV) changeront probablement avec d'autres espèces; cependant, ce protocole peut être utilisé comme point de départ pour les tentatives de reproduction chez d'autres poissons faiblement électriques.

Une cible génétique idéale pour la preuve de concept: scn4aa
Les poissons mormyrides et gymnotiformes faiblement électriques génèrent des champs électriques (électrogenèse) en déchargeant un organe spécialisé, appelé l'orgue électrique. Les décharges d'organes électriques (EOD) résultent de la production simultanée de potentiels d'action dans les cellules d'organes électriques appelées électrocytes. Les EOD sont détectés par un éventail d'électrorécepteurs dans la peau pour créer des images électriques à haute résolution de l'environnement du poisson45. Les poissons faiblement électriques sont également capables de détecter les caractéristiques des formes d'onde EOD18 de leurs conspécifiques ainsi que leurs taux de décharge46, permettant aux EOD de fonctionner en plus comme un signal de communication sociale analogue au chant des oiseaux ou à la grenouille vocalisations47.

Un composant principal de la génération potentielle d'action dans les électrocytes des poissons faiblement électriques mormyrid et gymnotiform est le canal de sodium tension-fermé NaV1.42. Les teleosts non-électriques expriment deux copies de gène paralogous, scn4aa et scn4ab,codage pour le canal de sodium à la tension NaV1.430. Dans les lignées de poissons à la fois gymnotiformes et mormyrides faiblement électriques, scn4aa a évolué rapidement et a subi de nombreuses substitutions d'acides aminés qui affectent ses propriétés cinétiques48. Plus important encore, scn4aa est devenu compartimenté dans les deux lignées à l'orgue électrique2,3. L'expression relativement limitée de scn4aa à l'orgue électrique, ainsi que son rôle clé dans la génération d'EODs, en fait une cible idéale pour les expériences PAR KO CRISPR/Cas9, car il a des effets pléiotropes délétères minimes. Étant donné que les poissons faiblement électriques commencent à décharger leurs organes électriques larvaires 6 à 8 jours après la fécondation (DPF), le ciblage du scn4aa est idéal pour le phénotypage rapide après la microinjection d'embryons.

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Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université d'État du Michigan.

1. Sélection des cibles sgRNA

REMARQUE: Un protocole est prévu pour la conception manuelle des sgRNAs à l'étape 1.1. Ceci a été utilisé pour la sélection de la cible scn4aa. Un protocole supplémentaire est fourni pour faciliter ce processus (étape 1.2) à l'aide du portail Web EFISHGENOMICS. Il est conseillé aux utilisateurs de sélectionner le protocole 1.2, qui comporte plusieurs « vérifications » automatisées pour assurer le succès dans la conception de sgRNAs pour des cibles personnalisées.

  1. Concevoir des cibles sgRNA.
    1. Pour générer des oligos guide sgRNA, il est préférable de cibler exon 1, ou d'autres 5' exons. L'UTR 5' peut être ciblé; cependant, il est préférable de cibler la séquence de codage de 5'. L'utilisation de l'information génomique est préférable, mais il est possible de développer des sgRNAs réussis en utilisant des données de transcriptome. Il est préférable d'annotations des limites intron/exon (données génomiques) ou exon/exon.
    2. Les séquences génomiques des candidats à partir de 1,1 sont recherchées pour des séquences cibles putatives qui correspondent au modèle 5'-N(18)-NGG-3'. Cela peut être exécuté automatiquement à l'aide d'un logiciel d'analyse de séquences de bureau, de scripts personnalisés ou d'une inspection manuelle des séquences.
    3. Les séquences peuvent être priorisées en utilisant la méthode de Doench et coll.49 pour l'activité sur la cible. En outre, les séquences cibles peuvent être évaluées par une recherche BLAST contre les bases de données génomiques/transcriptomiques pour la liaison hors cible.
    4. Assurez-vous que les amorces PCR standard peuvent être générées qui flanquent la séquence cible. Les amorces doivent être d'au moins 20 pb de chaque côté du site de coupe (trois bases en amont de la séquence NGG). Idéalement, le produit PCR devrait être de 150 à 200 paires de base (bp).
    5. Oligomers de conception répondant aux critères ci-dessus en utilisant le modèle ci-dessous, qui comprend un promoteur T7 (5' de N18) et une région complémentaire (3' de N18) pour l'annealing à l'oligomère constant (1.1.6): 5'-TAATACGACTCACTATA-N18 -GTTTTAGAGCTAGAATAGCAAG-3'
      REMARQUE: La séquence N18 n'inclut pas la séquence de motif adjacent e (PAM) du protospacer NGG. Ne pas inclure cela dans l'oligomère.
    6. Commandez l'oligomère constant (tableau 1) qui sera utilisé pour synthétiser tous les sgRNAs, les oligomères pour les cibles sgRNA (étape 1.1.5), et les amorces PCR (étape 1.1.4) comme oligomères dessalées standard d'un service de production d'oligonucléotide. Oligomers et amorces PCR peuvent être commandés comme oligomères dessalés standard, aucune purification supplémentaire n'est nécessaire.
  2. Effectuer la conception automatisée des cibles sgRNA.
    1. À l'aide de données génomiques, sélectionnez un gène cible. Les données de Transcriptome pourraient être utilisées à la place lorsque les limites exon/intron sont connues. Les cibles peuvent être identifiées à l'aide du portail EFISHGENOMICS (http://efishgenomics.integrativebiology.msu.edu). La cible idéale sera dans l'exon 1; cependant, d'autres exons de 5' et le 5' UTR peuvent être considérés.
    2. Une fois la séquence cible identifiée, chargez l'outil Web EFISHGENOMICS CRISPR (http://efishgenomics.integrativebiology.msu.edu/crispr_tool/) disponible gratuitement. Cet outil web utilise une version personnalisée de l'algorithme CRISPOR pour la génération cible50,51.
    3. Dans la case de l'étape 1, entrez le nom de la séquence et entrez la séquence de la cible dans la case appropriée.
  3. Sélectionnez le génome approprié dont la séquence provient. Actuellement, des données génomiques sont disponibles pour B. brachyistius et B. gauderio. Les séquences génomiques ne sont pas nécessaires pour l'utilisation de cet outil, mais sont utiles pour évaluer les effets indésirables potentiels hors cible.
  4. Sélectionnez le PAM approprié. Le PAM 20 bp-NGG est recommandé, bien qu'il existe plusieurs motifs PAM supplémentaires à choisir, en fonction de la protéine Cas9 utilisé.
  5. Un rapport sera généré avec l'emplacement de la séquence cible dans le génome avec des séquences de guides suggérées. Sélectionnez trois cibles avec des effets hors cible prévus faibles, des scores de spécificité élevés et des scores d'efficacité élevés. Les séquences de guides les plus marquantes sont mises en surbrillance avec du vert sur le côté gauche. Les séquences de guides surlignées jaunes et rouges doivent être évitées, si possible.
  6. En cliquant sur des séquences cibles sélectionnées, vous cliquez sur un rapport CRISPOR complet. Les informations clés de ces rapports sont pour "L'expression in vitro T7 des oligonucléotides qui se chevauchent". De ce rapport, extraire les informations suivantes: oligos sgRNA recommandés, amorces PCR pour le site cible, et un oligomer constant qui sera utilisé pour synthétiser tous les sgRNAs.
  7. Commandez les oligomères sélectionnés (étape 1.6) d'un service de production d'oligonucléotide. Oligomers et amorces PCR peuvent être commandés comme oligomères dessalés standard, aucune purification supplémentaire n'est nécessaire.

2. Générer sgRNA

  1. Oligomères anneaux dans le tube PCR : ajouter 1 L de 100 oM oligomère constant, 1 l de 100 m sgRNA oligomère spécifique, et 8 L de H2O sans nucléanie
  2. Oligomères anneaux dans un thermocycler avec le programme suivant : chauffer à 95 oC pendant 5 min, refroidir à 85 oC à -2 oC/s, refroidir jusqu'à 25 oC à 0,1 oC/s et tenir à 4 oC.
  3. Pour générer un modèle de sgRNA, ajouter 2,5 l de mélange dNTP (10 mM), 2 l de tampon 10x, 0,5 l de polymérase d'ADN T4 et 5 L de H2O sans nucléal aux oligomères annealed à partir de l'étape 2.2. Incuber pendant 20 min à 12 oC.
  4. Purifez le modèle à l'aide d'une colonne de nettoyage PCR selon les instructions du fabricant.
  5. Elute dans 20-30 L. Utilisez un spectrophotomètre pour estimer la concentration et la pureté. Le modèle doit être de 100 à 200 ng/L et de 1,8 à 1,9 A260/280.
  6. Vérifier via un gel d'agarose en exécutant 1 à 5 ll. La bande dominante devrait être de 120 pb. Voir la figure 1A pour obtenir des résultats représentatifs.
  7. Stockez le modèle de sgRNA vérifié par gel à -20 oC (à long terme) ou à 4 oC (à court terme, 1 à 4 semaines).
  8. Transcrire sgRNA à l'aide du kit de transcription de l'ARN T7 en ajoutant à un tube microcentrifuge de 1,5 ml à température ambiante 8 L de mélange dNTP (volumes égaux de dA, dT, dG, dC), 2 'L de tampon 10x (température ambiante), 2 'L de polymérase d'ARN T7, 100'200 ng de modèle sgRNA , et sans nucléane H2O à un volume total de 20 L. Tourner pour recueillir en bas. Incuber de 2 à 4 h à 37 oC.
  9. Ajouter 1 l de DNase et couver 15 min de plus à 37 oC.
    1. Nettoyez l'ARSG en ajoutant 1 l de glycogène, 30 l de H2O sans nucléane, 30 l d'acétate d'ammonium de 5 M et 180 L de 100 % EtOH à sgRNA transcrit. Bien mélanger et incuber au moins 20 min à -80 oC (jusqu'à ce qu'ils soient congelés) ou à -20 oC pendant la nuit. Centrifugeuse à 4 oC pendant 15 min à vitesse maximale.
  10. Retirez et jetez le supernatant sans déranger la pastille, et lavez-le avec 1 ml d'EtOH sans RNase 70 % refroidi à -20 oC. Faire tourner 5 min de plus à une vitesse maximale de 4 oC.
  11. Retirer et jeter le supernatant sans déranger la pastille, et sécher à l'air le granule pendant 5 min.
  12. Resuspendre dans 30 oL de H2O sans nucléane et déterminer la pureté et le rendement à l'aide de la spectroscopie UV (rendement minimum de 200 ng/L).
  13. Vérifier la présence de sgRNA sur un gel sans RNase. Le sgRNA apparaît entre 50 et 150 bp en tant que deux bandes en raison de la structure secondaire (Figure 1B).
  14. Aliquot en 3 l et stocker à -80 oC.

3. Valider l'efficacité de coupe in Vitro

  1. Extraire l'ADN génomique de l'espèce cible à l'aide d'une trousse commerciale d'extraction d'ADN. Les coupures de nageoires ventrales peuvent être utilisées sans avoir à sacrifier le poisson, parce que les tissus sont régénérés.
  2. Amplifiez la région d'ADN cible à l'aide des amorces conçues comme décrites dans les étapes 1.6 et 1.7 à l'aide de PCR standard. Vérifier le produit par électrophoresis de gel. Il est suggéré de séquençage du fragment pour s'assurer que la région appropriée est amplifiée, mais pas nécessaire. Les résultats représentatifs du modèle scn4aa sont affichés à la figure 2.
  3. Nettoyez le fragment de PCR à l'impéquirdoire d'un laboratoire ou d'une entreprise.
  4. Entreposez l'ADN amplifié à -20 oC. Envisagez de le séparer en aliquots pour réduire les cycles de gel et de dégel.
  5. Déterminer les quantités et les volumes requis de chaque composant. Envisagez d'exécuter des contrôles négatifs (à l'exclusion de l'ARSoual ou de Cas9) et d'un contrôle positif (un sgRNA déjà testé qui fend son ADN amplifié PCR cible) s'il est disponible, ainsi qu'une série de concentration de l'ARSG.
  6. Configurez le mélange de réaction ci-dessous dans l'ordre spécifié dans un tube PCR à température ambiante, en ajoutant le sgRNA et la protéine Cas9 en dernier pour les meilleurs résultats : 50 à 100 ng de produit PCR d'ADN cible, 1 L de 10x tampon 3, 1 l de 10x BSA (0,1 g/mL) , 50 à 200 ng de protéine Cas9 (1 mg/mL, 150 ng suggéré), et 30 à 200 ng sgRNA (100 ng suggéré).
    1. Incuber la réaction à 37 oC pendant 1 h, puis à 65 oC pendant 10 min pour inactiver la protéine Cas9.
    2. Exécuter l'échantillon entier sur un gel agarose de 2 % à 3 % (taille prévue de la bande entre 30 et 200 pb) ainsi que des contrôles positifs et négatifs. Clivage réussi peut montrer une partie du produit PCR, mais aura également deux plus petites bandes. Les résultats représentatifs sont présentés à la figure 2.

4. Obtenir des embryons

REMARQUE: Il peut être difficile d'obtenir des embryons de poissons faiblement électriques. Une surveillance attentive de la qualité de l'eau, un temps adéquat pour les soins des poissons et une alimentation régulière sont essentiels à la réussite d'un programme de reproduction. Les poissons doivent d'abord être conditionnés pendant plusieurs semaines pour la reproduction52 comme décrit dans l'étape 4.1 du protocole. Par la suite, un protocole augmentant la gamétogenèse naturelle (4.2) pour une utilisation dans le comportement naturel de frai (4.3), une alternative récemment développée technique in vitro pour obtenir précisément des embryons chronométrés (4.4) sont présentés. Protocole 4.3 est tout aussi efficace pour B. brachyistius et B. gauderio, et le protocole 4.4 est supérieur dans B. gauderio.

  1. conditionnement
    1. Gardez B. brachyistius en couples/petits groupes (100 à 150 l réservoirs) ou en très grands réservoirs (2 mâles et 5 à 6 femelles dans environ 475 réservoirs L), car ils deviennent très agressifs dans des conditions de reproduction. Il devrait y avoir au moins un tube de PVC par poisson à utiliser comme abri (Figure 3A,B).
    2. B. gauderio peut être élevé à une densité beaucoup plus élevée. Gardez jusqu'à huit individus dans un réservoir de 100 L (2 mâles et 6 femelles). Il devrait y avoir au moins 1 tube de PVC par poisson à utiliser comme abri. L'ajout de fils emmêlés augmente l'enrichissement et les cachettes. Ajouter des tubes centrifugeurs de 50 ml avec des trous de 1 cm de diamètre percés en haut du réservoir pour permettre aux adultes de frayer naturellement dans les tubes (Figure 3C).
    3. Pendant la saison de reproduction, nourrir les poissons tous les jours des vers noirs frais complétés par des vers de sang congelés. La nourriture peut être enrichie en vitamines et suppléments, si désiré.
    4. Les poissons de maison normalement dans une conductivité relativement élevée (300-600 S), solution équilibrée de pH. Pendant la saison de reproduction, réduire graduellement la conductivité d'au moins la moitié au cours d'une semaine à trois semaines pour induire la recrudescence et le frai des gonades. Une conductivité plus faible par des ajouts quotidiens d'osmose inverse (RO) d'eau, en gardant une attention particulière au pH lorsque la conductivité est faible (pH et lt;6).
    5. Les conditions de reproduction peuvent être maintenues pendant environ 3 à 5 mois, la production d'œufs diminuant au fil du temps. Après ce temps, retour des poissons à une conductivité élevée lentement sur une semaine et demie. Gardez encore 3 mois à haute conductivité avant d'être exposé à nouveau à des conditions de reproduction.
  2. Utilisez des injections d'agent de frai (SGnRHa et Domperidone).
    1. Identifier les poissons femelles dans des conditions de reproduction qui semblent gravid (figure 4). Dans B. gauderio la femelle aura des gonades gonflées juste caudal à l'évent. Les femelles b. brachyistius auront le ventre gonflé et apparaîtront corsées profondément(figure 4A). Les mâles n'ont généralement pas de problème de production de sperme. Cependant, de plus grands mâles sont préférés en raison du plus grand volume de sperme rassemblé.
      REMARQUE: L'agent de frai est un mélange d'hormones commerciales qui facilite la maturation des gamètes et coordonne le frai. Si le poisson a été injecté avec un agent de frai dans le passé, prévoir 4 semaines de repos et une alimentation suffisante entre les injections. Nous vous suggérons d'injecter au moins 2 mâles et 4 à 5 femelles pour assurer quelques couvées d'ovules et beaucoup de sperme.
    2. Anesthésiez le poisson dans mS-222 (0,4 g/3 L) pendant quelques minutes, jusqu'à ce que le poisson ne soit pas en mesure de garder sa posture, est immobile, mais continue d'avoir un mouvement operculaire (Étape II53).
    3. Peser le poisson (g) pour calculer la quantité d'agent de frai (0,5 l/g) à 0,5 l. L'extra 0.5 L tient compte des erreurs de pipetage.
    4. Ajouter l'agent de frai à 4x volumes de tampon (1x PBS ou DPBS) dans un tube PCR et bien mélanger. La solution deviendra trouble. Il aide à distribuer l'agent de frai sur le thermoplastique, puis utiliser une pipette pour mesurer la dose calculée. L'agent de frai est visqueux, alors assurez-vous de distribuer la dose entière et soyez prudent avec pipetting.
    5. Pipette la solution d'injection sur le thermoplastique et tirer dans une seringue en verre de précision, en évitant les bulles d'air. Nous recommandons une aiguille de 28 G, de 19 à 25 mm, bevée.
    6. Injecter la solution dans le muscle du tronc dorsal à un rythme lisse. Laisser l'aiguille s'asseoir pendant 2/4 s, puis retirer. Mettre immédiatement le poisson dans l'eau douce du système pour la récupération.
    7. Après environ 24 h se préparer à la collecte des embryons (voir 4.3 ou 4.4). Rassembler tous les matériaux nécessaires, y compris ce qui est nécessaire pour la microinjection à cellule unique (voir la section 5).
  3. Obtenir des embryons par frai naturel.
    1. Adultes injectés par agent de frai (4,2) dans un grand réservoir de 450 L. Les rapports sexuels les plus efficaces ont généralement été 1/2 mâles et 3-4 femelles avec des cachettes adéquates faites à partir de tubes de PVC, et substrat de marbre foncé sur le fond du réservoir pour empêcher la consommation d'oeufs. Les marbres sont généralement plus importants pour B. brachyistius que B. gauderio, qui préfèrent déposer leurs œufs collants dans des crevasses ou des tubes centrifugeurs de 50 ml comme décrit ci-dessus.
    2. Placez les poissons dans un cycle de lumière inversée pour qu'ils correspondent à la ponte nocturne et aux heures normales de travail en laboratoire. À l'aide d'un système de sécurité de qualité consommateur disponible sur le marché, surveillez les poissons à l'aide de l'éclairage infrarouge afin de minimiser les perturbations provenant d'un PC connecté à distance (figure 3).
    3. Le poisson frayera spontanément pendant la photopériode sombre environ 24 h après l'injection d'agent de frai.
    4. Lorsque le frai commence, recueillir les œufs toutes les heures pendant que le comportement de frai se produit. Dans B. brachyistius, recueillir les œufs à l'aide d'un siphon de petit diamètre sur un filet de maille de coton fin pour minimiser les dommages aux œufs fraîchement frayés. Recueillir les œufs B. gauderio des tubes de centrifugeuse de 50 ml ou du substrat de réservoir. Travaillez efficacement avec un minimum de perturbation pour frayer les poissons en utilisant une lampe frontale avec un feu rouge de faible intensité. Comme le premier clivage se produit environ 1 h après la fécondation (HPF), une grande partie des œufs sera approprié pour la microinjection à cellule unique.
    5. Passez immédiatement à la microinjection (voir la section 5).
  4. Pressez les mâles pour la fécondation in vitro de B. gauderio.
    1. Préparer la solution d'extension de sperme (SES) tel que décrit dans The Zebrafish Book54: 10 mM HEPES, 80 mM KCl, 45 mM NaCl, 45 mM d'acétate de sodium, 0,4 mM CaCl2, et 0,2 mM MgCl2.
      1. Utilisez ddH2O pour apporter au volume et ajuster le pH à 7,7 avec 1 M NaOH.
      2. Conserver au réfrigérateur.
      3. Filtrer à travers un filtre de 0,22 m avant utilisation.
    2. Anesthésiez le poisson dans mS-222 (0,4 g/3 L) pendant quelques minutes, jusqu'à ce que le poisson ne soit pas en mesure de garder sa posture, est immobile, mais continue d'avoir un mouvement operculaire (Étape II53). Placer 500 aliquots de SES dans la glace.
    3. Séchez les mains et pêchez à fond, surtout autour de la tête et de l'évent. Placez le côté ventral vers le haut, antérieur vers la gauche (pour les personnes de droite) dans un porte-mousse/éponge en polystyrène recouvert d'une serviette en papier humide trempée MS-222. La tête doit être aussi parallèle que possible à la table.
      REMARQUE: Les étapes 4.4.4-4.4.6 doivent être faites aussi rapidement que possible, et le poisson ne doit être hors de l'eau que pendant 30 à 60 s.
    4. Appliquer la pression dans la direction rostrale avec la lumière serrant médially sur les gonades vers l'évent. Le poisson peut expulser les déchets. Veillez à nettoyer l'évent avec une lingette délicate si des déchets sont expulsés. Ne collectez pas les déchets avec du sperme. Selon la taille du mâle, 10-60 L est commun.
    5. À l'aide d'un microppetter avec une pointe, recueillir soigneusement le sperme comme il est pressé du mâle par incréments de 50 L. Placer le sperme directement dans 500 aliquots de SES sur la glace. Il peut être utile d'avoir un autre chercheur aider à recueillir des spermatozoïdes tandis que l'autre serre. Le sperme doit être utilisé dès que possible, mais reste viable pendant au moins 1 h.
    6. Immédiatement après la collecte, mettre le poisson dans l'eau du système frais pour la récupération. Le poisson ne doit être hors de l'eau que pendant 30 à 60 s.
  5. Presser les femelles pour la fécondation in vitro de B. gauderio.
    1. Anesthésiez le poisson dans mS-222 (0,4 g/3 L) pendant quelques minutes, jusqu'à ce que le poisson ne soit pas en mesure de garder sa posture, est immobile, mais continue d'avoir un mouvement operculaire (Étape II53). Déposer la feuille de polytetrafluoroéthène sur le poste de travail.
      REMARQUE: Les sections 4.5.1-4.5.5 doivent être faites le plus rapidement possible et les poissons ne doivent être hors de l'eau que pendant 30 à 60 s.
    2. Mains sèches, outils, feuille de polytétrafluoroéthène, et le poisson à fond, en particulier autour de la tête et l'évent. Placer sur le côté avec la tête face antérieure (pour les droitiers).
    3. Appliquer la pression dans la direction rostrale avec la lumière serrant médially sur les gonades vers l'évent. Le poisson peut expulser les déchets. Veillez à nettoyer l'évent avec une lingette délicate si des déchets sont expulsés. Selon la taille du poisson, 20 à 150 œufs sont communs. À l'aide d'une spatule/outil enduit de polytétrafluoroéthylène, recueillir soigneusement les œufs qui sont pressés du cloaque. Déplacer rapidement les œufs dans un petit plat Petri et couvrir. Assurez-vous que les œufs restent secs pendant ce processus. Alternativement, après avoir serrant, toucher la masse d'oeufs à la base d'un petit plat de Petri ou à la feuille de polytetrafluoroethene pendant qu'ils sont expulsés de la femelle.
    4. Immédiatement après la collecte, mettre le poisson dans l'eau du système frais pour la récupération.
  6. Effectuer la fécondation des ovules pour la fécondation in vitro de B. gauderio.
    1. Ajouter 100 l de spermatozoïdes bien mélangés dans SES (voir l'étape 4.4) directement sur la masse d'ovules.
    2. Ajouter 1 ml d'eau du système (filtrée à travers un filtre de 0,22 m) et bien mélanger pendant 30 à 60 s.
    3. Ajouter un peu d'eau supplémentaire du système de 1 à 2 ml (laisser un peu d'espace dans le plat Petri) et placer dans un incubateur. Enregistrez le temps de FIV sur le plat Petri et passez à un incubateur de 29 oC. Définir une minuterie de 50 min pour vérifier l'évolution du développement (p. ex., formation de la cellule unique au pôle animal, voir Figure 6). Pendant ce temps, préparer les matériaux pour la microinjection.

5. Microinjection à cellule unique

  1. Tirez les aiguilles de microinjection avant les injections d'agent de frai (étape 4.2) ou le frai naturel (étape 4.3). Utilisez un capillaire en verre borosilicate avec un filament (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm de longueur) et un pull à aiguilles pour tirer les aiguilles de microinjection. Préparer 2 à 4 aiguilles par injection de traitement planifiée.
    REMARQUE: Les aiguilles de rechargement avec un filament sont préférées, parce que le filament mèche la solution vers la pointe et élimine les bulles. Cependant, des aiguilles sans filament peuvent être utilisées et le chargement frontal ne devrait avoir aucun effet sur le résultat. L'aiguille doit avoir un long, mais robuste cône. Utilisez le programme de traction d'aiguilles avec les spécifications suivantes comme point de départ : chaleur 500; Tirez 70; Vitesse no 70; et le temps no 100. Les morphologies d'aiguilles représentatives sont présentées à la figure 5A.
  2. Préparer la solution d'injection et préparer l'aiguille.
    1. Ajouter 0,9 l de sgRNA et 0,9 l d'enzyme Cas9 (1 mg/mL) à 0,2 l de 10 % ou 100 % de rouge phénol (pour 1 % et 10 % de concentration finale de phenol rouge, respectivement) dans un tube PCR. Bien mélanger et laisser reposer sur la glace de 2 à 5 min pour permettre au sgRNA et à la Cas9 de se complexiquer. Calculez la concentration finale de sgRNA, Cas9 et rouge phénol dans la solution d'injection.
      REMARQUE: S'il y a des problèmes avec l'engorgement ou l'efficacité de coupe d'aiguille utilisant la recette ci-dessus, il peut être utile d'employer un mélange final de sel/tampon de concentration 1x pour stabiliser Cas9 et empêcher l'engorgement d'aiguille.
    2. Utilisez une pointe de pipette de microchargeur pour recharger les 2 L de la solution dans l'aiguille de microinjection. Expulser le liquide le plus près possible de la pointe.
    3. Chargez l'aiguille dans le micromanipulateur et fixez les réglages de pression (commencer par 775 pi, 0,1 à 0,2 s, et 8-12 pc).
    4. Sous la portée, utilisez une paire de forceps fins pour briser la pointe de l'aiguille à un angle bevelé. Pause vers l'endroit où le cône de l'aiguille commence à avoir la rigidité. Il est préférable de se casser plus près de la pointe, tester la taille de la solution d'injection, puis casser plus loin si nécessaire. L'alésage de l'aiguille doit demeurer aussi petit que possible tout en maintenant un cône rigide (figure 5A).
    5. Utilisez de l'huile minérale et un micromètre pour mesurer la taille de la solution d'injection. 1/2 nL est généralement utilisé; 0,1 mm de diamètre est de 0,5 nL.
    6. Ajustez la pointe de l'aiguille ou les réglages de pression pour obtenir un volume d'injection dans les spécifications.
  3. Identifier les zygotes en développement et préparer l'étape de l'injection. Configurez l'étape d'injection. Prenez un plat Petri de 100 mm de diamètre. Inverser le fond et placer sous le dessus inversé. Placez une lame de microscope en verre dans le dessus inversé. Selon la façon dont votre micromanipulateur est monté à la portée, la hauteur ajoutée de la base inversée peut être inutile.
    1. Examinez les œufs en développement et identifiez les zygotes fécondés présumés 50 à 60 min après la FIV. Le pôle animal commencera à se former et il y aura un excès de petites gouttelettes de graisse autour de l'interface jaune/cellule animale (figure 6).
    2. Recueillir 10 à 20 œufs avec le moins d'eau possible à l'aide d'une pipette de transfert en plastique (couper légèrement la pointe pour permettre aux œufs de passer) et les placer sur le bord de la glissière. L'eau sera méchante sous la glissière et tirer les œufs contre le bord.
    3. Utilisez un lingette délicate et appuyez doucement sur la glissière pour enlever l'excès d'eau et permettre aux œufs d'adhérer fermement au bord de la glissière. Il devrait y avoir juste assez d'eau pour garder les œufs humides tout en maintenant peu d'humidité debout pour éviter le mouvement des œufs pendant l'injection.
  4. Injecter directement dans une seule cellule.
    1. Aligner les œufs contre la glissière verticalement, perpendiculaire à l'aiguille qui approche (figure 5B).
    2. À l'aide du micromanipulateur, placer l'aiguille contre le chorion. À environ un angle de 45 degrés, insérez l'aiguille dans le chorion, puis dans la cellule unique. Il peut être utile d'entrer dans la cellule unique par le jaune. Déplacer à la fois l'étape d'injection avec la main libre et le micromanipulateur peut fournir plus de contrôle sur le processus d'injection (Figure 5B).
    3. Injecter la solution rouge sgRNA/Cas9/phenol dans la seule cellule. Retirez soigneusement l'aiguille. Passez à l'œuf suivant et répétez les étapes 5.4.1-5.4.3 jusqu'à ce que tous les œufs soient injectés.
    4. Enlever les œufs cassés pendant l'injection avec des forceps fins. Utilisez 0,22 m d'eau filtrée dans une bouteille d'éclaboussure pour retirer délicatement les œufs du stade d'injection dans un nouveau plat Petri de 100 mm de diamètre.
    5. Répéter les étapes 5.3.3-5.4.6 jusqu'à ce que tous les œufs ont été injectés ou se sont développés à l'étape à deux cellules. Assurez-vous de mettre de côté environ 20 œufs fécondés présumés comme un contrôle sans injection pour déterminer les taux de fécondation et le succès de l'injection. Pour les embrayages plus grands, utilisez des embryons non injectés qui se sont développés jusqu'au stade à deux cellules, et pour les embrayages plus petits, réservez les œufs fécondés présumés.
    6. En outre, envisager un contrôle de l'ARS/injection en injectant 15 à 25 embryons avec Cas9 complexe avec un sgRNA contre un gène qui n'est pas présent dans le génome. Le gène GFP recommandé pour les embryons de type sauvage. Enregistrez le nombre d'œufs, les parents, l'heure de la FIV et la date sur chaque plat Petri. Inclure la cible ou l'étiquette sgRNA comme non injecté. Déplacez-vous vers un incubateur de 29 oC.

6. Élevage d'animaux

  1. Occupez-vous des œufs.
    1. Vérifier la viabilité des œufs 4 à 6 h après les injections.
    2. Enregistrez le nombre d'œufs morts, ainsi que ceux qui ne sont pas fécondés. Les œufs non fécondés s'arrêteront autour du stade à huit cellules et auront un motif de rosette des cellules au pôle animal (figure 6). Selon le nombre d'œufs morts et la quantité de débris d'œufs dans l'eau, retirer au moins 50 à 80 % de l'eau et remplacer par de l'eau filtrée. Il peut être utile de frotter le fond du plat Petri si un film de débris cellulaires ou biofilm se forme.
    3. Pendant les deux prochains jours, vérifiez les œufs 1 à 2 fois par jour. Répétez les étapes 6.1.2-6.1.3 chaque fois que les œufs sont vérifiés.
    4. Après 2 à 3 jours, les larves éclosent. Retirer toutes les douilles d'œufs à l'éclosion. La pipetage douce peut aider à libérer les larves à mi-hachures.
  2. Soins aux larves.
    1. Vérifier les œufs 1 à 2x par jour. Répéter les étapes 6.1.2-6.1.3 chaque fois que les larves sont vérifiées.
    2. De 6 à 14 DPF, nourrissez les anguilles de vinaigre aux larves. Un léger excès de nourriture est bon, parce que les anguilles de vinaigre restera vivante dans le plat. Ajouter les anguilles de vinaigre chaque fois que le plat est vérifié et nettoyé.
    3. De 11 à 14 DPF, ajoutez 5 à 10 Artemia fraîchement éclos par larves en plus des anguilles à vinaigre. Pendant ce temps, les larves apprendront à manger la natation libre Artemia.
    4. À 15 DPF, déplacez les larves vers des tasses d'œufs (voir la section 6.2.5) dans un réservoir avec de l'eau qui coule, la filtration et l'aération. Il ne devrait pas y avoir plus d'environ 25 embryons par tasse. Les tasses d'oeufsont sont des tasses en plastique avec un filet de maille sur le fond. Un haut de plat Petri de 100 mm peut être ajouté au fond de la tasse d'oeuf pour aider à empêcher la nourriture de tomber par le maillage. Les tasses à œufs permettent aux poissons d'être logés dans un plus grand volume d'eau pour des raisons de qualité de l'eau, tout en maintenant des groupes distincts. Continuer d'ajouter à la fois les anguilles de vinaigre et 15 à 30 Artémie fraîchement éclos par larves des jours 15 à 18. Nettoyer le plat Petri pièce tous les jours et utiliser une pipette pour enlever les masses d'Artemiamorts .
    5. De 18 à 30 jours, ne nourrissez que des Artemiafraîchement éclos. Augmentez la quantité d'alimentation à mesure que le poisson grandit et si l'on voit la queue mordre.
    6. Après environ 30 jours, déplacer le poisson dans des réservoirs de 10 L (2,5 gallons), soit environ 25 individus par réservoir. Assurez-vous qu'il y a filtration, aération et endroits pour se cacher. Considérez les milieuis de biofiltration cylindriques et les tubes en PVC de petit diamètre.
    7. Nourrissez l'artémie fraîchement éclos et les vers noirs à partir d'environ 30 à 45 jours. Maintenir le nettoyage standard et les changements d'eau pour le réservoir (c.-à-d., à un minimum de 10 % à 20 % de changement d'eau par semaine).
    8. Après 45 DPF, ne nourrissez que les vers noirs jusqu'à 60 DPF.
    9. Après 60 DPF, déplacez des cohortes d'environ 15 poissons dans des réservoirs de 40 L (10 gallons) et commencez les procédures d'élevage pour adultes. Ajouter des tubes en PVC et un fil "serpillière" (une masse de fil brun attaché autour d'un bouchon) pour les cachettes (Figure 3C). Les poissons devraient être près de la taille de la reproduction (10 à 12 cm) après environ 3 à 4 mois après la fécondation.

7. Maririe adulte

  1. Nourrissez les poissons quotidiennement avec suffisamment de vers noirs pour qu'une petite quantité de vers noirs soit présente à la prochaine alimentation. Cette alimentation ad libitum permet une croissance maximale.
  2. Quelques fois par semaine, il peut être utile de compléter l'alimentation du ver noir avec des vers de sang.
  3. Nettoyer les réservoirs toutes les 2 à 4 semaines avec un changement d'eau de 20 % à 30 %. Si la vadrouille de fil devient pleine de biofilm/algues, frottez-la proprement sous l'eau de RO.

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Résultats

Les sites cibles de sgRNA ont été identifiés dans l'exon 1 de scn4aa dans B. gauderio et B. brachyistius comme décrit dans la section 1. Les sgRNAs ont été générés comme décrit à la section 2. Après une sélection et une synthèse réussies de l'ARSS (Figure 1), le clivage in vitro a été testé (Figure 2). Les sgRNAs démontrant la coupe in vitro ont ensuite été sélectionnés pour des microinjections à cellule unique.

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Discussion

La richesse phénotypique des poissons faiblement électriques, ainsi qu'une prolifération récente des ressources génomiques, motivent un fort besoin d'outils génomiques fonctionnels dans le modèle de poisson faiblement électrique. Ce système est particulièrement attrayant en raison de l'évolution convergente de nombreux traits phénotypiques dans les lignées parallèles de poissons, qui sont facilement conservés en laboratoire.

Le protocole décrit ici démontre l'efficacité de la technique CRISPR/...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Les auteurs reconnaissent les efforts héroïques de Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud et Hope Healey pour obtenir de l'aide pour l'élevage des poissons, la collecte de données et le développement précoce du protocole. Nous tenons également à remercier les trois évaluateurs pour leurs suggestions au manuscrit. Nous croyons que le produit final est de meilleure qualité après avoir répondu à leurs commentaires. Ces travaux ont été financés par le soutien de la National Science Foundation #1644965 et #1455405 à JRG, et la subvention du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie DG à VLS.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
20 mg/mL Glycogène de qualité ARNThermo ScientificR0551
50 pb Échelle d’ADNNEBN3236L
Capillaire en verre borosilicaté avec filamentSutter InstrumentBF100-58-10(D.E. 1,0 mm, D.I. 0,58 mm, longueur 10 cm)
Protéine Cas9 avec NLS ; 1 mg/mLPNA BiologyCP01
Dneasy Blood & Kit de mouchoirsQiagen69506
Eppendorf FemptoJet 4i Micro-injecteurFisher ScientificE5252000021
Eppendorf Microloader Pipette TipsScientific10289651
Hamilton SeringueFisher Scientific14-824-654dénommée « seringue en verre de précision » dans le protocole
KimwipeFisher Scientific06-666est appelé « delicate task wipe » dans le protocole
MEGAscript T7 Transcription KitInvitrogenAM1334
NEBuffer 3 NEBB7003Sutilisé pour le test de clivage in vitro
OneTaq DNA kitNEBM0480L
OvaprimSyndel USAhttps://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.htmlappelé « agent de reproduction » dans le protocole
ParafilmFisher ScientificS37440appelé « thermoplastique » dans le protocole
Extracteur de pipetteWPISU-P97marque
QIAquick PCR Purification KitQiagen28106
Aiguille réutilisable - nécessite une personnalisationFisher Scientific7803-02Personnaliser à 0,7 pouces de long ; point de style 4 et angle 25
T4 ADN polyméraseNEBM0203Lutiliser avec le tampon NEB 10x inclus
revêtus de téflonbonefolder.comT-SPATULA4PIECEappelés « polytétrafluoroéthylène » dans le protocole
Fisher À Outils

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Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish
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