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Biology

Misurazione dell'assorbimento di glucosio stimolato da insulina e contrazione in muscolo scheletrico maturo isolato e incubato da topi

Published: May 16, 2021 doi: 10.3791/61398
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Section of Molecular Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports, University of Copenhagen, 2Section of Integrative Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports, University of Copenhagen

Summary

La regolazione intatta dell'assorbimento del glucosio muscolare è importante per mantenere l'omeostasi del glucosio in tutto il corpo. Questo protocollo presenta la valutazione dell'assorbimento di glucosio stimolato dall'insulina e dalla contrazione nel muscolo scheletrico maturo isolato e incubato quando delinea l'impatto di vari interventi fisiologici sul metabolismo del glucosio di tutto il corpo.

Abstract

Il muscolo scheletrico è un tessuto insulino-responsivo e in genere assorbe la maggior parte del glucosio che entra nel sangue dopo un pasto. Inoltre, è stato riportato che il muscolo scheletrico può aumentare l'estrazione di glucosio dal sangue fino a 50 volte durante l'esercizio rispetto alle condizioni di riposo. L'aumento dell'assorbimento del glucosio muscolare durante l'esercizio fisico e la stimolazione dell'insulina dipende dalla traslocazione del trasportatore di glucosio 4 (GLUT4) dai compartimenti intracellulari alla membrana della superficie delle cellule muscolari, nonché dalla fosforilazione del glucosio in glucosio-6-fosfato da parte dell'esochinasi II. L'isolamento e l'incubazione di muscoli di topo come m. soleus e m. extensor digitorum longus (EDL) è un modello ex vivo appropriato per studiare gli effetti dell'insulina e della contrazione indotta elettricamente (un modello per l'esercizio) sull'assorbimento del glucosio nel muscolo scheletrico maturo. Pertanto, il modello ex vivo consente la valutazione della sensibilità all'insulina muscolare e consente di abbinare la produzione di forza muscolare durante la contrazione garantendo un reclutamento uniforme delle fibre muscolari durante le misurazioni dell'assorbimento del glucosio muscolare. Inoltre, il modello descritto è adatto per i test farmacologici dei composti che possono avere un impatto sulla sensibilità all'insulina muscolare o possono essere di aiuto quando si cerca di delineare la complessità regolatoria dell'assorbimento del glucosio nel muscolo scheletrico.

Qui descriviamo e forniamo un protocollo dettagliato su come misurare l'assorbimento di glucosio stimolato dall'insulina e dalla contrazione in preparati muscolari isolati e incubati di soleo ed EDL da topi usando radiomarcato [3H]2-deossi-D-glucosio e [14C]mannitolo come marcatore extracellulare. Ciò consente una valutazione accurata dell'assorbimento di glucosio nel muscolo scheletrico maturo in assenza di fattori confondenti che possono interferire nel modello animale intatto. Inoltre, forniamo informazioni sulla vitalità metabolica del muscolo scheletrico del topo incubato suggerendo che il metodo applicato possiede alcuni avvertimenti in determinate condizioni quando si studia il metabolismo energetico muscolare.

Introduction

Il muscolo scheletrico possiede la capacità di estrarre grandi quantità di glucosio dallo spazio extracellulare in risposta all'insulina e all'esercizio fisico. Questo aiuta a mantenere l'omeostasi del glucosio in tutto il corpo e assicura l'approvvigionamento di glucosio durante i periodi di elevata domanda di energia. Poiché la regolazione intatta dell'assorbimento del glucosio nei muscoli scheletrici ha dimostrato di essere importante per la salute generale e le prestazioni fisiche 1,2, le misurazioni dell'assorbimento del glucosio muscolare durante varie condizioni hanno ricevuto molta attenzione. Nell'uomo e negli animali, il morsetto iperinsulinemico-euglicemico è stato utilizzato come tecnica gold standard per valutare la sensibilità all'insulina in vivo 3,4. In contrasto con i risultati ottenuti da un test di tolleranza al glucosio orale, la tecnica del morsetto iperinsulinemico-euglycemic non richiede una funzione gastrointestinale intatta o la secrezione di insulina dal pancreas e consente quindi di confrontare le risposte insuliniche tra soggetti che presentano variazioni nella funzione gastro-intestinale e/o pancreatica. Le misurazioni dell'assorbimento di glucosio muscolare in vivo durante l'esercizio negli esseri umani sono state eseguite frequentemente dal 19605. Prima con l'uso di tecniche di equilibrio artero-venoso6 e successivamente con l'uso della tomografia ad emissione di positroni (PET) in combinazione con un analogo del glucosio che emette positroni, ad esempio 18F-Fluoro-deossi-glucosio7. Nei roditori, l'assorbimento di glucosio muscolare stimolato dall'esercizio in vivo viene tipicamente eseguito mediante l'uso di analoghi del glucosio radioattivi o isotopici stabili 8,9,10.

Un metodo complementare alle misurazioni dell'assorbimento muscolare di glucosio in vivo consiste nell'isolare e incubare piccoli muscoli dai roditori e successivamente misurare l'assorbimento del glucosio utilizzando analoghi del glucosio radioattivi o stabili marcati con isotopi 11,12,13. Questo metodo consente una quantificazione accurata e affidabile dei tassi di assorbimento del glucosio nel muscolo scheletrico maturo e può essere eseguito in presenza di varie concentrazioni di insulina e durante la contrazione suscitata dalla stimolazione elettrica. Ancora più importante, le misurazioni dell'assorbimento di glucosio nel muscolo scheletrico isolato e incubato sono rilevanti quando si studia il fenotipo metabolico muscolare di topi che hanno subito vari interventi (ad esempio nutrizione, attività fisica, infezioni, terapie). Il modello di muscolo scheletrico isolato è anche uno strumento adatto per i test farmacologici dei composti che possono influenzare l'assorbimento del glucosio di per sé e / o modificare la sensibilità all'insulina12,14. In questo modo, l'efficacia dei composti progettati per regolare il metabolismo del glucosio muscolare può essere testata e valutata in un ambiente altamente controllato prima di successivi test in vivo in modelli animali pre-clinici.

In alcune condizioni, la vitalità metabolica può rappresentare una sfida nel sistema modello muscolare scheletrico isolato e incubato. Infatti, la mancanza di un sistema circolatorio nei muscoli incubati comporta che l'erogazione di substrati (ad esempio ossigeno e sostanze nutritive) dipenda completamente dalla semplice diffusione tra le fibre muscolari e l'ambiente circostante. A questo proposito, è importante che i muscoli incubati siano piccoli e sottili e quindi rappresentino meno di una barriera per la diffusione dell'ossigeno durante l'incubazione15. Soprattutto durante le incubazioni prolungate per diverse ore, possono svilupparsi stati ipossici a causa di un insufficiente apporto di ossigeno con conseguente esaurimento dell'energia muscolare15. Sebbene in precedenza siano stati riportati vari marcatori di vitalità metabolica nel muscolo di ratto incubato insieme all'identificazione di importanti variabili che aiutano a mantenere la vitalità muscolare del ratto15, una valutazione completa della vitalità metabolica nei piccoli muscoli di topo incubati è ancora giustificata. Quindi, allo stato attuale, il contenuto di glicogeno è stato utilizzato principalmente come marcatore di vitalità metabolica nel muscolo scheletrico del topo incubato16,17.

Qui descriviamo un protocollo dettagliato per misurare l'assorbimento di glucosio basale, insulino-stimolato e contrazione nel soleo isolato e incubato e nel muscolo EDL dai topi usando il [3H]2-deossi-D-glucosio radiomarcato e [14C]mannitolo come marcatore extracellulare. Nel presente studio, l'assorbimento di glucosio è stato misurato durante un periodo di 10 minuti e il metodo è presentato con l'uso di concentrazioni di insulina submassimili e massimamente efficaci, nonché un singolo protocollo di contrazione. Tuttavia, i protocolli qui descritti possono essere facilmente modificati per quanto riguarda il tempo di incubazione, il dosaggio dell'insulina e il protocollo di stimolazione elettrica. Inoltre, forniamo una caratterizzazione approfondita di vari marcatori di vitalità metabolica nel soleo incubato e nel muscolo di topo EDL. I risultati indicano che l'integrazione di glucosio nel tampone di incubazione è essenziale per preservare la vitalità metabolica del muscolo incubato per 1 ora.

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Protocol

Le procedure che coinvolgono animali da ricerca dovrebbero essere eseguite in conformità con le linee guida pertinenti e la legislazione locale. Tutti gli esperimenti sugli animali utilizzati per questo studio sono conformi alla Convenzione europea per la protezione degli animali vertebrati utilizzati a fini sperimentali e ad altri scopi scientifici e sono stati approvati dall'Ispettorato danese degli esperimenti sugli animali.

1. Preparazione dell'apparato sperimentale e dei circuiti di sutura

NOTA: Per questo studio, utilizzare un sistema miografico a striscia muscolare integrato con ganci di incubazione personalizzati per incubare i muscoli scheletrici isolati del topo (Figura 1). Questo sistema permette al muscolo di fare il bagno in una soluzione fisiologica con ossigenazione continua (95% O2 e 5% CO2) e a temperatura costante. Il bagno del tessuto muscolare è accoppiato ad un trasduttore di forza per la misurazione della produzione di forza muscolare durante la contrazione. Per suscitare e registrare le risposte mio-meccaniche durante la contrazione, utilizzare rispettivamente uno stimolatore di impulsi elettrico e un programma di raccolta dati. Stimolare i muscoli incubati a contrarsi con elettrodi di platino posizionati centralmente e su entrambi i lati del muscolo.

  1. Accendere il sistema miografico e riscaldare le camere a 30 °C. Software di raccolta dati aperto compatibile con il sistema miografico e calibrare i trasduttori di forza per garantire la comparabilità tra i set di dati.
  2. Inizia tagliando fili di ~ 16 cm di sutura chirurgica in nylon non assorbibile. Utilizzare una pinza per creare un anello di circa 0,4 cm di diametro da un singolo filo. Ripeti questa operazione fino a quando non sono stati prodotti abbastanza loop. Ogni muscolo ha bisogno di due anelli: uno per il prossimo e uno per il tendine distale.

2. Preparazione di soluzioni e mezzi di incubazione

  1. Preparazione dei mezzi di incubazione basale
    1. Preparare le seguenti soluzioni madre: cloruro di sodio 2,5 M (NaCl, 250 mL), bicarbonato di sodio 0,5 M (NaHCO3, 250 mL), cloruro di potassio 0,5 M (KCl, 50 mL), cloruro di calcio 0,25 M (CaCl2, 50 mL), 0,25 M fosfato di diidrogeno di potassio (KH2PO4, 50 mL), solfato di magnesio 0,25 M (MgSO4, 50 mL), piruvato di sodio 110 mM (Na-piruvato, 100 mL), 500 mM di D-mannitolo (100 mL), 1 M 2-deossi-D-glucosio (4 mL), soluzione al 15% di albumina sierica bovina (BSA) dializzata contro il tampone Krebs-Ringer-Henseleit (KRH) (descritto di seguito nella fase 4) (100 mL).
      NOTA: sono necessarie due soluzioni per misurare l'assorbimento di glucosio a riposo e stimolato dalla contrazione. Inoltre, ogni singola concentrazione di insulina utilizzata per valutare l'assorbimento di glucosio stimolato dall'insulina richiede due soluzioni. Pertanto, in totale sono necessarie sei diverse soluzioni per misurare l'assorbimento basale, submassimale di insulina, insulina massimale e glucosio stimolato dalla contrazione nel muscolo scheletrico di topo isolato. Di seguito, "mezzi di incubazione basale" si riferisce a mezzi senza insulina o traccianti radioattivi. "Mezzi di incubazione" si riferisce a mezzi contenenti insulina. Per «mezzi di incubazione per assorbimento del glucosio» si intendono i mezzi contenenti 2-deossi-D-glucosio e traccianti radioattivi oltre all'insulina ad una concentrazione identica a quella utilizzata nei «mezzi di incubazione».
    2. Preparare un tampone KRH integrando acqua ultrapura (ddH2O) con NaCl (117 mM), NaHCO3 (24,6 mM), KCl (4,7 mM), CaCl2 (2,5 mM), KH2PO4 (1,2 mM) e MgSO4 (1,2 mM). Successivamente, gasare il tampone KRH con il 95% O2 e il 5% di CO2 per almeno 10 min. Il pH desiderato del tampone KRH deve essere compreso tra 7,35-7,45 a 30 °C. Se la regolazione del pH viene eseguita a temperatura ambiente, il pH del tampone KRH deve essere compreso tra 7,25 e 7,35.
    3. Aggiungere BSA (0,1%), Na-piruvato (2 mM) e D-mannitolo (8 mM) al tampone KRH gassato e regolato a pH per completare il mezzo di incubazione basale. Conservare i mezzi di incubazione basale in un contenitore sigillato per ridurre al minimo la degassificazione di O2 e CO2 e posizionare i mezzi a 30 °C.
      NOTA: Tipicamente, l'osmolarità degli integratori KRH (cioè Na-piruvato, D-mannitolo e D-glucosio) viene mantenuta costante in un intero esperimento per evitare il restringimento o l'espansione delle cellule muscolari. Il protocollo qui descritto utilizza un'osmolarità di 10 mM per gli integratori KRH. Se è necessario un tampone contenente glucosio, sostituire gli integratori krH per soddisfare le esigenze, ad esempio 5 mM di D-glucosio e 5 mM di D-mannitolo.
    4. Per evitare possibili contaminanti associati a BSA nel tampone di incubazione, dializzare BSA contro KRH.
      1. Per realizzare una soluzione madre BSA al 15% dializzata contro il tampone KRH, iniziare sciogliendo 300 g di BSA senza grassi di grado analitico in 900 mL di tampone KRH. Quindi, far bollire il tubo di dialisi in acqua ridistillata fino a quando il tubo è morbido.
      2. Riempire il tubo con la soluzione BSA-KRH e fissare le estremità del tubo. Posizionare il tubo con BSA-KRH in 5 L di tampone KRH e lasciarlo per una notte a 4 °C. Il giorno seguente sostituire il tampone KRH e lasciare il tubo con BSA-KRH nel tampone KRH durante la notte a 4 °C.
      3. Infine, raccogliere la soluzione BSA-KRH dal tubo e aggiungere il tampone KRH a un volume finale di 2 L (cioè soluzione madre BSA-KRH al 15%). Dividere la soluzione madre BSA-KRH al 15% in aliquote e conservare in congelatore a ~-20 °C.
  2. Preparazione di mezzi di incubazione contenenti insulina
    1. Per i mezzi di incubazione contenenti una concentrazione di insulina submutilmente efficace, aggiungere 1 μL di una soluzione madre insulinica da 100 mU/mL per mL di mezzo di incubazione basale (100 μU/mL di insulina).
    2. Per i mezzi di incubazione contenenti una concentrazione massima di insulina efficace, aggiungere 1 μL di una soluzione madre di insulina da 10 U/mL per mL di mezzo di incubazione basale (10 mU/mL di insulina).
  3. Preparazione dei mezzi di incubazione dell'assorbimento del glucosio
    ATTENZIONE: La manipolazione di materiale radioattivo è consentita solo in un'area ristretta e controllata da personale autorizzato e alcune università, istituti di ricerca e aziende potrebbero richiedere l'acquisizione di un "Permesso di uso radioattivo". Il materiale e i rifiuti devono essere gestiti secondo procedure, linee guida e legislazioni locali appropriate.
    1. Seguire la stessa procedura descritta al punto 2.1.2.
    2. Aggiungere BSA (0,1%), Na-piruvato (2 mM), D-mannitolo (7 mM) e 2-deossi-D-glucosio (1 mM) al tampone KRH gassato e regolato a pH.
    3. Aggiungere [3H]2-deossi-D-glucosio (0,028 MBq/mL) e [14C]mannitolo (0,0083 MBq/mL) al tampone KRH integrato per completare il mezzo di incubazione dell'assorbimento del glucosio. Conservare a 30 °C. Se [3H]2-deossi-D-glucosio e [14C]mannitolo sono disciolti in etanolo, rimuovere l'etanolo mediante evaporazione mediata da N2 prima dell'uso.
    4. Per il mezzo di incubazione dell'assorbimento del glucosio contenente una concentrazione di insulina submaximalmente efficace, aggiungere 1 μL di una soluzione madre di insulina da 100 mU/mL per mL di mezzo di incubazione dell'assorbimento del glucosio (100 μU/mL di insulina).
    5. Per il mezzo di incubazione dell'assorbimento del glucosio contenente una concentrazione di insulina massimamente efficace, aggiungere 1 μL di una soluzione madre di insulina da 10 U/mL per mL di mezzo di incubazione dell'assorbimento del glucosio (10 mU/mL di insulina).

3. Animali e dissezione del soleo di topo e del muscolo EDL per l'incubazione

NOTA: le procedure che coinvolgono animali da ricerca devono essere eseguite in conformità con le linee guida pertinenti e la legislazione locale. La procedura descritta può essere utilizzata con topi maschi e femmine allevati internamente o disponibili in commercio di vari ceppi e background genetici. La seguente procedura è prevista per topi femmina C57Bl/6J alimentati. In media, i topi avevano 19 settimane e pesavano 25 g. I topi sono stati mantenuti su un ciclo luce-buio di 12:12 h con libero accesso al chow e all'acqua dei roditori standard. Gli esperimenti sugli animali sono stati avviati alle ~ 9:00 AM ora locale e tutti gli animali sono stati sacrificati entro un periodo di 2 ore.

  1. Aggiungere 4 mL di mezzi di incubazione basali preriscaldati (30 °C) a ciascuna camera di incubazione e assicurarsi che il mezzo di incubazione basale sia continuamente ossigenato con il 95% di O2 e il 5% di CO2.
  2. Anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital (10 mg/100 g di peso corporeo) o altra anestesia disponibile (ad es. tribromoetanolo).
    NOTA: Essere consapevoli del fatto che in alcuni paesi può essere richiesta una licenza per maneggiare pentobarbital e altri farmaci anestetici. Prima che la dissezione muscolare possa essere iniziata, l'anestesia di ciascun animale deve essere indotta correttamente. Per garantire questo, vengono testati i riflessi della coda e delle gambe. Per risultati ottimali la dissezione dovrebbe essere ben praticata per evitare di danneggiare i muscoli durante la rimozione.
  3. Posizionare topi anestetizzati inclini su un vassoio di dissezione (ad esempio coperchio in polistirolo) e appuntare le zampe anteriori e posteriori, se necessario, usando un ago.
  4. Rimuovere la pelle dalla parte inferiore della gamba e assicurarsi che sia il tendine di Achille che l'articolazione del ginocchio siano visibili.
    1. Per la dissezione del muscolo soleo, iniziare attaccando un singolo anello di sutura al tendine di Achille. Fissare una pinza peana al tendine di Achille distalmente dell'ansa di sutura e tagliare per rilasciare i muscoli soleo e gastrocnemio dalla zampa. Far scorrere con attenzione la pinza pean attraverso il mouse esponendo così il muscolo soleo.
    2. Fissare la pinza pean e posizionare un secondo anello di sutura attorno al tendine prossimale del muscolo soleo. Quindi, tagliare il tendine prossimale e sezionare il soleo (compresi i due anelli di sutura attaccati) privo di muscolo gastrocnemio. Posizionare rapidamente il muscolo soleo nella camera di incubazione attaccando ogni anello di sutura ai rispettivi ganci.
  5. Rimuovere la fascia che copre il m. tibialis anteriore (TA) usando una pinza. Se fatto correttamente, i tendini distali dei muscoli TA ed EDL dovrebbero essere chiari bianchi e visibili; e separati l'uno dall'altro.
  6. Tagliare il tendine distale del muscolo TA e sezionare il muscolo per analisi successive (ad es. genotipizzazione). Usando la pinza, libera delicatamente il muscolo EDL dai tessuti circostanti, ma lascia intatto il muscolo e non tagliare i tendini. Posizionare un anello di sutura attorno al tendine distale e un secondo anello di sutura attorno al tendine prossimale dell'EDL.
  7. Quindi, tagliare i tendini rilasciando il muscolo EDL con due anelli di sutura attaccati e posizionare rapidamente il muscolo nella camera di incubazione attaccando ogni anello di sutura ai rispettivi ganci. Per non perdere tensione durante l'incubazione e soprattutto durante la contrazione indotta elettricamente dei muscoli soleo ed EDL, è di grande importanza fissare gli anelli di sutura attorno ai tendini con nodi stretti.
  8. Infine, l'eutanasia dell'animale ad esempio con lussazione cervicale.
  9. Quando i muscoli sono stati sezionati e collocati in camere di incubazione, regolare la tensione di riposo di ciascun muscolo a ~ 5 mN e pre-incubare i muscoli per almeno 10 minuti prima di iniziare il protocollo sperimentale.

4. Assorbimento di glucosio stimolato dall'insulina nel muscolo scheletrico isolato del topo

  1. Seguendo la fase 3.9 sostituire il mezzo di incubazione basale con mezzi di incubazione non contenenti insulina (mezzi di incubazione basale), una concentrazione di insulina efficace sulmidale o una concentrazione di insulina massimamente efficace e lasciare nelle camere di incubazione per 20 minuti. Distanziare ogni camera di incubazione di 1 minuto, creando così il tempo per la successiva raccolta dei muscoli.
  2. Alla fine del periodo di stimolazione di 20 minuti, sostituire il mezzo di incubazione con il mezzo di incubazione dell'assorbimento del glucosio contenente un'identica concentrazione di insulina e lasciare nelle camere di incubazione per 10 minuti, sempre con una distanza di 1 minuto tra ciascuna camera di incubazione.
  3. Dopo 10 minuti di incubazione nel mezzo di incubazione dell'assorbimento del glucosio rimuovere delicatamente i muscoli dalle camere di incubazione e lavarli in mezzi di incubazione basale ghiacciati. Successivamente, asciugare rapidamente i muscoli su carta da filtro prima che i loop di sutura vengano rimossi e i muscoli congelati in azoto liquido. È imperativo che i muscoli incubati vengano raccolti rapidamente se si desidera anche studiare vari metaboliti intracellulari e la segnalazione proteica oltre all'assorbimento del glucosio.
  4. Raccogliere 100 μL del mezzo di incubazione dell'assorbimento del glucosio da ciascuna camera di incubazione e conservarlo a -20 °C. La quantità di radioattività in questi campioni sarà inclusa nel calcolo dell'assorbimento del glucosio muscolare.

5. Assorbimento di glucosio stimolato dalla contrazione nel muscolo scheletrico isolato del topo

NOTA: Per indurre la contrazione del muscolo scheletrico isolato del topo utilizzare il seguente protocollo: 1 treno/15 s, ogni treno lungo 1 s costituito da impulsi di 0,2 ms erogati a 100 Hz. Tuttavia, anche altri protocolli simili che suscitano la contrazione del muscolo scheletrico isolato del topo probabilmente funzioneranno. È importante sottolineare che la tensione deve essere regolata per generare lo sviluppo della forza massima del muscolo incubato, che dipende dalla configurazione sperimentale. Se questo non è garantito, si può rischiare che non tutte le fibre del muscolo si contraggano. A sua volta, ciò può indurre distorsioni nel set di dati.

  1. Seguendo il passaggio 3.9 posizionare gli elettrodi di platino centralmente e su entrambi i lati dei muscoli. Iniziare la contrazione dei muscoli immediatamente dopo aver sostituito il mezzo di incubazione basale con il mezzo di incubazione dell'assorbimento del glucosio. Se possibile, distanziare ogni camera di incubazione di 1 minuto, creando così il tempo per la successiva raccolta dei muscoli. Ricorda di registrare la produzione di forza da ciascun muscolo incubato.
  2. Dopo 10 minuti di contrazione nel mezzo di incubazione dell'assorbimento del glucosio, rimuovere gli elettrodi di platino, raccogliere delicatamente i muscoli dalle camere di incubazione e lavarli in mezzi di incubazione basale ghiacciati. Successivamente, asciugare rapidamente i muscoli su carta da filtro prima che i loop di sutura vengano rimossi e i muscoli congelati in azoto liquido. L'intera procedura di raccolta muscolare deve essere eseguita il più velocemente possibile.
  3. Raccogliere 100 μL del mezzo di incubazione dell'assorbimento del glucosio da ciascuna camera di incubazione e conservarlo a -20 °C. La quantità di radioattività in questi campioni sarà inclusa nel calcolo dell'assorbimento del glucosio muscolare.

6. Omogeneizzazione ed elaborazione del muscolo scheletrico

NOTA: La procedura indicata di seguito per l'omogeneizzazione muscolare consente di determinare sia l'assorbimento del glucosio che la segnalazione miocellulare mediante western blotting nello stesso set di campioni muscolari.

  1. Omogeneizzare ogni muscolo in 400 μL di tampone ghiacciato con pH 7,5 contenente 10% glicerolo, 20 mM sodio-pirofosfato, 1% IGEPAL CA-630 (NP-40), 2 mM fenilmetilsulfonifluoruro (disciolto in isopropanolo), 150 mM NaCl, 50 mM HEPES, 20 mM β-glicerofosfato, 10 mM fluoruro di sodio (NaF), 1 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 1 mM di acido glicoleterdiaminatetraacetico (EGTA), 10 μg/ml di aprotinina, 10 μg/mL di leupeptina, 3 mM di benzamidina e 2mM di sodio-ortovanadato utilizzando perline di acciaio e un listalizzatore (2 x 45 s a 30 Hz). Ruotare tutti gli omogeneizzati end-over-end per 1 ora a 4 °C dopodiché vengono centrifugati a 16.000 x g per 20 min a 4 °C. Raccogliere il lisato (surnatante) che viene utilizzato per determinare l'assorbimento del glucosio muscolare.

7. Determinazione del 2-desossiglucosio e del mannitolo radiomarcati

  1. Aggiungere 150 μL di ciascun lisato muscolare e 25 μL del mezzo di incubazione dell'assorbimento del glucosio da ciascuna camera di incubazione per separare i flaconcini di conteggio a scintillazione liquida contenenti 2 mL di liquido di scintillazione liquida. Inoltre, preparare due flaconcini di controllo ciechi contenenti solo 3 ml di liquido a scintillazione liquida. Chiudere tutti i flaconcini e mescolare accuratamente vorticosamente ogni flaconcino per ~5 s.
  2. Posizionare i flaconcini in un contatore di scintillazione liquida e misurare la radioattività di [3H]2-deossi-D-glucosio e [14C]mannitolo secondo le linee guida del produttore. Registrare DPM (disintegrazioni al minuto) per ogni flaconcino di scintillazione liquida.

8. Calcolo dei tassi di assorbimento del glucosio muscolare

  1. Utilizzare il lisato dal punto 6.1 per misurare la concentrazione totale di proteine in ciascun campione muscolare utilizzando metodi standard di quantificazione delle proteine (ad esempio, acido bicinchoninico o saggi di Bradford). Calcolare la quantità di proteine (mg) aggiunte a ciascun flaconcino di scintillazione.
    NOTA: Il tasso di assorbimento del glucosio per ciascun campione muscolare viene calcolato sottraendo la quantità di [3H]2-deossi-D-glucosio situata nello spazio extracellulare dalla quantità totale di [3H]2-deossi-D-glucosio nel campione muscolare utilizzando [14C]mannitolo come marcatore extracellulare. Si presume che [3H]2-deossi-D-glucosio e [14C]mannitolo mostrino proprietà di diffusione simili all'interno del tessuto muscolare durante l'incubazione. Eseguire i calcoli seguenti:
  2. Inizia sottraendo il DPM [3H] e [14C] dei campioni di controllo cieco da tutti i campioni muscolari e mediali.
  3. Determinare lo spazio extracellulare muscolare in μL (μL-ECS):
    [14C] MuscoloDPM / ([14C]DPMmedia / Mvol)
  4. Calcolare la quantità di [3H]DPM nello spazio extracellulare muscolare ([3H]DPMECS):
    μL-ECS × ([3H]DPMmedia / Mvol)
  5. Calcolare la quantità di [3H]DPM nello spazio intracellulare muscolare ([3H]DPMICS):
    [3ore] MuscoloDPM− [3H]DPMECS
  6. Calcola il tasso di assorbimento del glucosio muscolare (μmol / g di proteine / ora):
    [3ore] DPMICS / ([3H]DPMmedia / Mvol) / [2-deossi-D-glucosio])) / mg di proteine) / Th
    NOTA: per tutte le equazioni di cui sopra,
    [14C] Ilmuscolo DPM è la quantità di radioattività [14C]mannitolo in un campione muscolare;
    [14C] Il supportoDPM è la quantità di radioattività di [14C]mannitolo in un campione di supporto;
    [3ore] Ilmuscolo DPM è la quantità di radioattività [3H]2-deossi-D-glucosio in un campione muscolare;
    [3ore] Il mezzoDPM èla quantità di radioattività [3H]2-deossi-D-glucosio in un campione di media;
    [3ore] DPMECS è la quantità di radioattività [3H]2-deossi-D-glucosio nello spazio extracellulare muscolare;
    [3ore] DPMICS è la quantità di radioattività [3H]2-deossi-D-glucosio nello spazio intracellulare muscolare;
    μL-ECS è lo spazio extracellulare muscolare in μL;
    Mvol è il volume (μL) dei mezzi di incubazione utilizzati per il conteggio della scintillazione (ad esempio '25' come menzionato sopra);
    Th è il fattore temporale utilizzato per calcolare i tassi di assorbimento all'ora (cioè "1/6" quando si incubano i muscoli con mezzi di assorbimento del glucosio per 10 minuti)
  7. Prendi in considerazione questo esempio di calcolo. Il DPM [3H] e [14C] dei campioni di controllo ciechi (rispettivamente 17 e 6) sono stati sottratti dai valori DPM indicati di seguito.
    [14C] MuscoloDPM: 343
    [14C] Supporti DPM: 11846
    [3ore] MuscoloDPM: 4467
    [3ore] Supporti DPM: 39814
    Mvol: 25
    mg di proteine: 0,396 (in 150 μL di lisato proteico muscolare)
    [2-deossi-D-glucosio]: 1 (mM)
    Th: 1/6 (h)
    μL-ECS = 343 DPM / (11846 DPM / 25 μL) = 0,724 μL
    [3ore] DPMECS: 0,724 μL × (39814 DPM / 25 μL) = 1153 DPM
    [3ore] DPMICS: 4467 DPM - 1153 DPM = 3314 DPM
    Assorbimento di glucosio: ((3314 DPM / (39814 DPM / 25 μL) / 1 mmol / L) / 0,396 mg di proteine) / (1/6 ora) = 31,53 μmol / g di proteine / ora

9. Analisi SDS-PAGE e Western Blot

  1. Preparare i lisati muscolari soleus ed EDL in tampone Laemmli e riscaldare per 5 minuti a 96 °C.
  2. Separare quantità uguali di proteine muscolari da SDS-PAGE su gel auto-colati e trasferire le proteine alle membrane di fluoruro di polivinilidene mediante semidry blotting.
  3. Successivamente, incubare membrane in soluzione salina tamponata tris contenente lo 0,05% di latte scremato Tween 20 e il 2% e membrane sonda con anticorpi primari e secondari rilevanti.
  4. Rileva le proteine con chemiluminescenza e visualizzale tramite un sistema di imaging digitale.

10. Glicogeno muscolare, nucleotidi, lattato, creatina e fosfocreatina

  1. Utilizzare l'acido perclorico per estrarre campioni di EDL e muscoli soleus.
  2. Successivamente, neutralizzare i campioni e analizzarli per lattato, creatina e fosfocreatina come precedentemente descritto18.
  3. Analizzare il contenuto di nucleotidi nell'EDL e nel muscolo soleo mediante HPLC in fase inversa dopo l'estrazione in acido perclorico.
  4. Determinare il contenuto di glicogeno muscolare nell'omogeneizzato muscolare intero come unità glicosiliche dopo idrolisi acida con un metodo fluorometrico come descritto in precedenza18.

11. Statistiche

  1. Esegui analisi statistiche con software di analisi statistiche.
  2. Utilizzare un test ANOVA (Double-Way Analysis of Variance) per valutare le differenze statistiche tra i valori presentati nella Tabella 1.
  3. Utilizzare test Student t non accoppiati per valutare le differenze statistiche nell'assorbimento di glucosio tra EDL e soleo all'interno di ciascun gruppo presentato nella Figura 2. Presentare i dati come mezzi ± errore standard della media (SEM). P < 0,05 è considerato statisticamente significativo.

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Representative Results

Come mostrato nella Figura 2, i tassi di assorbimento basale del glucosio erano simili tra soleo isolato e muscolo EDL di topi femmina. Questo è stato anche riportato più volte prima di 12,13,19,20. L'assorbimento di glucosio è aumentato di ~ 0,8 e ~ 0,6 volte raggiungendo 12 e 9 μmol / g di proteine / h nel soleo e nel muscolo EDL, rispettivamente, in risposta a una concentrazione di insulina submaximalmente efficace (100 μU / mL). Questo aumento è stato ancora più elevato (~ 4 e ~ 2 volte raggiungendo 33 e 19 μmol / g di proteine / h nel soleo e nel muscolo EDL, rispettivamente) quando i muscoli sono stati stimolati con una concentrazione di insulina massimamente efficace (10 mU / mL). Inoltre, sia l'assorbimento di glucosio sottomassimale che quello massimo stimolato dall'insulina erano significativamente più alti nel muscolo soleo, indicando che il muscolo soleo presenta una maggiore sensibilità e reattività all'insulina rispetto al muscolo EDL. Ciò può essere correlato alla maggiore espressione del trasportatore di glucosio 4 (GLUT4) e della proteina chinasi B (Akt) del trasduttore di segnalazione dell'insulina nel muscolo soleo rispetto al muscolo EDL 10,21,22,23,24.

L'assorbimento di glucosio indotto dalla contrazione era significativamente più alto nel muscolo EDL rispetto al muscolo soleo (Figura 2), come riportato anche in precedenza13,19. Pertanto, l'assorbimento di glucosio è aumentato di ~ 2 e ~ 2,5 volte raggiungendo 14 e 22 μmol / g di proteine / h nel soleo e nel muscolo EDL, rispettivamente, in risposta alle contrazioni indotte elettricamente. La Figura 3 mostra la massima produzione di forza muscolare nel soleo e nel muscolo EDL durante il periodo di stimolazione di 10 minuti. Come visto e precedentemente riportato19, il muscolo EDL genera più forza (225 mN in EDL contro 150 mN nel soleo) durante la parte iniziale del periodo di stimolazione. D'altra parte, il muscolo EDL mostra un declino più rapido della produzione di forza rispetto al muscolo soleo più tardi nel periodo di stimolazione. Questi risultati sono probabilmente dovuti alla differenza nella distribuzione del tipo di fibra tra il soleo (tipo 1 > tipo 2) e EDL (tipo 2 > tipo 1) muscolo25 come fibre di tipo 2 generano più forza ma affaticamento più veloce rispetto alle fibre di tipo 126,27.

Per valutare l'effetto dell'insulina e della contrazione sulla segnalazione intracellulare nel soleo isolato e nel muscolo EDL, la fosforilazione di Akt Thr308, TBC1 domain family member 4 (TBC1D4) Ser588, AMPKα Thr172 e acetil-CoA carbossilasi (ACC) Ser212 è stata eseguita con la tecnica western blotting (Figura 4). Come previsto, la concentrazione di insulina submaximalmente e massimamente efficace ha indotto un aumento della fosforilazione di Akt Thr308 e TBC1D4 Ser588 mentre la contrazione ha indotto un aumento della fosforilazione di AMPKα Thr172 e ACC Ser212. Né l'insulina né la contrazione hanno portato a una variazione del contenuto proteico totale di Akt2, TBC1D4, AMPKα2 e ACC nel soleo e nel muscolo EDL (Figura 4).

Esaminando vari marcatori di vitalità metabolica del soleo incubato e del muscolo EDL, abbiamo osservato una riduzione complessiva dei livelli di nucleotidi adenosina (ATP, ADP, AMP) (~ 15-25%) e creatina (~ 10-35%) indipendentemente dal fatto che i muscoli siano stati incubati in presenza di piruvato o glucosio rispetto ai muscoli non incubati (Tabella 1 ). D'altra parte, il calo dei livelli di glicogeno osservato nei muscoli soleo ed EDL incubati con piruvato è stato impedito se i muscoli sono stati incubati con glucosio. È interessante notare che abbiamo osservato che i livelli di inosina monofosfato (IMP) sono aumentati di diverse volte, ma solo nel muscolo soleo incubato. I livelli di IMP in genere aumentano nel muscolo durante il grave stress metabolico mentre il muscolo tenta di prevenire l'accumulo di AMP convertendo AMP in IMP al fine di mantenere il rapporto ATP / ADP28. Ciò indica che il muscolo soleo è un po 'più metabolicamente stressato rispetto al muscolo EDL durante l'incubazione. Questa nozione è supportata anche dai risultati di un'elevata fosforilazione di AMPKα Thr172 e ACC Ser212 nel muscolo soleo incubato con piruvato (Figura 5). È importante sottolineare che l'aumento osservato dei livelli di IMP e la fosforilazione di AMPKα Thr172 e ACC Ser212 diminuiscono quando il muscolo soleo viene incubato con glucosio. Quindi, sembra vantaggioso incubare il muscolo scheletrico isolato in un tampone contenente glucosio per ridurre al minimo le fluttuazioni dei nucleotidi di adenosina e prevenire un calo del glicogeno muscolare quando i muscoli vengono incubati per un periodo di tempo prolungato. Per quanto riguarda l'assorbimento del 2-desossiglucosio, abbiamo prove che suggeriscono che l'incubazione dei muscoli per 6-8 ore in presenza di piruvato aumenterà i tassi di assorbimento del glucosio basale / a riposo. L'incubazione dei muscoli in un mezzo contenente glucosio sembra impedire tale aumento dell'assorbimento di glucosio (dati non pubblicati).

Figure 1
Figura 1: Sistema di incubazione. (A) Sistema miografico con quattro camere di incubazione singole. (B) Ganci di incubazione personalizzati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Assorbimento di glucosio nel muscolo scheletrico maturo isolato dai topi. L'assorbimento del 2-desossiglucosio è stato determinato nei muscoli isolati soleus (barre nere) ed EDL (barre grigie) in risposta a una concentrazione di insulina efficace sottomassimalmente (100 μU/mL), una concentrazione di insulina massimamente efficace (10 mU/mL) e contrazioni indotte elettricamente (polso 0,2 ms, 100 Hz, 1 s/15s, 30 V, 10 min). I dati sono stati analizzati dagli studenti t test all'interno di ciascun gruppo. ###p<0.001, ##p<0.01 vs muscolo soleo. I valori sono mezzi ± SEM. n = 4-6 per gruppo. h, ora. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Curve di forza muscolare in risposta a contrazioni indotte elettricamente. La produzione di forza di picco durante la stimolazione elettrica è stata calcolata per il muscolo soleo (punti neri) e EDL (punti grigi). Ogni singolo valore corrisponde ad una media degli ultimi 500 ms di ogni periodo di stimolazione 1-s. I valori sono mezzi ± SEM. n = 5-6 per gruppo. s, secondo. mN, milli-Newton. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Western blots rappresentativi della fosforilazione Akt Thr308, TBC1D4 Ser588, AMPKα Thr172 e ACC Ser212, nonché delle proteine Akt2, TBC1D4, AMPKα2 e ACC. Le analisi Western blot sono state eseguite sui campioni di soleo di topo e di muscolo EDL descritti nella Figura 2. B, basale. S, insulina submaximally efficace. M, insulina massimamente efficace. C, contrazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Western blots rappresentativi della fosforilazione AMPKα Thr172 e ACC Ser212, nonché delle proteine AMPKα2 e ACC. Le analisi Western blot sono state eseguite sui campioni di soleo di topo e di muscolo EDL descritti nella Tabella 1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

non incubato Incubato 1h con piruvato Incubato 1h con glucosio Effetti principali Interazione
Soleo EDL · Soleo EDL · Soleo EDL ·
Lattato 1.00 ± 0.01 1.00 ± 0.02 0.96 ± 0.03 0,98 ± 0,02 1,05 ± 0,01 0.99 ± 0.01 - -
Cr 1,00 ± 0,04 1.00 ± 0.06 0,64 ± 0,07 ### 0,76 ± 0,05 ### 0.76 ± 0.07 ## 0.88 ± 0.09 ## p < 0,001 -
PCr 1.00 ± 0.19 1.00 ± 0.06 0,80 ± 0,12 1,13 ± 0,14 0,65 ± 0,31 0,75 ± 0,08 - -
PCr/(Cr + PCr) 1.00 ± 0.20 1,00 ± 0,07 1,17 ± 0,11 1,25 ± 0,12 0,78 ± 0,36 0,92 ± 0,11 - -
ATP 1,00 ± 0,03 1.00 ± 0.02 0,72 ± 0,03 ###,§§§ 0,99 ± 0,03 * 0,81 ± 0,06 ### 0,85 ± 0,04 ## - p < 0,001
ADP 1,00 ± 0,04 1,00 ± 0,04 0,75 ± 0,05 ### 0,92 ± 0,03 ### 0,84 ± 0,04 ## 0.86 ± 0.03 ## p < 0,001 -
AMP 1,00 ± 0,11 1.00 ± 0.12 0,85 ± 0,15 0,79 ± 0,13 0,84 ± 0,18 0,75 ± 0,13 - -
DIAVOLETTO 1.00 ± 0.17 1.00 ± 0.30 4.43 ± 0.67 ###,§§§ 0,72 ± 0,29 3.33 ± 1.25 ##,§ 1,08 ± 0,01 - p < 0,001
Rapporto AMP/ATP 1.00 ± 0.12 1,00 ± 0,13 1,18 ± 0,22 0,81 ± 0,16 1,06 ± 0,23 0,90 ± 0,19 - -
Glicogeno 1,00 ± 0,08 1.00 ± 0.12 0,74 ± 0,07 (#),* 0,80 ± 0,12 (#),* 1,12 ± 0,10 1,10 ± 0,03 p = 0,035 -
pAMPK Thr172 / AMPKα2 1,00 ± 0,10 1.00 ± 0.12 3.26 ± 0.58 ###,***,§§§ 1,55 ± 0,27 1,68 ± 0,19 # 1.36 ± 0.19 - p = 0,002
pACC Ser212 / ACC 1,00 ± 0,18 1.00 ± 0.12 2.22 ± 0.58 ###,**,§§ 0,96 ± 0,21 0.99 ± 0.15 0,83 ± 0,09 - p = 0,030

Tabella 1: Confronto della vitalità metabolica dei muscoli soleo di topo ed EDL incubati per 1 ora in presenza di 2 mM di piruvato o 5 mM di glucosio. I muscoli non incubati sono stati sezionati da animali anestetizzati e nutriti prima di essere congelati in azoto liquido. I muscoli separati sono stati incubati per 1 ora in tampone KRH integrato con BSA (0,1%), Na-piruvato (2 mM) e D-mannitolo (8 mM) mentre altri sono stati incubati per 1 ora in tampone KRH integrato con BSA (0,1%), D-glucosio (5 mM) e D-mannitolo (5 mM) prima congelati in azoto liquido. I dati sono stati convertiti in unità relative per evidenziare i cambiamenti osservati in vari marcatori di vitalità metabolica. I valori assoluti del soleo di topo non incubato e dei muscoli EDL sono riportati di seguito. Lattato (mmol/kg p.w): 137,53soleo; 139,05EDL. Cr (mmol/kg w.w): 9,35soleus; 8,98EDL. PCr (mmol/kg w.w): 1,50soleus; 5.20EDL. PCr/(PCr+Cr): 13,98soleo; 37.30EDL. ATP (mmol/kg w.w): 3,07soleo; 4.24EDL. ADP (mmol/kg w.w): 0,60soleus; 0,51EDL. AMP (mmol/kg w.w): 0,18soleus; 0,08EDL. IMP (mmol/kg w.w): 0,07soleus; 0,14EDL. Rapporto AMP/ATP: 0,06soleo; 0,02EDL. Glicogeno (proteina pmol/μg): 77.01soleus; 67,56EDL. I dati sono stati analizzati da un ANOVA bidirezionale all'interno di ciascun gruppo. ###p<0.001, ##p<0.01 e #p<0.05 rispetto a quelli non incubati. p<0.001, **p<0.01 e *p<0.05 vs incubato 1 ora con glucosio. §§§p<0.001, §§p<0.01 e §p<0.05 vs EDL. I valori sono mezzi ± SEM. n = 12 nel gruppo non incubato, n = 4-6 nei gruppi incubati. Cr, Creatina; PCr, Fosfocreatina; w.w, peso bagnato; h, ora.

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Discussion

La regolazione intatta dell'assorbimento del glucosio nel muscolo scheletrico è importante per preservare la salute generale1. Pertanto, l'indagine sull'assorbimento del glucosio muscolare spesso funge da lettura primaria quando si valutano vari interventi che alterano la salute. Qui descriviamo un metodo ex vivo per misurare l'assorbimento di glucosio nel soleo isolato e incubato e nel muscolo EDL dai topi in risposta all'insulina e alle contrazioni indotte elettricamente. Il metodo è rapido e affidabile e consente un controllo preciso dell'ambiente circostante del muscolo incubato che consente indagini accurate sui tassi di assorbimento del glucosio muscolare isolati dall'influenza potenzialmente confondente di ormoni e substrati che si possono trovare nel sangue. Il metodo è stato utilizzato per diversi anni in molti studi ed è ampiamente adottato dalla comunità di ricerca muscolare.

Il modello di incubazione ex vivo è stato generalmente considerato un metodo per valutare la capacità di trasporto del glucosio piuttosto che l'assorbimento del glucosio nel muscolo scheletrico. La capacità di trasporto del glucosio nel muscolo incubato può essere determinata misurando il D-glucosio accumulato per un periodo di tempo. Tuttavia, questo pone un problema in quanto il D-glucosio viene rapidamente metabolizzato nella cellula muscolare dopo l'assorbimento. Per aggirare questo problema, l'analogo del glucosio 3-O-metil-D-glucosio (3-MG) è stato ampiamente utilizzato per valutare la capacità di trasporto del glucosio, poiché il 3-MG non viene ulteriormente metabolizzato all'interno della cellula dopo essere stato trasportato attraverso la membrana superficiale cellulare. Pertanto, il tasso iniziale di 3-MG accumulato intracellulare funge da indice della capacità di trasporto del glucosio cellulare di per sé perché non è influenzato da altri passaggi nelle vie metaboliche del glucosio. Tuttavia, l'uso di 3-MG può costituire un problema in quanto il 3-MG si accumula riducendo così il gradiente transmembrana per 3-MG e successivamente riducendo ulteriormente l'assorbimento. Pertanto, per ottenere una misura della capacità di trasporto della membrana, è necessario stimare il tasso iniziale di assorbimento di 3-MG. In particolare quando la capacità di trasporto è elevata questo può rappresentare un problema a causa dell'efflusso di 3-MG dal muscolo29,30. Il potenziale problema con l'efflusso di 3 MG può essere evitato utilizzando 2-deossi-D-glucosio (2-DG). Dopo il trasporto nel muscolo scheletrico, il 2-DG viene fosforilato dall'esochinasi II al 2-deossi-D-glucosio-6-fosfato (2-DG-6P). Poiché il muscolo scheletrico manca di glucosio-6-fosfatasi e GLUT4 non può trasportare 2-DG fosforilato, 2-DG-6P sarà intrappolato all'interno della cellula muscolare. A differenza del glucosio-6-fosfato, il 2-DG-6P è un inibitore allosterico molto debole dell'esochinasi II30 che aiuta a mantenere il gradiente transmembrana per la 2-DG. Pertanto, le osservazioni hanno dimostrato che l'assorbimento di 2-DG nel muscolo incubato (ratto) rimane lineare fino a quando la concentrazione intracellulare di 2-DG-6P supera i 30 mM, una concentrazione che abbassa l'attività dell'esochinasi II30. Inoltre, nel muscolo scheletrico di topo incubato l'assorbimento di 2-DG rimane lineare per ~ 30 minuti quando le temperature dei tamponi di incubazione sono 37 ° C o meno31. Ciò suggerisce che il 2-DG può essere utilizzato per misurare la capacità di trasporto del glucosio piuttosto che l'assorbimento del glucosio nel muscolo incubato, ad eccezione delle situazioni in cui le concentrazioni di 2-DG-6P diventano molto elevate (ad esempio osservate durante le incubazioni >2 ore con 1 mM 2-DG e una concentrazione massima di insulina29,30). L'idea che l'assorbimento di 2-DG rifletta probabilmente la capacità di trasporto del glucosio è supportata anche da risultati che dimostrano che l'assorbimento massimo di 2-DG stimolato dall'insulina è simile nel muscolo incubato di topi e topi wild-type che sovraesprimono l'esochinasi II32. Una potenziale preoccupazione quando si utilizza 2-DG per le misurazioni del trasporto muscolare del glucosio durante la contrazione è un aumento della concentrazione intracellulare di glucosio-6-fosfato a causa di un elevato tasso di glicogenolisi. Tuttavia, poiché un aumento lineare dell'assorbimento del muscolo (di ratto) 2-DG è osservato durante la contrazione nel tempo29, ciò indica che l'accumulo di glucosio-6-fosfato dalla rottura del glicogeno durante la contrazione non interferisce con l'attività dell'esochinasi II e quindi con i tassi di assorbimento di 2-DG. Sulla base di questo, 2-DG sembra adatto per le misurazioni del trasporto del glucosio nel muscolo scheletrico isolato durante l'insulina e la contrazione considerando i limiti di 3-MG.

Sebbene si assuma generalmente che il 2-DG non sia ulteriormente metabolizzato dopo la fosforilazione da parte dell'esochinasi II, è stato riportato che alcuni 2-DG sono diretti e incorporati nel glicogeno muscolare. Pertanto, durante un morsetto iperinsulinemico normoglicemico di 2 ore nei ratti ~ 30% del 2-DG assorbito dal muscolo scheletrico è incorporato nel glicogeno33. Pertanto, si potrebbe ragionare sul fatto che i tassi di assorbimento di 2-DG stimolati dall'insulina nel muscolo scheletrico incubato sono sottostimati se l'accumulo di 2-DG nel glicogeno viene trascurato. Abbiamo determinato che il protocollo qui descritto su come preparare i lisati muscolari (surnatante) per le successive analisi dei tassi di assorbimento 2-DG nel muscolo scheletrico incubato precedentemente non è influenzato dalla potenziale incorporazione di 2-DG nel glicogeno. Si potrebbe sostenere che il glicogeno si accumula nel pellet durante la centrifugazione dell'omogeneizzato del muscolo intero per generare lisato per le misurazioni dell'assorbimento di 2-DG. Tuttavia, quando si confrontano i livelli di radioattività nell'omogeneizzato muscolare intero stimolato dall'insulina rispetto al lisato, non rileviamo alcuna differenza significativa (dati non pubblicati). Ciò suggerisce che l'incubazione del muscolo di topo per 10 minuti in 1 mM di 2-DG non causa un accumulo rilevabile di 2-DG nel glicogeno.

La determinazione dell'assorbimento del muscolo scheletrico 2-DG senza considerare che il 2-DG è distribuito sia nello spazio extra- che intracellulare porterà ad una sovrastima dell'assorbimento di 2-DG. Per aggirare questo, il glucosio L dovrebbe essere usato come marcatore extracellulare in quanto questo non viene trasportato attraverso la membrana cellulare, ma altrimenti presenta proprietà simili a quelle del D-glucosio tra cui massa, solubilità, diffusione passiva, legame, ecc. A causa dei costi eccessivi di produzione e quindi dell'acquisto di L-glucosio, il mannitolo è tipicamente usato come marcatore extracellulare poiché il mannitolo non viene assorbito dalla cellula muscolare, è relativamente economico e si stima che abbia un volume di distribuzione extracellulare in qualche modo simile a quello del glucosio e del 2-DG34.

Gli orologi cellulari e molecolari intrinseci sembrano svolgere un ruolo essenziale per la regolazione del metabolismo di tutto il corpo e l'omeostasi energetica35. È stato osservato che il knockout muscolo-specifico del gene dell'orologio centrale Bmal1 compromette l'assorbimento di glucosio stimolato dall'insulina nel muscolo scheletrico isolato del topo36. Inoltre, l'assorbimento submassimale di glucosio stimolato dall'insulina del muscolo scheletrico isolato mostra un ritmo circadiano con la risposta insulinica più bassa e più alta nel mezzo della fase di luce e oscura, rispettivamente37. Sulla base di questi risultati, è quindi importante incorporare il tempo del sacrificio animale nel disegno sperimentale per aumentare la riproducibilità dei dati.

Uno dei principali svantaggi del metodo ex vivo è la mancanza di flusso capillare nel muscolo isolato. Ciò significa che la consegna e la rimozione di vari substrati dipendono completamente dalla semplice diffusione tra le fibre muscolari e l'ambiente circostante. Di conseguenza, la validazione della vitalità metabolica del muscolo isolato incubato ex vivo è stata focalizzata sulle limitazioni di diffusione dell'ossigeno alle fibre muscolari superficiali e profonde. Pertanto, il muscolo incubato, in particolare il muscolo di topo altamente metabolico, tende a sviluppare nuclei ipossici in cui si verifica la rottura del glicogeno 16,17,38. In una revisione dettagliata di Bonen e colleghi15, è stato suggerito che i nuclei ipossici del muscolo incubato probabilmente si sviluppano quando si incuba un muscolo troppo spesso per essere adeguatamente ossigenato, specialmente quando si incuba a temperature di ≥ 37 ° C. Ciò ha portato alla raccomandazione che solo i muscoli sottili e cilindrici del topo, come il soleo e l'EDL, dovrebbero essere utilizzati per le incubazioni a 25-30 ° C per evitare lo sviluppo di nuclei ipossici. Ciò indica che lo spessore e la geometria piuttosto che la massa sono fattori importanti da considerare quando si incubano i muscoli scheletrici del topo. Inoltre, è stato raccomandato di misurare e segnalare regolarmente la temperatura di incubazione, lo spessore muscolare, l'ATP, la fosfocreatina e il contenuto di glicogeno e/o il rilascio di lattato per valutare la vitalità del muscolo incubato15. Per quanto ne sappiamo, tali analisi complete del muscolo incubato sono state riportate principalmente per il muscolo di ratto 39,40,41,42 e solo in misura limitata riportate per il muscolo di topo16,17. Per aumentare la comprensione di vari marcatori metabolici di vitalità nel muscolo scheletrico del topo incubato, abbiamo valutato possibili cambiamenti nel contenuto intracellulare di lattato, creatina, fosfocreatina, nucleotidi di adenosina, glicogeno e segnalazione AMPK nel soleo e nel muscolo EDL dopo 1 ora di incubazione nel tampone KRH integrato con glucosio o piruvato. Simile ai risultati precedenti nel soleo di topo incubato e nel muscolo EDL17, abbiamo osservato che i livelli di glicogeno diminuivano quando i muscoli venivano incubati in mezzi privi di glucosio. Ciò indica che l'assenza di glucosio durante l'incubazione promuove la degradazione del glicogeno e il successivo ingresso di glucosio-6-fosfato nella glicolisi che può agire per garantire la produzione di ATP in particolare se l'apporto di ossigeno è inadeguato. Inoltre, abbiamo riscontrato una riduzione complessiva dei pool di nucleotidi ATP e ADP nel soleo incubato e nel muscolo EDL. Ciò può implicare che l'apporto di ossigeno non è del tutto sufficiente a soddisfare la domanda di muscolo di topo incubato sia in presenza che in assenza di glucosio. Poiché il muscolo soleo ossidativo si basa maggiormente sull'ossigeno per la produzione di ATP rispetto al muscolo EDL glicolitico, ciò suggerirebbe che il muscolo soleo è influenzato in misura maggiore dalla procedura di incubazione. In accordo, abbiamo scoperto che i livelli intracellulari di IMP e segnalazione AMPK erano marcatamente aumentati nel soleo rispetto al muscolo EDL quando incubati in assenza di glucosio. Ciò significa che il muscolo soleo presenta un grado più elevato di stress metabolico durante l'incubazione, che deve essere preso in considerazione quando si valutano i dati del modello muscolare murino ex vivo.

Le cellule muscolari coltivate, tra cui L6 e C2C12 immortalizzati, nonché i miotubi umani primari, sono comunemente usati come surrogato del muscolo scheletrico maturo per studiare gli effetti di varie manipolazioni genetiche e farmacologiche sull'assorbimento del glucosio muscolare stimolato dall'insulina. Tuttavia, in diversi modi le cellule muscolari coltivate non assomigliano al muscolo scheletrico maturo e quando si confrontano i due sistemi modello diventano evidenti numerose differenze. Questi includono differenze nell'espressione proteica, nella struttura dimensionale, nell'ambiente circostante, nello stato di proliferazione e differenziazione, nella composizione del tipo di fibra, nei processi metabolici e nelle proprietà funzionali43 , che possono influenzare il modo in cui la cellula muscolare regola l'assorbimento del glucosio in risposta a vari stimoli. Tipicamente, maggiori effetti relativi dell'insulina sui tassi di assorbimento del glucosio sono osservati nel muscolo scheletrico maturo rispetto alle cellule muscolari in coltura44 , il che può indicare che le cellule muscolari in coltura in una certa misura mancano del meccanismo responsabile della regolazione dei tassi di assorbimento del glucosio, incluso un alto livello di espressione del trasportatore di glucosio insulino-sensibile GLUT443 . Considerando i limiti e gli avvertimenti associati all'uso di cellule muscolari in coltura e muscolo scheletrico isolato, è quindi probabile che sia vantaggioso adottare un approccio combinato quando si studiano vari processi metabolici muscolari come l'assorbimento del glucosio.

I muscoli soleo ed EDL sono in genere considerati rappresentativi dei muscoli a contrazione lenta e veloce, rispettivamente. Pertanto, questi tipi di muscoli sono ideali per studi meccanici che cercano di indagare interventi che influenzano la forza muscolare e lo sviluppo della fatica. Inoltre, il muscolo soleo è in genere segnalato per avere una maggiore sensibilità e reattività all'insulina rispetto al muscolo EDL e, quindi, gli interventi che mirano alla sensibilità all'insulina muscolare possono influenzare il soleo e l'EDL in modo diverso. Inoltre, la distribuzione relativa dei diversi complessi AMPK differisce tra il soleo e il muscolo EDL che sembra influenzare la capacità dei composti attivanti AMPK di aumentare l'assorbimento del glucosio muscolare. Pertanto, la più grande intuizione sulla regolazione dell'assorbimento del glucosio muscolare è probabilmente raggiunta se sia il soleo che i muscoli EDL vengono utilizzati durante la sperimentazione con il modello di incubazione ex vivo.

Il metodo qui descritto mette in relazione l'assorbimento del glucosio con la quantità di abbondanza totale di proteine determinata in ciascun campione muscolare dopo l'omogeneizzazione. È nostra esperienza che la variazione diminuisce quando si correla l'assorbimento di glucosio per quantità di proteine muscolari anziché il peso muscolare (dati non pubblicati). Inoltre, l'omogeneizzazione di campioni muscolari in un tampone utilizzato per vari saggi biochimici consente di determinare sia l'assorbimento del glucosio, la segnalazione miocellulare e le attività enzimatiche nella stessa preparazione del campione45,46. Questo spesso diminuirà la quantità di topi utilizzati per uno studio. Tuttavia, l'assorbimento di glucosio può essere facilmente determinato in campioni di muscolo scheletrico che vengono disciolti dal riscaldamento in idrossido di sodio (NaOH) seguito da neutralizzazione con acido cloridrico20. Poiché il trattamento del muscolo con NaOH interferisce con le misurazioni della concentrazione totale di proteine muscolari, il trasporto di glucosio misurato con questa procedura deve essere correlato al peso muscolare.

Sulla base di varie ottimizzazioni, il nostro tampone di incubazione dell'assorbimento del glucosio contiene un'attività specifica di 0,028 MBq/ mL di [3H]2-deossi-D-glucosio e 0,0083 MBq/mL di [14C]Mannitolo. Da un lato, questo riduce la quantità di lisato (150 su 400 μL) necessaria per ottenere misurazioni di radioattività sufficienti e affidabili. D'altra parte, aumenta la quantità di radioattivo [3H]2-deossi-D-glucosio e [14C]mannitolo necessario per ogni esperimento, il che aumenta i costi sperimentali. Pertanto, per qualsiasi configurazione sperimentale è possibile regolare la quantità di radioattività utilizzata nel mezzo di incubazione dell'assorbimento del glucosio per soddisfare requisiti specifici. Tuttavia, bisogna fare attenzione a non diminuire la quantità di radioattività nel tampone di incubazione in misura tale da rendere inaffidabili le misurazioni della radioattività. Ciò è garantito mantenendo la radioattività nei campioni superiore ai limiti di rilevamento specificati del meccanismo di conteggio a scintillazione liquida utilizzato.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Danish Council for Independent Research - Medical Sciences (FSS8020-00288B) e della Novo Nordisk Foundation (NNF160C0023046). Questo lavoro è stato anche supportato da una borsa di ricerca a Rasmus Kjøbsted della Danish Diabetes Academy, che è finanziata dalla Novo Nordisk Foundation, numero di sovvenzione NNF17SA0031406. Gli autori desiderano ringraziare Karina Olsen, Betina Bolmgren e Irene Bech Nielsen (Dipartimento di Nutrizione, Esercizio e Sport, Facoltà di Scienze, Università di Copenaghen) per la loro assistenza tecnica qualificata.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[14C]D-mannitol American Radiolabeled Chemicals, Inc. ARC 0127
[3H]2-deoxy-D-glucose  American Radiolabeled Chemicals, Inc. ART 0103A
2-Deoxy-D-glucose Sigma D8375
4-0 USP non-sterile surgical nylon suture Harvard Apparatus 51-7698
Streptavidin/HRP (Conjugate) DAKO P0397 Used to detect ACC protein
Akt2 antibody Cell Signaling 3063
AMPKα2 antibody Santa Cruz SC-19131
aprotinin Sigma A1153
benzamidine Sigma B6505
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7030
CaCl2 Merck 1020831000
Calibration kit (force) Danish Myo Technology A/S 300041
Chemiluminescence Millipore WBLUF0500
D-Glucose Merck 1084180100
D-Mannitol Sigma M4125
Data collection program National Instruments LabVIEW software version 7.1
Dialysis tubing Visking DTV.12000.09 Size No.9
Digital imaging system BioRad ChemiDoc MP
EDTA Sigma EDS E9884
EGTA Sigma E4378
Electrical Pulse Stimulator Digitimer D330 MultiStim System
Glycerol Sigma G7757
HEPES Sigma H7637
IGEPAL CA-630  Sigma I8896
Insulin Novo Nordisk Actrapid, 100 IE/mL
KCl Merck 1049361000
KH2PO4 Merck 104873025
leupeptin Sigma L2884
MgSO4 Merck 1058860500
Muscle Strip Myograph System Danish Myo Technology A/S Model 820MS
Na-Orthovanadate Sigma S6508
Na-Pyrophosphate Sigma 221368
Na-Pyruvate Sigma P2256
NaCl Merck 106041000
NaF Sigma S1504
NaHCO3 VWR 27778260
pACC Ser212 antibody Cell Signaling 3661
pAkt Thr308 antibody Cell Signaling 9275
pAMPK Thr172 antibody Cell Signaling 2531
phenylmethylsulfonylfluoride Sigma P7626
Platinum electrodes Danish Myo Technology A/S 300145
pTBC1D4 Ser588 antibody Cell Signaling 8730
Scintillation counter Perkin Elmer Tri-Carb-2910TR
Scintillation fluid  Perkin Elmer 6013329
Statistical analyses software Systat SigmaPlot version 14
TBC1D4 antibody Abcam ab189890
TissueLyser II  Qiagen 85300
Ultrapure water Merck Milli-Q Reference A+ System
β-glycerophosphate Sigma G9422

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Biologia Numero 171 muscolo scheletrico trasporto del glucosio assorbimento del glucosio sensibilità all'insulina contrazione espianto ex vivo in vitro incubazione traccianti radioattivi del glucosio 2-deossi-D-glucosio
Misurazione dell'assorbimento di glucosio stimolato da insulina e contrazione in muscolo scheletrico maturo isolato e incubato da topi
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Kjøbsted, R., Kido, K., Larsen, … More

Kjøbsted, R., Kido, K., Larsen, J. K., Jørgensen, N. O., Birk, J. B., Hellsten, Y., Wojtaszewski, J. F. P. Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice. J. Vis. Exp. (171), e61398, doi:10.3791/61398 (2021).

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