Summary
Her beskriver vi immunudfældning af ribosomer og tilhørende RNA fra udvalgte populationer af voksne mandlige musekimceller ved hjælp af RiboTag-systemet. Strategisk avl og omhyggelig immunudfældning resulterer i rene, reproducerbare resultater, der informerer om kimcellen stilbar og giver indsigt i mekanismerne i mutante fænotyper.
Abstract
Kvantificering af forskelle i mRNA-tæthed er en klassisk tilgang til at forstå virkningen af en given genmutation på cellefysiologi. Men, karakterisere forskelle i oversætteome (hele oversatte mRNAs) giver et ekstra lag af oplysninger særligt nyttigt, når de forsøger at forstå funktionen af RNA regulere eller bindende proteiner. Der er udviklet en række metoder til at opnå dette, herunder ribosom profilering og polysome analyse. Begge metoder bærer imidlertid betydelige tekniske udfordringer og kan ikke anvendes på specifikke cellepopulationer i et væv, medmindre de kombineres med yderligere sorteringsmetoder. I modsætning hertil er RiboTag-metoden et genetisk baseret, effektivt og teknisk ligetil alternativ, der gør det muligt at identificere ribosomrelaterede RNA'er fra specifikke cellepopulationer uden tilsat sorteringstrin, forudsat at der findes en relevant cellespecifik Cre-driver. Denne metode består af avl til at generere de genetiske modeller, prøveindsamling, immunfældning og nedstrøms RNA-analyser. Her skitserer vi denne proces i voksne mandlige museceller mutant for et RNA bindende protein, der kræves for mandlig fertilitet. Der lægges særlig vægt på overvejelser om avl med fokus på effektiv koloniforvaltning og generering af korrekte genetiske baggrunde og immunudfældning for at reducere baggrunden og optimere produktionen. Diskussion af fejlfindingsmuligheder, yderligere bekræftelseseksperimenter og potentielle downstream-programmer er også inkluderet. De præsenterede genetiske værktøjer og molekylære protokoller er en effektiv måde at beskrive de ribosom-associerede RNA'er af specifikke cellepopulationer i komplekse væv eller i systemer med afvigende mRNA opbevaring og oversættelse med det formål at informere om de molekylære drivkræfter for mutant fænotyper.
Introduction
Analyse af en celle eller vævs RNA-tæthed, som undersøgt af microarray eller RNA-sekventering, har vist sig at være et effektivt redskab til at forstå de molekylære drivkræfter bag mutantfænotyper. Disse relativt ufuldstændige analyseværktøjer kan dog ikke informeres om cellens fysiologi eller proteom, især i systemer, hvor mange mRNA'er opbevares før oversættelse såsom neurale og kimceller. I disse systemer, definere befolkningen af mRNAs bliver aktivt oversat til protein, eller cellens oversætteome, kan være en bedre indikator for cellens faktiske fysiologiske tilstand1,2. For eksempel, kimceller på forskellige stadier af udviklingen transskribere RNAs, der er gemt til senere oversættelse, drevet enten af udviklingsmæssige3 eller signalering signaler4. Denne proces eksemplificeres af mRNAs, der koder protaminer, hvor mRNA-udskriften kan påvises dage før proteinet fremstilles1,2,5,6. Ligeledes, neurale celler transskribere RNA i kernen og transportere det ned axon, som det er tilfældet med β-actin7. Ud over disse specialiserede cellesystemer, steady-state transforskrifter er usandsynligt, at være informativ i modeller, hvor RNA opbevaring, ribosom biogenese, eller mRNA oversættelse er påvirket. Flere andre faktorer kan også påvirke en celles steady-state RNA pool omfatter mRNA henfald og aktiviteten af RNA bindende proteiner. I disse tilfælde er der større sandsynlighed for, at robuste værktøjer til analyse af ribosomassocierede RNA'er eller mRNA'er under aktiv oversættelse giver biologisk relevante resultater.
Med henblik herpå er der udviklet flere metoder til at identificere ribosom-associerede eller aktivt oversatte meddelelser. Polysome profilering, som giver et øjebliksbillede af ribosom tilknyttede udskrifter, har været brugt i mange årtier til at isolere intakte RNAs forbundet med enten ribosomale underenheder eller mono-, di-, og poly-ribosomkomplekser3. Kort, indsamlede celle lysater påføres en lineær saccharose gradient og centrifugeret som høj hastighed, hvilket resulterer i adskillelse af ribosome underenheder, intakte ribosomer, og polysomer efter størrelse. Traditionelt er denne teknik blevet anvendt til at studere en eller et par mRNAs, men for nylig denne metode er blevet kombineret med RNA-seq undersøgelser for at belyse funktionen af potentielle translationelle regulatorer8,9 Mens en effektiv måde at skelne mellem aktivt oversætte og ikke-oversætte mRNAs10, polysome profilering kræver tidskrævende metoder (fraktion gradient og ultracentrifuge) og kan kræve en god del af prøven gør analysen af celle sjældne befolkninger udfordrende.
En alternativ tilgang til at undersøge oversætteomer er ribosom profilering, som identificerer de dele af udskrifter direkte forbundet med ribosomet. Kort sagt genereres ribosome tilknyttede RNA-fragmenter via RNase-beskyttelsesanalyse, individuelle ribosomkomplekser adskilt via saccharosegradient og tilhørende RNA-fragmenter isoleret og konverteret til RNA-seq-tags, der kan afstå ved dyb sekventering11. En af de vigtigste fordele for ribosomprofilering er evnen til at bestemme de specifikke steder af ribosomerne på tidspunktet for isolation, som gør det muligt at identificere oversættelse startsteder, beregning af ribosomal belægning og distribution, og identifikation af ribosom boder12. Men denne metode har flere iboende ulemper, herunder udstyr behov (gradient fraktionator og ultracentrifuge), en relativt kompleks protokol, der kræver omfattende fejlfinding, og beregningsmæssige spørgsmål ikke let håndteres af den uerfarne bruger11. Det er vigtigt, at ribosom profilering primært anvendes på isolerede celler i kultur og kræver betydeligt materiale, hvilket gør dens anvendelse på blandet celletype væv eller sorteret celler fra in vivo begrænset.
Den pattedyr RiboTag metode, udviklet af Sanz et al. i 200913, eliminerer en række spørgsmål iboende til både polysome og ribosom profilering. I denne metode kan ribosomassocierede RNA'er isoleres fra specifikke celletyper, der gør det muligt at undersøge celletypespecifikke oversætteomer i komplekse væv uden yderligere isolationsteknikker og specialiseret udstyr, som det er nødvendigt i andre metoder13,14. Grundlaget for RiboTag-metoden er en transgen musemodel (RiboTag), der bærer en modificeret locus til 60S ribosomelt subunit proteingen Rpl22. Dette locus (Rpl22-HA) omfatter en floxed terminal exon efterfulgt af en ekstra kopi af terminalexon ændret til at omfatte en C-terminal hemagglutinin (HA) tag inden for kodning regionen. Når den floxed exon krydses til en mus, der udtrykker en cellespecifik Cre Recombinase, fjernes den floxed exon, så udtrykket HA-mærket RPL22 udtrykkes på en cellespecifik måde (figur 1). HA-mærket kan derefter bruges til at immunforkaste (IP) ribosomer og deres tilknyttede RNA'er fra den valgte celletype.
Ud over den første publikation, der udviklede teknikken, har flere andre laboratorier udnyttet RiboTag-modellen. Diverse væv som mus Sertoli og Leydig celler15, microglia16, neuroner17,18, oocytter19, og dyrkede celler20 er blevet profileret og undersøgt. Selv om denne protokol er klart i stand til at isolere ribosomer og de tilhørende RNA'er på tværs af en forskelligartet vævstyper er der stadig områder, der kræver forbedringer, især når de anvendes på mutantsystemer. Især resulterer almindelig afhængighed af friskvæv i øget teknisk variation, som i høj grad kan reducere effekten af analysen. For det andet, sikker identifikation af differentieret oversat mål er gjort mere udfordrende, når høj immunfældning baggrund opstår fra ikke-Cre recombined celletyper som tidligere rapporteret13. Mens Sanz et al. manipuleret den grundlæggende forudsætning for teknikken, i dette manuskript Snyder laboratoriet præsenterer optimering af protokollen for at reducere disse bekymringer, hvilket gør metoden mere praktisk og effektiv.
Hensigten med denne artikel er at forklare trinene for avl mus udtrykke celle-specifikke HA-mærkede ribosomer, immunovergroning disse ribosomer fra flash-frosne prøver, og rense deres tilknyttede RNA'er for yderligere downstream analyser. Som pattedyr mandlige kimcelle og barnløshed mutation undersøgt give unikke udfordringer, har der gjort en indsats for at belyse måder denne teknik kan tilpasses andre cellesystemer.
Protocol
Alle former for dyrebrug og håndtering er blevet godkendt af Rutgers University's Internal Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Mus avl
- Race kvindelige mus homozygous for en RNA bindende protein mutation, der fører til mandlig infertilitet (manuskript under forberedelse, benævnt heri som genet af interesse) i trio parringer til hanner hemizygous for Stra8-iCre allel (B6. FVB-Tg(Stra8-iCre)1Reb/LguJ) (Cre+), som parring to hunner til hver mandligøger avl effektivitet.
BEMÆRK: Det mutante gen af interesse (M) blev passeret moderligt, da hunner homozygous for M har normal fertilitet. Dette har den ekstra fordel at tillade faderlig overførsel af den mandlige kimcelle Cre (hemizygous), som anbefalet21 og optimere procent af afkom med den ønskede allelic kombination. Fordi homozygous Cres udviser kimcelle toksicitet22,anbefales det allelen opretholdes og bestået i en heterozygot eller hemizygous tilstand. Det er vigtigt, at Cre-udtrykket ikke må ske side om side med Rpl22-HA-allelen, før den eksperimentelle population. Hvis Rpl22-HA-allelen ikke isoleres fra Cre hos avlsdyr, vil det resultere i afkom, der globalt udtrykker Rpl22-HA på grund af kimcelle Cre-aktiviteten. Dette problem er specifikt for kimcelle. Derudover stra8-iCre er specifik for forfatternes celle population af interesse22,rettet mod celler, der skifter til og meget tidligt i meiose, herunder preleptotenes og leptotenes. En anden Cre-driver, der er specifik for en anden celletype, kan bruges i stedet. Almindelig praksis dikterer mandlige kimcelle udtrykt Cres overføres på faderlig side. Men det er muligt moderlig overførsel af Stra8-iCre vil resultere i lignende transgene udtryk i mandlige afkom. Uanset hvilken støtteordning der udvælges, bør alle forsøgsprøver for at generere afkom med tilsvarende Cre-udtryk genereres via Cre-overførsel fra samme forældreside (enten altid moderlig eller altid faderlig). - Genotype resulterende handyr hvalpe som beskrevet i afsnit 2.4. Vælg dem, der bærer M allel og positiv for Cre (+/M:Cre +) for downstream avl.
- Race kvindelige mus homozygous for M allel i trio parringer til hanner homozygous for Rpl22-HA (B6J.129 (Cg)-Rpl22tm1.1Psam/ SjJ).
BEMÆRK: Rpl22-HA-baggrunden er meget blandet, så der bør udvises forsigtighed ved vurdering af stammespecifikke fænotyper. - Genotype resulterende hununger til at identificere dem, der bærer M allel og positiv for Rpl22-HA (+/M:Rpl22-HA +) (se afsnit 2.3). Vælg disse hunner til nedstrømsavl.
- Cross +/M:Cre+ hanner med +/M:Rpl22+ hunner i trioparringer. Genotype de resulterende hvalpe (se afsnit 2.3 og 2.4) for at identificere mænd, der er både Cre + og Rpl22 + og enten vildtype eller M / M.
BEMÆRK: Da dette arbejde fokuserer på en mutation, der resulterer i fuldstændig mandlig infertilitet, er der i avlsordningen taget særlige hensyn til, at de mest effektivt opnår ønskede eksperimentelle genotyper. Sådanne overvejelser kan være unødvendige i andre forsøgsmodeller. Se figur 2 for en fuld avl skematisk og ledsagende legende for yderligere diskussion af avl overvejelser.
2. Indsamling af prøver
- Indsamle testikler fra hanmus på 21 dage efter partum (dpp).
- Ofre mus ved CO2 indånding efterfulgt af cervikal dislokation. Lav et ventral snit (3 cm) på hvert dyr flankeret af to kortere (2 cm hver), tilsluttede laterale snit. Træk huden og peritoneum tilbage for at afsløre testiklerne.
- Brug pincet, trække den epidymal fedt pad fra den ene side af kroppen hulrum til at afsløre epididymis og testis. Med tenotomy saks, punktafgifter testis, sørge for at trimme væk epididymis, omgivende fedt, og eventuelle eksterne vaskulatur. Placer intakte testikler i et rent 1,7 ml rør.
- Gentag med anden side, tilføje de anden testikler til det første rør. Cap dette rør og straks nedsænke det i flydende nitrogen til flash-fryse.
BEMÆRK: Prøverne kan opbevares ved -80 °C, indtil de er taget i brug.
- Der indsamles yderligere prøver af halespidser for hvert dyr (2 mm) til genoypingbekræftelse.
- For at udtrække DNA tilsættes 100 μL 50 mM NaOH til en 2 mm halespids i et 1,7 ml rør og koges ved 95 °C i 30 min. Tilsæt 100 μL 50 mM HCl og 20 μL 1 M Tris-HCl pH 8.0 og prøver centrifuger i 3 min ved 10.000 x g. Behold supernatant (indeholdende genomisk DNA) og opbevares udvundet DNA ved 4 °C, indtil det bruges som skabelon til følgende genoypingreaktioner.
- Udfør Rpl22-HA genotyping efter en metode tilpasset fra Sanz et al.13 ved hjælp af følgende primere: fremad: 5' GGGAGGCTTGCTGGATATG 3'; omvendt: 5' TTTCCAGACACAGGCTAAGTACAC 3«.
- Der fremstilles en reaktionsblanding bestående af 2 μL DNA som udvundet i trin 2.2.1, 0,08 μL 25 mM dNTPs, 0,1 μL 10 mM frem primer 0,1 μL 10 mM omvendt primer, 2 μL polymerase kædereaktion (PCR) buffer (650 mM Tris pH = 8,8, 165 mM (NH4)2SO4, 30 mM MgCl2, og 0,1% Tween), 0,2 μL Taq polymerase, og nuklease-fri H2O til en samlet volumen på 20 μL.
- Brug følgende termocyclerbetingelser: et 30 s primer smeltetrin ved 95 °C, 30 s anneal ved 64 °C og en 30 s forlængelse ved 72 °C, gentaget 37 gange med en endelig 5 min forlængelse ved 72 °C.
BEMÆRK: Dette gav en produktstørrelse på 260 bp for wildtype prøver og 292 bp for prøver, der var Rpl22-HA +
- Udfør Cre genotyping ved hjælp af følgende primere: fremad: 5'GTGCCAGCTGAACAACAGGA 3'; omvendt: 5' AGGGACACAGCATTGGAGTC 3«. Forbered PCR reaktion som beskrevet i trin 2.3.2 udnytte Cre primere i stedet. Brug følgende termocyclerbetingelser: et 30 s primer smeltetrin ved 95 °C, 30 s anneal ved 60 °C og en 15 s forlængelse ved 72 °C, gentaget 35 gange med en endelig 5 min forlængelse ved 72 °C.
- Udfør gen af interesse genotyping som standard for det pågældende gen.
BEMÆRK: Forfatterens genoyping protokol udnytter en koncentreret brugerdefineret Taq, og som sådan, andre brugere kan have til at ændre betingelserne for at passe deres enzymatiske krav. For bedre at forstå virkningen af dette gen af interesse tab på oversættelse, mænd, der var enten vildtype eller homozygot for mutant allel af interesse, og som også var Cre + og Rpl22 + blev udvalgt til at være de eksperimentelle prøver. Valget af genotype drøftes yderligere ovenfor i afsnit 1.
3. Udarbejdelse af løsninger
BEMÆRK: Forberedelse af løsninger og alle efterfølgende trin skal ske under strenge forhold.
- Til klargøring af homogeniseringsbuffer (HB) tilsættes 2,5 ml 1 M Tris pH 7,4, 5 ml 1 M KCl, 600 μL 1 M MgCl2og 500 μL NP-40 til et 50 ml rør. Bring til volumen (50 ml) i diethyl pyrocarbonat (DEPC) H2O og bland indtil alle komponenter er indarbejdet.
BEMÆRK: De endelige koncentrationer vil være som følger: 50 mM Tris pH 7,4, 100 mM KCl, 12 mM MgCl2,og 1% NP-40. - For at forberede høj saltvaskbuffer (HSWB) tilsættes 2,5 ml 1 M Tris pH 7,4, 15 ml 1 M KCl, 600 μL 1 M MgCl2og 500 μL NP-40 til et 50 ml rør. Bring til volumen (50 ml) i DEPC H2O og bland indtil alle komponenter er indarbejdet.
BEMÆRK: De endelige koncentrationer vil være som følger: 50 mM Tris pH 7,4, 300 mM KCl, 12 mM MgCl2,og 1% NP-40Protokollen kan sættes på pause her, og løsninger kan opbevares ved stuetemperatur, indtil de er brugt.
4. Fremstilling af væv
- Overvægt af alle prøverør, optagevægt og forkøling i flydende nitrogen.
- Forcool steril mørtel, støder, og vejer spatel på tør is.
- Grind flash-frosne vævsprøver til et fint pulver ved hjælp af en forkølet, steril mørtel og støder på tøris.
- Placer flash frosset væv i forkølet mørtel på tør is. Bryd forsigtigt væv i store stykker ved hjælp af støder og male langsomt, indtil vævet er et fint pulver.
BEMÆRK: Selv om frisk væv også kan anvendes, som pr den oprindelige protokol13, ingen væsentlig forskel i resultatet er observeret med brug af flash-frosne væv. Se repræsentative resultater og diskussion for at få flere oplysninger. - Overfør forsigtigt jordprøven til forkølet opsamlingsrør ved at skrabe pulver fra mørtel ved hjælp af forkølet spatel. Sørg for, at kun væv opsamles, og ikke fugt, der deponeres på den kolde mørtel.
- Afvej røret med væv, og sørg for at holde på tøris når det er muligt. Vævsmasse ved at trække rørets oprindelige vægt fra rørets vægt med prøven i det. Optag denne værdi til senere beregning af lysis bufferdiskenheder.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her, og prøverne kan opbevares ved -80 °C, indtil de er brugt.
- Placer flash frosset væv i forkølet mørtel på tør is. Bryd forsigtigt væv i store stykker ved hjælp af støder og male langsomt, indtil vævet er et fint pulver.
5. Homogenisering af prøven
- Klargør lysisbuffer (10 ml HB + kosttilskud) ved tilsætning af 10 μL 1 M dithiothreitol (DTT), 1 proteasehæmmertablet, 50 μL RNase-hæmmer (40.000 enheder/ml), 200 μL 5 mg/ml cyclohexie og 100 μL 100 mg/ml heparin til 10 m HBL af HBL. Bland indtil alle komponenter er indarbejdet og holde på is, indtil brug.
BEMÆRK: De endelige koncentrationer af kosttilskud i 10 ml HB vil være som følger: 1 mM DTT, 200 U/mL RNase-hæmmer, 100 μg/mL cycloheximid og 1 mg/ml heparin. Denne opløsning skal anvendes inden for 24 timer efter tilsætning af kosttilskud og kan opbevares ved 4 °C eller på is, indtil den er brugt. - For hver 100 mg prøve, tilsættes 1 ml lysis buffer. Med den samme pipette, der bruges til at tilføje lysisbufferen, skal den resulterende lysate omhyggeligt op og ned og blandes. Fortsæt pipettering, indtil prøven ikke længere er tyktflydende, normalt 25−30 slag.
BEMÆRK: Da opløsningen er meget tyktflydende i starten, skal der anvendes en pipette med stor diameter til at blande opløsningen. En standard 1000 μL er normalt tilstrækkelig til 100 mg væv. - Sæt prøver på is i 10 minutter til lyse. Derefter centrifugeres prøverne i en forkølet centrifuge (4 °C) i 10 min ved 10.000 x g. En stor, løs, overskyet pellet bør dannes i bunden af røret.
- Pas på ikke at forstyrre pellet, indsamle lysate i et nyt rør og optage volumen for hver prøve. For at forhindre afhjælpning af prøver skal du sørge for, at prøverne forbliver afkølede i hele den resterende protokol, opbevaring på is eller ved 4°C, når det er muligt.
6. Ligevægt af perler
- Ved hjælp af lysatmængden fra trin 5.2 beregnes den nødvendige mængde magnetiske perler koblet til det relevante antistofbindende protein (i dette tilfælde protein G). For 1 ml lysat anvendes 375 μL protein G-perler (30 mg/ml).
BEMÆRK: Valget af konjugerede perler vil variere med anti-HA antistof anvendes; hvis der for eksempel vælges et kaningenereret anti-HA antistof, vil protein A perler være at foretrække. - Ved hjælp af en magnetisk rørrack skal du fjerne perleopløsningsmiddel og tilføje en lige stor mængde frisk lysisbuffer til perlerne. Roter 5 min ved 4 °C for at vaske. Udfør alle rotationstrin ved hjælp af en rotationsdrejemaskine til bænkrør, der er indstillet til 20 omdr./min.
- Anbring røret på det magnetiske rørrack, og fjern vaskebufferen.
- Gentag trin 6.1−6.3 to gange mere.
- Tilføj lysis buffer ved det oprindelige volumen til ligeudkalibrerede perler. Opbevares ved 4 °C eller på is, indtil det er brugt.
7. Prøve for forclearing
- Der tilsættes 50 μL equilibrated perler for hver 1 ml lysat til supernatant af lysed prøve (lysat) og roteres ved 4 °C i 1 time.
- Anbring røret på magnetholderen, og opsaml lysat i et friskrør. Kassér brugte perler.
- Til lysaten tilsættes 25 μL ækvilibrerede perler for hver 1 ml og roteres ved 4 °C i 1 time. Opbevares de resterende equilibrated protein G-perler ved 4 °C natten over.
- Placer røret på magnetrackog indsamle lysat e i et frisk rør. Kassér brugte perler. Fra den ryddede lysat opbevares 50 μL for at fungere som prøveinputkontrol. Opbevares ved -80 °C.
BEMÆRK: Inputprøven fungerer som en kontrol, der repræsenterer den samlede RNA-population af prøven, herunder RNA'er, der er forbundet med andre celletyper i vævet, og som skal anvendes under downstream-analyser til at korrigere for ændringer i genekspressionsomer som mutationsfunktion.
8. Inkubation af antistof
- For hver 1 ml ryddet lysat tilsættes 5 μg anti-HA antistof. For at undgå prøvetab forsegles rørhætten med laboratoriefilm. Prøverne roteres 16−18 timer ved 4 °C.
BEMÆRK: Antistofinkubationstiden og koncentrationen er ikke optimeret. Forfatterne fandt en overnight inkubation med 5 μg at være tilstrækkelig; det er dog muligt, at en kortere inkubation eller mindre antistof vil være tilstrækkelig, eller at en længere inkubation eller mere antistof vil forbedre bindingen.
9. Inkubation af perler
- For hver 1 ml ryddet lysat tilsættes 300 μL protein G perler. Røretforsegles igen med laboratoriefolie, og drej i 2 timer ved 4 °C.
10. Vask af perler
- Placer prøverøret på magnetristen, så perlerne kan adskilles fra IPed lysate. Pipette fra flow-through lysate og kassér, fastholde perlerne.
- Påfør 800 μL HSWB på perler og lad det rotere i 10 min ved 4 °C. Anbring prøverøret på magnetholderen, og lad perlerne adskille skildig fra vask. Fjern og kassér vask.
- Påfør yderligere 800 μL HSWB på perler. Luk prøven, og lad det rotere i 5 min ved 4 °C. Anbring prøverøret på magnetholderen, og lad perlerne adskille skildig fra vask. Fjern og kassér vask.
- Gentag trin 10.3 igen.
11. RNA-ekstraktion
- Anbring prøverøret på magnetholderen, og lad perlerne adskille skildig fra vask. Pipette ud og kassér vask, fastholde perler til RNA udvinding. Der tilsættes 3,5 μL 14,2 M beta-mercaptoethanol (bME) til perler og blandes ved vortexing i 15 s.
- Uddrag RNA ved hjælp af et kommercielt RNA-rensesæt, som pr. producentens anvisninger. Elute prøve i 30 μL rnase fri H2O.
BEMÆRK: Selvom 10 μL/prøve DNase-behandlingen er valgfri for de fleste kits, opfordres der kraftigt til den. Dette valgfrioprydningstrin reducerer baggrunden betydeligt, hvilket giver mulighed for en mere nøjagtig endelig koncentration. Det er stærkt anbefalet at bruge et kit, der indeholder beta-mercaptoethanol (bME) i lysis buffer. bME fungerer som en yderligere RNase-hæmmer for at forhindre nedbrydning af prøver under RNA-isolation. - Prøve ved -80 °C eller analyseres med det samme.
12. Kvantificering og analyse af prøver
- Ved hjælp af et UV-Vis spektrofotometer skal du kvantificere RNA-koncentration og foreløbig kvalitet.
- Analysér kvaliteten af RNA udvundet af prøver via en bioanalysator.
BEMÆRK: Det resulterende RNA kan derefter anvendes til RNA-sekventering eller andre downstream-analyser såsom nording blotting eller kvantitativ omvendt transskription PCR (qRT-PCR).
Representative Results
Tidligere rapporter har foreslået ikke-specifik immunudfældning fra celler mangler Cre14. For at afgøre, om dette var tilfældet i vores ændrede protokol, blev IP-effektiviteten bestemt i prøver, der stammer fra dyr, der transporterer både Cre og Rpl22-HA, og dyr, der kun transporterer det ene, men ikke det andet, med forventning om, at der uden både en Cre-driverog Rpl22-HAbør immunoprecipiteret RNA være minimal. Som vist i figur 3isoleres meget lidt RNA fra prøver, der mangler enten Cre eller Rpl22-HA, og som viser effektiviteten af denne protokol for at reducere IP-baggrund og isolere ægte HA-mærkede ribosome RNA'er. Desuden repræsenterer kun prøver af Cre-only og Rpl22-HApassende negative kontroller.
I betragtning af reagenskildens potentiale til at påvirke effektiviteten af IP blev der testet en række antistoffer og RNA-isolationsprotokoller (figur 4) i cre- og Rpl22-HA-positive prøver. Disse resultater viser, at reagensvalg kan have en betydelig indvirkning på IP-effektiviteten, og derfor bør eventuelle ændringer af reagensvalget foretages med forsigtighed.
For at teste denne protokol i forbindelse med en RNA-bindende proteinmutant blev wildtype-Cre+Rpl22-HA+ (wildtype) og gen af interesse-/--Cre+Rpl22-HA+ (Gene af interesse-/-) testis undersøgt for ribotagsystemets effektivitet for at isolere ribosomassocieret RNA ( figur5). Når RNA-koncentrationen af vildtypeinput og IP blev sammenlignet med gene af interesse-/- input og IP, blev der ikke set nogen signifikant forskel mellem genotyper. For begge genotyper var inputkoncentrationen imidlertid betydeligt højere end IP-koncentrationen, hvilket indikerer, at der var mere RNA i inputprøven (figur 5B). Dette resultat forventes, da ikke alle mRNA'er til stede i cellen er forbundet med ribosomet på et givet tidspunkt, især i tilfælde af kimceller, hvor RNA'er kan transskriberes længe før de oversættes.
For at bekræfte kvaliteten af de RNA-prøver, der blev sendt til sekventering, blev der kørt prøver på en bioanalysator. RNA-integritetstal (RIN'er), der normalt beregnes som forholdet mellem 28S og 18S rRNA-toppe, blev sammenlignet på tværs af prøver. I de samlede RNA-puljer forventes RIN-værdierne at være tæt på 10 med en højere RIN, der er korreleret med højere udledes prøveintegritet og -kvalitet. Mens IP-prøverne havde lavere RIN end input, var RIN'erne stadig inden for et acceptabelt interval og var ikke afhængige af prøvegenotype (figur 5C). De reducerede RIN-værdier for IPed-prøver er sandsynligvis et resultat af RNA-nedbrydning, men meget lille i betragtning af det relativt lille fald i den gennemsnitlige nukleotidlængde af analyserede RNA'er. I betragtning af længden af protokollen og temperaturer, der kræves for immunfældning en vis nedbrydning forventes. Det er også muligt, at den reducerede RIN- og RNA-længde er en funktion af tilsætning for ikke-rRNA-arter, såsom mRNA'er.
Figur 1: RiboTag-metoden. Præmissen for metoden er biologisk enkel. En ny Exon 4 indsættes i sekvensen for Rpl22 locus nedstrøms for den oprindelige Exon 4. I overværelse af en Cre driver, loxP steder på hver side af den oprindelige Exon 4 er skåret, excising den floxed exon. DEN HA-taggede Exon 4 er nu indarbejdet i Rpl22 mRNA, genererer en HA mærket RPL22 i celler, der udtrykker CRE. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Prøveavlsordning for RiboTag-mus. Den avlsordning, der anvendes til at generere forsøgsdyr, er vist. En tostrenget ordning blev udnyttet. I generation 1 blev der etableret to parallelle sæt opdrættertrioer. Den ene side kombinerede allelen af interesse (båret moderlig som denne specifikke mutation resulterer i mandlig infertilitet) med hemizygous Cre og på den anden kombinere allel af interesse, igen gennemført moderlig, med Rpl22-HA. Derefter, i generation 2, hanner fra den første parring, der bærer allel af interesse og Cre krydses til kvindelige afkom af den anden parring, der bærer allel af interesse og Rpl22-HA. Genotyperne af det resulterende afkom bestemmes, og der udvælges eksperimentelt relevante dyr (i dette tilfælde enten vildtype eller homozygot mutant med både Cre og Rpl22-HA alleler). Det er vigtigt at bemærke, at for kimcelle, der udtrykker Cre-drivere,bør Cre og Rpl22-HA alleler ikke yngle sammen, før den eksperimentelle generation. Eksponering af Rpl22-HA allel til kim celle-udtrykt Cre i avl generationer vil drive kim-celle Rpl22-HA excision. Enhver resulterende afkom vil globalt udtrykke Rpl22-HA og dermed forhindre celle-specifik ribosom isolation. I det system, der er beskrevet heri, gav en n = 4 pr. genotype tilstrækkelig statistisk effekt til downstream-analyser. Biologisk replikatnummer bør bestemmes for hvert forsøgssystem. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Bekræftelse af negative kontroller. Prøver, der er Cre+ og Rpl22-HA+ viser højere RNA-pulldown end prøver, der er Cre+ eller Rpl22-HA+ alene. Der er ingen signifikant forskel mellem Cre+ og Rpl22-HA+ udtrækseffekten af RNA, hvilket indikerer, at prøver, der mangler enten Cre eller Rpl22-HA, er egnede negative kontroller. Et "+" angiver, at den tilsvarende allel eller transgene var til stede i disse prøver, og et "-" angiver, at den var fraværende. IP/input repræsenterer forholdet mellem RNA-immunforfældet (IP) i forhold til det samlede (input) RNA. Værdi beregnet ud fra koncentration i nanogram. ** angiver p < 0025. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Succes med reagenser effektprotokol. (A) Flash frosset væv resulterer i immunfældning effektivitet svarende til frisk væv. B) IP-effektiviteten for to kommercielle antistoffer blev fastlagt, betegnet som antistof 1 og antistof 2 (materialetabel). Når det blev testet, antistof 1 var mere effektiv til at trække ned RNA end Antistof 2, som syntes at være i stand til at skelne mellem negative (ikke udtrykke enten Cre eller Rpl22-HA +) og positive kontroller (udtrykke både Cre og Rpl22-HA +). Prikker, der angiver forholdet mellem IPed versus input RNA for individuelle biologiske replikater. (C ) Når RNA ekstraktion kits (Tabel over materialer) blev sammenlignet, Kit 2 væsentligt overgået Kit 1. Selvom begge kits IPed en lignende mængde RNA fra negative kontroller, Kit 2 resulterede i en betydeligt højere RNA udbytte fra positive prøver. * angiver p < 0,05, ** p < 0,025, *** p < 0,01. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Anvendelse af metoden på en mutant model. (A) Prøve Gen af interesse genotype bekræftelse via vestlige blotting ved hjælp af en brugerdefineret in-house antistof mod genet af interesse protein viser Gene af interesse -/- (M / M) hanner undlader at producere det tilknyttede protein. GAPDH vist som en belastningskontrol. (B) Grafisk bioanalysatoroutput fra parret input og IPed prøver til vilde og mutantprøver. (C) Sammenligning RNA integritet numre (RIN) efter prøvetype og genotype. (D) Gennemsnitlig nukleotidlængde for RNA-arter, der analyseres af bioanalysator efter prøvetype og genotype. * angiver p < 0,05, ** p < 0,025, *** p < 0,01, N.S. ikke signifikant. N = 4 pr. genotype. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Eksempel på Cre-chaufførbekræftelse. Kvantificering af et gen, der er oversat tidligt i udvikling af kimceller (Stra8) og to gener, der er oversat sent i udvikling af kimceller (Tnp1 og Prm1), analyseret af qRT-PCR af RNA-immunbundfældet fra RPL22-HA drevet af to forskellige kimcellecres , Stra8-iCre (udtrykt tidligt i udvikling af kimceller) og Hspa2-Cre (udtrykt senere i kimcelleudvikling, specielt efter Stra8-oversættelse). Her, HA-IP af Stra8 opnås med den tidlige kimcelle Cre driver, men ikke med den senere kimcelle Cre driver demonstrere celle-specificitet immunudfældning. I modsætning hertil opnås HA-IP af udskrifter oversat i sene kimceller af både Stra8-iCre og Hspa2-Cre. Dette forventes som celler, der udtrykker Stra8-iCre vil generere HA-tagged RPL22 hele hele deres udvikling, mens dem, der udtrykker Hspa2-Cre vil kun gøre det i de senere dele af deres udvikling. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Forståelse af oversætteome af en bestemt celletype er uvurderlig for mere præcist at forstå en celles fysiologi i normal eller mutant tilstand. Særlig fordel ses i systemer, hvor oversættelse er afkoblet fra transskription, såsom i neurale væv, hvor oversættelse næsker meget langt fra transskription, eller i kimceller, hvor transskription forekommer længe før oversættelse. I forhold til andre metoder til oversætteom analyse, RiboTag systemets største fordel kommer fra brugen af Cre rekombinase system. Dette giver frihed til at målrette enhver cellepopulation, der har en relevant Cre driver. For det andet er RiboTag IP som beskrevet heri effektiv og langt mindre teknisk udfordrende og tidskrævende end enten polyom eller ribosom profilering. Endelig kan RiboTag IP nemt udføres på bordpladen.
Der er en række kritiske trin i denne protokol. Chief blandt dem er etableringen af RiboTag muselinje og generation af forsøgsdyr til undersøgelse. Som for alle genetiske modeller, omhyggelig sporing af personer i musekolonien samt omhyggelig genoyping protokoller bør anvendes. PCR genotyping som pr. Sanz et al. bør omfatte primere rettet mod loxP site 5 ' af wildtype exon 4 at skelne mellem vilde alleler (260 bp) og mutant (290 bp)13. For RiboTag-analyse i kimcellemodeller bør meget specifikke avlskrav overholdes. For det første, i tilfælde af mutanter, der resulterer i barnløshed, tankevækkende avl strategier bør omfatte metoder til at optimere antallet af afkom med den ønskede genotype i mellemliggende og eksperimentelle generationer. For det andet bør der, når det drejer sig om kønscellespecifikke Cres,sørge for,at der tages hensyn til Cre-zygosity i betragtning af kønscellernes følsomhed over for Crettoksicitet. I kimcellen kan høje niveauer af Cre-protein have skadelige virkninger22, der forbyder brugen af Cre/Cre-dyr i avlsordningen. Endelig, når du bruger kimcelle Cres, er det vigtigt at isolere RiboTag allel fra Cre indtil den endelige generation som Cre udtryk i kimcellen af en mellemliggende generation vil resultere i afkom udtrykke Rpl22-HA globalt.
Uanset cellesystem er en række anbefalede kontroller mulige for at kontrollere robustheden af både Cre-udtryk og specificitet. Korrekt udtryk for din Cre og forventede excision af Rpl22-HA kan bestemmes ved hjælp af flere metoder. I den første kan væv isoleret fra forsøgsdyr farves for HA ved hjælp af enten immunhistokemi eller immunfluorescens15. Denne metode er optimal, idet den ikke kræver forudgående kendskab til oversatte mRNA'er i målcelletyperne. Den anden metode, som er et eksempel på, og som er vist i figur 6,kræver en vis viden om translationelle regulerede meddelelser i målcelletyperne. I denne metode kan berigelse af et kendt translationelt reguleret mRNA bekræftes fra den valgte Cre-driverved hjælp af kvantitativ PCR af IPed versus input RNA. På samme måde kan robust Rpl22-HA-udtryk bekræftes ved sammenligning af Cre+/Rpl22+ prøver (positive kontroller) med enten Cre-/Rpl22+ eller Cre+/Rpl22-prøver, der fungerer som effektive negative kontroller (se figur 3). Disse sammenligninger kan enten foretages på det samlede IPed RNA eller tilsætning for et kendt translationelt reguleret mRNA vurderet ved qRT-PCR eller en anden kvantitativ metode.
Almindelige problemer i udførelsen af protokollen har tendens til kun at vise sig, når RNA-udbyttet uventet er lavt eller højt. Den mest almindelige årsag til disse fejl opstår som følge af forkert genoyping af enkeltpersoner. Vi anbefaler, at yderligere væv fra den indsamlede prøve bevares for at bekræfte genotyper af alle prøver i tilfælde af uventede RNA-udbytter. Når det er bekræftet, bør andre muligheder overvejes, herunder muligheden for RNase-kontaminering eller nedbrydning af prøver. Omhyggelig prøveopbevaring og håndtering og vedligeholdelse af RNase-frizoner i laboratoriet kan i høj grad reducere eller eliminere disse problemer. Selv om RNA isolation spørgsmål er et andet potentielt problem i denne protokol, brugen af kommercielle kits i høj grad reducerer dette problem, selv om der bør udvises omhu for at sikre, at de opretholdes som RNase fri og indeholder ingen udløbne løsninger. Endelig, som med alle antistof-baserede procedurer, variationer i parti, opbevaring betingelser, koncentration, eller endda forsendelse har potentiale til at have en negativ indvirkning på kvaliteten af antistoffet og den efterfølgende succes pulldown. Som et resultat, efter omhyggelig og gentagen test, valgte vi den mest konsekvente og effektive antistof til rådighed.
Denne protokol indeholder to større ændringer i forhold til andre offentliggjorte RiboTag-protokoller, der i væsentlig grad øger sandsynligheden for succes. Den ene er evnen til at bruge flash frosset væv, og dermed afbøde eventuelle problemer, der involverer parti, tekniker, eller tekniske køre variationer. Prøver kan indsamles og opbevares, så der kan isoleres ha-ribosomer fra alle prøver på én gang, hvilket kan være vigtige kilder til variation. For det andet reducerer tilføjelsen af det foreløbige trin i væsentlig grad den form for baggrund, der rapporteres af andre brugere af RiboTag-systemet. For nylig, en protokol rapport fra Sanz et al. angiver tilstedeværelsen af høj baggrund på grund af overflod af ribosom-associerede udskrifter fraikke-Cre-drevneceller14. Vores protokol løser dette problem ved at inkludere et forclearingtrin, hvilket effektivt eliminerer tilstedeværelsen af RNA i Cre negative IP-prøver.
Som alle andre systemer bør ribotagsystemets iboende begrænsninger holdes for øje. Når du bruger ukarakteriserede Cre-drivere, skal der foretages analyse af udtryk før eksperimentel prøveproduktion. Set ud fra oversættelsens perspektiv skal der bemærkes flere nuancer af denne metode. For det første tillader RiboTag ikke differentiering mellem mRNA'er, der er klar til at oversætte, og dem, der aktivt oversætter. Som sådan tillader de nuværende RiboTag-baserede metoder ikke kvantificering af oversættelseseffektiviteten som funktion af de enkelte mRNA'er. Hvis oversættelseseffektiviteten er af interesse, kan den måles på et cellespecifikt grundlag, hvis RiboTag-metoden kombineres med andre oversætteanalyseværktøjer såsom polyen profilering. For det andet er det afgørende at tage hensyn til de samlede RNA-tæthedsændringer, der stammer fra den individuelle eller genotypeafhængige varians. Det er grunden til, at omhyggelig isolering af input RNA ledsage immunfudfældning og prøver stammer fra hver forblive parret i alle downstream analyser. Endelig og med hensyn til RiboTag-baseret analyse skal det erindres, at tilknytningen til et ribosin ikke nødvendigvis beviser, at der sker oversættelse. Der bør udføres sekundære analysemetoder for at bekræfte translationel regulering i interessemål.
Denne protokol beskriver isoleringen af ribosom-associerede RNAs fra kimceller af mandlige mus ved hjælp af RiboTag model. Ikke tegner sig for mus avl og prøve indsamling, protokollen tager to dage, med tre timer den første dag, bedst gøres om eftermiddagen, en overnatning inkubation, efterfulgt af fem timers arbejde den efterfølgende morgen. Det anbefales på det kraftigste, at forberedelse af lageropløsninger (HB og HSWB) samt vævsslibning sker på forhånd. Den samlede succes af protokollen er afhængig af korrekt genosoping og strengt RNase-fri betingelser. Evnen til at undersøge oversætte af specifikke celletyper vil gøre det muligt for fremtidige undersøgelser til bedre at forstå forholdet mellem transskription, oversættelse og proteom i utallige celletyper og mutant baggrunde.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af NIH tilskud NICHD R00HD083521 til EMS og intern støtte fra Rutgers University til EMS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 1,4-Dithio-DL-threitol (8% | Alfa Aesar | A15797 | |
| 1.7 mL or 2mL tubes | Preference of researcher | ||
| 10 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
| 10 mL serological pippettes | Preference of researcher | ||
| 10 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 20 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 200 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 5 mL serological pipettes | Preference of researcher | ||
| 50 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
| Anti-HA tag antibody | Abcam | ab18181 | Antibody 1 |
| Anti-HA tag antibody | Antibodies.com | A85278 | Antibody 2 |
| B6.FVB-Tg(Stra8-icre)1Reb/LguJ Mice | The Jackson Laboratory | 17490 | Or mice carrying Cre driver of choice |
| B6N.129-Rpl22tm1.1Psam/J Mice | The Jackson Laboratory | 11029 | |
| Benchtop centrifuge | Preference of researcher | ||
| C1000 Touch thermal cycler | BioRad | 184-1100 | Or equivalent thermal cycler |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000537 | Or equivalent refrigerated centrifuge |
| Cyclohexamide | Sigma Aldrich | C7698-1g | |
| Dissection scissors | Preference of researcher | ||
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen by ThermoFisher Scientific | 10009D | |
| DynaMag-2 Magnet rack | Invitrogen by ThermoFisher Scientific | 12321D | |
| E.Z.N.A. Total RNA Kit 1 | OMEGA | 6834-01 | Kit 1 |
| Heat block | Preference of researcher | ||
| Heparin | Sigma Aldrich | 84020 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M9272-500g | |
| Microdissection forceps | Preference of researcher | ||
| Microdissection scissors | Preference of researcher | ||
| MiRNeasy kit | Qiagen | 217004 | Kit 2 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | Or equivalent spectrophotometer |
| NP-40 Alternative - CAS 9016-45-9 - Calbiochem | Millipore Sigma | 492016 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free | ThermoFisher Scientific | A32965 | |
| Potassium (KCl) | Sigma Aldrich | P3911-2.5kg | |
| RNase Inhibitor, Murine | New England BioLabs Inc. | M0314 | |
| SI vortex-genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Or equivalent benchtop vortex |
| Tips for 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tips for 10 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tips for 20 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tips for 200 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP152-500 | |
| Tube Revolver / Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | Or equivalent rotator |
| VWR Powerpette Plus pipet controller | VWR | 75856-450 | Or equivalent pipette controller |
References
- Snyder, E. M., et al. Gene expression in the efferent ducts, epididymis, and vas deferens during embryonic development of the mouse. Developmental Dynamics. 239 (9), 2479-2491 (2010).
- Snyder, E. M., Small, C. L., Li, Y., Griswold, M. D. Regulation of gene expression by estrogen and testosterone in the proximal mouse reproductive tract. Biology of Reproduction. 81 (4), 707-716 (2009).
- Iguchi, N., Tobias, J. W., Hecht, N. B. Expression profiling reveals meiotic male germ cell mRNAs that are translationally up- and down-regulated. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 103 (20), 7712-7717 (2006).
- Busada, J. T., et al. Retinoic acid regulates Kit translation during spermatogonial differentiation in the mouse. Developmental Biology. 397 (1), 140-149 (2015).
- Kleene, K. Patterns of translational regulation in the mammalian testis. Molecular Reproduction and Development. 43 (2), 268-281 (1996).
- Mali, P., et al. Stage-specific expression of nucleoprotein mRNAs during rat and mouse spermiogenesis. Reproduction Fertilility and Development. 1 (4), 369-382 (1989).
- Steward, O., Schuman, E. M. Protein synthesis at synaptic sites on dendrites. Annual Review of Neuroscience. 24, 299-325 (2001).
- Michel, A. M., Baranov, P. V. Ribosome profiling: a Hi-Def monitor for protein synthesis at the genome-wide scale. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 4 (5), 473-490 (2013).
- Snyder, E., et al. Compound Heterozygosity for Y Box Proteins Causes Sterility Due to Loss of Translational Repression. PLoS Genetics. 11 (12), 1005690 (2015).
- Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. Polysome Profiling Analysis of mRNA and Associated Proteins Engaged in Translation. Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79 (2019).
- McGlincy, N. J., Ingolia, N. T. Transcriptome-wide measurement of translation by ribosome profiling. Methods. 126, 112-129 (2017).
- Aeschimann, F., Xiong, J., Arnold, A., Dieterich, C., Grosshans, H. Transcriptome-wide measurement of ribosomal occupancy by ribosome profiling. Methods. 85, 75-89 (2015).
- Sanz, E., et al. Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).
- Sanz, E., Bean, J. C., Carey, D. P., Quintana, A., McKnight, G. S. RiboTag: Ribosomal Tagging Strategy to Analyze Cell-Type-Specific mRNA Expression In Vivo. Current Protocols in Neuroscience. 88 (1), 77 (2019).
- Sanz, E., et al. RiboTag analysis of actively translated mRNAs in Sertoli and Leydig cells in vivo. PLoS One. 8 (6), 66179 (2013).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Ceolin, L., et al. Cell Type-Specific mRNA Dysregulation in Hippocampal CA1 Pyramidal Neurons of the Fragile X Syndrome Mouse Model. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 340 (2017).
- Puighermanal, E., et al. drd2-cre:ribotag mouse line unravels the possible diversity of dopamine d2 receptor-expressing cells of the dorsal mouse hippocampus. Hippocampus. 25 (7), 858-875 (2015).
- Chen, J., et al. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes and Development. 25 (7), 755-766 (2011).
- Lesiak, A. J., Brodsky, M., Neumaier, J. F. RiboTag is a flexible tool for measuring the translational state of targeted cells in heterogeneous cell cultures. Biotechniques. 58 (6), 308-317 (2015).
- The Jackson Laboratory. B6.FVB-Tg(Stra8-icre)1Reb/LguJ. , The Jackson Laboratory. (2019).
- Bao, J., Ma, H. Y., Schuster, A., Lin, Y. M., Yan, W. Incomplete cre-mediated excision leads to phenotypic differences between Stra8-iCre; Mov10l1(lox/lox) and Stra8-iCre; Mov10l1(lox/Delta) mice. Genesis. 51 (7), 481-490 (2013).
