Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Meting van insuline- en contractie-gestimuleerde glucoseopname in geïsoleerde en geïncubeerde volwassen skeletspieren van muizen

Published: May 16, 2021 doi: 10.3791/61398
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Section of Molecular Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports, University of Copenhagen, 2Section of Integrative Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports, University of Copenhagen

Summary

Intacte regulatie van spierglucoseopname is belangrijk voor het behoud van glucosehomeostase van het hele lichaam. Dit protocol presenteert een beoordeling van insuline- en contractie-gestimuleerde glucoseopname in geïsoleerde en geïncubeerde volwassen skeletspieren bij het afbakenen van de impact van verschillende fysiologische interventies op het glucosemetabolisme van het hele lichaam.

Abstract

Skeletspieren zijn een insuline-responsief weefsel en nemen meestal het grootste deel van de glucose op die na een maaltijd in het bloed komt. Bovendien is gemeld dat skeletspieren de extractie van glucose uit het bloed tijdens inspanning tot 50-voudig kunnen verhogen in vergelijking met rustomstandigheden. De toename van de opname van spierglucose tijdens inspanning en insulinestimulatie is afhankelijk van de translocatie van glucosetransporter 4 (GLUT4) van intracellulaire compartimenten naar het spierceloppervlakmembraan, evenals fosforylering van glucose naar glucose-6-fosfaat door hexokinase II. Isolatie en incubatie van muisspieren zoals m. soleus en m. extensor digitorum longus (EDL) is een geschikt ex vivo model om de effecten van insuline en elektrisch geïnduceerde contractie (een model voor lichaamsbeweging) op glucoseopname in volwassen skeletspieren te bestuderen. Het ex vivo-model maakt dus evaluatie van de gevoeligheid van spierinsuline mogelijk en maakt het mogelijk om de spierkrachtproductie tijdens contractie te matchen, wat zorgt voor een uniforme rekrutering van spiervezels tijdens metingen van spierglucoseopname. Bovendien is het beschreven model geschikt voor farmacologische samengestelde testen die van invloed kunnen zijn op de insulinegevoeligheid van de spieren of van hulp kunnen zijn bij het afbakenen van de regulerende complexiteit van de glucoseopname van de skeletspier.

Hier beschrijven en bieden we een gedetailleerd protocol over het meten van insuline- en contractie-gestimuleerde glucoseopname in geïsoleerde en geïncubeerde soleus- en EDL-spierpreparaten van muizen met behulp van radioactief gelabelde [3H] 2-deoxy-D-glucose en [14C] mannitol als een extracellulaire marker. Dit maakt een nauwkeurige beoordeling van de glucoseopname in volwassen skeletspieren mogelijk in afwezigheid van verstorende factoren die het intacte diermodel kunnen verstoren. Bovendien geven we informatie over de metabole levensvatbaarheid van geïncubeerde muizenskeletspieren, wat suggereert dat de toegepaste methode onder bepaalde omstandigheden enkele kanttekeningen bevat bij het bestuderen van het spierenergiemetabolisme.

Introduction

Skeletspieren bezitten het vermogen om grote hoeveelheden glucose uit de extracellulaire ruimte te extraheren als reactie op insuline en lichaamsbeweging. Dit helpt om de glucosehomeostase van het hele lichaam te behouden en stelt de glucosetoevoer veilig in tijden van hoge energievraag. Aangezien intacte regulatie van de glucoseopname van de skeletspier belangrijk is gebleken voor de algehele gezondheid en fysieke prestaties 1,2, hebben metingen van spierglucoseopname tijdens verschillende aandoeningen veel aandacht gekregen. Bij mens en dier is de hyperinsulinemisch-euglycemische klem gebruikt als de gouden standaardtechniek om de insulinegevoeligheid in vivo te beoordelen 3,4. In tegenstelling tot bevindingen verkregen uit een orale glucosetolerantietest, vereist de hyperinsulinemisch-euglycemische klemtechniek geen intacte gastro-intestinale functie of insulinesecretie uit de pancreas en maakt het dus mogelijk insulineresponsen te vergelijken tussen proefpersonen die variaties vertonen in gastro-intestinale en / of pancreasfunctie. Metingen van spierglucoseopname in vivo tijdens inspanning bij mensen zijn vaak uitgevoerd sinds de jaren 19605. Eerst door het gebruik van arterioveneuze balanstechnieken6 en later door het gebruik van positronemissietomografie (PET) beeldvorming in combinatie met een positron emitterende glucose analoog bijv. 18F-Fluoro-deoxy-glucose7. Bij knaagdieren wordt de door inspanning gestimuleerde spierglucoseopname in vivo meestal uitgevoerd door het gebruik van radioactieve of stabiele isotoop-gelabelde glucoseanalogen 8,9,10.

Een aanvullende methode voor het meten van spierglucoseopname in vivo, is het isoleren en incuberen van kleine spieren van knaagdieren en vervolgens de glucoseopname te meten met behulp van radioactieve of stabiele isotoop-gelabelde glucoseanalogen 11,12,13. Deze methode maakt een nauwkeurige en betrouwbare kwantificering van glucoseopnamesnelheden in volwassen skeletspieren mogelijk en kan worden uitgevoerd in de aanwezigheid van verschillende insulineconcentraties en tijdens contractie opgewekt door elektrische stimulatie. Wat nog belangrijker is, metingen van glucoseopname in geïsoleerde en geïncubeerde skeletspieren zijn van belang bij het onderzoeken van het spierstofwisselingsfenotype van muizen die verschillende interventies hebben ondergaan (bijv. Voeding, fysieke activiteit, infectie, therapeutica). Het geïsoleerde skeletspiermodel is ook een geschikt hulpmiddel voor farmacologische samengestelde tests die de glucoseopname op zich kunnen beïnvloeden en/of de insulinegevoeligheid kunnen wijzigen12,14. Op deze manier kan de werkzaamheid van verbindingen die zijn ontworpen om het spierglucosemetabolisme te reguleren, worden getest en geëvalueerd in een zeer gecontroleerde omgeving voordat vervolgens in vivo wordt getest in preklinische diermodellen.

Onder sommige omstandigheden kan metabole levensvatbaarheid een uitdaging vormen in het geïsoleerde en geïncubeerde skeletspiermodelsysteem. Het ontbreken van een bloedsomloop in de geïncubeerde spieren brengt immers met zich mee dat de afgifte van substraten (bijv. zuurstof en voedingsstoffen) volledig afhankelijk is van eenvoudige diffusie tussen de spiervezels en de omgeving. In dit verband is het van belang dat de geïncubeerde spieren klein en dun zijn en dus minder een barrière vormen voor zuurstofdiffusie tijdens incubatie15. Vooral tijdens langdurige incubaties gedurende enkele uren kunnen hypoxische toestanden zich ontwikkelen als gevolg van onvoldoende zuurstoftoevoer, wat resulteert in uitputting van spierenergie15. Hoewel verschillende markers van metabole levensvatbaarheid in geïncubeerde rattenspier eerder zijn gemeld naast de identificatie van belangrijke variabelen die helpen om de levensvatbaarheid van de rattenspier te behouden15, is een uitgebreide evaluatie van de metabole levensvatbaarheid in kleine geïncubeerde muisspieren nog steeds gerechtvaardigd. Daarom is het glycogeengehalte momenteel voornamelijk gebruikt als een marker van metabole levensvatbaarheid in geïncubeerde muizenskeletspieren16,17.

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol om basale, insuline- en contractie-gestimuleerde glucoseopname te meten in geïsoleerde en geïncubeerde soleus- en EDL-spieren van muizen met behulp van radioactief gelabelde [3H] 2-deoxy-D-glucose en [14C] mannitol als extracellulaire marker. In de huidige studie werd de glucoseopname gemeten gedurende een periode van 10 minuten en de methode wordt gepresenteerd met behulp van submaximaal en maximaal effectieve insulineconcentraties en een enkel contractieprotocol. De hierin beschreven protocollen kunnen echter gemakkelijk worden gewijzigd met betrekking tot incubatietijd, insulinedosering en elektrisch stimulatieprotocol. Verder bieden we een grondige karakterisering van verschillende markers van metabole levensvatbaarheid in geïncubeerde soleus- en EDL-muizenspier. De resultaten geven aan dat glucosesuppletie aan de incubatiebuffer essentieel is om de metabole levensvatbaarheid van de geïncubeerde spieren gedurende 1 uur te behouden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Procedures waarbij proefdieren betrokken zijn, moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en lokale wetgeving. Alle dierproeven die voor deze studie werden gebruikt, voldeden aan het Europees Verdrag inzake de bescherming van gewervelde dieren die worden gebruikt voor experimentele en andere wetenschappelijke doeleinden en werden goedgekeurd door de Deense inspectie voor dierproeven.

1. Voorbereiding van het experimentele apparaat en de hechtlussen

OPMERKING: Gebruik voor deze studie een geïntegreerd spierstripmyograafsysteem met aangepaste incubatiehaken om geïsoleerde skeletspieren van muizen te incuberen (figuur 1). Dit systeem laat spieren baden in een fysiologische oplossing met continue oxygenatie (95% O2 en 5% CO2) en bij constante temperatuur. Het spierweefselbad is gekoppeld aan een krachtopnemer voor het meten van spierkrachtproductie tijdens contractie. Om myo-mechanische reacties tijdens contractie uit te lokken en te registreren, gebruikt u respectievelijk een elektrische pulsstimulator en een gegevensverzamelingsprogramma. Stimuleer de geïncubeerde spieren om samen te trekken door platina-elektroden die centraal en aan beide zijden van de spier zijn geplaatst.

  1. Zet het myograafsysteem en de warme kamers aan op 30 °C. Open dataverzamelingssoftware die compatibel is met het myograafsysteem en kalibreer krachtomvormers om vergelijkbaarheid tussen datasets te garanderen.
  2. Begin met het snijden van ~ 16 cm strengen van niet-absorbeerbare chirurgische nylon hechtdraad. Gebruik een tang om een lus van ongeveer 0,4 cm in diameter te maken van een enkele streng. Herhaal dit totdat er voldoende lussen zijn geproduceerd. Elke spier heeft twee lussen nodig - een voor de proximale en een voor de distale pees.

2. Bereiding van oplossingen en incubatiemedia

  1. Bereiding van basale incubatiemedia
    1. Bereid de volgende stamoplossingen voor: 2,5 M natriumchloride (NaCl, 250 ml), 0,5 m natriumbicarbonaat (NaHCO3, 250 ml), 0,5 m kaliumchloride (KCl, 50 ml), 0,25 m calciumchloride (CaCl2, 50 ml), 0,25 m kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2PO4, 50 ml), 0,25 m magnesiumsulfaat (MgSO4, 50 ml), 110 m natriumpyruvaat (na-pyruvaat, 100 ml), 500 mM D-mannitol (100 ml), 1 M 2-deoxy-D-glucose (4 ml), 15% oplossing van runderserumalbumine (BSA) gedialyseerd tegen Krebs-Ringer-Henseleit (KRH) buffer (hieronder beschreven in stap 4) (100 ml).
      OPMERKING: Er zijn twee oplossingen nodig om de opname van glucose in rust en contractie te meten. Bovendien vereist elke afzonderlijke insulineconcentratie die wordt gebruikt om de insuline-gestimuleerde glucoseopname te beoordelen, twee oplossingen. In totaal zijn er dus zes verschillende oplossingen nodig om basale, submaximale insuline-, maximale insuline- en contractie-gestimuleerde glucoseopname in geïsoleerde muizenskeletspieren te meten. In het volgende verwijst 'basale incubatiemedia' naar media zonder insuline of radioactieve tracers. 'Incubatiemedia' verwijst naar media die insuline bevatten. "Glucoseopname-incubatiemedia" verwijst naar media die naast insuline 2-deoxy-D-glucose en radioactieve tracers bevatten in een concentratie die identiek is aan die welke in de "incubatiemedia" wordt gebruikt.
    2. Bereid een KRH-buffer voor door ultrapuur water (ddH2O) aan te vullen met NaCl (117 mM), NaHCO3 (24,6 mM), KCl (4,7 mM), CaCl2 (2,5 mM), KH2PO4 (1,2 mM) en MgSO4 (1,2 mM). Vergas vervolgens de KRH-buffer met 95% O2 en 5% CO2 gedurende ten minste 10 minuten. De gewenste pH van de KRH-buffer moet tussen 7,35-7,45 bij 30 °C liggen. Als de pH bij kamertemperatuur wordt aangepast, moet de pH van de KRH-buffer tussen 7,25 en 7,35 liggen.
    3. Voeg BSA (0,1%), Na-Pyruvaat (2 mM) en D-mannitol (8 mM) toe aan de vergaste en pH-aangepaste KRH-buffer om de basale incubatiemedia te voltooien. Bewaar basale incubatiemedia in een afgesloten container om de ontgassing van O2 en CO2 tot een minimum te beperken en plaats de media bij 30 °C.
      OPMERKING: Typisch, de osmolariteit van de KRH supplementen (dwz Na-Pyruvaat, D-Mannitol, en D-glucose) wordt constant gehouden gedurende een heel experiment om krimp of uitbreiding van de spiercellen te voorkomen. Het hierin beschreven protocol gebruikt een osmolariteit van 10 mM voor de KRH-supplementen. Als een glucosebevattende buffer nodig is, vervang dan KRH-supplementen om aan de behoeften te voldoen, bijvoorbeeld 5 mM D-glucose en 5 mM D-mannitol.
    4. Om mogelijke BSA-geassocieerde verontreinigingen in de incubatiebuffer te voorkomen, dialyseert u BSA tegen KRH.
      1. Om een 15% BSA-voorraadoplossing gedialyseerd tegen KRH-buffer te maken, begint u met het oplossen van 300 g vetvrije BSA van analytische kwaliteit in 900 ml KRH-buffer. Kook vervolgens de dialysebuis in herdacht water totdat de slang zacht is.
      2. Vul de slang met de BSA-KRH-oplossing en zet de uiteinden van de slang vast. Plaats de slang met BSA-KRH in 5 L KRH-buffer en laat deze een nacht op 4 °C staan. Vervang de volgende dag de KRH-buffer en laat de slang met BSA-KRH 's nachts in KRH-buffer bij 4 °C staan.
      3. Verzamel ten slotte de BSA-KRH-oplossing uit de slang en voeg KRH-buffer toe aan een eindvolume van 2 l (d.w.z. 15% BSA-KRH-voorraadoplossing). Verdeel de 15% BSA-KRH-stamoplossing in aliquots en bewaar in de vriezer bij ~-20 °C.
  2. Bereiding van incubatiemedia die insuline bevatten
    1. Voeg voor de incubatiemedia die een submaximaal effectieve insulineconcentratie bevatten, 1 μL van een insulinevoorraadoplossing van 100 ml per ml basale incubatiemedia (100 μU/ml insuline) toe.
    2. Voeg voor de incubatiemedia met een maximaal effectieve insulineconcentratie 1 μL van een insulinevoorraadoplossing van 10 E/ml toe per ml basale incubatiemedia (10 ml insuline).
  3. Bereiding van glucoseopname-incubatiemedia
    LET OP: Het hanteren van radioactief materiaal is alleen toegestaan in een beperkt en gecontroleerd gebied door geautoriseerd personeel en sommige universiteiten, onderzoeksinstellingen en bedrijven kunnen de verwerving van een "Radioactivity Use Permit" vereisen. Materiaal en afval moeten worden behandeld volgens de juiste lokale procedures, richtlijnen en wetgeving.
    1. Volg dezelfde procedure als beschreven in rubriek 2.1.2.
    2. Voeg BSA (0,1%), Na-Pyruvaat (2 mM), D-mannitol (7 mM) en 2-deoxy-D-glucose (1 mM) toe aan de vergaste en pH-aangepaste KRH-buffer.
    3. Voeg [3H]2-deoxy-D-glucose (0,028 MBq/ml) en [14C]mannitol (0,0083 MBq/ml) toe aan de aangevulde KRH-buffer om de glucoseopname-incubatiemedia te voltooien. Bewaren bij 30 °C. Als [3H]2-deoxy-D-glucose en [14C]mannitol in ethanol zijn opgelost, verwijder dan de ethanol door N 2-gemedieerde verdamping vóór gebruik.
    4. Voeg voor de glucoseopname-incubatiemedia met een submaximaal effectieve insulineconcentratie 1 μL van een insulinevoorraadoplossing van 100 mU/ml toe per ml glucoseopname-incubatiemedia (100 μU/ml insuline).
    5. Voeg voor de glucoseopname-incubatiemedia met een maximaal effectieve insulineconcentratie 1 μL van een insulinevoorraadoplossing van 10 E/ml toe per ml glucose-opname-incubatiemedia (10 ml/ml insuline).

3. Dieren en dissectie van de muis soleus en EDL spier voor incubatie

OPMERKING: Procedures waarbij proefdieren betrokken zijn, moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en lokale wetgeving. De beschreven procedure kan worden gebruikt met in-house gefokte of commercieel verkrijgbare mannelijke en vrouwelijke muizen van verschillende stammen en genetische achtergronden. De volgende procedure is voorzien voor gevoede vrouwelijke C57Bl / 6J-muizen. Gemiddeld waren muizen 19 weken oud en wogen ze 25 g. De muizen werden onderhouden op een licht-donkercyclus van 12:12 uur met vrije toegang tot standaard knaagdier chow en water. Dierproeven werden gestart om ~ 9:00 uur lokale tijd en alle dieren werden geofferd binnen een periode van 2 uur.

  1. Voeg 4 ml voorverwarmde (30 °C) basale incubatiemedia toe aan elke incubatiekamer en zorg ervoor dat de basale incubatiemedia continu van zuurstof worden voorzien met 95% O2 en 5% CO2.
  2. Verdoof muizen met een intraperitoneale injectie van pentobarbital (10 mg/100 g lichaamsgewicht) of andere beschikbare anesthesie (bijv. tribromoethanol).
    OPMERKING: Houd er rekening mee dat in sommige landen een vergunning voor het gebruik van pentobarbital en andere anesthetica vereist kan zijn. Voordat spierdissectie kan worden gestart, moet de anesthesie van elk dier op de juiste manier worden geïnduceerd. Om dit te garanderen, worden staart- en beenreflexen getest. Voor optimale resultaten moet dissectie goed worden geoefend om te voorkomen dat de spieren tijdens het verwijderen worden beschadigd.
  3. Plaats verdoofde muizen op een dissectiebak (bijv. piepschuim deksel) en pin de voor- en achterpoten zo nodig vast met een naald.
  4. Verwijder de huid van het onderbeen en zorg ervoor dat zowel de achillespees als het kniegewricht zichtbaar zijn.
    1. Voor de dissectie van de soleusspier begint u met het bevestigen van een enkele hechtlus aan de achillespees. Zet een peantang vast aan de achillespees los van de hechtlus en snijd door om de soleus- en gastrocnemiusspieren uit de poot te bevrijden. Schuif de peantang voorzichtig over de muis waardoor de soleusspier bloot komt te liggen.
    2. Pin de peantang vast en plaats een tweede hechtlus rond de proximale pees van de soleusspier. Snijd vervolgens de proximale pees door en ontleed soleus (inclusief de twee aangehechte hechtlussen) vrij van gastrocnemiusspier. Plaats de soleusspier snel in de incubatiekamer door elke hechtlus aan de respectievelijke haken te bevestigen.
  5. Verwijder de fascia die de m. tibialis anterior (TA) bedekt met een tang. Als het correct wordt gedaan, moeten distale pezen van de TA- en EDL-spieren helder wit en zichtbaar zijn; en van elkaar gescheiden.
  6. Knip de distale pees van de TA-spier door en ontleed de spier voor latere analyses (bijv. genotypering). Bevrijd met behulp van een tang voorzichtig de EDL-spier van de omliggende weefsels, maar laat de spier intact en snijd de pezen niet door. Plaats een hechtlus rond de distale pees en een tweede hechtlus rond de proximale pees van EDL.
  7. Snijd vervolgens de pezen door de EDL-spier los te maken met twee bevestigde hechtlussen en plaats de spier snel in de incubatiekamer door elke hechtlus aan de respectieve haken te bevestigen. Om geen spanning te verliezen tijdens de incubatie en vooral tijdens elektrisch geïnduceerde samentrekking van de soleus- en EDL-spieren, is het van groot belang om de hechtlussen rond de pezen met strakke knopen te fixeren.
  8. Tot slot euthanaseer je het dier door bijvoorbeeld cervicale dislocatie.
  9. Wanneer de spieren zijn ontleed en in incubatiekamers zijn geplaatst, past u de rustspanning van elke spier aan op ~ 5 mN en incubeert u de spieren gedurende ten minste 10 minuten voordat het experimentele protocol wordt gestart.

4. Insuline-gestimuleerde glucoseopname in geïsoleerde skeletspieren van muizen

  1. Vervang na stap 3.9 de basale incubatiemedia door incubatiemedia die geen insuline (basale incubatiemedia), een submaximaal effectieve insulineconcentratie of een maximaal effectieve insulineconcentratie bevatten en laat gedurende 20 minuten in de incubatiekamers. Plaats elke incubatiekamer met 1 minuut, waardoor er tijd is voor de daaropvolgende oogst van spieren.
  2. Vervang aan het einde van de stimulatieperiode van 20 minuten de incubatiemedia door de glucoseopname-incubatiemedia met een identieke insulineconcentratie en laat deze gedurende 10 minuten in de incubatiekamers staan, opnieuw met een afstand van 1 minuut tussen elke incubatiekamer.
  3. Na 10 minuten incubatie in de glucoseopname-incubatiemedia verwijdert u voorzichtig de spieren uit de incubatiekamers en wast u ze in ijskoude basale incubatiemedia. Droog vervolgens de spieren snel op filterpapier voordat de hechtlussen worden verwijderd en de spieren worden bevroren in vloeibare stikstof. Het is absoluut noodzakelijk dat de geïncubeerde spieren snel worden geoogst als men naast glucose-opname ook verschillende intracellulaire metabolieten en eiwitsignalering wil onderzoeken.
  4. Verzamel 100 μL van de glucoseopname-incubatiemedia uit elke incubatiekamer en bewaar deze bij -20 °C. De hoeveelheid radioactiviteit in deze monsters wordt meegenomen in de berekening van de spierglucoseopname.

5. Contractie-gestimuleerde glucoseopname in geïsoleerde muizenskeletspieren

OPMERKING: Om contractie van geïsoleerde muizenskeletspieren te induceren, gebruikt u het volgende protocol: 1 trein/15 s, elke trein 1 s lang bestaande uit pulsen van 0,2 ms die worden afgeleverd bij 100 Hz. Andere soortgelijke protocollen die contractie van geïsoleerde skeletspieren van muizen veroorzaken, zullen waarschijnlijk ook werken. Belangrijk is dat de spanning moet worden aangepast om maximale krachtontwikkeling van de geïncubeerde spier te genereren, die afhankelijk is van de experimentele opstelling. Als dit niet is verzekerd, kunt u het risico lopen dat niet alle vezels van de spier samentrekken. Dit kan op zijn beurt leiden tot vertekening in de dataset.

  1. Plaats na stap 3.9 de platina-elektroden centraal en aan beide zijden van de spieren. Start de samentrekking van de spieren onmiddellijk na het vervangen van de basale incubatiemedia door de glucoseopname-incubatiemedia. Plaats indien mogelijk elke incubatiekamer met 1 minuut, waardoor er tijd wordt gemaakt voor de daaropvolgende oogst van spieren. Vergeet niet om de krachtproductie van elke geïncubeerde spier te registreren.
  2. Na 10 minuten contractie in de glucose-opname-incubatiemedia, verwijder de platina-elektroden, verzamel voorzichtig de spieren uit de incubatiekamers en was ze in ijskoude basale incubatiemedia. Droog vervolgens de spieren snel op filterpapier voordat de hechtlussen worden verwijderd en de spieren worden bevroren in vloeibare stikstof. De hele spieroogstprocedure moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd.
  3. Verzamel 100 μL van de glucoseopname-incubatiemedia uit elke incubatiekamer en bewaar deze bij -20 °C. De hoeveelheid radioactiviteit in deze monsters wordt meegenomen in de berekening van de spierglucoseopname.

6. Homogenisatie en verwerking van skeletspieren

OPMERKING: De onderstaande procedure voor spierhomogenisatie maakt het mogelijk om zowel glucoseopname als myocellulaire signalering te bepalen door western blotting in dezelfde set spiermonsters.

  1. Homogeniseer elke spier in 400 μL ijskoude buffer met pH 7,5 met 10% glycerol, 20 mM natriumpyrofosfaat, 1% IGEPAL CA-630 (NP-40), 2 mM fenylmethylsulfonylfluoride (opgelost in isopropanol), 150 mM NaCl, 50 mM HEPES, 20 mM β-glycerofosfaat, 10 mM natriumfluoride (NaF), 1 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), 1 mM glycoletherdiaminetetra-azijnzuur (EGTA), 10 μg/ml aprotinine, 10 μg/ml leupeptine, 3 mM benzamidine en 2mM natrium-orthovanadaat met stalen kralen en een tissuelyser (2 x 45 s bij 30 Hz). Draai alle homogenaten gedurende 1 uur bij 4 °C, waarna ze gedurende 20 minuten bij 4 °C bij 16.000 x g worden gecentrifugeerd. Verzamel het lysaat (supernatant) dat wordt gebruikt om de opname van spierglucose te bepalen.

7. Bepaling van radioactief gelabeld 2-deoxyglucose en mannitol

  1. Voeg 150 μL van elk spierlysaat en 25 μL van de glucoseopname-incubatiemedia van elke incubatiekamer toe aan afzonderlijke injectieflacons voor het tellen van vloeibare scintillaties met 2 ml vloeibare scintillatievloeistof. Bereid bovendien twee blinde controleflacons voor die slechts 3 ml vloeibare scintillatievloeistof bevatten. Sluit alle injectieflacons en meng grondig door elke injectieflacon gedurende ~ 5 s te vortexen.
  2. Plaats de injectieflacons in een vloeibare scintillatieteller en meet de radioactiviteit van [3H]2-deoxy-D-glucose en [14C]mannitol volgens de richtlijnen van de fabrikant. Registreer DPM (desintegraties per minuut) voor elke vloeibare scintillatieflacon.

8. Berekening van spierglucoseopnamesnelheden

  1. Gebruik het lysaat uit stap 6.1 om de totale eiwitconcentratie in elk spiermonster te meten met behulp van standaard eiwitkwantificeringsmethoden (bijv. Bicinchoninic acid of Bradford-assays). Bereken de hoeveelheid eiwit (mg) die aan elke scintillatieflacon wordt toegevoegd.
    OPMERKING: De snelheid van glucoseopname voor elk spiermonster wordt berekend door de hoeveelheid [3H]2-deoxy-D-glucose in de extracellulaire ruimte af te trekken van de totale hoeveelheid [3H]2-deoxy-D-glucose in het spiermonster met [14C]mannitol als extracellulaire marker. Aangenomen wordt dat [3H]2-deoxy-D-glucose en [14C]mannitol vergelijkbare diffusie-eigenschappen vertonen in het spierweefsel tijdens de incubatie. Voer de volgende berekeningen uit:
  2. Begin met het aftrekken van de [3H] en [14C] DPM van de blinde controlemonsters van alle spier- en mediamonsters.
  3. Bepaal de spier extracellulaire ruimte in μL (μL-ECS):
    [14C] DPMspier / ([14C]DPMmedia / Mvol)
  4. Bereken de hoeveelheid [3H]DPM in de extracellulaire ruimte van de spier ([3H]DPMECS):
    μL-ECS × ([3H]DPMmedia / Mvol)
  5. Bereken de hoeveelheid [3H]DPM in de spier intracellulaire ruimte ([3H]DPMICS):
    [3uur] DPMspier− [3H]DPMECS
  6. Bereken de spierglucoseopnamesnelheid (μmol / g eiwit / uur):
    [3uur] DPMICS / ([3H]DPMmedia / Mvol) / [2-deoxy-D-glucose])) / mg eiwit) / Th
    OPMERKING: Voor alle bovenstaande vergelijkingen,
    [14C] DPMspier is de hoeveelheid [14C] mannitol radioactiviteit in een spiermonster;
    [14C] DPM-media is de hoeveelheid [14C]mannitol radioactiviteit in een mediamonster;
    [3uur] DPM-spier is de hoeveelheid [3H] 2-deoxy-D-glucose radioactiviteit in een spiermonster;
    [3uur] DPM-mediais de hoeveelheid [3H]2-deoxy-D-glucose radioactiviteit in een mediamonster;
    [3uur] DPMECS is de hoeveelheid [3H]2-deoxy-D-glucose radioactiviteit in de spier extracellulaire ruimte;
    [3uur] DPMICS is de hoeveelheid [3H]2-deoxy-D-glucose radioactiviteit in de spier intracellulaire ruimte;
    μL-ECS is de spierextracellulaire ruimte in μL;
    Mvol is het volume (μL) incubatiemedia dat wordt gebruikt voor het tellen van scintillaties (bv. "25" zoals hierboven vermeld);
    Th is de tijdsfactor die wordt gebruikt om de opnamesnelheden per uur te berekenen (d.w.z. '1/6' bij het incuberen van spieren met glucoseopnamemedia gedurende 10 minuten)
  7. Houd rekening met deze voorbeeldberekening. De [3H] en [14C] DPM van de blinde controlemonsters (respectievelijk 17 en 6) zijn afgetrokken van de hieronder vermelde DPM-waarden.
    [14C] DPMspier: 343
    [14C] DPMmedia: 11846
    [3uur] DPMspier: 4467
    [3uur] DPMmedia: 39814
    Mvol: 25
    mg eiwit: 0,396 (in 150 μL spiereiwit lysaat)
    [2-deoxy-D-glucose]: 1 (mM)
    Th: 1/6 (h)
    μL-ECS = 343 DPM / (11846 DPM / 25 μL) = 0,724 μL
    [3uur] DPMECS: 0,724 μL × (39814 DPM / 25 μL) = 1153 DPM
    [3uur] DPMICS: 4467 DPM - 1153 DPM = 3314 DPM
    Glucose opname: ((3314 DPM / (39814 DPM / 25 μL) / 1 mmol/L) / 0,396 mg eiwit) / (1/6 uur) = 31,53 μmol / g eiwit / uur

9. SDS-PAGE en western blot analyses

  1. Bereid soleus- en EDL-spierlysaten in Laemmli-buffer en verwarm gedurende 5 minuten bij 96 °C.
  2. Scheid gelijke hoeveelheden spiereiwit door SDS-PAGE op zelf gegoten gels en breng de eiwitten over naar polyvinylideenfluoridemembranen door semidry blotting.
  3. Incubeer vervolgens membranen in Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,05% Tween 20 en 2% magere melk en sondemembranen met relevante primaire en secundaire antilichamen.
  4. Detecteer eiwitten met chemiluminescentie en visualiseer ze door een digitaal beeldvormingssysteem.

10. Spierglycogeen, nucleotiden, lactaat, creatine en fosfocreatine

  1. Gebruik perchloorzuur om EDL en soleus spiermonsters te extraheren.
  2. Neutraliseer vervolgens monsters en analyseer ze op lactaat, creatine en fosfocreatine zoals eerder beschreven18.
  3. Analyseer het nucleotidegehalte in EDL en soleusspier door omgekeerde fase HPLC na extractie in perchloorzuur.
  4. Bepaal het spierglycogeengehalte in hele spierhomogenaat als glycosyleenheden na zure hydrolyse met een fluorometrische methode zoals eerder beschreven18.

11. Statistieken

  1. Statistische analyses uitvoeren met statistische analysesoftware.
  2. Gebruik een ANOVA-test (two-way analysis of variance) om statistische verschillen tussen de waarden in tabel 1 te beoordelen.
  3. Gebruik ongepaarde Student t-tests om statistische verschillen in glucoseopname tussen EDL en soleus te beoordelen binnen elke groep in figuur 2. Gegevens presenteren als middel ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). P < 0,05 wordt als statistisch significant beschouwd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Zoals te zien is in figuur 2 waren de basale glucoseopnamesnelheden vergelijkbaar tussen geïsoleerde soleus- en EDL-spieren van vrouwelijke muizen. Dit is ook meerdere keren gemeld voor 12,13,19,20. De glucoseopname nam toe met ~ 0,8 en ~ 0,6 keer en bereikte 12 en 9 μmol / g eiwit / h in respectievelijk soleus- en EDL-spieren, als reactie op een submaximaal effectieve insulineconcentratie (100 μU / ml). Deze toename was nog hoger (~ 4 en ~ 2 keer bereiken 33 en 19 μmol / g eiwit / h in respectievelijk soleus- en EDL-spieren) wanneer spieren werden gestimuleerd met een maximaal effectieve insulineconcentratie (10 ml / ml). Bovendien waren zowel submaximale als maximale insuline-gestimuleerde glucoseopname significant hoger in soleusspier, wat aangeeft dat soleusspier een verhoogde insulinegevoeligheid en responsiviteit vertoont in vergelijking met EDL-spieren. Dit kan verband houden met de hogere expressie van de glucosetransporter 4 (GLUT4) en de insulinesignalerende transducerproteïne kinase B (Akt) in soleusspier in vergelijking met EDL-spier 10,21,22,23,24.

Contractie-geïnduceerde glucoseopname was significant hoger in EDL-spieren in vergelijking met soleusspier (figuur 2) zoals ook eerder gemeld13,19. De glucoseopname nam dus toe met ~ 2 en ~ 2,5 keer en bereikte 14 en 22 μmol / g eiwit / h in respectievelijk soleus- en EDL-spieren, als reactie op elektrisch geïnduceerde contracties. Figuur 3 toont de maximale spierkrachtproductie in soleus- en EDL-spieren gedurende de stimulatieperiode van 10 minuten. Zoals gezien en eerder gemeld19, genereert de EDL-spier meer kracht (225 mN in EDL versus 150 mN in soleus) tijdens het eerste deel van de stimulatieperiode. Aan de andere kant vertoont de EDL-spier een snellere afname van de krachtproductie in vergelijking met de soleusspier later in de stimulatieperiode. Deze bevindingen zijn waarschijnlijk te wijten aan het verschil in vezeltypeverdeling tussen de soleus (type 1 > type 2) en EDL (type 2 > type 1) spier25 omdat type 2-vezels meer kracht genereren, maar vermoeidheid sneller in vergelijking met type 1-vezels26,27.

Om het effect van insuline en contractie op intracellulaire signalering in geïsoleerde soleus- en EDL-spieren te evalueren, werd fosforylering van Akt Thr308, TBC1-domeinfamilielid 4 (TBC1D4) Ser588, AMPKα Thr172 en acetyl-CoA carboxylase (ACC) Ser212 uitgevoerd door de western blotting-techniek (figuur 4). Zoals verwacht veroorzaakte de submaximaal en maximaal effectieve insulineconcentratie een toename van de fosforylering van Akt Thr308 en TBC1D4 Ser588, terwijl contractie een toename van de fosforylering van AMPKα Thr172 en ACC Ser212 veroorzaakte. Noch insuline noch contractie leidde tot een verandering in het totale eiwitgehalte van Akt2, TBC1D4, AMPKα2 en ACC in soleus- en EDL-spieren (figuur 4).

Bij onderzoek naar verschillende markers van metabole levensvatbaarheid van geïncubeerde soleus- en EDL-spieren, zagen we een algehele vermindering van de niveaus van adenosinenucleotiden (ATP, ADP, AMP) (~ 15-25%) en creatine (~ 10-35%), ongeacht of de spieren werden geïncubeerd in aanwezigheid van pyruvaat of glucose in vergelijking met niet-geïncubeerde spieren (tabel 1 ). Aan de andere kant werd de daling van de glycogeenspiegels waargenomen in soleus- en EDL-spieren geïncubeerd met pyruvaat voorkomen als de spieren werden geïncubeerd met glucose. Interessant is echter dat we zagen dat de inosinemonofosfaat (IMP) -niveaus meerdere malen toenamen, maar alleen in geïncubeerde soleusspieren. IMP-niveaus nemen meestal toe in de spieren tijdens ernstige metabole stress, omdat de spier probeert AMP-accumulatie te voorkomen door AMP om te zetten in IMP om de ATP / ADP-verhouding28 te behouden. Dit geeft aan dat de soleusspier tijdens de incubatie wat meer metabolisch belast is in vergelijking met de EDL-spier. Dit idee wordt ook ondersteund door bevindingen van verhoogde AMPKα Thr172 en ACC Ser212 fosforylering in de soleusspier geïncubeerd met pyruvaat (figuur 5). Belangrijk is dat de waargenomen toename van IMP-niveaus en AMPKα Thr172 en ACC Ser212 fosforylering afneemt wanneer de soleusspier wordt geïncubeerd met glucose. Daarom lijkt het voordelig om geïsoleerde skeletspieren in een glucosebevattende buffer te incuberen om fluctuaties in adenosinenucleotiden te minimaliseren en een daling van spierglycogeen te voorkomen wanneer spieren gedurende een langere periode worden geïncubeerd. Met betrekking tot de opname van 2-deoxyglucose hebben we aanwijzingen dat het incuberen van spieren gedurende 6 tot 8 uur in aanwezigheid van pyruvaat de basale / rustglucoseopnamesnelheden zal verhogen. Het uitbroeden van spieren in een medium dat glucose bevat, lijkt een dergelijke toename van de glucoseopname te voorkomen (ongepubliceerde gegevens).

Figure 1
Figuur 1: Incubatiesysteem. (A) Myograafsysteem met vier enkele incubatiekamers. (B) Aangepaste incubatiehaken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Glucoseopname in geïsoleerde volwassen skeletspieren van muizen. 2-deoxyglucoseopname werd bepaald in geïsoleerde soleus (zwarte staven) en EDL (grijze balken) spieren als reactie op een submaximaal effectieve insulineconcentratie (100 μU/ml), een maximaal effectieve insulineconcentratie (10 mU/ml) en elektrisch geïnduceerde contracties (0,2 ms puls, 100 Hz, 1 s/15s, 30 V, 10 min). Gegevens werden geanalyseerd door studenten t test binnen elke groep. ###p<0.001, ##p<0.01 vs. soleus spier. Waarden zijn gemiddelden ± SEM. n = 4-6 per groep. h, uur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Spierkrachtcurves als reactie op elektrisch geïnduceerde contracties. Piekkrachtproductie tijdens elektrische stimulatie werd berekend voor de soleus (zwarte stippen) en EDL (grijze stippen) spier. Elke afzonderlijke waarde komt overeen met een gemiddelde van de laatste 500 ms van elke stimulatieperiode van 1 s. Waarden zijn gemiddelden ± SEM. n = 5-6 per groep. s, tweede. mN, milli-Newton. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Representatieve western blots van Akt Thr308, TBC1D4 Ser588, AMPKα Thr172 en ACC Ser212 fosforylering evenals Akt2, TBC1D4, AMPKα2 en ACC eiwit. Western blot-analyses werden uitgevoerd op de soleus- en EDL-spiermonsters van muizen zoals beschreven in figuur 2. B, basaal. S, submaximaal effectieve insuline. M, maximaal effectieve insuline. C, krimp. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Representatieve western blots van AMPKα Thr172 en ACC Ser212 fosforylering evenals AMPKα2 en ACC eiwit. Western blot-analyses werden uitgevoerd op de soleus- en EDL-spiermonsters van muizen zoals beschreven in tabel 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

niet-geïncubeerd 1 uur geïncubeerd met pyruvaat Geïncubeerd 1 uur met glucose Belangrijkste effecten Interactie
Soleus EDL Soleus EDL Soleus EDL
Lactaat 1,00 ± 0,01 1,00 ± 0,02 0,96 ± 0,03 0,98 ± 0,02 1,05 ± 0,01 0,99 ± 0,01 - -
Cr 1,00 ± 0,04 1,00 ± 0,06 0,64 ± 0,07 ### 0,76 ± 0,05 ### 0,76 ± 0,07 ## 0,88 ± 0,09 ## p < 0,001 -
PCr 1,00 ± 0,19 1,00 ± 0,06 0,80 ± 0,12 1,13 ± 0,14 0,65 ± 0,31 0,75 ± 0,08 - -
PCr / (Cr + PCr) 1,00 ± 0,20 1,00 ± 0,07 1,17 ± 0,11 1,25 ± 0,12 0,78 ± 0,36 0,92 ± 0,11 - -
ATP 1,00 ± 0,03 1,00 ± 0,02 0,72 ± 0,03 ###,§§§ 0,99 ± 0,03 * 0,81 ± 0,06 ### 0,85 ± 0,04 ## - p < 0,001
ADP 1,00 ± 0,04 1,00 ± 0,04 0,75 ± 0,05 ### 0,92 ± 0,03 ### 0,84 ± 0,04 ## 0,86 ± 0,03 ## p < 0,001 -
AMP 1,00 ± 0,11 1,00 ± 0,12 0,85 ± 0,15 0,79 ± 0,13 0,84 ± 0,18 0,75 ± 0,13 - -
KABOUTER 1,00 ± 0,17 1,00 ± 0,30 4.43 ± 0.67 ###,§§§ 0,72 ± 0,29 3.33 ± 1.25 ##,§ 1,08 ± 0,01 - p < 0,001
AMP/ATP-verhouding 1,00 ± 0,12 1,00 ± 0,13 1,18 ± 0,22 0,81 ± 0,16 1,06 ± 0,23 0,90 ± 0,19 - -
Glycogeen 1,00 ± 0,08 1,00 ± 0,12 0,74 ± 0,07 (#),* 0,80 ± 0,12 (#),* 1,12 ± 0,10 1,10 ± 0,03 p = 0,035 -
pAMPK Thr172 / AMPKα2 1,00 ± 0,10 1,00 ± 0,12 3.26 ± 0.58 ###,***,§§§ 1,55 ± 0,27 1,68 ± 0,19 # 1,36 ± 0,19 - p = 0,002
pACC Ser212 / ACC 1,00 ± 0,18 1,00 ± 0,12 2.22 ± 0.58 ###,**,§§ 0,96 ± 0,21 0,99 ± 0,15 0,83 ± 0,09 - p = 0,030

Tabel 1: Vergelijking van de metabole levensvatbaarheid van muis soleus en EDL spieren geïncubeerd gedurende 1 uur in aanwezigheid van 2 mM pyruvaat of 5 mM glucose. Niet-geïncubeerde spieren werden ontleed uit verdoofde en gevoede dieren voordat ze werden ingevroren in vloeibare stikstof. Afzonderlijke spieren werden gedurende 1 uur geïncubeerd in KRH-buffer aangevuld met BSA (0,1%), Na-pyruvaat (2 mM) en D-mannitol (8 mM), terwijl anderen gedurende 1 uur werden geïncubeerd in KRH-buffer aangevuld met BSA (0,1%), D-glucose (5 mM) en D-mannitol (5 mM) voordat ze werden ingevroren in vloeibare stikstof. Gegevens werden omgezet in relatieve eenheden om waargenomen veranderingen in verschillende markers van metabole levensvatbaarheid te benadrukken. Absolute waarden van niet-geïncubeerde muis soleus- en EDL-spieren worden hieronder gegeven. Lactaat (mmol/kg w.g): 137,53soleus; 139,05EDL. Cr (mmol/kg w.g): 9,35soleus; 8,98EDL. PCr (mmol/kg w.g): 1,50soleus; 5,20EDL. PCr / (PCr + Cr): 13,98soleus; 37,30EDL. ATP (mmol/kg w.g): 3,07soleus; 4,24EDL. ADP (mmol/kg w.g): 0,60soleus; 0,51EDL. AMP (mmol/kg w.g): 0,18soleus; 0,08EDL. IMP (mmol/kg w.g): 0,07soleus; 0,14EDL. AMP / ATP-verhouding: 0,06soleus; 0,02EDL. Glycogeen (pmol/μg eiwit): 77.01soleus; 67,56EDL. Gegevens werden geanalyseerd door een tweerichtings-ANOVA binnen elke groep. ###p<0.001, ##p<0.01 en #p<0.05 vs. niet-geïncubeerd. p<0,001, **p<0,01 en *p<0,05 vs geïncubeerd 1 uur met glucose. §§§p<0.001, §§p<0.01 en §p<0.05 vs EDL. Waarden zijn gemiddelden ± SEM. n = 12 in niet-geïncubeerde groep, n = 4-6 in geïncubeerde groepen. Cr, Creatine; PCr, Fosfocreatine; w.w., nat gewicht; h, uur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Intacte regulatie van glucoseopname in skeletspieren is belangrijk voor het behoud van de algehele gezondheid1. Onderzoek naar spierglucoseopname dient dus vaak als een primaire uitlezing bij het evalueren van verschillende gezondheidsveranderende interventies. Hier beschrijven we een ex vivo methode voor het meten van glucoseopname in geïsoleerde en geïncubeerde soleus- en EDL-spieren van muizen als reactie op insuline en elektrisch geïnduceerde contracties. De methode is snel en betrouwbaar en maakt een nauwkeurige controle van de omgeving van de geïncubeerde spier mogelijk die nauwkeurig onderzoek mogelijk maakt naar spierglucoseopnamesnelheden geïsoleerd van de potentieel verstorende invloed van hormonen en substraten die in het bloed kunnen worden gevonden. De methode wordt al enkele jaren in vele studies gebruikt en wordt op grote schaal overgenomen door de spieronderzoeksgemeenschap.

Het ex vivo incubatiemodel wordt over het algemeen beschouwd als een methode om de glucosetransportcapaciteit te beoordelen in plaats van de glucoseopname in de skeletspieren. Glucose transportcapaciteit in geïncubeerde spieren kan worden bepaald door het meten van geaccumuleerde D-glucose over een bepaalde periode. Dit vormt echter een probleem omdat D-glucose na opname snel wordt gemetaboliseerd in de spiercel. Om dit probleem te omzeilen, is het glucoseanaloog 3-O-Methyl-D-glucose (3-MG) op grote schaal gebruikt om de glucosetransportcapaciteit te beoordelen, omdat 3-MG niet verder in de cel wordt gemetaboliseerd nadat het over het celoppervlakmembraan is getransporteerd. De initiële snelheid van intracellulair geaccumuleerd 3-MG dient dus als een index van cellulaire glucosetransportcapaciteit op zich omdat deze niet wordt beïnvloed door andere stappen in de glucose-metabole routes. Het gebruik van 3-MG kan echter een probleem vormen, omdat 3-MG zich zal ophopen, waardoor de transmembraangradiënt voor 3 MG wordt verminderd en vervolgens de verdere opname wordt verminderd. Om een maat voor de membraantransportcapaciteit te verkrijgen, moet dus de initiële opnamesnelheid van 3 MG worden geschat. Met name wanneer de transportcapaciteit hoog is, kan dit een probleem vormen als gevolg van efflux van 3-MG uit de spier29,30. Het potentiële probleem met 3 mg efflux kan worden vermeden met behulp van 2-deoxy-D-glucose (2-DG). Na transport naar de skeletspieren wordt 2-DG gefosforyleerd door hexokinase II tot 2-deoxy-D-glucose-6-fosfaat (2-DG-6P). Omdat de skeletspieren glucose-6-fosfatase missen en GLUT4 geen gefosforyleerd 2-DG kan transporteren, zal 2-DG-6P gevangen zitten in de spiercel. In tegenstelling tot glucose-6-fosfaat is 2-DG-6P een zeer zwakke allosterische remmer van hexokinase II30 die helpt om de transmembraangradiënt voor 2-DG te behouden. Zo hebben observaties aangetoond dat de opname van 2-DG in geïncubeerde (ratten)spieren lineair blijft totdat de intracellulaire 2-DG-6P-concentratie hoger is dan 30 mM, een concentratie die de hexokinase II-activiteitverlaagt 30. Bovendien blijft in geïncubeerde muizenskeletspieren 2-DG opname lineair gedurende ~ 30 minuten wanneer de temperatuur van de incubatiebuffers 37 °C of minder31 is. Dit suggereert dat 2-DG kan worden gebruikt om de glucosetransportcapaciteit te meten in plaats van glucoseopname in geïncubeerde spieren, behalve in situaties waarin 2-DG-6P-concentraties zeer hoog worden (bijv. waargenomen tijdens incubaties >2 uur met 1 mM 2-DG en een maximale insulineconcentratie29,30). Het idee dat 2-DG-opname waarschijnlijk de glucosetransportcapaciteit weerspiegelt, wordt ook ondersteund door bevindingen die aantonen dat maximale insuline-gestimuleerde 2-DG-opname vergelijkbaar is in geïncubeerde spieren van wild-type muizen en muizen die hexokinase II32 overexpressie geven. Een mogelijke zorg bij het gebruik van 2-DG voor spierglucosetransportmetingen tijdens contractie is een toename van de intracellulaire glucose-6-fosfaatconcentratie als gevolg van een verhoogde glycogenolysesnelheid. Aangezien echter een lineaire toename van de (rat) spier 2-DG opname wordt waargenomen tijdens contractie in de loop van de tijd29, geeft dit aan dat de accumulatie van glucose-6-fosfaat uit de afbraak van glycogeen tijdens contractie niet interfereert met hexokinase II activiteit en dus 2-DG opnamesnelheden. Op basis hiervan lijkt 2-DG zeer geschikt voor metingen van glucosetransport in geïsoleerde skeletspieren tijdens insuline en contractie gezien de beperkingen van 3-MG.

Hoewel algemeen wordt aangenomen dat 2-DG niet verder wordt gemetaboliseerd na fosforylering door hexokinase II, is gemeld dat sommige 2-DG is gericht op en opgenomen in spierglycogeen. Zo wordt tijdens een 2 uur normoglycemische hyperinsulinemische klem bij ratten ~30% van de 2-DG die door de skeletspieren wordt opgenomen, opgenomen in glycogeen33. Daarom kan worden geredeneerd dat de snelheid van insuline-gestimuleerde 2-DG opname in geïncubeerde skeletspieren wordt onderschat als de accumulatie van 2-DG in glycogeen wordt verwaarloosd. We hebben vastgesteld dat het hierin beschreven protocol over het bereiden van spierlysaten (supernatant) voor latere analyses van 2-DG-opnamesnelheden in eerder geïncubeerde skeletspieren niet wordt beïnvloed door de mogelijke opname van 2-DG in glycogeen. Men zou kunnen stellen dat glycogeen zich ophoopt in de pellet bij het centrifugeren van hele spierhomogenaat om lysaat te genereren voor 2-DG opnamemetingen. Bij het vergelijken van de niveaus van radioactiviteit in insuline-gestimuleerde hele spierhomogenaat versus lysaat detecteren we echter geen significant verschil (ongepubliceerde gegevens). Dit suggereert dat het incuberen van muizenspier gedurende 10 minuten in 1 mM 2-DG geen detecteerbare accumulatie van 2-DG in glycogeen veroorzaakt.

Bepaling van de 2-DG-opname van de skeletspieren zonder rekening te houden met het feit dat 2-DG is verdeeld in zowel de extra- als intracellulaire ruimte, zal leiden tot een overschatting van de opname van 2 DG's. Om dit te omzeilen, moet L-glucose worden gebruikt als een extracellulaire marker, omdat dit niet over het celmembraan wordt getransporteerd, maar verder vergelijkbare eigenschappen vertoont als D-glucose, inclusief massa, oplosbaarheid, passieve diffusie, binding, enz. Vanwege de buitensporige productiekosten en dus de aankoop van L-glucose, wordt mannitol meestal gebruikt als een extracellulaire marker, omdat mannitol niet wordt opgenomen door de spiercel, relatief goedkoop is en naar schatting een enigszins vergelijkbaar extracellulair distributievolume heeft als glucose en 2-DG34.

Intrinsieke cellulaire en moleculaire klokken lijken een essentiële rol te spelen voor de regulatie van het metabolisme van het hele lichaam en energiehomeostase35. Er is waargenomen dat spierspecifieke knock-out van het kernklokgen Bmal1 de insuline-gestimuleerde glucoseopname in geïsoleerde muizenskeletspierenschaadt 36. Bovendien vertoont submaximale insuline-gestimuleerde glucoseopname van geïsoleerde skeletspieren circadiaans ritme met de laagste en hoogste insulinerespons in het midden van de lichte en donkere fase, respectievelijk37. Op basis van deze bevindingen is het daarom belangrijk om tijd van dierenoffers op te nemen in het experimentele ontwerp om de reproduceerbaarheid van gegevens te vergroten.

Een groot nadeel van de ex vivo methode is het ontbreken van capillaire stroming in de geïsoleerde spier. Dit betekent dat de levering en verwijdering van verschillende substraten volledig afhankelijk is van eenvoudige diffusie tussen de spiervezels en de omgeving. Bijgevolg is de validatie van de metabole levensvatbaarheid van geïsoleerde spieren die ex vivo zijn geïncubeerd, gericht op diffusiebeperkingen van zuurstof tot zowel oppervlakkige als diepe spiervezels. Zo heeft geïncubeerde spier, met name zeer metabolische muizenspier, de neiging om hypoxische kernen te ontwikkelen waarin afbraak van glycogeen optreedt 16,17,38. In een gedetailleerde beoordeling door Bonen en collega's15 werd gesuggereerd dat hypoxische kernen van geïncubeerde spieren zich waarschijnlijk ontwikkelen bij het incuberen van spieren die te dik zijn om goed van zuurstof te worden voorzien, vooral bij het broeden bij temperaturen van ≥ 37 ° C. Dit leidde tot de aanbeveling dat alleen dunne en cilindrische muisspieren, zoals soleus en EDL, mogen worden gebruikt voor incubaties bij 25-30 °C om de ontwikkeling van hypoxische kernen te voorkomen. Dit geeft aan dat dikte en geometrie in plaats van massa belangrijke factoren zijn om te overwegen bij het incuberen van skeletspieren van muizen. Bovendien werd aanbevolen dat incubatietemperatuur, spierdikte en ATP-, fosfocreatine- en glycogeengehalte en / of afgifte van lactaat routinematig moeten worden gemeten en gerapporteerd om de levensvatbaarheid van de geïncubeerde spier te evalueren15. Voor zover wij weten, zijn dergelijke volledige analyses van geïncubeerde spieren voornamelijk gemeld voor rattenspier 39,40,41,42 en slechts in beperkte mate gerapporteerd voor muizenspier16,17. Om inzicht te krijgen in verschillende metabole markers van levensvatbaarheid in geïncubeerde muizenskeletspieren, beoordeelden we mogelijke veranderingen in intracellulaire inhoud van lactaat, creatine, fosfocreatine, adenosinenucleotiden, glycogeen en AMPK-signalering in soleus- en EDL-spieren na 1 uur incubatie in glucose- of pyruvaat-aangevulde KRH-buffer. Vergelijkbaar met eerdere bevindingen in geïncubeerde muis soleus en EDL spier17, zagen we dat glycogeenspiegels afnamen wanneer spieren werden geïncubeerd in glucosevrije media. Dit geeft aan dat de afwezigheid van glucose tijdens incubatie de glycogeenafbraak en de daaropvolgende invoer van glucose-6-fosfaat in glycolyse bevordert, wat kan werken om de ATP-productie veilig te stellen, met name als de zuurstoftoevoer ontoereikend is. Bovendien vonden we een algehele vermindering van de ATP- en ADP-nucleotidepools in geïncubeerde soleus- en EDL-spieren. Dit kan impliceren dat de zuurstoftoevoer niet volledig voldoende is om aan de vraag van geïncubeerde muizenspier te voldoen, zowel in aanwezigheid als afwezigheid van glucose. Aangezien de oxidatieve soleusspier meer afhankelijk is van zuurstof voor ATP-productie in vergelijking met de glycolytische EDL-spier, zou dit suggereren dat de soleusspier in grotere mate wordt beïnvloed door de incubatieprocedure. In overeenstemming vonden we dat de intracellulaire niveaus van IMP en AMPK-signalering duidelijk verhoogd waren in soleus in vergelijking met EDL-spieren wanneer geïncubeerd in afwezigheid van glucose. Dit betekent dat de soleusspier een hogere mate van metabole stress vertoont tijdens de incubatie, waarmee rekening moet worden gehouden bij het evalueren van gegevens uit het ex vivo muizenspiermodel.

Gekweekte spiercellen, waaronder vereeuwigde L6 en C2C12, evenals primaire menselijke myotubes worden vaak gebruikt als surrogaat voor volwassen skeletspieren om de effecten van verschillende genetische en farmacologische manipulaties op insuline-gestimuleerde spierglucoseopname te bestuderen. Op verschillende manieren lijken gekweekte spiercellen echter niet op volwassen skeletspieren en bij het vergelijken van de twee modelsystemen worden tal van verschillen duidelijk. Deze omvatten verschillen in eiwitexpressie, dimensionale structuur, omringende omgeving, proliferatie- en differentiatietoestand, vezeltypesamenstelling, metabole processen en functionele eigenschappen43 die allemaal van invloed kunnen zijn op hoe de spiercel de glucoseopname reguleert als reactie op verschillende stimuli. Doorgaans worden grotere relatieve effecten van insuline op glucoseopnamesnelheden waargenomen in volwassen skeletspieren in vergelijking met gekweekte spiercellen44 , wat erop kan wijzen dat gekweekte spiercellen tot op zekere hoogte de machinerie missen die verantwoordelijk is voor het reguleren van glucoseopnamesnelheden, waaronder een hoog niveau van expressie van de insulinegevoelige glucosetransporter GLUT443 . Gezien de beperkingen en kanttekeningen die gepaard gaan met het gebruik van gekweekte spiercellen en geïsoleerde skeletspieren, is het daarom waarschijnlijk voordelig om een gecombineerde aanpak te volgen bij het bestuderen van verschillende spierstofwisselingsprocessen zoals glucoseopname.

Soleus- en EDL-spieren worden meestal beschouwd als representatief voor respectievelijk langzame en snelle spiertrekkingen. Daarom zijn deze spiertypen ideaal voor mechanische studies die interventies willen onderzoeken die de spierkracht en vermoeidheidsontwikkeling beïnvloeden. Bovendien wordt meestal gemeld dat soleusspier een verhoogde insulinegevoeligheid en -responsiviteit hebben in vergelijking met EDL-spieren en dus kunnen interventies die zich richten op spierinsulinegevoeligheid soleus en EDL anders beïnvloeden. Bovendien verschilt de relatieve verdeling van de verschillende AMPK-complexen tussen de soleus- en EDL-spier, wat van invloed lijkt te zijn op het vermogen van AMPK-activerende verbindingen om de opname van spierglucose te verhogen. Het grootste inzicht in de regulatie van spierglucoseopname wordt dus waarschijnlijk bereikt als zowel de soleus- als de EDL-spieren worden gebruikt tijdens experimenten met het ex vivo incubatiemodel.

De hierin beschreven methode relateert glucoseopname aan de hoeveelheid totale eiwitrijkdom bepaald in elk spiermonster na homogenisatie. Het is onze ervaring dat de variatie afneemt bij het relateren van glucoseopname per hoeveelheid spiereiwit in plaats van spiergewicht (ongepubliceerde gegevens). Bovendien maakt homogenisatie van spiermonsters in een buffer die wordt gebruikt voor verschillende biochemische testen het mogelijk om zowel glucoseopname, myocellulaire signalering als enzymactiviteiten in hetzelfde monsterpreparaat te bepalen45,46. Dit zal vaak het aantal muizen verminderen dat voor een onderzoek wordt gebruikt. Niettemin kan de opname van glucose gemakkelijk worden bepaald in skeletspiermonsters die worden opgelost door verhitting in natriumhydroxide (NaOH) gevolgd door neutralisatie met waterstofchloride20. Aangezien de behandeling van spieren met NaOH interfereert met metingen van de totale spiereiwitconcentratie, moet het glucosetransport dat met deze procedure wordt gemeten, worden gerelateerd aan het spiergewicht.

Op basis van verschillende optimalisaties bevat onze glucoseopname incubatiebuffer een specifieke activiteit van 0,028 MBq/ml [3H]2-deoxy-D-glucose en 0,0083 MBq/ml [14C]Mannitol. Aan de ene kant verlaagt dit de hoeveelheid lysaat (150 van de 400 μL) die nodig is om voldoende en betrouwbare radioactiviteitsmetingen te krijgen. Aan de andere kant verhoogt het de hoeveelheid radioactief [3H] 2-deoxy-D-glucose en [14C] mannitol die nodig is voor elk experiment, wat de experimentele kosten verhoogt. Voor elke experimentele opstelling is het dus mogelijk om de hoeveelheid radioactiviteit die wordt gebruikt in de glucoseopname-incubatiemedia te reguleren om aan specifieke vereisten te voldoen. Er moet echter voor worden gezorgd dat de hoeveelheid radioactiviteit in de incubatiebuffer niet zodanig wordt verminderd dat radioactiviteitsmetingen onbetrouwbaar worden. Dit wordt gewaarborgd door de radioactiviteit in monsters hoger te houden dan de gespecificeerde detectiegrenzen van de gebruikte vloeistofscintilatietelmachinerie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Deense Raad voor Onafhankelijk Onderzoek - Medische Wetenschappen (FSS8020-00288B) en de Novo Nordisk Foundation (NNF160C0023046). Dit werk werd ook ondersteund door een onderzoekssubsidie aan Rasmus Kjøbsted van de Deense Diabetes Academie, die wordt gefinancierd door de Novo Nordisk Foundation, subsidienummer NNF17SA0031406. De auteurs willen Karina Olsen, Betina Bolmgren en Irene Bech Nielsen (Department of Nutrition, Exercise and Sports, Faculty of Science, University of Copenhagen) bedanken voor hun bekwame technische assistentie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[14C]D-mannitol American Radiolabeled Chemicals, Inc. ARC 0127
[3H]2-deoxy-D-glucose  American Radiolabeled Chemicals, Inc. ART 0103A
2-Deoxy-D-glucose Sigma D8375
4-0 USP non-sterile surgical nylon suture Harvard Apparatus 51-7698
Streptavidin/HRP (Conjugate) DAKO P0397 Used to detect ACC protein
Akt2 antibody Cell Signaling 3063
AMPKα2 antibody Santa Cruz SC-19131
aprotinin Sigma A1153
benzamidine Sigma B6505
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7030
CaCl2 Merck 1020831000
Calibration kit (force) Danish Myo Technology A/S 300041
Chemiluminescence Millipore WBLUF0500
D-Glucose Merck 1084180100
D-Mannitol Sigma M4125
Data collection program National Instruments LabVIEW software version 7.1
Dialysis tubing Visking DTV.12000.09 Size No.9
Digital imaging system BioRad ChemiDoc MP
EDTA Sigma EDS E9884
EGTA Sigma E4378
Electrical Pulse Stimulator Digitimer D330 MultiStim System
Glycerol Sigma G7757
HEPES Sigma H7637
IGEPAL CA-630  Sigma I8896
Insulin Novo Nordisk Actrapid, 100 IE/mL
KCl Merck 1049361000
KH2PO4 Merck 104873025
leupeptin Sigma L2884
MgSO4 Merck 1058860500
Muscle Strip Myograph System Danish Myo Technology A/S Model 820MS
Na-Orthovanadate Sigma S6508
Na-Pyrophosphate Sigma 221368
Na-Pyruvate Sigma P2256
NaCl Merck 106041000
NaF Sigma S1504
NaHCO3 VWR 27778260
pACC Ser212 antibody Cell Signaling 3661
pAkt Thr308 antibody Cell Signaling 9275
pAMPK Thr172 antibody Cell Signaling 2531
phenylmethylsulfonylfluoride Sigma P7626
Platinum electrodes Danish Myo Technology A/S 300145
pTBC1D4 Ser588 antibody Cell Signaling 8730
Scintillation counter Perkin Elmer Tri-Carb-2910TR
Scintillation fluid  Perkin Elmer 6013329
Statistical analyses software Systat SigmaPlot version 14
TBC1D4 antibody Abcam ab189890
TissueLyser II  Qiagen 85300
Ultrapure water Merck Milli-Q Reference A+ System
β-glycerophosphate Sigma G9422

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeFronzo, R., Tripathy, D. Skeletal muscle insulin resistance is the primary defect in type 2 diabetes. Diabetes Care. 32, suppl_2 157-163 (2009).
  2. Coyle, E. F., et al. Carbohydrate feeding during prolonged strenuous exercise can delay fatigue. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 55 (1), Pt 1 230-235 (1983).
  3. Kim, J. K. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp to assess insulin sensitivity in vivo. Methods in Molecular Biology. 560, 221-238 (2009).
  4. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
  5. Richter, E. A., Hargreaves, M. Exercise, GLUT4, and skeletal muscle glucose uptake. Physiological Reviews. 93 (3), 993-1017 (2013).
  6. Sanders, C. A., Levinson, G. E., Abelmann, W. H., Freinkel, N. Effect of exercise on the peripheral utilization of glucose in man. The New England Journal of Medicine. 271, 220-225 (1964).
  7. Barrington, S. F., Maisey, M. N. Skeletal muscle uptake of fluorine-18-FDG: effect of oral diazepam. Journal of Nuclear Medicine Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 37 (7), 1127-1129 (1996).
  8. Fentz, J., et al. AMPKα is critical for enhancing skeletal muscle fatty acid utilization during in vivo exercise in mice. FASEB Journal. 29 (5), 1725-1738 (2015).
  9. Maarbjerg, S. J., et al. Genetic impairment of AMPKalpha2 signaling does not reduce muscle glucose uptake during treadmill exercise in mice. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 297 (4), 924-934 (2009).
  10. Stöckli, J., et al. The RabGAP TBC1D1 plays a central role in exercise-regulated glucose metabolism in skeletal muscle. Diabetes. 64 (6), 1914-1922 (2015).
  11. Jørgensen, S. B., et al. Knockout of the alpha2 but not alpha1 5'-AMP-activated protein kinase isoform abolishes 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-beta-4-ribofuranosidebut not contraction-induced glucose uptake in skeletal muscle. The Journal of Biological Chemistry. 279 (2), (2004).
  12. Kjøbsted, R., et al. Prior AICAR stimulation increases insulin sensitivity in mouse skeletal muscle in an AMPK-dependent manner. Diabetes. 64 (6), 2042-2055 (2015).
  13. Lantier, L., et al. AMPK controls exercise endurance, mitochondrial oxidative capacity, and skeletal muscle integrity. FASEB Journal. 28 (7), 3211-3224 (2014).
  14. Cokorinos, E. C., et al. Activation of skeletal muscle AMPK promotes glucose disposal and glucose lowering in non-human primates and mice. Cell Metabolism. 25 (5), 1147-1159 (2017).
  15. Bonen, A., Clark, M. G., Henriksen, E. J. Experimental approaches in muscle metabolism: hindlimb perfusion and isolated muscle incubations. The American Journal of Physiology. 266, 1-16 (1994).
  16. van Breda, E., Keizer, H. A., Glatz, J. F., Geurten, P. Use of the intact mouse skeletal-muscle preparation for metabolic studies. Evaluation of the model. The Biochemical Journal. 267 (1), 257-260 (1990).
  17. Sogaard, P., et al. Effects of fibre type and diffusion distance on mouse skeletal muscle glycogen content in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 107 (6), 1189-1197 (2009).
  18. Lowry, O. H., Passonneau, J. V. Typical fluorometric procedures for metabolite assays. A Flexible System of Enzymatic Analysis. , 68-92 (1972).
  19. Jensen, T. E., et al. Contraction-stimulated glucose transport in muscle is controlled by AMPK and mechanical stress but not sarcoplasmatic reticulum Ca(2+) release. Molecular Metabolism. 3 (7), 742-753 (2014).
  20. Kristensen, J. M., Treebak, J. T., Schjerling, P., Goodyear, L., Wojtaszewski, J. F. P. Two weeks of metformin treatment induces AMPK-dependent enhancement of insulin-stimulated glucose uptake in mouse soleus muscle. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 306 (10), 1099-1109 (2014).
  21. Szekeres, F., et al. The Rab-GTPase-activating protein TBC1D1 regulates skeletal muscle glucose metabolism. AJP: Endocrinology and Metabolism. 303 (4), 524-533 (2012).
  22. Pehmøller, C., et al. Genetic disruption of AMPK signaling abolishes both contraction- and insulin-stimulated TBC1D1 phosphorylation and 14-3-3 binding in mouse skeletal muscle. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297 (3), 665-675 (2009).
  23. Ryder, J. W., Bassel-Duby, R., Olson, E. N., Zierath, J. R. Skeletal muscle reprogramming by activation of calcineurin improves insulin action on metabolic pathways. The Journal of Biological Chemistry. 278 (45), 44298-44304 (2003).
  24. Long, Y. C., Glund, S., Garcia-Roves, P. M., Zierath, J. R. Calcineurin regulates skeletal muscle metabolism via coordinated changes in gene expression. The Journal of Biological Chemistry. 282 (3), 1607-1614 (2007).
  25. Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PloS One. 7 (4), 35273 (2012).
  26. Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. Measurement of maximum isometric force generated by permeabilized skeletal muscle fibers. Journal of Visualized Experiments. (100), e52695 (2015).
  27. Park, K. H., et al. Ex vivo assessment of contractility, fatigability and alternans in isolated skeletal muscles. Journal of Visualized Experiments. (69), e4198 (2012).
  28. Tullson, P. C., Terjung, R. L. Adenine nucleotide metabolism in contracting skeletal muscle. Exercise and Sport Sciences Reviews. 19, 507-537 (1991).
  29. Wojtaszewski, J. F., Jakobsen, A. B., Ploug, T., Richter, E. A. Perfused rat hindlimb is suitable for skeletal muscle glucose transport measurements. The American Journal of Physiology. 274 (1), Pt 1 184-191 (1998).
  30. Hansen, P. A., Gulve, E. A., Holloszy, J. O. Suitability of 2-deoxyglucose for in vitro measurement of glucose transport activity in skeletal muscle. Journal of AppliedPhysiology. 76 (2), 979-985 (1994).
  31. Watson-Wright, W. M., Tan, M. H., Bonen, A. Insulin binding and 2-deoxy-D-glucose uptake in fast- and slow-twitch mouse skeletal muscle at 18 and 37 degrees C. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 62 (12), 1460-1465 (1984).
  32. Hansen, P. A., Marshall, B. A., Chen, M., Holloszy, J. O., Mueckler, M. Transgenic overexpression of hexokinase II in skeletal muscle does not increase glucose disposal in wild-type or Glut1-overexpressing mice. The Journal of Biological Chemistry. 275 (29), (2000).
  33. Virkamäki, A., Rissanen, E., Hämäläinen, S., Utriainen, T., Yki-Järvinen, H. Incorporation of [3-3H]glucose and 2-[1-14C]deoxyglucose into glycogen in heart and skeletal muscle in vivo: implications for the quantitation of tissue glucose uptake. Diabetes. 46 (7), 1106-1110 (1997).
  34. Bhave, G., Neilson, E. G. Body fluid dynamics: back to the future. Journal of the American Society of Nephrology JASN. 22 (12), 2166-2181 (2011).
  35. Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. Metabolism and the circadian clock converge. Physiological Reviews. 93 (1), 107-135 (2013).
  36. Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Molecular Metabolism. 3 (1), 29-41 (2014).
  37. Basse, A. L., et al. Skeletal muscle insulin sensitivity show circadian rhythmicity which is independent of exercise training status. Frontiers in Physiology. 9, 1198 (2018).
  38. Segal, S. S., Faulkner, J. A. Temperature-dependent physiological stability of rat skeletal muscle in vitro. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 248 (3), 265-270 (1985).
  39. Wallberg-Henriksson, H. Glucose transport into skeletal muscle. Influence of contractile activity, insulin, catecholamines and diabetes mellitus. Acta Physiologica Scandinavica. Supplementum. 564, 1-80 (1987).
  40. Alkhateeb, H., Chabowski, A., Bonen, A. Viability of the isolated soleus muscle during long-term incubation. Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. 31 (4), 467-476 (2006).
  41. Cleland, P. J., Rattigan, S., Clark, M. G. Glucose-induced loss of exercise-mediated 3-0-methyl glucose uptake by isolated rat soleus and epitrochlearis muscles. Hormone and Metabolic Research. 22 (2), 121-122 (1990).
  42. Gulve, E. A., Cartee, G. D., Holloszy, J. O. Prolonged incubation of skeletal muscle in vitro: prevention of increases in glucose transport. The American Journal of Physiology. 261 (1), Pt 1 154-160 (1991).
  43. Deshmukh, A. S., et al. Deep proteomics of mouse skeletal muscle enables quantitation of protein isoforms, metabolic pathways, and transcription factors. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 841-853 (2015).
  44. Rudich, A., Klip, A. Push/pull mechanisms of GLUT4 traffic in muscle cells. Acta physiologica Scandinavica. 178 (4), 297-308 (2003).
  45. Kjøbsted, R., et al. Enhanced muscle insulin sensitivity after contraction/exercise is mediated by AMPK. Diabetes. 66 (3), 598-612 (2017).
  46. Kjøbsted, R., et al. TBC1D4 is necessary for enhancing muscle insulin sensitivity in response to AICAR and contraction. Diabetes. 68 (9), 1756-1766 (2019).

Tags

Biologie Nummer 171 skeletspieren glucosetransport glucoseopname insulinegevoeligheid contractie explant ex vivo in vitro incubatie radioactieve glucose tracers 2-deoxy-D-glucose
Meting van insuline- en contractie-gestimuleerde glucoseopname in geïsoleerde en geïncubeerde volwassen skeletspieren van muizen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kjøbsted, R., Kido, K., Larsen, … More

Kjøbsted, R., Kido, K., Larsen, J. K., Jørgensen, N. O., Birk, J. B., Hellsten, Y., Wojtaszewski, J. F. P. Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice. J. Vis. Exp. (171), e61398, doi:10.3791/61398 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter