Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Måling af insulin- og sammentrækningsstimuleret glukoseoptagelse i isoleret og inkuberet moden skeletmuskulatur fra mus

Published: May 16, 2021 doi: 10.3791/61398
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Section of Molecular Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports, University of Copenhagen, 2Section of Integrative Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports, University of Copenhagen

Summary

Intakt regulering af muskelglukoseoptagelse er vigtig for at opretholde glukosehomeostase i hele kroppen. Denne protokol præsenterer vurdering af insulin- og sammentrækningsstimuleret glukoseoptagelse i isoleret og inkuberet moden skeletmuskel, når man afgrænser virkningen af forskellige fysiologiske interventioner på hele kroppens glukosemetabolisme.

Abstract

Skeletmuskulatur er et insulinresponsivt væv og optager typisk det meste af den glukose, der kommer ind i blodet efter et måltid. Desuden er det blevet rapporteret, at skeletmuskulatur kan øge ekstraktionen af glukose fra blodet med op til 50 gange under træning sammenlignet med hvileforhold. Stigningen i muskelglukoseoptagelsen under træning og insulinstimulering afhænger af translokationen af glukosetransportør 4 (GLUT4) fra intracellulære rum til muskelcelleoverflademembranen samt fosforylering af glucose til glucose-6-phosphat ved hexokinase II. Isolering og inkubation af musemuskler som m. soleus og m. extensor digitorum longus (EDL) er en passende ex vivo-model til at studere virkningerne af insulin og elektrisk induceret sammentrækning (en model til træning) på glukoseoptagelse i moden skeletmuskel. Ex vivo-modellen tillader således evaluering af muskelinsulinfølsomhed og gør det muligt at matche muskelkraftproduktionen under sammentrækning, hvilket sikrer ensartet rekruttering af muskelfibre under målinger af muskelglukoseoptagelse. Desuden er den beskrevne model velegnet til farmakologisk forbindelsestestning, der kan have indflydelse på muskelinsulinfølsomheden eller kan være til hjælp, når man forsøger at afgrænse den regulatoriske kompleksitet af skeletmuskulaturglukoseoptagelse.

Her beskriver og giver vi en detaljeret protokol om, hvordan man måler insulin- og sammentrækningsstimuleret glukoseoptagelse i isolerede og inkuberede soleus- og EDL-muskelpræparater fra mus ved hjælp af radioaktivt mærket [3H]2-deoxy-D-glucose og [14C]mannitol som en ekstracellulær markør. Dette muliggør nøjagtig vurdering af glukoseoptagelsen i moden skeletmuskulatur i fravær af forvirrende faktorer, der kan forstyrre den intakte dyremodel. Derudover giver vi oplysninger om metabolisk levedygtighed af inkuberet museskeletmuskulatur, hvilket tyder på, at den anvendte metode har nogle forbehold under visse betingelser, når man studerer muskelenergimetabolisme.

Introduction

Skeletmuskulatur besidder evnen til at udtrække store mængder glukose fra det ekstracellulære rum som reaktion på insulin og motion. Dette hjælper med at opretholde glukosehomeostase i hele kroppen og sikrer glukoseforsyningen i tider med høj energiefterspørgsel. Da intakt regulering af skeletmuskulaturens glukoseoptagelse har vist sig at være vigtig for den generelle sundhed og fysiske ydeevne 1,2, har målinger af muskelglukoseoptagelse under forskellige forhold fået stor opmærksomhed. Hos mennesker og dyr er den hyperinsulinæmiske-euglykæmiske klemme blevet anvendt som guldstandardteknik til vurdering af insulinfølsomhed in vivo 3,4. I modsætning til resultater opnået ved en oral glukosetolerancetest kræver den hyperinsulinemiske-euglykæmiske klemmeteknik ikke intakt gastrointestinal funktion eller insulinsekretion fra bugspytkirtlen og gør det således muligt at sammenligne insulinresponser mellem forsøgspersoner, der udviser variationer i mave-tarm- og/eller bugspytkirtelfunktionen. Målinger af muskelglukoseoptagelse in vivo under træning hos mennesker er blevet udført hyppigt siden 1960'erne5. Først ved anvendelse af arteriovenøse balanceteknikker6 og senere ved anvendelse af positronemissionstomografi (PET) billeddannelse i kombination med en positron, der udsender glucoseanalog, f.eks. 18F-Fluor-deoxy-glucose7. Hos gnavere udføres træningsstimuleret muskelglukoseoptagelse in vivo typisk ved anvendelse af radioaktive eller stabile isotopmærkede glucoseanaloger 8,9,10.

En supplerende metode til målinger af muskelglukoseoptagelse in vivo er at isolere og inkubere små muskler fra gnavere og efterfølgende måle glukoseoptagelsen ved hjælp af radioaktive eller stabile isotopmærkede glucoseanaloger 11,12,13. Denne metode muliggør nøjagtig og pålidelig kvantificering af glukoseoptagelseshastigheder i moden skeletmuskel og kan udføres i nærvær af forskellige insulinkoncentrationer og under sammentrækning fremkaldt af elektrisk stimulering. Endnu vigtigere er målinger af glukoseoptagelse i isoleret og inkuberet skeletmuskulatur af relevans, når man undersøger muskelmetabolisk fænotype hos mus, der har gennemgået forskellige interventioner (f.eks. Ernæring, fysisk aktivitet, infektion, terapi). Den isolerede skeletmuskelmodel er også et egnet redskab til test af farmakologiske forbindelser, der kan påvirke glukoseoptagelsen i sig selv og/eller ændre insulinfølsomheden12,14. På denne måde kan effekten af forbindelser, der er designet til at regulere muskelglukosemetabolismen, testes og evalueres i et stærkt kontrolleret miljø inden efterfølgende in vivo-test i prækliniske dyremodeller.

Under visse omstændigheder kan metabolisk levedygtighed udgøre en udfordring i det isolerede og inkuberede skeletmuskelmodelsystem. Manglen på et kredsløbssystem i de inkuberede muskler indebærer faktisk, at levering af substrater (f.eks. Ilt og næringsstoffer) helt afhænger af simpel diffusion mellem muskelfibrene og det omgivende miljø. I den forbindelse er det vigtigt, at de inkuberede muskler er små og tynde og dermed udgør en mindre barriere for iltdiffusion under inkubation15. Især under langvarige inkubationer i flere timer kan hypoxiske tilstande udvikle sig på grund af utilstrækkelig iltforsyning, hvilket resulterer i muskelenergiudtømning15. Selvom forskellige markører for metabolisk levedygtighed i inkuberet rottemuskel tidligere er blevet rapporteret sammen med identifikationen af vigtige variabler, der hjælper med at opretholde rottemuskelens levedygtighed15, er en omfattende evaluering af metabolisk levedygtighed i små inkuberede musemuskler stadig berettiget. Derfor er glykogenindholdet i øjeblikket hovedsageligt blevet anvendt som en markør for metabolisk levedygtighed i inkuberet museskeletmuskel16,17.

Her beskriver vi en detaljeret protokol til måling af basal-, insulin- og sammentrækningsstimuleret glukoseoptagelse i isoleret og inkuberet soleus- og EDL-muskel fra mus ved hjælp af radioaktivt mærket [3H]2-deoxy-D-glucose og [14C]mannitol som en ekstracellulær markør. I den foreliggende undersøgelse blev glukoseoptagelsen målt over en periode på 10 minutter, og metoden præsenteres ved anvendelse af submaksimalt og maksimalt effektive insulinkoncentrationer samt en enkelt sammentrækningsprotokol. Imidlertid kan de protokoller, der er beskrevet heri, let ændres med hensyn til inkubationstid, insulindosering og elektrisk stimuleringsprotokol. Desuden giver vi en grundig karakterisering af forskellige markører for metabolisk levedygtighed i inkuberet soleus og EDL musemuskel. Resultaterne indikerer, at glukosetilskud til inkubationsbufferen er afgørende for at bevare metabolisk levedygtighed af muskler inkuberet i 1 time.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Forsøg, der involverer forsøgsdyr, bør udføres i overensstemmelse med relevante retningslinjer og lokal lovgivning. Alle dyreforsøg, der blev anvendt til dette forsøg, var i overensstemmelse med den europæiske konvention om beskyttelse af hvirveldyr, der anvendes til forsøg og andre videnskabelige formål, og blev godkendt af Det Danske Dyreforsøgsinspektorat.

1. Forberedelse af forsøgsapparatet og sutursløjferne

BEMÆRK: Til denne undersøgelse skal du bruge et integreret muskelstrimmelmyografsystem med tilpassede inkubationskroge til at inkubere isolerede museskeletmuskler (figur 1). Dette system gør det muligt for muskler at bade i en fysiologisk opløsning med kontinuerlig iltning (95%O2 og 5% CO2) og ved konstant temperatur. Muskelvævsbadet er koblet til en krafttransducer til måling af muskelkraftproduktion under sammentrækning. For at fremkalde og registrere myo-mekaniske reaktioner under sammentrækning skal du anvende henholdsvis en elektrisk pulsstimulator og et dataindsamlingsprogram. Stimuler de inkuberede muskler til at trække sig sammen med platinelektroder placeret centralt og på begge sider af musklen.

  1. Tænd for myografsystemet og de varme kamre til 30 °C. Åbn dataindsamlingssoftware, der er kompatibel med myografsystemet, og kalibrer krafttransducere for at sikre sammenlignelighed mellem datasæt.
  2. Start med at skære ~ 16 cm tråde af ikke-absorberbar kirurgisk nylonsutur. Brug tang til at skabe en løkke på ca. 0,4 cm i diameter fra en enkelt streng. Gentag dette, indtil der er produceret nok sløjfer. Hver muskel har brug for to sløjfer - en til den proksimale og en til den distale sene.

2. Fremstilling af opløsninger og inkubationsmedier

  1. Fremstilling af basale inkubationsmedier
    1. Følgende stamopløsninger fremstilles: 2,5 M natriumchlorid (NaCl, 250 ml), 0,5 M natriumbicarbonat (NaHCO3, 250 ml), 0,5 M kaliumchlorid (KCl, 50 ml), 0,25 M calciumchlorid (CaCl2, 50 ml), 0,25 M kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4, 50 ml), 0,25 M magnesiumsulfat (MgSO4, 50 ml), 110 mM natriumpyruvat (Na-Pyruvat, 100 ml), 500 mM D-mannitol (100 ml), 1 M 2-deoxy-D-glucose (4 ml), 15 % opløsning af bovin serumalbumin (BSA) dialyseret mod Krebs-Ringer-Henseleit (KRH) buffer (beskrevet nedenfor i trin 4) (100 ml).
      BEMÆRK: Der kræves to opløsninger til måling af hvile og sammentrækningsstimuleret glukoseoptagelse. Desuden kræver hver enkelt insulinkoncentration, der anvendes til at vurdere insulinstimuleret glukoseoptagelse, to opløsninger. Således er der i alt behov for seks forskellige opløsninger til måling af basal, submaksimal insulin-, maksimal insulin- og sammentrækningsstimuleret glukoseoptagelse i isoleret museskeletmuskulatur. I det følgende henviser »basal inkubationsmedier« til medier uden insulin eller radioaktive sporstoffer. "Inkubationsmedier" henviser til medier, der indeholder insulin. Ved »glucoseoptagelsesinkubationsmedier« forstås medier, der indeholder 2-deoxy-D-glucose og radioaktive sporstoffer ud over insulin i en koncentration, der er identisk med den, der anvendes i »inkubationsmediet«.
    2. Forbered en KRH-buffer ved at supplere ultrarent vand (ddH2O) med NaCl (117 mM), NaHCO3 (24,6 mM), KCl (4,7 mM), CaCl2 (2,5 mM), KH2PO4 (1,2 mM) og MgSO4 (1,2 mM). Derefter gas KRH-bufferen med 95%O2 og 5% CO2 i mindst 10 min. Den ønskede pH-værdi i KRH-bufferen skal være mellem 7,35-7,45 ved 30 °C. Hvis pH-justering udføres ved stuetemperatur, skal pH-værdien i KRH-bufferen være mellem 7,25-7,35.
    3. Tilsæt BSA (0,1%), Na-Pyruvat (2 mM) og D-mannitol (8 mM) til den gassede og pH-justerede KRH-buffer for at fuldføre det basale inkubationsmedie. Opbevar basale inkubationsmedier i en forseglet beholder for at minimere afgasning afO2 og CO2 og anbring medier ved 30 °C.
      BEMÆRK: Typisk holdes osmolariteten af KRH-kosttilskuddene (dvs. Na-Pyruvat, D-Mannitol og D-glucose) konstant på tværs af et helt eksperiment for at undgå krympning eller udvidelse af muskelcellerne. Protokollen beskrevet heri bruger en osmolaritet på 10 mM for KRH kosttilskud. Hvis der er behov for en glukoseholdig buffer, skal krh-tilskud udskiftes for at imødekomme behovene, f.eks. 5 mM D-glucose og 5 mM D-mannitol.
    4. For at undgå mulige BSA-associerede forurenende stoffer i inkubationsbufferen skal du dialysere BSA mod KRH.
      1. For at gøre en 15% BSA-stamopløsning dialyseret mod KRH-buffer skal du starte med at opløse 300 g fedtfri BSA af analytisk kvalitet i 900 ml KRH-buffer. Kog derefter dialyserøret i redistilleret vand, indtil slangen er blød.
      2. Fyld slangen med BSA-KRH-opløsningen, og fastgør slangeenderne. Anbring slangen med BSA-KRH i 5 L KRH-buffer og lad den stå natten over ved 4 °C. Den følgende dag skal krh-bufferen udskiftes, og slangen efterlades med BSA-KRH i KRH-buffer natten over ved 4 °C.
      3. Til sidst opsamles BSA-KRH-opløsningen fra slangen og tilsættes KRH-buffer til et endeligt volumen på 2 L (dvs. 15% BSA-KRH-stamopløsning). Opdel 15% BSA-KRH stamopløsningen i alikvoter og opbevar i fryser ved ~-20 °C.
  2. Fremstilling af inkubationsmedier indeholdende insulin
    1. For inkubationsmediet, der indeholder en submaksimalt effektiv insulinkoncentration, tilsættes 1 μL af en 100 mU/ml insulinstændelig stamopløsning pr. ml basalt inkubationsmedie (100 μU/ml insulin).
    2. For inkubationsmedier, der indeholder en maksimalt effektiv insulinkoncentration, tilsættes 1 μL af en 10 U/ml insulinstabelopløsning pr. ml basalt inkubationsmedie (10 mU/ml insulin).
  3. Fremstilling af glucoseoptagelsesinkubationsmedier
    FORSIGTIG: Håndtering af radioaktivt materiale er kun tilladt i et begrænset og kontrolleret område af autoriseret personale, og nogle universiteter, forskningsinstitutioner og virksomheder kan kræve erhvervelse af en "Radioaktivitetstilladelse". Materiale og affald skal håndteres i henhold til passende lokale procedurer, retningslinjer og lovgivning.
    1. Følg samme fremgangsmåde som beskrevet i punkt 2.1.2.
    2. Der tilsættes BSA (0,1 %), Na-Pyruvat (2 mM), D-mannitol (7 mM) og 2-deoxy-D-glucose (1 mM) til den gassede og pH-justerede KRH-buffer.
    3. Der tilsættes [3H]2-deoxy-D-glucose (0,028 MBq/ml) og [14C]mannitol (0,0083 MBq/ml) til den supplerede KRH-buffer for at færdiggøre glukoseoptagelsesinkubationsmediet. Opbevares ved 30 °C. Hvis [3H]2-deoxy-D-glucose og [14C]mannitol opløses i ethanol, fjernes ethanolen vedN2-medieret fordampning før brug.
    4. Til glucoseoptagelsesinkubationsmediet, der indeholder en submaksimalt effektiv insulinkoncentration, tilsættes 1 μL af en 100 mU/ml insulinstængelopløsning pr. ml glucoseoptagelsesinkubationsmedie (100 μU/ml insulin).
    5. Til glukoseoptagelsesinkubationsmediet, der indeholder en maksimalt effektiv insulinkoncentration, tilsættes 1 μL af en 10 U/ml insulinstændelig opløsning pr. ml glucoseoptagelsesinkubationsmedie (10 mU/ml insulin).

3. Dyr og dissektion af musens soleus og EDL-muskel til inkubation

BEMÆRK: Forsøg med forsøgsdyr bør udføres i overensstemmelse med relevante retningslinjer og lokal lovgivning. Den beskrevne procedure kan anvendes med internt opdrættede eller kommercielt tilgængelige han- og hunmus af forskellige stammer og genetiske baggrunde. Følgende procedure er tilvejebragt for fodrede kvindelige C57Bl/6J-mus. I gennemsnit var musene 19 uger gamle og vejede 25 g. Musene blev opretholdt på en 12:12 timers lys-mørk cyklus med fri adgang til standard gnaver chow og vand. Dyreforsøg blev indledt kl. ~ 9:00 lokal tid, og alle dyr blev ofret inden for en periode på 2 timer.

  1. Tilsæt 4 ml forvarmede (30 ° C) basale inkubationsmedier til hvert inkubationskammer, og sørg for, at det basale inkubationsmedie kontinuerligt iltes med 95%O2 og 5% CO2.
  2. Bedøve mus med en intraperitoneal injektion af pentobarbital (10 mg/100 g kropsvægt) eller anden tilgængelig anæstesi (f.eks. tribromoethanol).
    BEMÆRK: Vær opmærksom på, at der i nogle lande kan kræves tilladelse til at håndtere pentobarbital og andre anæstesilægemidler. Før muskeldissektion kan påbegyndes, skal bedøvelse af hvert dyr induceres korrekt. For at sikre dette testes hale- og benreflekser. For optimale resultater dissektion bør være godt praktiseret for at undgå at beskadige musklerne under fjernelse.
  3. Anbring bedøvede mus, der er tilbøjelige til det, på en dissektionsbakke (f.eks. styrofoamlåg) og fastgør for- og bagpoter efter behov ved hjælp af en nål.
  4. Fjern huden fra underbenet og sørg for, at både akillessenen og knæleddet er synlige.
    1. Til dissektion af soleus muskel, start med at fastgøre en enkelt sutursløjfe til akillessenen. Fastgør en pean tang til akillessenen distalt af sutursløjfen og skær for at frigøre soleus og gastrocnemius musklerne fra poten. Skub forsigtigt ærte tangen hen over musen og derved udsætte soleusmusklen.
    2. Fastgør peantangen og læg en anden sutursløjfe omkring den proksimale sene i soleusmusklen. Skær derefter den proksimale sene og dissekere soleus (inklusive de to vedhæftede sutursløjfer) fri for gastrocnemius muskel. Placer hurtigt soleusmusklen i inkubationskammeret ved at fastgøre hver sutursløjfe til de respektive kroge.
  5. Fjern fasciaen, der dækker m. tibialis anterior (TA) ved hjælp af tang. Hvis det gøres korrekt, skal distale sener i TA- og EDL-musklerne være klare hvide og synlige; og adskilt fra hinanden.
  6. Skær den distale sene af TA-musklen og dissekere musklen til senere analyser (f.eks. Genotyping). Brug tang til forsigtigt at frigøre EDL-musklen fra det omgivende væv, men lad musklen være intakt og skær ikke senerne. Placer en sutursløjfe omkring den distale sene og en anden sutursløjfe omkring den proksimale sene af EDL.
  7. Skær derefter senerne, der frigiver EDL-musklen med to vedhæftede sutursløjfer, og placer hurtigt musklen i inkubationskammeret ved at fastgøre hver sutursløjfe til de respektive kroge. For ikke at miste spændinger under inkubation og især under elektrisk induceret sammentrækning af soleus- og EDL-musklerne er det af stor betydning at fastgøre sutursløjferne omkring senerne med stramme knuder.
  8. Endelig aflives dyret ved f.eks. cervikal dislokation.
  9. Når musklerne er blevet dissekeret og anbragt i inkubationskamre, skal du justere hvilespændingen for hver muskel til ~ 5 mN og præinkkubere musklerne i mindst 10 minutter, før den eksperimentelle protokol påbegyndes.

4. Insulinstimuleret glukoseoptagelse i isoleret museskeletmuskulatur

  1. Efter trin 3.9 skal du erstatte det basale inkubationsmedie med inkubationsmedier, der ikke indeholder insulin (basal inkubationsmedie), en submaksimalt effektiv insulinkoncentration eller en maksimalt effektiv insulinkoncentration og lade den stå i inkubationskamrene i 20 minutter. Rum hvert inkubationskammer med 1 minut og derved give tid til den efterfølgende høst af muskler.
  2. Ved afslutningen af stimuleringsperioden på 20 minutter skal inkubationsmediet udskiftes med glukoseoptagelsesinkubationsmediet, der indeholder en identisk koncentration af insulin, og efterlades i inkubationskamrene i 10 minutter, igen med 1 minuts afstand mellem hvert inkubationskammer.
  3. Efter 10 minutters inkubation i glukoseoptagelsesinkubationsmedierne fjernes forsigtigt musklerne fra inkubationskamrene og vaskes i iskolde basale inkubationsmedier. Derefter tørres musklerne hurtigt på filterpapir, før sutursløjferne fjernes, og musklerne fryses i flydende nitrogen. Det er bydende nødvendigt, at de inkuberede muskler høstes hurtigt, hvis man også ønsker at undersøge forskellige intracellulære metabolitter og proteinsignalering ud over glukoseoptagelsen.
  4. 100 μL af glukoseoptagelsesinkubationsmediet opsamles fra hvert inkubationskammer og opbevares ved -20 °C. Mængden af radioaktivitet i disse prøver vil indgå i beregningen af muskelglukoseoptagelsen.

5. Sammentrækningsstimuleret glukoseoptagelse i isoleret museskeletmuskel

BEMÆRK: For at fremkalde sammentrækning af isoleret museskeletmuskulatur skal du bruge følgende protokol: 1 tog / 15 s, hvert tog 1 s langt bestående af 0,2 ms impulser leveret ved 100 Hz. Imidlertid vil andre lignende protokoller, der fremkalder sammentrækning af isoleret museskeletmuskulatur, sandsynligvis også fungere. Det er vigtigt, at spændingen justeres for at generere maksimal kraftudvikling af den inkuberede muskel, som er afhængig af forsøgsopsætningen. Hvis dette ikke er sikret, kan du risikere, at ikke alle fibre i musklen trækker sig sammen. Til gengæld kan dette fremkalde bias i datasættet.

  1. Efter trin 3.9 placeres platinelektrerne centralt og på begge sider af musklerne. Start sammentrækning af musklerne umiddelbart efter udskiftning af det basale inkubationsmedie med glukoseoptagelsesinkubationsmediet. Hvis det er muligt, skal du placere hvert inkubationskammer med 1 minut og derved give tid til den efterfølgende høst af muskler. Husk at registrere kraftproduktion fra hver inkuberet muskel.
  2. Efter 10 minutters sammentrækning i glukoseoptagelsesinkubationsmediet skal du fjerne platinelektrerne, forsigtigt samle musklerne fra inkubationskamrene og vaske dem i iskolde basale inkubationsmedier. Derefter tørres musklerne hurtigt på filterpapir, før sutursløjferne fjernes og musklerne fryses i flydende nitrogen. Hele muskelhøstproceduren skal udføres så hurtigt som muligt.
  3. 100 μL af glukoseoptagelsesinkubationsmediet opsamles fra hvert inkubationskammer og opbevares ved -20 °C. Mængden af radioaktivitet i disse prøver vil indgå i beregningen af muskelglukoseoptagelsen.

6. Skeletmuskelhomogenisering og -behandling

BEMÆRK: Nedenstående procedure for muskelhomogenisering gør det muligt at bestemme både glukoseoptagelse og myocellulær signalering ved vestlig blotting i det samme sæt muskelprøver.

  1. Homogenisere hver muskel i 400 μL iskold buffer med pH 7,5 indeholdende 10% glycerol, 20 mM natriumpyrophosphat, 1% IGEPAL CA-630 (NP-40), 2 mM phenylmethylsulfonylfluorid (opløst i isopropanol), 150 mM NaCl, 50 mM HEPES, 20 mM β-glycerophosphat, 10 mM natriumfluorid (NaF), 1 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 1 mM glycoletherdiamintetraeddikesyre (EGTA), 10 μg/ml aprotinin, 10 μg/ml leupeptin, 3 mM benzamidin og 2mM natrium-orthovanadat ved hjælp af stålperler og en vævsbrænder (2 x 45 s ved 30 Hz). Alle homogenater drejes ende-over-ende i 1 time ved 4 °C, hvorefter de centrifugeres ved 16 000 x g i 20 minutter ved 4 °C. Saml lysatet (supernatant), som bruges til at bestemme muskelglukoseoptagelsen.

7. Bestemmelse af radioaktivt mærket 2-deoxyglucose og mannitol

  1. Der tilsættes 150 μL af hvert muskellysat og 25 μL glucoseoptagelsesinkubationsmediet fra hvert inkubationskammer for at adskille flydende scintillationstællingshætteglas indeholdende 2 ml flydende scintillationsvæske. Desuden skal du forberede to blinde kontrolhætteglas, der kun indeholder 3 ml flydende scintillationsvæske. Luk alle hætteglassene og bland grundigt ved at hvirvle hvert hætteglas i ~ 5 s.
  2. Anbring hætteglassene i en flydende scintillationstæller, og mål radioaktiviteten af [3H]2-deoxy-D-glucose og [14C]mannitol i henhold til producentens retningslinjer. Optag DPM (disintegrationer pr. Minut) for hvert hætteglas med flydende scintillation.

8. Beregning af muskelglukoseoptagelseshastigheder

  1. Brug lysatet fra trin 6.1 til at måle den samlede proteinkoncentration i hver muskelprøve ved hjælp af standard proteinkvantificeringsmetoder (f.eks. Bicinchoninsyre eller Bradford-assays). Beregn mængden af protein (mg) tilsat til hvert hætteglas med scintillation.
    BEMÆRK: Glukoseoptagelseshastigheden for hver muskelprøve beregnes ved at trække mængden af [3H]2-deoxy-D-glucose placeret i det ekstracellulære rum fra den samlede mængde [3H]2-deoxy-D-glucose i muskelprøven ved anvendelse af [14C]mannitol som ekstracellulær markør. Det antages, at [3H]2-deoxy-D-glucose og [14C]mannitol udviser lignende diffusionsegenskaber i muskelvævet under inkubation. Udfør følgende beregninger:
  2. Start med at trække [3H] og [14C] DPM for de blinde kontrolprøver fra alle muskel- og medieprøver.
  3. Bestem muskel ekstracellulært rum i μL (μL-ECS):
    [14C] DPMmuskel / ([14C]DPMmedier / Mvol)
  4. Beregn mængden af [3H]DPM i muskelekstracellulært rum ([3H]DPMECS):
    μL-ECS × ([3H]DPMmedier / Mvol)
  5. Beregn mængden af [3H]DPM i muskelens intracellulære rum ([3H]DPMICS):
    [3H] DPMmuskel− [3H]DPMECS
  6. Beregn muskelglukoseoptagelseshastigheden (pmol / g protein / time):
    [3H] DPMICS / ([3H]DPM-medier / Mvol) / [2-deoxy-D-glucose])) / mg protein) / Th
    BEMÆRK: For alle ligningerne ovenfor,
    [14C] DPM-muskel er mængden af [14C] mannitolradioaktivitet i en muskelprøve;
    [14C] DPM-medier er mængden af [14C]mannitolradioaktivitet i en medieprøve;
    [3H] DPM-muskel er mængden af [3H]2-deoxy-D-glucoseradioaktivitet i en muskelprøve;
    [3H] DPM-medierer mængden af [3H]2-deoxy-D-glucoseradioaktivitet i en medieprøve;
    [3H] DPMECS er mængden af [3H]2-deoxy-D-glucoseradioaktivitet i muskelekstracellulært rum;
    [3H] DPMICS er mængden af [3H]2-deoxy-D-glucoseradioaktivitet i muskelens intracellulære rum;
    μL-ECS er muskel ekstracellulært rum i μL;
    Mvol er volumenet (μL) af inkubationsmedier, der anvendes til scintillationstælling (f.eks. »25« som nævnt ovenfor)
    Th er den tidsfaktor, der anvendes til at beregne optagelseshastigheder pr. time (dvs. '1/6' ved inkubation af muskler med glukoseoptagelsesmedier i 10 minutter)
  7. Tag højde for denne eksempelberegning. [3H] og [14C] DPM for blinde kontrolprøver (henholdsvis 17 og 6) er blevet trukket fra de DPM-værdier, der er nævnt nedenfor.
    [14C] DPMmuskel: 343
    [14C] DPMmedier: 11846
    [3H] DPMmuskel: 4467
    [3H] DPMmedier: 39814
    Mvol: 25
    mg protein: 0,396 (i 150 μL muskelproteinlysat)
    [2-deoxy-D-glucose]: 1 (mM)
    Th: 1/6 (h)
    μL-ECS = 343 DPM / (11846 DPM / 25 μL) = 0,724 μL
    [3H] DPMECS: 0,724 μL × (39814 DPM / 25 μL) = 1153 DPM
    [3H] DPMICS: 4467 DPM - 1153 DPM = 3314 DPM
    Glukoseoptagelse: ((3314 DPM / (39814 DPM / 25 μL) / 1 mmol / L) / 0,396 mg protein) / (1/6 time) = 31,53 μmol / g protein / time

9. SDS-PAGE og western blot analyser

  1. Forbered soleus- og EDL-muskellysater i Laemmli-buffer og opvarm i 5 minutter ved 96 °C.
  2. Adskil lige store mængder muskelprotein ved SDS-PAGE på selvstøbte geler og overfør proteinerne til polyvinylidenfluoridmembraner ved halvdry blotting.
  3. Derefter inkuberes membraner i Tris-bufret saltvand indeholdende 0,05% Tween 20 og 2% skummetmælk og sondemembraner med relevante primære og sekundære antistoffer.
  4. Registrer proteiner med kemiluminescens og visualiser dem ved hjælp af et digitalt billeddannelsessystem.

10. Muskelglykogen, nukleotider, laktat, kreatin og phosphocreatin

  1. Brug perchlorsyre til at ekstrahere EDL og soleus muskelprøver.
  2. Derefter neutraliseres prøver og analyseres for laktat, kreatin og phosphocreatin som tidligere beskrevet18.
  3. Analysér nukleotidindholdet i EDL og soleus muskler ved omvendt fase HPLC efter ekstraktion i perchlorsyre.
  4. Muskelglykogenindholdet i hele muskelhomogenat bestemmes som glycosylenheder efter syrehydrolyse ved hjælp af en fluorometrisk metode som tidligere beskrevet18.

11. Statistikker

  1. Udfør statistiske analyser med software til statistiske analyser.
  2. Brug en tovejs variansanalyse (ANOVA) test til at vurdere statistiske forskelle mellem værdier præsenteret i tabel 1.
  3. Brug uparrede Student t-tests til at vurdere statistiske forskelle i glukoseoptagelse mellem EDL og soleus inden for hver gruppe, der er præsenteret i figur 2. Præsenter data som midler ± standardfejl i middelværdien (SEM). P < 0,05 betragtes som statistisk signifikant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som vist i figur 2 var de basale glukoseoptagelseshastigheder ens mellem isoleret soleus og EDL-muskel fra hunmus. Dette er også blevet rapporteret flere gange før 12,13,19,20. Glukoseoptagelsen steg med ~0,8 og ~0,6 gange og nåede 12 og 9 μmol/g protein/h i henholdsvis soleus- og EDL-muskel som reaktion på en submaksimalt effektiv insulinkoncentration (100 μU/ml). Denne stigning var endnu højere (~ 4 og ~ 2 gange nåede 33 og 19 μmol / g protein / h i henholdsvis soleus og EDL muskel), når musklerne blev stimuleret med en maksimalt effektiv insulinkoncentration (10 mU / ml). Desuden var både submaksimal og maksimal insulinstimuleret glukoseoptagelse signifikant højere i soleusmusklen, hvilket indikerer, at soleusmusklen udviser forbedret insulinfølsomhed og responsivitet sammenlignet med EDL-muskel. Dette kan være relateret til den højere ekspression af glukosetransportøren 4 (GLUT4) såvel som insulinsignaltransducerproteinet kinase B (Akt) i soleusmusklen sammenlignet med EDL-muskel 10,21,22,23,24.

Sammentrækningsinduceret glukoseoptagelse var signifikant højere i EDL-muskel sammenlignet med soleusmuskel (figur 2) som også tidligere rapporteret13,19. Således steg glukoseoptagelsen med ~ 2 og ~ 2,5 gange og nåede 14 og 22 μmol / g protein / h i henholdsvis soleus og EDL muskel som reaktion på elektrisk inducerede sammentrækninger. Figur 3 viser maksimal muskelkraftproduktion i soleus og EDL-muskel i løbet af 10 minutters stimuleringsperioden. Som set og tidligere rapporteret19 genererer EDL-musklen mere kraft (225 mN i EDL vs. 150 mN i soleus) i den indledende del af stimuleringsperioden. På den anden side udviser EDL-musklen et hurtigere fald i kraftproduktionen sammenlignet med soleusmusklen senere i stimuleringsperioden. Disse resultater skyldes sandsynligvis forskellen i fibertypefordeling mellem soleus (type 1 > type 2) og EDL (type 2 > type 1) muskel25 som type 2 fibre genererer mere kraft, men træthed hurtigere sammenlignet med type 1 fibre26,27.

For at evaluere effekten af insulin og sammentrækning på intracellulær signalering i isoleret soleus- og EDL-muskel blev fosforylering af Akt Thr308, TBC1-domænefamiliemedlem 4 (TBC1D4) Ser588, AMPKα Thr172 og acetyl-CoA-carboxylase (ACC) Ser212 udført ved hjælp af den vestlige blottingteknik (figur 4). Som forventet inducerede den submaksimalt og maksimalt effektive insulinkoncentration en stigning i fosforyleringen af Akt Thr308 og TBC1D4 Ser588, mens sammentrækning inducerede en stigning i fosforyleringen af AMPKα Thr172 og ACC Ser212. Hverken insulin eller sammentrækning førte til en ændring i det samlede proteinindhold i Akt2, TBC1D4, AMPKα2 og ACC i soleus og EDL-muskler (figur 4).

Ved at undersøge forskellige markører for metabolisk levedygtighed af inkuberet soleus og EDL-muskel observerede vi en samlet reduktion i niveauerne af adenosinnukleotider (ATP, ADP, AMP) (~ 15-25%) samt kreatin (~ 10-35%) uanset om musklerne blev inkuberet i nærvær af pyruvat eller glucose sammenlignet med ikke-inkuberede muskler (tabel 1 ). På den anden side blev faldet i glykogenniveauer observeret i soleus- og EDL-muskler inkuberet med pyruvat forhindret, hvis musklerne blev inkuberet med glucose. Interessant nok observerede vi dog, at inosinmonophosphatniveauerne (IMP) steg flere gange, men kun i inkuberet soleusmuskel. IMP-niveauer stiger typisk i muskler under svær metabolisk stress, da musklen forsøger at forhindre AMP-akkumulering ved at konvertere AMP til IMP for at opretholde ATP / ADP-forholdet28. Dette indikerer, at soleusmusklen er noget mere metabolisk stresset sammenlignet med EDL-musklen under inkubation. Denne opfattelse understøttes også af fund af forhøjet AMPKα Thr172 og ACC Ser212 fosforylering i soleusmusklen inkuberet med pyruvat (figur 5). Det er vigtigt, at den observerede stigning i IMP-niveauer såvel som AMPKα Thr172 og ACC Ser212 fosforylering falder, når soleusmusklen inkuberes med glucose. Derfor synes det fordelagtigt at inkubere isoleret skeletmuskulatur i en glukoseholdig buffer for at minimere udsving i adenosinnukleotider og forhindre et fald i muskelglykogen, når musklerne inkuberes i længere tid. Med hensyn til 2-deoxyglucose optagelse har vi beviser for, at inkubation af muskler i 6 til 8 timer i nærvær af pyruvat vil øge basal / hvilende glukoseoptagelseshastigheder. Inkubation af muskler i et medie, der indeholder glukose, synes at forhindre en sådan stigning i glukoseoptagelsen (upublicerede data).

Figure 1
Figur 1: Inkubationssystem. (A) Myografsystem med fire enkelte inkubationskamre. (B) Tilpassede inkubationskroge. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Glukoseoptagelse i isolerede modne skeletmuskler fra mus. 2-deoxyglucoseoptagelse blev bestemt i isolerede soleus( sorte bjælker) og EDL (grå bjælker) muskler som reaktion på en submaksimalt effektiv insulinkoncentration (100 μU/ml), en maksimalt effektiv insulinkoncentration (10 mU/ml) og elektrisk inducerede sammentrækninger (0,2 ms puls, 100 Hz, 1 s/15s, 30 V, 10 min). Data blev analyseret af Studerende t test inden for hver gruppe. ###p<0.001, ##p<0.01 vs. soleus muskel. Værdier betyder ± SEM. n = 4-6 pr. Gruppe. h, time. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Muskelkraftkurver som reaktion på elektrisk inducerede sammentrækninger. Peak force produktion under elektrisk stimulering blev beregnet for soleus (sorte prikker) og EDL (grå prikker) muskel. Hver enkelt værdi svarer til et gennemsnit af de sidste 500 ms i hver 1-s stimuleringsperiode. Værdier betyder ± SEM. n = 5-6 pr. Gruppe. s, for det andet. mN, milli-Newton. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative western blots af Akt Thr308, TBC1D4 Ser588, AMPKα Thr172 og ACC Ser212 phosphorylering samt Akt2, TBC1D4, AMPKα2 og ACC protein. Western blot-analyser blev udført på muse-soleus- og EDL-muskelprøverne beskrevet i figur 2. B, basal. S, submaksimalt effektivt insulin. M, maksimalt effektivt insulin. C, sammentrækning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Repræsentative vestlige blots af AMPKα Thr172 og ACC Ser212 fosforylering samt AMPKα2 og ACC protein. Western blot-analyser blev udført på muse-soleus- og EDL-muskelprøverne beskrevet i tabel 1. Klik her for at se en større version af denne figur.

ikke-inkuberet Inkuberet 1 time med pyruvat Inkuberet 1 time med glukose Vigtigste virkninger Vekselvirkning
Soleus EDL Soleus EDL Soleus EDL
Laktat 13.00 ± 0.01 13.00 ± 0.02 0,96 ± 0,03 0.98 ± 0.02 13.05 ± 0.01 0,99 ± 0,01 - -
Cr 13.00 ± 0.04 13.00 ± 0.06 0,64 ± 0,07 ### 0,76 ± 0,05 ### 0,76 ± 0,07 ## 0,88 ± 0,09 ## p < 0.001 -
PCr 13.00 ± 0.19 13.00 ± 0.06 0,80 ± 0,12 1.13 ± 0.14 0,65 ± 0,31 0,75 ± 0,08 - -
PCr/(Cr + PCr) 13.00 ± 0.20 13.00 ± 0.07 1.17 ± 0.11 1.25 ± 0.12 0,78 ± 0,36 0,92 ± 0,11 - -
ATP 13.00 ± 0.03 13.00 ± 0.02 0,72 ± 0,03 ###,§§§ 0,99 ± 0,03 * 0,81 ± 0,06 ### 0,85 ± 0,04 ## - p < 0.001
ADP 13.00 ± 0.04 13.00 ± 0.04 0,75 ± 0,05 ### 0,92 ± 0,03 ### 0,84 ± 0,04 ## 0.86 ± 0.03 ## p < 0.001 -
AMP 13.00 ± 0.11 13.00 ± 0.12 0,85 ± 0,15 0,79 ± 0,13 0,84 ± 0,18 0,75 ± 0,13 - -
IMP 13.00 ± 0.17 13.00 ± 0.30 4.43 ± 0,67 ###,§§§ 0,72 ± 0,29 3.33 ± 1.25 ##,§ 1.08 ± 0.01 - p < 0.001
AMP/ATP-forhold 13.00 ± 0.12 13.00 ± 0.13 1.18 ± 0.22 0,81 ± 0,16 1.06 ± 0.23 0,90 ± 0,19 - -
Glykogen 13.00 ± 0.08 13.00 ± 0.12 0,74 ± 0,07 (#),* 0,80 ± 0,12 (#),* 1.12 ± 0.10 1.10 ± 0.03 p = 0,035 -
pAMPK Thr172 / AMPKα2 13.00 ± 0.10 13.00 ± 0.12 3.26 ± 0.58 ###,***,§§§ 1.55 ± 0.27 1.68 ± 0.19 # 1.36 ± 0.19 - p = 0,002
pACC Ser212 / ACC 13.00 ± 0.18 13.00 ± 0.12 2.22 ± 0,58 ###,**,§§ 0,96 ± 0,21 0,99 ± 0,15 0,83 ± 0,09 - p = 0,030

Tabel 1: Sammenligning af metabolisk levedygtighed af muse soleus og EDL muskler inkuberet i 1 time i nærvær af 2 mM pyruvat eller 5 mM glucose. Ikke-inkuberede muskler blev dissekeret fra bedøvede og fodrede dyr, før de blev frosset i flydende nitrogen. Separate muskler blev inkuberet i 1 time i KRH-buffer suppleret med BSA (0,1%), Na-pyruvat (2 mM) og D-mannitol (8 mM), mens andre blev inkuberet i 1 time i KRH-buffer suppleret med BSA (0,1%), D-glucose (5 mM) og D-mannitol (5 mM), før de blev frosset i flydende nitrogen. Data blev konverteret til relative enheder for at fremhæve observerede ændringer i forskellige markører for metabolisk levedygtighed. Absolutte værdier fra ikke-inkuberede muse soleus og EDL muskler er angivet nedenfor. Laktat (mmol/kg w.w): 137,53soleus; 139,05EDL. Cr (mmol/kg w.w): 9,35soleus; 8.98EDL. PCr (mmol/kg w.w): 1,50soleus; 5.20EDL. PCr/(PCr+Cr): 13,98soleus; 37.30EDL. ATP (mmol/kg w.w): 3,07soleus; 4.24EDL. ADP (mmol/kg w.w): 0,60soleus; 0,51EDL. AMP (mmol/kg w.w): 0,18soleus; 0,08EDL. IMP (mmol/kg w.w): 0,07soleus; 0,14EDL. AMP/ATP-forhold: 0,06soleus; 0,02EDL. Glykogen (pmol/μg protein): 77,01soleus; 67,56EDL. Data blev analyseret af en tovejs ANOVA inden for hver gruppe. ###p<0.001, ##p<0.01 og #p<0.05 vs. ikke-inkuberet. s<0.001, **p<0.01 og *p<0.05 vs inkuberet 1 time med glucose. §§§p<0.001, §§p<0.01 og §s<0.05 vs EDL. Værdier er betyder ± SEM. n = 12 i ikke-inkuberet gruppe, n = 4-6 i inkuberede grupper. Cr, kreatin; PCr, Phosphocreatin; w.w, våd vægt; h, time.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Intakt regulering af glukoseoptagelsen i skeletmuskulaturen er vigtig for at bevare det generelle helbred1. Således tjener undersøgelse af muskelglukoseoptagelse ofte som en primær aflæsning, når man evaluerer forskellige sundhedsændrende interventioner. Her beskriver vi en ex vivo-metode til måling af glukoseoptagelse i isolerede og inkuberede soleus- og EDL-muskler fra mus som reaktion på insulin og elektrisk inducerede sammentrækninger. Metoden er hurtig og pålidelig og muliggør en præcis kontrol af det omgivende miljø i den inkuberede muskel, der muliggør nøjagtige undersøgelser af muskelglukoseoptagelseshastigheder isoleret fra den potentielt forvirrende indflydelse af hormoner og substrater, der kan findes i blodet. Metoden er blevet brugt i flere år i mange undersøgelser og er bredt vedtaget af muskelforskningsmiljøet.

Ex vivo-inkubationsmodellen er generelt blevet betragtet som en metode til at vurdere glukosetransportkapacitet snarere end glukoseoptagelse i skeletmuskulaturen. Glukosetransportkapacitet i inkuberet muskel kan bestemmes ved at måle akkumuleret D-glucose over en periode. Dette udgør imidlertid et problem, da D-glukose hurtigt metaboliseres i muskelcellen efter optagelse. For at omgå dette problem er glukoseanalogen 3-O-methyl-D-glucose (3-MG) i vid udstrækning blevet brugt til at vurdere glukosetransportkapaciteten, da 3-MG ikke metaboliseres yderligere inde i cellen efter at være blevet transporteret over celleoverflademembranen. Således tjener den indledende hastighed af intracellulær akkumuleret 3-MG som et indeks for cellulær glukosetransportkapacitet i sig selv, fordi den ikke påvirkes af andre trin i glukosemetaboliske veje. Brugen af 3-MG kan dog udgøre et problem, da 3-MG akkumuleres og derved reducerer transmembrangradienten for 3-MG og efterfølgende reducerer yderligere optagelse. For at opnå et mål for membranens transportkapacitet skal den oprindelige hastighed på 3 MG-optagelse således estimeres. Især når transportkapaciteten er høj, kan dette udgøre et problem på grund af udstrømning af 3-MG fra musklen29,30. Det potentielle problem med 3-MG efflux kan undgås ved anvendelse af 2-deoxy-D-glucose (2-DG). Efter transport ind i skeletmuskulaturen fosforyleres 2-GD ved hexokinase II til 2-deoxy-D-glucose-6-phosphat (2-DG-6P). Da skeletmuskulaturen mangler glukose-6-phophatase, og GLUT4 ikke kan transportere fosforyleret 2-DG, vil 2-DG-6P blive fanget i muskelcellen. I modsætning til glucose-6-phosphat er 2-DG-6P en meget svag allosterisk hæmmer af hexokinase II30, som hjælper med at opretholde transmembrangradienten for 2-DG. Observationer har således vist, at 2-GD-optagelse i inkuberet (rotte) muskel forbliver lineær, indtil den intracellulære 2-DG-6P-koncentration overstiger 30 mM, en koncentration, der sænker hexokinase II-aktivitet30. Desuden forbliver 2-DG-optagelsen i inkuberet museskeletmuskel lineær i ~ 30 minutter, når temperaturen på inkubationsbufferne er 37 ° C eller mindre31. Dette tyder på, at 2-GD kan anvendes til at måle glukosetransportkapaciteten i stedet for glukoseoptagelsen i inkuberede muskler, bortset fra situationer, hvor koncentrationerne af 2-DG-6P bliver meget høje (f.eks. observeret under inkubationer >2 timer med 1 mM 2-DG og en maksimal insulinkoncentration29,30). Ideen om, at 2-GD-optagelse sandsynligvis afspejler glukosetransportkapacitet, understøttes også af resultater, der viser, at maksimal insulinstimuleret 2-GD-optagelse er ens i inkuberede muskler fra vildtypemus og mus, der overudtrykker hexokinase II32. En potentiel bekymring ved anvendelse af 2-DG til muskelglukosetransportmålinger under sammentrækning er en stigning i den intracellulære glucose-6-phosphatkoncentration på grund af en forhøjet glykogenolysehastighed. Da der imidlertid observeres en lineær stigning i (rotte)muskel 2-GD-optagelse under sammentrækning over tid29, indikerer dette, at akkumuleringen af glucose-6-phosphat fra nedbrydning af glykogen under sammentrækning ikke forstyrrer hexokinase II-aktiviteten og dermed 2-GD-optagelseshastighederne. Baseret på dette synes 2-DG velegnet til målinger af glukosetransport i isoleret skeletmuskulatur under insulin og sammentrækning i betragtning af begrænsningerne ved 3-MG.

Selvom det generelt antages, at 2-DG ikke metaboliseres yderligere efter fosforylering ved hexokinase II, er det blevet rapporteret, at nogle 2-GD er rettet mod og inkorporeret i muskelglykogen. Under en 2 timers normoglykæmisk hyperinsulinæmisk klemme hos rotter inkorporeres ~ 30% af 2-DG optaget af skeletmuskulatur i glykogen33. Derfor kan det begrundes, at antallet af insulinstimuleret 2-GD-optagelse i inkuberet skeletmuskulatur undervurderes, hvis akkumulering af 2-GD i glykogen forsømmes. Vi har fastslået, at den heri beskrevne protokol om, hvordan man forbereder muskellysater (supernatant) til efterfølgende analyser af 2-GD optagelseshastigheder i tidligere inkuberet skeletmuskulatur, ikke påvirkes af den potentielle inkorporering af 2-GD i glykogen. Det kan hævdes, at glykogen akkumuleres i pelleten, når man centrfugerer hele muskelhomogenat for at generere lysat til 2-DG-optagelsesmålinger. Når vi sammenligner niveauerne af radioaktivitet i insulinstimuleret helmuskelhomogenat vs. lysat, opdager vi imidlertid ingen signifikant forskel (upublicerede data). Dette tyder på, at inkubation af musemuskler i 10 minutter i 1 mM af 2-DG ikke forårsager en påviselig ophobning af 2-DG i glykogen.

Bestemmelse af skeletmuskulaturens 2-GD-optagelse uden at tage hensyn til, at 2-GD er fordelt i både det ekstra- og intracellulære rum, vil føre til en overvurdering af 2-GD-optagelsen. For at omgå dette bør L-glucose anvendes som en ekstracellulær markør, da dette ikke transporteres over cellemembranen, men ellers udviser lignende egenskaber som D-glucose, herunder masse, opløselighed, passiv diffusion, binding osv. På grund af de for store omkostninger ved fremstilling og dermed køb af L-glucose anvendes mannitol typisk som en ekstracellulær markør, da mannitol ikke optager muskelcellen, er relativt billig og anslås at have et noget lignende ekstracellulært fordelingsvolumen som glucose og 2-DG34.

Iboende cellulære og molekylære ure synes at spille en væsentlig rolle for reguleringen af helkropsmetabolisme og energihomeostase35. Det er blevet observeret, at muskelspecifik knockout af kerneuret Bmal1 svækker insulinstimuleret glukoseoptagelse i isoleret museskeletmuskel36. Desuden udviser submaksimal insulinstimuleret glukoseoptagelse af isoleret skeletmuskel døgnrytme med det laveste og højeste insulinrespons midt i henholdsvis den lyse og mørke fase37. På baggrund af disse resultater er det derfor vigtigt at indarbejde tidspunktet for ofring af dyr i forsøgsdesignet for at øge reproducerbarheden af data.

En stor ulempe ved ex vivo-metoden er manglen på kapillærstrøm i den isolerede muskel. Det betyder, at levering og fjernelse af forskellige substrater helt afhænger af simpel diffusion mellem muskelfibrene og det omgivende miljø. Derfor har validering af den metaboliske levedygtighed af isoleret muskelinkuberet ex vivo været fokuseret på diffusionsbegrænsninger af ilt til overfladiske såvel som dybe muskelfibre. Således har inkuberet muskel, især højmetabolisk musemuskel, tendens til at udvikle hypoxiske kerner, hvor nedbrydning af glykogen forekommer 16,17,38. I en detaljeret gennemgang af Bonen og kolleger15 blev det foreslået, at hypoxiske kerner af inkuberet muskel sandsynligvis udvikler sig, når man inkuberer muskler, der er for tykke til at blive korrekt iltet, især ved inkubation ved temperaturer på ≥ 37 ° C. Dette førte til anbefalingen om, at kun tynde og cylindriske musemuskler, såsom soleus og EDL, bør anvendes til inkubationer ved 25-30 °C for at undgå udvikling af hypoxiske kerner. Dette indikerer, at tykkelse og geometri snarere end masse er vigtige faktorer, der skal overvejes, når man inkuberer museskeletmuskler. Derudover blev det anbefalet, at inkubationstemperatur, muskeltykkelse samt ATP-, phosphocreatin- og glykogenindhold og/eller frigivelse af laktat måles og rapporteres rutinemæssigt for at evaluere levedygtigheden af den inkuberede muskel15. Så vidt vi ved, er sådanne komplette analyser af inkuberet muskel hovedsageligt rapporteret for rottemuskel 39,40,41,42 og kun i begrænset omfang rapporteret for musemuskel16,17. For at øge indsigten i forskellige metaboliske markører for levedygtighed i inkuberede museskeletmuskler vurderede vi mulige ændringer i intracellulært indhold af laktat, kreatin, phosphocreatin, adenosinnukleotider, glykogen og AMPK-signalering i soleus- og EDL-muskel efter 1 times inkubation i glucose- eller pyruvatssammenstillet KRH-buffer. I lighed med tidligere fund i inkuberet muse soleus og EDL muskel17 observerede vi, at glykogenniveauerne faldt, når musklerne blev inkuberet i glukosefrie medier. Dette indikerer, at fraværet af glucose under inkubation fremmer glykogennedbrydning og den efterfølgende indtræden af glucose-6-phosphat i glykolyse, der kan virke for at sikre ATP-produktion, især hvis iltforsyningen er utilstrækkelig. Desuden fandt vi en samlet reduktion i ATP- og ADP-nukleotidpuljerne i inkuberet soleus- og EDL-muskel. Dette kan betyde, at iltforsyningen ikke er helt tilstrækkelig til at imødekomme efterspørgslen efter inkuberet musemuskel både i nærvær og fravær af glukose. Da den oxidative soleusmuskel er mere afhængig af ilt til ATP-produktion sammenlignet med den glykolytiske EDL-muskel, tyder det på, at soleusmusklen i højere grad påvirkes af inkubationsproceduren. I enighed fandt vi, at de intracellulære niveauer af IMP såvel som AMPK-signalering blev markant øget i soleus sammenlignet med EDL-muskler, når de blev inkuberet i fravær af glukose. Dette betyder, at soleusmusklen udviser en højere grad af metabolisk stress under inkubation, hvilket skal tages i betragtning ved evaluering af data fra ex vivo musemuskelmodellen.

Dyrkede muskelceller, herunder udødeliggjort L6 og C2C12 samt primære humane myotubes, anvendes almindeligvis som surrogat for moden skeletmuskel til at studere virkningerne af forskellige genetiske og farmakologiske manipulationer på insulinstimuleret muskelglukoseoptagelse. På flere måder ligner dyrkede muskelceller imidlertid ikke moden skeletmuskulatur, og når man sammenligner de to modelsystemer, bliver mange forskelle tydelige. Disse omfatter forskelle i proteinekspression, dimensionel struktur, omgivende miljø, proliferation og differentieringstilstand, fibertypesammensætning, metaboliske processer og funktionelle egenskaber43 som alle kan påvirke, hvordan muskelcellen regulerer glukoseoptagelsen som reaktion på forskellige stimuli. Typisk observeres større relative virkninger af insulin på glukoseoptagelseshastigheden i modne skeletmuskler sammenlignet med dyrkede muskelceller44, hvilket kan indikere, at dyrkede muskelceller til en vis grad mangler det maskineri, der er ansvarligt for at regulere glukoseoptagelseshastigheden, herunder et højt ekspressionsniveau for den insulinfølsomme glukosetransportør GLUT443 . I betragtning af de begrænsninger og forbehold, der er forbundet med brugen af enten dyrkede muskelceller og isoleret skeletmuskulatur, er det derfor sandsynligvis fordelagtigt at tage en kombineret tilgang, når man studerer forskellige muskelmetaboliske processer såsom glukoseoptagelse.

Soleus- og EDL-muskler betragtes typisk som repræsentative for henholdsvis langsomme og hurtige trækmuskler. Derfor er disse muskeltyper ideelle til mekaniske undersøgelser, der søger at undersøge interventioner, der påvirker muskelkraft og træthedsudvikling. Desuden rapporteres soleusmusklen typisk at have forbedret insulinfølsomhed og lydhørhed sammenlignet med EDL-muskel, og derfor kan interventioner, der er målrettet mod muskelinsulinfølsomhed, påvirke soleus og EDL forskelligt. Derudover varierer den relative fordeling af de forskellige AMPK-komplekser mellem soleus- og EDL-musklen, hvilket synes at påvirke AMPK-aktiverende forbindelsers evne til at øge muskelglukoseoptagelsen. Således opnås den største indsigt i reguleringen af muskelglukoseoptagelsen sandsynligvis, hvis både soleus- og EDL-musklerne anvendes under forsøg med ex vivo-inkubationsmodellen.

Den heri beskrevne metode relaterer glukoseoptagelse til mængden af total proteinoverflod bestemt i hver muskelprøve efter homogenisering. Det er vores erfaring, at variationen falder, når man relaterer glukoseoptagelsen pr. mængde muskelprotein i stedet for muskelvægt (upublicerede data). Desuden gør homogenisering af muskelprøver i en buffer, der anvendes til forskellige biokemiske assays, det muligt at bestemme både glukoseoptagelse, myocellulær signalering og enzymaktiviteter i samme prøvepræparat45,46. Dette vil ofte reducere mængden af mus, der bruges til en undersøgelse. Ikke desto mindre kan glukoseoptagelse let bestemmes i skeletmuskelprøver, der opløses ved opvarmning i natriumhydroxid (NaOH) efterfulgt af neutralisering med hydrogenchlorid20. Da behandling af muskler med NaOH forstyrrer målinger af den samlede muskelproteinkoncentration, skal glukosetransport målt ved denne procedure være relateret til muskelvægt.

Baseret på forskellige optimeringer indeholder vores glukoseoptagelsesinkubationsbuffer en specifik aktivitet på 0,028 MBq/ml [3H]2-deoxy-D-glucose og 0,0083 MBq/ml [14C]Mannitol. På den ene side sænker dette mængden af lysat (150 ud af 400 μL), der er nødvendig for at få tilstrækkelige og pålidelige radioaktivitetsmålinger. På den anden side øger det mængden af radioaktiv [3H] 2-deoxy-D-glucose og [14C] mannitol, der er nødvendig for hvert eksperiment, hvilket øger forsøgsomkostningerne. For enhver forsøgsopstilling er det således muligt at regulere mængden af radioaktivitet, der anvendes i glukoseoptagelsesinkubationsmediet, så det passer til specifikke krav. Man skal dog være opmærksom på ikke at mindske mængden af radioaktivitet i inkubationsbufferen i et omfang, der gør radioaktivitetsmålinger upålidelige. Dette sikres ved at holde radioaktiviteten i prøverne højere end de specificerede detektionsgrænser for det anvendte maskineri til optælling af flydende scintillation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre

Acknowledgments

Dette arbejde er støttet af bevillinger fra Det Frie Forskningsråd - Medicinsk Videnskab (FSS8020-00288B) og Novo Nordisk Fonden (NNF160C0023046). Dette arbejde blev også støttet af en forskningsbevilling til Rasmus Kjøbsted fra Danish Diabetes Academy, som er finansieret af Novo Nordisk Fonden, bevillingsnummer NNF17SA0031406. Forfatterne vil gerne takke Karina Olsen, Betina Bolmgren og Irene Bech Nielsen (Institut for Idræt og Ernæring, Det Natur- og Biovidenskabelige Fakultet, Københavns Universitet) for deres dygtige tekniske bistand.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[14C]D-mannitol American Radiolabeled Chemicals, Inc. ARC 0127
[3H]2-deoxy-D-glucose  American Radiolabeled Chemicals, Inc. ART 0103A
2-Deoxy-D-glucose Sigma D8375
4-0 USP non-sterile surgical nylon suture Harvard Apparatus 51-7698
Streptavidin/HRP (Conjugate) DAKO P0397 Used to detect ACC protein
Akt2 antibody Cell Signaling 3063
AMPKα2 antibody Santa Cruz SC-19131
aprotinin Sigma A1153
benzamidine Sigma B6505
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7030
CaCl2 Merck 1020831000
Calibration kit (force) Danish Myo Technology A/S 300041
Chemiluminescence Millipore WBLUF0500
D-Glucose Merck 1084180100
D-Mannitol Sigma M4125
Data collection program National Instruments LabVIEW software version 7.1
Dialysis tubing Visking DTV.12000.09 Size No.9
Digital imaging system BioRad ChemiDoc MP
EDTA Sigma EDS E9884
EGTA Sigma E4378
Electrical Pulse Stimulator Digitimer D330 MultiStim System
Glycerol Sigma G7757
HEPES Sigma H7637
IGEPAL CA-630  Sigma I8896
Insulin Novo Nordisk Actrapid, 100 IE/mL
KCl Merck 1049361000
KH2PO4 Merck 104873025
leupeptin Sigma L2884
MgSO4 Merck 1058860500
Muscle Strip Myograph System Danish Myo Technology A/S Model 820MS
Na-Orthovanadate Sigma S6508
Na-Pyrophosphate Sigma 221368
Na-Pyruvate Sigma P2256
NaCl Merck 106041000
NaF Sigma S1504
NaHCO3 VWR 27778260
pACC Ser212 antibody Cell Signaling 3661
pAkt Thr308 antibody Cell Signaling 9275
pAMPK Thr172 antibody Cell Signaling 2531
phenylmethylsulfonylfluoride Sigma P7626
Platinum electrodes Danish Myo Technology A/S 300145
pTBC1D4 Ser588 antibody Cell Signaling 8730
Scintillation counter Perkin Elmer Tri-Carb-2910TR
Scintillation fluid  Perkin Elmer 6013329
Statistical analyses software Systat SigmaPlot version 14
TBC1D4 antibody Abcam ab189890
TissueLyser II  Qiagen 85300
Ultrapure water Merck Milli-Q Reference A+ System
β-glycerophosphate Sigma G9422

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeFronzo, R., Tripathy, D. Skeletal muscle insulin resistance is the primary defect in type 2 diabetes. Diabetes Care. 32, suppl_2 157-163 (2009).
  2. Coyle, E. F., et al. Carbohydrate feeding during prolonged strenuous exercise can delay fatigue. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 55 (1), Pt 1 230-235 (1983).
  3. Kim, J. K. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp to assess insulin sensitivity in vivo. Methods in Molecular Biology. 560, 221-238 (2009).
  4. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
  5. Richter, E. A., Hargreaves, M. Exercise, GLUT4, and skeletal muscle glucose uptake. Physiological Reviews. 93 (3), 993-1017 (2013).
  6. Sanders, C. A., Levinson, G. E., Abelmann, W. H., Freinkel, N. Effect of exercise on the peripheral utilization of glucose in man. The New England Journal of Medicine. 271, 220-225 (1964).
  7. Barrington, S. F., Maisey, M. N. Skeletal muscle uptake of fluorine-18-FDG: effect of oral diazepam. Journal of Nuclear Medicine Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 37 (7), 1127-1129 (1996).
  8. Fentz, J., et al. AMPKα is critical for enhancing skeletal muscle fatty acid utilization during in vivo exercise in mice. FASEB Journal. 29 (5), 1725-1738 (2015).
  9. Maarbjerg, S. J., et al. Genetic impairment of AMPKalpha2 signaling does not reduce muscle glucose uptake during treadmill exercise in mice. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 297 (4), 924-934 (2009).
  10. Stöckli, J., et al. The RabGAP TBC1D1 plays a central role in exercise-regulated glucose metabolism in skeletal muscle. Diabetes. 64 (6), 1914-1922 (2015).
  11. Jørgensen, S. B., et al. Knockout of the alpha2 but not alpha1 5'-AMP-activated protein kinase isoform abolishes 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-beta-4-ribofuranosidebut not contraction-induced glucose uptake in skeletal muscle. The Journal of Biological Chemistry. 279 (2), (2004).
  12. Kjøbsted, R., et al. Prior AICAR stimulation increases insulin sensitivity in mouse skeletal muscle in an AMPK-dependent manner. Diabetes. 64 (6), 2042-2055 (2015).
  13. Lantier, L., et al. AMPK controls exercise endurance, mitochondrial oxidative capacity, and skeletal muscle integrity. FASEB Journal. 28 (7), 3211-3224 (2014).
  14. Cokorinos, E. C., et al. Activation of skeletal muscle AMPK promotes glucose disposal and glucose lowering in non-human primates and mice. Cell Metabolism. 25 (5), 1147-1159 (2017).
  15. Bonen, A., Clark, M. G., Henriksen, E. J. Experimental approaches in muscle metabolism: hindlimb perfusion and isolated muscle incubations. The American Journal of Physiology. 266, 1-16 (1994).
  16. van Breda, E., Keizer, H. A., Glatz, J. F., Geurten, P. Use of the intact mouse skeletal-muscle preparation for metabolic studies. Evaluation of the model. The Biochemical Journal. 267 (1), 257-260 (1990).
  17. Sogaard, P., et al. Effects of fibre type and diffusion distance on mouse skeletal muscle glycogen content in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 107 (6), 1189-1197 (2009).
  18. Lowry, O. H., Passonneau, J. V. Typical fluorometric procedures for metabolite assays. A Flexible System of Enzymatic Analysis. , 68-92 (1972).
  19. Jensen, T. E., et al. Contraction-stimulated glucose transport in muscle is controlled by AMPK and mechanical stress but not sarcoplasmatic reticulum Ca(2+) release. Molecular Metabolism. 3 (7), 742-753 (2014).
  20. Kristensen, J. M., Treebak, J. T., Schjerling, P., Goodyear, L., Wojtaszewski, J. F. P. Two weeks of metformin treatment induces AMPK-dependent enhancement of insulin-stimulated glucose uptake in mouse soleus muscle. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 306 (10), 1099-1109 (2014).
  21. Szekeres, F., et al. The Rab-GTPase-activating protein TBC1D1 regulates skeletal muscle glucose metabolism. AJP: Endocrinology and Metabolism. 303 (4), 524-533 (2012).
  22. Pehmøller, C., et al. Genetic disruption of AMPK signaling abolishes both contraction- and insulin-stimulated TBC1D1 phosphorylation and 14-3-3 binding in mouse skeletal muscle. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297 (3), 665-675 (2009).
  23. Ryder, J. W., Bassel-Duby, R., Olson, E. N., Zierath, J. R. Skeletal muscle reprogramming by activation of calcineurin improves insulin action on metabolic pathways. The Journal of Biological Chemistry. 278 (45), 44298-44304 (2003).
  24. Long, Y. C., Glund, S., Garcia-Roves, P. M., Zierath, J. R. Calcineurin regulates skeletal muscle metabolism via coordinated changes in gene expression. The Journal of Biological Chemistry. 282 (3), 1607-1614 (2007).
  25. Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PloS One. 7 (4), 35273 (2012).
  26. Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. Measurement of maximum isometric force generated by permeabilized skeletal muscle fibers. Journal of Visualized Experiments. (100), e52695 (2015).
  27. Park, K. H., et al. Ex vivo assessment of contractility, fatigability and alternans in isolated skeletal muscles. Journal of Visualized Experiments. (69), e4198 (2012).
  28. Tullson, P. C., Terjung, R. L. Adenine nucleotide metabolism in contracting skeletal muscle. Exercise and Sport Sciences Reviews. 19, 507-537 (1991).
  29. Wojtaszewski, J. F., Jakobsen, A. B., Ploug, T., Richter, E. A. Perfused rat hindlimb is suitable for skeletal muscle glucose transport measurements. The American Journal of Physiology. 274 (1), Pt 1 184-191 (1998).
  30. Hansen, P. A., Gulve, E. A., Holloszy, J. O. Suitability of 2-deoxyglucose for in vitro measurement of glucose transport activity in skeletal muscle. Journal of AppliedPhysiology. 76 (2), 979-985 (1994).
  31. Watson-Wright, W. M., Tan, M. H., Bonen, A. Insulin binding and 2-deoxy-D-glucose uptake in fast- and slow-twitch mouse skeletal muscle at 18 and 37 degrees C. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 62 (12), 1460-1465 (1984).
  32. Hansen, P. A., Marshall, B. A., Chen, M., Holloszy, J. O., Mueckler, M. Transgenic overexpression of hexokinase II in skeletal muscle does not increase glucose disposal in wild-type or Glut1-overexpressing mice. The Journal of Biological Chemistry. 275 (29), (2000).
  33. Virkamäki, A., Rissanen, E., Hämäläinen, S., Utriainen, T., Yki-Järvinen, H. Incorporation of [3-3H]glucose and 2-[1-14C]deoxyglucose into glycogen in heart and skeletal muscle in vivo: implications for the quantitation of tissue glucose uptake. Diabetes. 46 (7), 1106-1110 (1997).
  34. Bhave, G., Neilson, E. G. Body fluid dynamics: back to the future. Journal of the American Society of Nephrology JASN. 22 (12), 2166-2181 (2011).
  35. Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. Metabolism and the circadian clock converge. Physiological Reviews. 93 (1), 107-135 (2013).
  36. Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Molecular Metabolism. 3 (1), 29-41 (2014).
  37. Basse, A. L., et al. Skeletal muscle insulin sensitivity show circadian rhythmicity which is independent of exercise training status. Frontiers in Physiology. 9, 1198 (2018).
  38. Segal, S. S., Faulkner, J. A. Temperature-dependent physiological stability of rat skeletal muscle in vitro. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 248 (3), 265-270 (1985).
  39. Wallberg-Henriksson, H. Glucose transport into skeletal muscle. Influence of contractile activity, insulin, catecholamines and diabetes mellitus. Acta Physiologica Scandinavica. Supplementum. 564, 1-80 (1987).
  40. Alkhateeb, H., Chabowski, A., Bonen, A. Viability of the isolated soleus muscle during long-term incubation. Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. 31 (4), 467-476 (2006).
  41. Cleland, P. J., Rattigan, S., Clark, M. G. Glucose-induced loss of exercise-mediated 3-0-methyl glucose uptake by isolated rat soleus and epitrochlearis muscles. Hormone and Metabolic Research. 22 (2), 121-122 (1990).
  42. Gulve, E. A., Cartee, G. D., Holloszy, J. O. Prolonged incubation of skeletal muscle in vitro: prevention of increases in glucose transport. The American Journal of Physiology. 261 (1), Pt 1 154-160 (1991).
  43. Deshmukh, A. S., et al. Deep proteomics of mouse skeletal muscle enables quantitation of protein isoforms, metabolic pathways, and transcription factors. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 841-853 (2015).
  44. Rudich, A., Klip, A. Push/pull mechanisms of GLUT4 traffic in muscle cells. Acta physiologica Scandinavica. 178 (4), 297-308 (2003).
  45. Kjøbsted, R., et al. Enhanced muscle insulin sensitivity after contraction/exercise is mediated by AMPK. Diabetes. 66 (3), 598-612 (2017).
  46. Kjøbsted, R., et al. TBC1D4 is necessary for enhancing muscle insulin sensitivity in response to AICAR and contraction. Diabetes. 68 (9), 1756-1766 (2019).

Tags

Biologi udgave 171 skeletmuskulatur glukosetransport glukoseoptagelse insulinfølsomhed sammentrækning eksplantation ex vivo in vitro inkubation radioaktive glukosesporstoffer 2-deoxy-D-glucose
Måling af insulin- og sammentrækningsstimuleret glukoseoptagelse i isoleret og inkuberet moden skeletmuskulatur fra mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kjøbsted, R., Kido, K., Larsen, … More

Kjøbsted, R., Kido, K., Larsen, J. K., Jørgensen, N. O., Birk, J. B., Hellsten, Y., Wojtaszewski, J. F. P. Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice. J. Vis. Exp. (171), e61398, doi:10.3791/61398 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter