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Bioengineering

Temperaturgesteuerte Montage und Charakterisierung eines Droplet Interface Bilayers

Published: April 19, 2021 doi: 10.3791/62362
Automatic Translation
1, 1
1Department of Mechanical, Aerospace and Biomedical Engineering, University of Tennessee

Summary

Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz eines temperaturgesteuerten Wärmesystems zur Förderung der Lipid-Monolayer-Montage und der Tröpfchen-Schnittstellen-Bilayerbildung für Lipide mit erhöhten Schmelztemperaturen und Kapazitätsmessungen zur Charakterisierung temperaturgetriebener Veränderungen in der Membran.

Abstract

Die Droplet Interface Bilayer (DIB)-Methode zur Montage von Lipid-Doppelschichten (d.h. DIBs) zwischen lipidbeschichteten wässrigen Tröpfchen in Öl bietet im Vergleich zu anderen Methoden wichtige Vorteile: DIBs sind stabil und oft langlebig, bilayerBereich kann reversibel abgestimmt werden, Prospektasymmetrie wird leicht über Tröpfchenzusammensetzungen gesteuert und gewebeähnliche Netzwerke von Doppeltöten können durch angrenzende. Die Bildung von DIBs erfordert eine spontane Montage von Lipiden in hochdichte Lipidmonolayer an den Oberflächen der Tröpfchen. Während dies bei gemeinsamen synthetischen Lipiden leicht bei Raumtemperatur vorkommt, bildet sich bei Lipiden mit Schmelzpunkten oberhalb der Raumtemperatur, einschließlich einiger zellulärer Lipidextrakte, keine ausreichende Monoschicht oder stabile Doppelschicht. Dieses Verhalten hat wahrscheinlich die Zusammensetzungen – und vielleicht die biologische Relevanz – von DIBs in Modellmembranstudien eingeschränkt. Um dieses Problem anzugehen, wird ein experimentelles Protokoll vorgelegt, um das Ölreservoir, das DIB-Tröpfchen beherbergt, sorgfältig zu erwärmen und die Auswirkungen der Temperatur auf die Lipidmembran zu charakterisieren. Insbesondere zeigt dieses Protokoll, wie eine thermisch leitfähige Aluminiumhalterung und resistive Heizelemente, die durch eine Rückkopplungsschleife gesteuert werden, verwendet werden, um erhöhte Temperaturen vorzuschreiben, was die Monolayer-Montage und Diebesbildung für einen breiteren Satz von Lipidtypen verbessert. Die strukturellen Eigenschaften der Membran sowie die thermotropen Phasenübergänge der Lipide, die die Bilayer umfassen, werden durch Messung der Veränderungen der elektrischen Kapazität des DIB quantifiziert. Zusammen kann dieses Verfahren bei der Bewertung biophysikalischer Phänomene in Modellmembranen über verschiedene Temperaturen helfen, einschließlich der Bestimmung einer effektiven Schmelztemperatur (TM) für Mehrkomponenten-Lipidmischungen. Diese Fähigkeit wird somit eine engere Replikation natürlicher Phasenübergänge in Modellmembranen ermöglichen und die Bildung und Verwendung von Modellmembranen aus einem größeren Spektrum von Membranbestandteilen fördern, einschließlich derjenigen, die die Heterogenität ihrer zellulären Gegenstücke besser erfassen.

Introduction

Zellmembranen sind selektiv durchlässige Barrieren, die aus Tausenden von Lipidtypen1,Proteinen, Kohlenhydraten und Sterolen bestehen, die alle lebenden Zellen verkapseln und unterteilen. Zu verstehen, wie ihre Zusammensetzungen ihre Funktionen beeinflussen, und zu zeigen, wie natürliche und synthetische Moleküle mit Zellmembranen interagieren, anhaften, stören und translozieren, sind daher wichtige Forschungsbereiche mit weitreichenden Implikationen in Biologie, Medizin, Chemie, Physik und Materialtechnik.

Diese Entdeckungsziele profitieren direkt von bewährten Techniken zur Montage, Manipulation und Untersuchung von Modellmembranen – einschließlich Lipid-Doppelschichten, die aus synthetischen oder natürlich vorkommenden Lipiden zusammengesetzt sind –, die die Zusammensetzung, Struktur und Transporteigenschaften ihrer zellulären Gegenstücke imitieren. In den letzten Jahren hat die Droplet-Schnittstelle Bilayer (DIB) Methode2,3,4 für den Bau einer planaren Lipid-Bilayer zwischen lipidbeschichteten Wassertröpfchen in Öl hat erhebliche Aufmerksamkeit erhalten5,6,7,8,9, 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23, und hat praktische Vorteile gegenüber anderen Ansätzen für die Modellmembranbildung gezeigt: die DIB-Methode ist einfach durchzuführen, erfordert keine ausgeklügelte Herstellung oder Zubereitung (z. B. "Lackierung") eines Substrats zur Unterstützung der Membran, liefert durchgängig Membranen mit überlegenen Langlebigkeit, ermöglicht Standard-Elektrophysiologie-Messungen und vereinfacht die Bildung von Modellmembranen mit asymmetrischen Packungsbeilage-Zusammensetzungen3. Da sich die Bilayer spontan zwischen Tröpfchen und jedem Tröpfchen in Position und Make-up maßgeschneidert werden können, Die DIB-Technik hat auch großes Interesse an der Entwicklung von zellinspirierten Materialsystemen geweckt, die auf der Verwendung von Reizen-responsiven Membranen18,24,25,26,27,28,29, ausgewogene Abschottung und Transport14,30,31, und gewebeähnliche Materialien17,23,32,33,34,35,36.

Die meisten veröffentlichten Experimente an Modellmembranen, einschließlich der er mit DIBs, wurden bei Raumtemperatur (RT, 20-25 °C) und mit einer Handvoll synthetischer Lipide (z. B. DOPC, DPhPC usw.) durchgeführt. Diese Praxis begrenzt den Umfang biophysikalischer Fragen, die in Modellmembranen untersucht werden können, und kann, basierend auf Beobachtung, auch die Arten von Lipiden einschränken, die zur Montage von DIBs verwendet werden können. Beispielsweise montiert ein synthetisches Lipid wie DPPC, das eine Schmelztemperatur von 42 °C hat, keine eng gepackten Monolayer oder bildet DIBs bei RT37. Die DIB-Bildung bei Raumtemperatur hat sich auch für natürliche Extrakte als schwierig erwiesen, z. B. von Säugetieren (z. B. Gehirn-Gesamtfettextrakt, BTLE)38 oder Bakterien (z.B. Escherichia coli Total LipidExtrakt, ETLE)37, die viele verschiedene Arten von Lipiden enthalten und von Zellen stammen, die bei erhöhten Temperaturen (37 °C) leben. Die Ermöglichung des Studiums unterschiedlicher Zusammensetzungen bietet somit die Möglichkeit, membranvermittelte Prozesse unter biologisch relevanten Bedingungen zu verstehen.

Die Erhöhung der Temperatur des Öls kann zwei Zwecken dienen: Es erhöht die Kinetik der Monolayer-Montage und es kann dazu führen, dass Lipide einen Schmelzübergang durchlaufen, um eine flüssige ungeordnete Phase zu erreichen. Beide Folgen helfen in der Monolayer-Baugruppe39, eine Voraussetzung für ein DIB. Neben der Erwärmung für die Bilayer-Bildung kann die Kühlung der Membran nach der Bildung verwendet werden, um thermotrope Übergänge in einzelnen Lipid-Doppelschichten38zu identifizieren, einschließlich derjenigen in natürlichen Lipidmischungen (z. B. BTLE), die mit Kalorimetrie schwer zu erkennen sind. Neben der Beurteilung thermotroper Lipidübergänge kann die Temperatur des DIB genau variieren, um temperaturinduzierte Veränderungen der Membranstruktur38 zu untersuchen und zu untersuchen, wie Lipidzusammensetzung und Fließfähigkeit die Kinetik membranaktiver Arten (z. B. porenbildende Peptide und Transmembranproteine37) beeinflussen, einschließlich Säugetier- und Bakterienmodellmembranen bei einer physiologisch relevanten Temperatur (37 °C).

Hierin wird eine Beschreibung der Montage eines modifizierten DIB-Ölbehälters und des Betriebs eines Rückkopplungs-Temperaturreglers erläutert, um die Monolayer-Montage und Bilayer-Bildung bei Temperaturen über RT zu ermöglichen. Von einem früheren Protokoll40unterscheidet, sind explizite Details über die Integration von Instrumenten enthalten, die für die Messung und Regelung der Temperatur parallel zur Montage und Charakterisierung des DIB im Ölreservoir erforderlich sind. Das Verfahren wird es dem Anwender somit ermöglichen, diese Methode zur Bildung und Untersuchung von DIBs über einen Temperaturbereich in einer Vielzahl von wissenschaftlichen Kontexten anzuwenden. Darüber hinaus liefern die repräsentativen Ergebnisse spezifische Beispiele für die Arten messbarer Veränderungen sowohl in der Membranstruktur als auch im Ionentransport, die bei unterschiedlicher Temperatur auftreten können. Diese Techniken sind wichtige Ergänzungen zu den vielen biophysikalischen Studien, die effektiv in DIBs entworfen und durchgeführt werden können, einschließlich der Untersuchung der Kinetik membranaktiver Arten in verschiedenen Membranzusammensetzungen.

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Protocol

1. Beheizte Vorrichtungsvorbereitung

  1. Sammeln Sie 2 Stück von 1 mm dicken isolierenden Gummi auf 25 mm x 40 mm in der Breite und Länge getrimmt, 2 Stück eines 6 mm dicken Gummis, die auch 25 mm x 40 mm sind, eine vorbereitete Aluminium-Basisbefestigung und ein Acrylölreservoir, das in das Sichtfenster der Aluminium-Basishalterung passt (siehe Abbildungen S1, S2 und S3 für Details zur Fertigung und eine explosionsartige Ansicht der Montage). Bereiten Sie die Aluminiumhalterung zuerst vor, indem Sie an der Unterseite der Leuchte ein Glasabdeckungssichtfenster mit UV-härtebarem Klebstoff befestigen und 1 resistives Heizelement an der Oberseite jedes 25 mm x 25 mm Seitenflansch der Leuchte anbringen.
  2. Legen Sie die dünneren Gummistücke auf die Bühne des Mikroskops, so dass die lange Kante jedes Stückes tangential zur Bühnenöffnung ist, wie in Abbildung1dargestellt.
  3. Positionieren Sie die Aluminium-Basishalterung auf den Isolierpads mit dem Sichtfenster der Leuchte zentriert über der Objektivlinse. Für die Abbildung der angeschlossenen Tröpfchen ist eine richtige Ausrichtung erforderlich.
  4. Legen Sie ein dickeres Stück Gummi auf jedes widerstandsfähige Heizelement und verwenden Sie einen Mikroskop-Bühnenclip, um es an Ort und Stelle zu halten. Diese Teile schützen die Heizelemente vor Schäden durch die Bühnenclips und isolieren vor versehentlicher elektrischer Entschärbung zwischen den Heizelementen und sowohl der Aluminiumhalterung als auch der Mikroskopstufe.
  5. Biegen Sie das Messende eines Thermoelements vorsichtig, um einen 90°-Winkel von 4 mm vom Ende zu erreichen.
  6. Setzen Sie die gebogene Spitze des Thermoelements in die linke untere Ecke der Aluminiumhalterung ein und befestieren Sie sie vorsichtig mit der Verriegelungsschraube.
  7. Legen Sie das Acrylreservoir in den Brunnen der Aluminiumhalterung. Dies geschieht vor dem Hinzufügen von Hexadecanöl zum Brunnen (Schritt 1.8) der Aluminiumhalterung, um das Risiko zu minimieren, Luftblasen zwischen dem Sichtfenster und dem Boden des Acrylbehälters einzufangen, was die Sicht auf die Tröpfchen versperren kann.
    HINWEIS: Öl, das dem Sichtfach der Aluminiumhalterung zugesetzt wird, wird verwendet, um die Brechungsindizes von Acryl und Glas für eine klarere Abbildung der tröpftigen Tröpfchen im Acrylreservoir zu entsprechen. Daher ist es erwähnenswert, dass Öl im Brunnen der Aluminiumhalterung nicht den Inhalt des Acrylbehälters in Berührung bringt und eine rigorose Reinigung der Aluminiumhalterung nicht erforderlich ist.
  8. Geben Sie 1.000 l Hexadecanöl in den Brunnen der Aluminiumhalterung (d. h. zwischen den Wänden des Acrylbehälters und der Aluminiumhalterung) und achten Sie darauf, nicht zu überfüllen. Der Ölstand im Brunnen der Aluminiumhalterung sollte so hoch wie zulässig sein, um die Oberfläche für die Wärmeübertragung zu maximieren, während es nicht zulässt, dass Öl über die Ränder der Leuchte auf die Mikroskopbühne oder objektive Linse ausläuft.
  9. Geben Sie das Hexadecanöl mit 1.000 l in das Acrylreservoir aus, während Sie darauf achten, nicht zu überfüllen.
    HINWEIS: Das Acrylreservoir sollte zwischen den Experimenten immer gründlich gereinigt werden. Der Benutzer muss ein Regiment verwenden, das aus aufeinanderfolgenden Spülungen mit Ethylalkohol und entionisiertem Wasser besteht, gefolgt von dem Trocknen in einer Trockenschüssel über 12 h.

Figure 1
Abbildung 1:Beheizte Bühnenmontage. Die Bilder zeigen die Montage der thermisch leitfähigen Vorrichtung und des Ölreservoirs für die DIB-Bildung; Zahlen unter jedem Bild den entsprechenden Schritt des Protokolls identifizieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Instrumentierung zur gleichzeitigen Rückkopplungstemperaturregelung und elektrischen Charakterisierung eines DIB

HINWEIS: Dieses Protokoll integriert die folgenden Instrumente zur Steuerung der Rückkopplungstemperatur regelung und gleichzeitige elektrische Charakterisierung eines DIB: ein Pc (PC) mit zwei verfügbaren Usb-Anschlüssen (Universal Serial Bus), ein Patch-Klemmenverstärker gekoppelt mit einem dedizierten Datenerfassungssystem (DAQ-1), ein Wellenformgenerator, ein zweiter programmierbarer Datenerfassungs-Daten-/Datenanschluss mit Spannungsausgangs- und Temperatureingangsmodulen sowie ein Netzteil/Verstärker. Die folgenden Schritte beschreiben die notwendigen Verbindungen dieser Instrumente (wie in Abbildung 2adargestellt), die für die Isolierung der Messung und Kontrolle der Temperatur von der simultanen Elektrophysiologie eines DIB benötigt werden. Bei Bedarf können Ersatzinstrumente ersetzt werden.

  1. Stellen Sie Ausgangs- und Eingangsverbindungen zu den DAQ-2-Modulen her.
    1. Wählen Sie zwei Paar Schneckenklemmen am Spannungsausgangsmodul für Differenzspannungsverbindungen aus und befestigen Sie Drahtleitungen an diese Stellen. Ungerade Zahlenklemmen sind gemeinsame Grundverbindungen, und die geraden Nummernklemmen sind ungeerdabgerundete Ausgänge, wie in (Abbildung 2c) dargestellt. Schließen Sie jedes dieser beiden Paar von Bleidrähten an separate Schraubklemmen-BNC-Adapter an und schließen Sie dann jeden Adapter an ein separates BNC-Kabel an, das zum Weiterleiten von Spannungssignalen an andere Instrumente verwendet wird.
      HINWEIS: Bei diesem Setup werden Differenzverbindungen an den Klemmen 0 und 1 für den Temperaturregelausgang an den Leistungsverstärker zugewiesen, während ein weiteres Paar von Anschlüssen an den Klemmen 6 und 7 für die Spannungsausgabe vorgesehen ist, die über den Patchklemmenverstärker an die Tröpfchen gesendet werden soll.
    2. Unter Bezugnahme auf (Abbildung 2c) wählen Sie einen Satz von Thermoelementklemmen (z. B. klemmen 2 und 3 sind als TC1-Paar bezeichnet) am Thermoelement-Eingangsmodul aus und schließen Sie die Thermoelementdrähte an.

Figure 2
Abbildung 2:Systemverdrahtungsverbindungen. Ein Schaltplan der für das System erforderlichen Geräte und Verdrahtungen ist in (a )dargestellt, während ein detaillierter Blick auf die DAQ-2-Verbindungen in (b) angezeigt wird. Die Abbildung in (c) zeigt wässrige Tröpfchen auf hydrogelbeschichteten Elektroden, die zur DIB-Bildung in Öl getaucht sind. Die beiden Elektroden sind mit den geerdeten bzw. ungeerdeten (V+) Anschlüssen an der Kopfbühneneinheit des Patchklemmverstärkers verbunden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Nachdem die elektrischen Anschlüsse an die DAQ-2-Module hergestellt wurden, schließen Sie das DAQ-2-Chassis über einen USB-Anschluss an einen PC an und schließen Sie es an eine elektrische Stromquelle an. Bestätigen Sie dann die erfolgreiche Treiber- und Softwareinstallation vor der Verwendung mit einer kommerziellen Software.
  2. Konfigurieren und verbinden Sie einen Leistungsverstärker zwischen DAQ-2 und widerstandsbeständigen Heizelementen.
    1. Konfigurieren Sie den Verstärker so, dass er im Festverstärkungsmodus mit einer Verstärkung von 10X betrieben wird.
    2. Schließen Sie das BNC-Kabel der Klemmen 0 und 1 am Spannungsausgangsmodul (Abbildung 2b) mit einem Bananenbuchsen-BNC-Adapter an die Eingangsanschlüsse des Leistungsverstärkers an.
    3. Schließen Sie die Ausgangsklemmen des Leistungsverstärkers mit zusätzlichen BNC-Adaptern und Verkabelung an beide Heizelemente- und Verstärkersätze an, die parallel zueinander verdrahtet sind, und den Verstärker, um sicherzustellen, dass beide Elemente während des Gebrauchs den gleichen Spannungsabfall beibehalten.
  3. Stellen Sie die notwendigen Anschlüsse für die elektrophysiologische Ausrüstung her.
    1. Schließen Sie ein BNC-Kabel von den Klemmen 6 und 7 am Spannungsausgangsmodul(Abbildung 2b) an die HINTERgeschalteten externen Befehls-BNC-Anschlüsse auf der Rückseite des Patchklemmverstärkers an.
    2. Schließen Sie ein zweites BNC-Kabel zwischen dem Ausgang des Wellenformgenerators und dem Front Switch External Command-Anschluss auf der Rückseite des Patchklemmverstärkers an.
      HINWEIS: Diese beiden Anschlüsse bieten alternative Methoden zur Erzeugung von Spannungswellenformen, die über den Patchklemmenverstärker auf die Tröpfchenelektroden aufgebracht werden. Der Wellenformgenerator ist besonders nützlich für die Erzeugung von dreieckigen Wellenformspannungen, die zur Messung der Membrankapazität verwendet werden. Der Benutzer kann entscheiden, welche, wenn entweder, für seine eigene Anwendung notwendig sind.
    3. Schließen Sie mit einem dritten BNC-Kabel den Ausgang des gemessenen Stroms auf der Vorderseite des Patchklemmverstärkers an einen verfügbaren analogen Eingang BNC-Anschluss an der Vorderseite des DAQ-1 an.
    4. Mit einem vierten BNC-Kabel den Ausgang der gemessenen Membranspannung (auf der Rückseite des Patchklemmenverstärkers) an einen separaten analogen Eingangsanschluss an DAQ-1 anschließen. Dies ermöglicht die Digitalisierung der über die Elektroden angelegten Spannung.
    5. Mit den beiden Tröpfchenelektroden, die auf Mikromanipulatoren wie in den Schritten 7-9 in Ref.40beschrieben vorbereitet und unterstützt werden, verbinden Sie die Elektrode an die Patchklemmenkopfbühne, die über Kabel an den Patchklemmenverstärker angeschlossen ist.
      HINWEIS: Die Rolle der Kopfbühne besteht darin, die Spannung zwischen den Elektroden zu steuern und den resultierenden Strom zu messen, der in eine proportionale Spannung umgewandelt wird, die vom Patchklemmenverstärker zu DAQ-1 ausgegeben wird.
    6. Schließen Sie DAQ-1 über einen USB-Anschluss an einen PC an und schließen Sie die entsprechenden Netzkabel sowohl an den Patchklemmenverstärker als auch an den DAQ-1 an.
  4. Strom an allen Messgeräten.
    HINWEIS: Das vielleicht wichtigste Detail in diesem Setup ist, sicherzustellen, dass die Leistungsverstärker-Ausgangsanschlüsse (mA-A) elektrisch von der Kopfbühneneinheit des Patchklemmenverstärkers isoliert sind, der eine empfindliche Schaltung verwendet, um pA-nA-Pegelströme in einem DIB zu messen.

3. Feedback Temperaturregelung von Tröpfchen-Schnittstelle Bilayer

HINWEIS: Die folgenden Schritte für den Betrieb des Feedback-Temperaturregelungssystems basieren auf einer benutzerdefinierten grafischen Benutzeroberfläche (GUI), die für die Implementierung der proportional-integralen (PI) Feedback-Temperaturregelung40,41 (siehe Ergänzende Codierungsdateien)erstellt wurde. Stattdessen können andere Software- und Steuerungsalgorithmen verwendet werden. Eine Kopie dieses Programms wird dem Leser mit den Zusatzinformationen für das Papier zur Verfügung gestellt, jedoch ist der Benutzer verantwortlich, es für seine eigenen Geräte und Bedürfnisse zu konfigurieren.

  1. Starten Sie die DAQ-2-Software auf dem PC und öffnen Sie die Programmdatei zur Temperaturregelung. Sobald die GUI geöffnet wird, öffnen Sie das Programm erneut, indem Sie auf das Ordnersymbol in der unteren linken Ecke der GUI klicken und das Temperaturregelungsprogramm auswählen (Abbildung 3).
  2. Geben Sie die entsprechenden numerischen Werte für die proportionale Kontrollverstärkung (KP) und die integrale Kontrollverstärkung (KI) ein.
    HINWEIS: KP und KI Werte von 0,598 bzw. 0,00445 haben sich im Setup gut bewährt. Diese Werte wurden iterativ durch Simulation mithilfe eines Systemmodells ermittelt, das Parameter enthält, die aus gemessenen Open-Loop-Heizantworten gewonnen wurden (siehe Abbildung 4). Beim Open-Loop-Heizenist die vorgeschriebene Heizleistung unabhängig von der gemessenen Temperatur. Im Gegensatz dazu besteht die geschlossene Heizung darin, die aufgebrachte Leistung kontinuierlich an die Heizungen anzupassen, so dass die gemessene Temperatur näher an die gewünschte Temperatur ansteigt. Dies wird hierin mit einem PI-Kontrollschema erreicht.
  3. Um das Temperaturregelungsschema zu testen, geben Sie eine gewünschte Sollwerttemperatur (über Raumtemperatur) ein und aktivieren Sie dann die Rückkopplungstemperaturregelung in der GUI. Beobachten Sie das gemessene Temperatursignal unter der Rückkopplungssteuerung (geschlossene Schleife), die in der GUI für die nächsten Minuten angezeigt wird. Wenn die gemessene Temperatur des Öls die gewünschte Temperatur stark überschreitet, zu langsam auf Veränderungen reagiert oder nicht zum gewünschten Sollwert konvergiert, muss der Benutzer die Steuergewinne anpassen, um die gewünschte Closed-Loop-Leistung zu erreichen.
    HINWEIS: Das Programm definiert eine Sättigungsgrenze für die Leistung (und damit Spannung), die den widerstandsbeständigen Heizelementen zugeführt wird. Beispielsweise verbrauchen zwei hier in diesem Element gemeldete Elemente jeweils bis zu 5 W Strom. Die parallele Verdrahtung bedeutet, dass der Gesamtstromverbrauch 10 W nicht überschreiten sollte. Dem Benutzer wird empfohlen, die maximale Leistung zu berücksichtigen, die den Geräten zugeführt werden sollte, und zu wissen, dass diese Grenze die Geschwindigkeit beeinflussen kann, mit der das Closed-Loop-System auf gewünschte Temperaturänderungen reagiert. Höhere Leistungsheizungselemente ermöglichen eine schnellere Erwärmung und höhere Sollwerttemperaturen, erfordern aber höhere zugeführte Ströme für die Heizung.
  4. Wenn das System auf akzeptable Closed-Loop-Leistung abgestimmt ist, geben Sie die gewünschte Öltemperatur für die DIB-Bildung als Sollwert in der GUI ein.
    HINWEIS: Beispielsweise lieferte eine Solltemperatur von 60 °C gute Ergebnisse in Experimenten mit BTLE-Liposomen in den wässrigen Tröpfchen37. Der Benutzer wird an anderer Stelle verwiesen2,40 für Protokolle, die die DIB-Montage zwischen Tröpfchen erklären, die an Drahtelektroden hängen, und die Konfiguration von elektrophysiologischen Geräten mit dem Patchklemmenverstärker, DAQ-1 und der elektrophysiologischen Messsoftware. Insbesondere kann das Protokoll von Najem, et al.40 bis Schritt 13 genau befolgt werden. Über diesen Schritt hinaus wird ein etwas anderer Ansatz für eine erfolgreiche Monolayer- und Bilayer-Bildung verwendet, wenn Lipide verwendet werden, die erhitzt werden müssen, um die Monolayer- oder Bilayerbildung zu fördern.
  5. Senken Sie die Spitzen der Silber/Silberchlorid (Ag/AgCl) Elektroden in das Öl, bis sie fast den Boden des Acrylbehälters berühren. Diese Positionierung der Elektrodenspitzen ist entscheidend, um das Tröpfchen auf der Elektrode in beheiztem Öl zu halten, wo konvektive Ströme im Öl beobachtet wurden, um Tröpfchen von den hydrogelbeschichteten Elektroden zu lösen (Abbildung 2c).
  6. Pipette ein 250 nL Tröpfchen wässriger Lipidlösung mit 2 mg/ml BTLE, 100 mM Kaliumchlorid (KCl) und 10 mM 3-(N-Morpholino) Propanulfonsäure (MOPS) auf jede Elektrodenspitze und sie mindestens 10 Minuten in das erhitzte Öl eintauchen lassen, um die Bildung von Monolayern zu fördern.
  7. Bedecken Sie die Kopfbühne und die beheizte Bühnenleuchte mit einem geerdeten Faraday-Käfig.
  8. Bringen Sie die Tröpfchen langsam in leichten Kontakt, indem Sie
    Manipulieren der horizontalen Positionen der Elektroden, bis der Benutzer sieht, dass sich die Tröpfchen vom Kontakt verformen oder beginnen, sich gegenseitig zu verdrängen und einige Minuten zu warten, bis die Bilayer-Bildung beginnt. Wenn sich nach einigen Minuten kein Doppelschichtgebildet hat, können die Tröpfchen mehr zusammengezäut werden, um die Bilayerbildung zu erleichtern. Die Bildung einer ausgedünnten Grenzflächen-Bilayer kann durch visuelle Inspektion (Abbildung 5a) oder durch Messung der Erhöhung der Amplitude eines rechteckigen kapazitiven Stroms bestätigt werden, der durch einen Wellenformgenerator induziert wird, der eine 10 mV, 10 Hz Dreiecksspannung22ausgibt. Lassen Sie die Bilayer für mindestens 10 Minuten ausdemadien, um einen stabilen Grenzflächenbereich zu erreichen, bei der Erstausbildung und vor der anschließenden Charakterisierung am ursprünglichen Sollwert.
    HINWEIS: Die Art des Öls kann einen erheblichen Einfluss auf die Doppelschichtverdünnung, Membrandicke und den Kontaktwinkel zwischen Tröpfchen haben. Im Allgemeinen gilt: Je kleiner das Ölmolekül, desto leichter kann es im hydrophoben Kern der Von Lipid-Acylketten besetzten Bischicht verbleiben. Die Ölretention erhöht sowohl monolayer als auch bilayer Spannungen und Dicke und verringert den Kontaktbereich und den Kontaktwinkel zwischen Tröpfchen. Diese Metriken bedeuten einen schwächeren Haftungszustand. Größere, sperrigere Moleküle wirken umgekehrt. Squalen ist beispielsweise ein sperrigeres Molekül als Alkane wie Hexadecan, wodurch es während der zweischichtigen Ausdünnung leicht zwischen Monolayern ausgeschlossen werden kann. Als solche sind die in Squalen gebildeten DIBs dünner, sie weisen höhere Kontaktflächen und Winkel auf und weisen höhere freie Energien der Formation22,42 (ein Maß für die Tropfen-Tropfen-Haftung) auf.

4. Charakterisierung temperaturabhängiger Verhaltensweisen in DIBs

HINWEIS: Viele physikalische Prozesse können in DIB-basierten Modellmembranen untersucht werden, einschließlich wie temperaturverändernde Änderungen die Struktur und die Transporteigenschaften der Membran beeinflussen. Die folgenden Schritte sollten nach erfolgreicher Bilayer-Bildung bei einer gewünschten Temperatur durchgeführt werden.

  1. Messen Sie die Nominalkapazität der Membran und senken Sie gleichzeitig die Temperatur des Ölbades von einem Sollwert, der die Bilayerbildung ermöglicht, thermotrope Phasenübergänge der Lipide in der Membran38zu identifizieren.
    1. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Temperaturdiagramm auf der GUI, und löschen Sie die angezeigten Daten. Dadurch wird sichergestellt, dass genügend Platz im Puffer für nachfolgende Aufnahmen zur Verfügung steht.
    2. Mit dem an den Patchklemmenverstärker angeschlossenen Wellenformgenerator eine dreieckige Spannungswellenform (z.B. 10 mV, 10 Hz) über die DIB-Elektroden auftragen und die induzierte Stromreaktion durch die Doppelschicht aufzeichnen.
    3. Kühlen Sie die Doppelschicht, indem Sie die Sollwerttemperatur in 5 °C-Schritten reduzieren und mindestens 5 min auf die neue Konstantatentemperatur zwischen Temperaturänderungen warten, bis die gewünschte Temperatur erreicht ist. Alternativ können Sie die Bilayer passiv abkühlen, indem Sie die Rückkopplungssteuerung ausschalten. Beachten Sie jedoch, dass Experimente zur Durchführung passiver Kühlung von 50-60 °C zu höheren Koaleszenzraten führten.
    4. Nachdem das Ölbad und die Doppelschicht auf die gewünschte Mindesttemperatur abgekühlt sind, klicken Sie mit der rechten Maustaste erneut auf das Temperaturdiagramm in der GUI und exportieren Sie die Temperaturdaten im Vergleich zur Zeit in eine Tabellenkalkulationssoftware. Beenden Sie die aktuelle Aufzeichnung.
    5. Berechnen Sie aus dem gemessenen Strom die nominale Kapazität der rechteckigen Wellen-Strom-Antwort im Vergleich zur Zeit während der Kühlperiode.
    6. Plot Nominelle Kapazität (C) versus Temperatur (T), um zu beobachten, wie sich die Membrankapazität verändert hat. Suchen Sie nichtmonotone Änderungen in C im Vergleich zu T, um TMzu identifizieren.
      ANMERKUNG: Die Nominalkapazität kann aus der Amplitude des Rechteckstroms43 (| I|) Verwendung der Beziehung | Ich | = C dv/dt, wobei dv/dt dem Vierfachen des Produkts der Spannungsamplitude entspricht(| V|) und Frequenz (f) der angelegten Dreiecksspannung. Aus diesen Gleichungen wird C = | I|/(4| V|f).
  2. In ähnlicher Weise bewerten Sie die quasi-statische spezifische Kapazität (Cm) der Bilayer bei festen Temperaturen, indem Sie die Temperatur des Ölbades und des Zweischichtbereichs sukzessive erhöhen.
    1. Ändern Sie die Sollwerttemperatur in 10 °C-Schritten mit der GUI und lassen Sie das System der neuen Temperatur entsprechen.
      1. Führen Sie Schritt 4.1.2 durch, um die Messung des kapazitiven Stroms und der Aufzeichnung zu initiieren.
      2. Ändern Sie den Bilayer-Bereich, indem Sie die Positionen der Elektroden mit den Mikromanipulatoren sorgfältig einstellen (d. h. die Trennung der Elektroden reduziert die Bilayer-Fläche). Ermöglichen Sie es, dass der rechteckige Strom eine stationäre Amplitude erreicht und Bilder des DIB sammelt, um die Berechnung der Membranfläche im Vergleich zur Zeit zu ermöglichen, indem eine am Mikroskop montierte Kamera verwendet wird, um die Bilayer aus der Blende der Mikroskopstufe abzubilden. Fügen Sie gleichzeitig ein digitales Tag in der aktuellen Aufnahmesoftware hinzu, um den entsprechenden Zeitpunkt für die Bildsammlung zu markieren.
        HINWEIS: Mikromanipulatoren ermöglichen die präzise Steuerung der Elektroden und damit einen schonenden Kontakt zwischen Tröpfchen. Grobe Manipulation der Tröpfchen kann zu einem fehlgeschlagenen Experiment durch Koaleszenz der Tröpfchen oder durch das Ausfallen eines Tröpfchens von der Elektrode führen. Wie an anderer Stelle22erläutert, wird der bilayer Bereich aus der Kontaktlänge zwischen Tröpfchen berechnet, die als überlappende Kreise in einem Bild in der unteren Ansicht erscheinen. Die Positionen und Abmessungen der Tröpfchen sowie die Länge der Kontaktlinie können mit einer Bildverarbeitungssoftware oder mit anderen wissenschaftlichen Programmierwerkzeugen berechnet werden.
      3. Wiederholen Sie Schritt 4.2.1.2 mindestens 4 Mal, um insgesamt 5 DIB-Bilder und stationäre Regionen mit bilayerm Strom zu erhalten.
    2. Wiederholen Sie Schritt 4.2.1 bei jeder gewünschten Temperatur.
    3. Analysieren Sie an den markierten Zeitpunkten, die stationären Bilayer-Bereichen für erfasste Bilder entsprechen, die aktuellen Aufnahmen und DIB-Bilder, um C- und A-Daten für jede Temperatur zu extrahieren.
    4. Plot C im Vergleich zu A-Daten für jede Temperatur und berechnen die Steigung einer Regression erster Ordnung, die das Cm des Doppellayers bei jeder Temperatur22darstellt.
    5. Plotwerte von Cm aus Schritt 4.2.4 im Vergleich zu T.
    6. Untersuchen Sie die C m-im-T-Daten auf nicht-monotone Schwankungen, um Schmelztemperaturen zu identifizieren, TM.
  3. Bewerten Sie die Dynamik der spannungsabhängigen Ionenkanalbildung, indem Sie einen DC-Spannungsschritteingang über die Bilayer generieren.
    1. Stellen Sie die Ausgangsspannung auf den gewünschten Schrittwert in mV (z.B. 100 mV) ein.
    2. Stellen Sie die Endspannung und Schrittgröße auf einen Wert höher als der gewünschte Schritt (z. B. 110 mV Endspannung und 110 mV Schrittgröße).
    3. Stellen Sie die gewünschte Dauerzeit für die Schritteingabe in Sekunden (z. B. 90 s) ein.
    4. Wählen Sie die gewünschte Polarität für den Schritteingang (z.B. positiv).
    5. Schalten Sie den Patchklemmenverstärker, um die Vom GUI/Spannungsausgangsmodul ausgehende Befehlsspannung an die Kopfbühne zu senden.
    6. Initiieren Sie aktuelle Aufzeichnungen.
    7. Schalten Sie die Spannung ein und notieren Sie die induzierte Stromreaktion, die eine S-förmige Reaktion auf eine kritische Spannung aufweisen sollte (z. B. 70 mV für 1 g/ml Mz in 2 mg/ml BTLE).
  4. Unabhängig davon können dynamische Strom-Spannungs-Beziehungen für eine Membran bei gewünschten Temperaturen erhalten werden, um spannungsabhängige Beziehungen, wie z. B. Ionenkanalverhalten, aufzudecken.
    1. Schalten Sie den Patchklemmenverstärker, um die vom Wellenformgenerator ausgehende Befehlsspannung an die Kopfbühne zu senden und Stromaufzeichnungen zu initiieren.
    2. Geben Sie am Wellenformgenerator eine kontinuierliche sinusförmige Wellenform mit einer gewünschten Amplitude, Einem Offset und einer Frequenz aus.
    3. Zeichnen Sie die induzierte Stromantwort über einen oder mehrere Zyklen auf.
    4. Wiederholen Sie dies nach Belieben für verschiedene Sinuswellenamplituden sowie Frequenzen und Temperaturen.

Figure 3
Abbildung 3:Die Temperaturregelungs-GUI. In dieser Abbildung werden die kritischen Schritte hervorgehoben und beschrieben, die erforderlich sind, um die GUI des Programms zu verwenden, um die Temperatur des Ölbades zu steuern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Representative Results

Abbildung 1 zeigt, wie die Aluminiumhalterung und das Acrylölreservoir auf der Mikroskopbühne auf die DIB-Bildung vorbereitet werden. Die Montageschritte 1.2-1.4 dienen dazu, die Leuchte von der Bühne für eine effizientere Erwärmung wärmezudämmen. Die Schritte 1.5-1.7 zeigen, wie das Thermoelement richtig an der Halterung befestigt und das Ölreservoir positioniert wird, und die Schritte 1.8 -1.9 zeigen empfohlene Orte für die Ölabgabe in diese Teile an.

Abbildung 2 zeigt die Komponenten, die zur Festlegung der Rückkopplungstemperaturregelung und zur Durchführung elektrischer Messungen an einem DIB verwendet werden: ein PC, ein Verstärker mit fester Verstärkung, ein Patchklemmenverstärker und ein DAQ-System (oder ein gleichwertiges Instrument zur Anbringung von Spannungs- und Mess-pA-nA-Pegelströmen), eine zweite Datenerfassung mit entsprechenden analogen Ein- und Ausgängen, ein Wellenformgenerator und die montierte Aluminiumhalterung mit angeschlossenen Widerstandsheizungen. DAQ-2 nutzt zwei Module (Abbildung 2b). Ein 4-Kanal, ±10 V, 16-Bit-Analogspannungsausgangsmodul wird verwendet, um die unabhängigen Spannungen zu initiieren, die an den Eingang des Leistungsverstärkers (blauer Anschluss in Abbildung 2a) und einen Externen Befehlseingang am Patchklemmenverstärker (grüner Anschluss) geliefert werden. Das Spannungsausgangsmodul wird durch einen maximalen Ausgangsstrom von 46 mA und eine maximale Ausgangsspannung von 10 V begrenzt, während jedes hier verwendete Heizelement bei einer maximalen Spannung von 28 V bis zu 5 W Leistung (max. 180 mA) verbraucht. Aus diesem Grund wurde das Netzteil/Verstärker mitgeliefert, um die Ausgangsspannung vorzuverstärken und den zugeführten Strom zu ergänzen, der für die Stromversorgung der heizelemente (parallel verdrahtet) benötigt wird, die an der Aluminiumhalterung befestigt sind. Zur Digitalisierung von Temperaturmessungen aus dem Ölreservoir in der Nähe des DIB (gelber Anschluss) wird ein 4-Kanal-Thermoelement-Eingangsgerät mit 4 Kanälen verwendet. Da das Thermoelement-Eingangsgerätmodul bis zu 4 Thermoelemente zulässt, kann der Anwender die Überwachung der Temperaturen an anderen Stellen im Gerät in Betracht ziehen. Wenn dies der Wunsch ist, müssen sie auch berücksichtigen, welches Signal oder welche Kombination von Signalen für den Vergleich mit der gewünschten Sollwerttemperatur innerhalb der Rückkopplungsschleife verwendet wird.

Diese Ausgänge und gemessenen Signale werden über zwei Software gesteuert: 1) die benutzerdefinierte GUI für die Temperaturregelung; und 2) elektrophysiologische Messsoftware. Abbildung 3 zeigt einen Screenshot der GUI und enthält Anmerkungen zu den entsprechenden Schritten im Protokoll. Die GUI wird verwendet, um schlüsselfertige Parameter (Sollwerttemperatur, PI-Steuergewinne, Spannungsgrenzen) zu definieren, die gemessene Temperatur mit der Sollwerttemperatur zu vergleichen und das dem Verstärker und dann den Heizelementen zugeführte Steuersignal zu berechnen und Daten der Temperatur und der angelegten Spannung im Vergleich zur Zeit aufzuzeichnen. Dieses Programm beinhaltet auch die Möglichkeit, die Spannung, die auf DIB-Elektroden angewendet wird (Abbildung 2c) über den Patch-Klemmverstärker zu befehlen. Separat wird die Messsoftware verwendet, um Messungen sowohl der auf die DIB-Elektroden aufgebrachten Spannung als auch des induzierten Stroms durch die Lipid-Doppelschicht zu konfigurieren. Eine spannungproportional zum DIB-Strom wird vom Patchklemmenverstärker ausgegeben und über ein BNC-Kabel an DAQ-1 gesendet (Anschluss nicht gezeigt).

Abbildung 4 zeigt die Temperaturänderung und die absolute elektrische Leistung, die an die Heizungen gesendet wird, im Vergleich zur Zeit sowohl unter Open-Loop- als auch in Closed-Loop-Heizszenarien. Für erstere wurde eine beliebige Eingangsspannung in Derener Heizungen in Dergröße von 5,2 W erhöht, was zu einem exponentiellen Temperaturanstieg mit einer Zeitkonstante von 125 s und einem konstanten Zustand von t ≈ 4,5 °C/W nach einer anfänglichen Verzögerung von 20 s führte. Diese Eigenschaften des Open-Loop-Systems wurden verwendet, um ein Modell des Closed-Loop-Systems in einer Simulationssoftware zu konstruieren (detailssiehe Abbildung S4), mit dem Werte für die proportionalen und integralen Kontrollgewinne bestimmt werden können. Die geschlossenen und simulierten Modellantworten in Abbildung 4 stellen somit die gemessenen und simulierten Antworten des getunten PI-Controllers dar, wobei die KP- und K-I-Werte 0,598 bzw. 0,00445 auf eine Solltemperatur von 20 °C höher als RT liegen. Im Vergleich zum Open-Loop-Gehäuse bestätigen sowohl die Simulation als auch die Messungen die erhöhte Ansprechgeschwindigkeit im geschlossenen Loop-System (Zeitkonstante 63 s). Die Reduzierung der Heizzeit geht zu Lasten der höheren Anfangsleistung. Dennoch blieben die gewünschte Sollwerttemperatur und die gemessene Öltemperatur bei konstantem Zustand innerhalb von 0,6 °C, was als einsatzfähig erachtet wurde. Die gesamte gelieferte Leistung ist innerhalb des Programms während der Closed-Loop-Steuerung begrenzt, um die Gesamtleistungsgrenze von 10 W für die beiden Heizungen nicht zu verdunkeln.

Das Temperaturregelungssystem wurde verwendet, um die Temperaturabhängigkeit von Lösungsmittel in einem aus BTLE-Lipiden gebildeten DIB und seine Auswirkungen auf die Membrankapazität zu zeigen (Abbildung 5). Für diese Messung wurden BTLE-Lipide gewählt, da für die DIB-Bildung aufgrund eines Lipidphasenübergangs, der zwischen 35-42 °C38auftritt, eine Erwärmung erforderlich ist. Das hier beschriebene Protokoll wurde durchgeführt, um die Bilayerbildung bei 60 °C zu initiieren. Nach der Membranbildung und dem Gleichgewicht kann die Temperatur nach Bedarf gesenkt oder erhöht werden, um die Reaktion der Membran zu charakterisieren. Abbildung 5a zeigt beispielsweise repräsentative Messungen des rohen kapazitiven Stroms (quadratförmige Wellenform) und der Temperatur im Vergleich zur Zeit während eines Heizzyklus von RT bis 60 °C. Beachten Sie, dass die Amplitude der kapazitiven Stromwellenform bei steigender Temperatur um mehr als die Hälfte reduziert wird, was durch die Aufnahme von Öl in den hydrophoben Kern der Membran verursacht wird. Diese Änderung verdickt die Schnittstelle und verändert die seitliche Spannung der Bilayer22,37,38.

Die Daten in Abbildung 5b dokumentieren Veränderungen in C (normalisiert durch die Kapazität bei 27 °C) im Vergleich zu T über einen vollständigen Kühl-Heizzyklus nach anfänglicher Bilayer-Bildung bei 60 °C. Genau wie in Abbildung 5a, wenn die Temperatur steigt, sinkt die Kapazität. Was diese Darstellung jedoch deutlicher zeigt, sind die nichtmonotonen Veränderungen, die bei Temperaturen zwischen 30-42 °C auftreten, was die kollektive Schmelztemperatur TMdarstellt, während der das Lipidgemisch zwischen einer flüssigkeitsbestellten und einer flüssigkeitsgestörten thermotropen Phaseübergeht. Die Temperatur, bei der die nichtmonotone Veränderung der Kapazität auftritt, entspricht einer Veränderung der Zweischichtdicke unter Ausschluss von Öl aus der Membran38. Beachten Sie auch, dass die hysterese zwischen dem Heizzyklus und dem Kühlzyklus auf irreversible Veränderungen im Zweischichtbereich zurückzuführen ist, die zwischen den nachfolgenden Zyklen auftreten, die in der Regel 10 min voneinander entfernt durchgeführt wurden.

In ähnlicher Weise zeigt Abbildung 6a,b, wie quasi-statische Messungen von Cm bei unterschiedlichen Temperaturen verwendet werden können, um TMzu identifizieren. Hierbei wird der Bereich der Membran sukzessive variiert, indem der Abstand zwischen den Tröpfchenelektroden manuell vergrößert wird. Während dieses Experiments werden die Tröpfchen zunächst zusammengeschoben, um die maximale Membranfläche zu fördern, bevor anschließend die Kontaktfläche mit stufenweisen Trennungen zwischen den Elektroden reduziert wird. Auf jeder Kontaktebene wird die Nominalkapazität der Bilayer aus dem induzierten Strom und ihr Bereich durch Bildanalyse bestimmt. Plotten C im Vergleich zu A ermöglicht eine lineare Regression, wobei die Neigung den Wert von Cm darstellt, wie in Abbildung 6adargestellt. Die Wiederholung dieses Verfahrens über mehrere Temperaturen hinweg(Abbildung 6b) zeigt, dass Cm bei Temperaturen über TMum fast 50 % abnimmt, was eine Zunahme der hydrophoben Dicke der Membran aufgrund der hitzeinduzierten Hexadecanaufnahme bestätigt (siehe Abbildung S5 für vollständige C-im-A-Daten). Bei höheren Temperaturen reduziert das zusätzliche Lösungsmittel in der Membran auch die maximale Kontaktfläche zwischen den Tröpfchen und damit die maximale Nennkapazität. Durch die Reduzierung der Temperatur werden diese Effekte umgekehrt. Das DIB-Bild in Abbildung 6c zeigt, dass die Membran, wenn die Temperatur (25 °C) deutlich unter TMliegt, unter der Spannung von gestreckten Tröpfchen, die durch gut getrennte Elektroden verursacht werden, stabil einen hochklebenden Zustand annehmen kann. Dies ist das Ergebnis des vollständigen Ausschlusses von Hexadecan aus der Bilayer, die die Haftenergie der Tröpfchen erhöht. In diesem Zustand kann der Bilayer-Bereich nicht zuverlässig durch Manipulation der Elektroden verändert werden und behindert die Fähigkeit, bestimmte Kapazität genau zu messen (siehe Abbildung S5 für weitere Details).

Schließlich zeigen die repräsentativen Daten in Abbildung 7, wie Temperaturänderungen das Verhalten porenbildender Arten beeinflussen können, die Ionenleitende Kanäle über ein DIB erzeugen. Monazomycin (Mz), ein positiv aufgeladenes Antibiotikum, das kationselektive Kanäle durch die Bilayer bei ausreichenden Transmembranpotentialen37,44bildet, wurde ausgewählt, um diese Beziehung zu demonstrieren. Diese Messungen wurden an einer BTLE-basierten (2 mg/ml Endkonzentration in beiden Tröpfchen) DIB durchgeführt, die mit Mz dotiert war (1 g/ml Endkonzentration in beiden Tröpfchen). Die in Abbildung 7a dargestellten Strom-Gegen-Spannungsspuren wurden durch Anwendung sinusförmiger Membranspannungen und Messung des induzierten Stroms bei zwei unterschiedlichen Temperaturen ermittelt; die Pfeile und nachfolgenden Zahlen in Abbildung 7a helfen bei der Visualisierung der aufeinanderfolgenden Viertel der sinusförmigen Spannung in Bezug auf die Zeit. Diese Art der Messung wird oft durchgeführt, um die Spannungsabhängigkeit des Stroms durch Ionenkanäle zu untersuchen. Die Daten hier zeigen, dass die Erhöhung der DIB-Temperatur von 27 °C auf 45 °C dazu führt, dass der Schwellenwert für die Kanalbildung von |100 mV ansteigt| auf |110 mV|. Diese Veränderung, die wahrscheinlich durch die höhere Membrandicke durch absorbiertes Öl angetrieben wird, zeigt, dass die Energiebarriere für das Einführen gestiegen ist. Die Hysterese in diesen Kurven- was den Gedächtniswiderstand bedeutet - kann durch spannungsinduzierte Veränderungen im Bilayer-Bereich oder durch die Kinetik der Mz-Kanalbildung und -inaktivierung44verursacht werden.

Um diese Faktoren in DIBs zu trennen, können transiente Veränderungen des Ionenstroms als Reaktion auf eine Gleichspannung gemessen werden. Abbildung 7b zeigt die gemessene Stromdichte für dieselbe Mz-dotierte BTLE-Membran bei gleichem Spannungspegel (+90 mV) und zwei unterschiedlichen Temperaturen (27 °C und 45 °C). Die Daten zeigen deutlich, dass die Kinetik der Kanalantworten sehr unterschiedlich ist. Insbesondere weist die Membran bei 27 °C eine schnellere, größere Stromzunahme auf, die dann von einem vorübergehenden Zerfall gefolgt wird (letzteres ist das Ergebnis von Mz-Kanälen, die sich über die Bilayer in einen inaktiven Zustand transziert44). Die Reaktion ist bei 45 °C wesentlich gedämpfter, wobei der S-förmigeStromanstieg nicht durch einen nachfolgenden Rückgang erfolgt. Unterschiede wie diese sind hilfreich, um die Kinetik der Kanalreaktionen zu bewerten und zu verstehen, wie diese zum gesamten dynamischen Widerstand der Membran beitragen könnten.

Figure 4
Abbildung 4:Open-Loop versus Closed-Loop-Heizung. Panel (a) vergleicht die Zeitantworten für das gemessene und simulierte (siehe SI) Closed-Loop-System mit einem Temperaturschritt von +20 °C mit dem Open-Loop-Heizverhalten unter fest angewendeter Leistung. Panel (b) zeigt die von jedem System abgeführte Leistung an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5:Messung derKapazität und der unterschiedlichen Temperatur. Die typische quadratische Wellenstromantwort auf eine dreieckige Wellenformeingabe von 10 mV, 10 Hz auf einer BTLE Lipidmembran, die einen Phasenübergang durchläuft, ist in (a )dargestellt. Der Phasenübergang der Lipide ist auch in den über dem Panel angezeigten Flächenmessdaten (a )zu sehen. Die durch die anfängliche Kapazität bei 27 °C normalisierte Kapazität wird in der Tafel (b) dargestellt, die als Funktion der Temperatur für einen Heiz- und Kühlzyklus dargestellt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Spezifische Kapazitätsmessungen Panel (a) zeigt nominale Kapazität im Vergleich zu Bilayer-Bereich an aufeinanderfolgenden Kontaktflächen für zwei verschiedene Temperaturen erhalten. Lineare Regressionen zu jedem Satz werden verwendet, um ihre jeweiligen Werte von CMzu bestimmen. Panel (b) Plots CM versus T, während Panel (c) zeigt die stabile kapazitive Strom-Wellenform (links) und Kontaktfläche (rechts) unter versuchter Tröpfchentrennung bei 25 °C. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: Spannungsabhängiger Membranwiderstand und Mz-Ionenkanal-Kinetik versus Temperatur. Panel (a)   zeigt, wie sich die Strom-Spannungs-Beziehung mit der Temperatur für BTLE-DIBs ändert, die zwischen Tröpfchen mit einer Mz von 1 g/ml gebildet werden. Die Pfeile und Zahlen stellen die aufeinanderfolgenden Teile der angewendeten Sinuswelle dar. Die Unterschiede in diesen Spuren veranschaulichen, wie die Temperatur den Spannungsschwellenwert für die Mz-Einfügung verschiebt, die als die Größe der Spannung identifiziert wird, wo der induzierte Strom stark ansteigt. Ebenso zeigt panel (b) die Aufpralltemperatur auf die transiente Stromreaktion, die durch eine GLEICHstromschrittspannung von 90 mV induziert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung S1: Aluminiumhalterung. Diese Zeichnung zeigt die notwendigen Abmessungen und Merkmale für die Herstellung der Aluminium-Befestigung, die die Basis der beheizten Bühne ist. Die 25,2 mm X 26 mm flachen Flecken neben dem Ölbrunnen wurden so konzipiert, dass sie eine maximale Menge an Oberflächenkontakt zwischen der Leuchte und den Heizelementen für die Wärmeleitung ermöglichen. Ebenso wurde Aluminium aufgrund seiner hohen Wärmeleitfähigkeit für das Basisbefestigungsmaterial ausgewählt. Das im Druck genannte Schraubloch M3 X 0,5 mm dient zur Befestigung und Positionierung des Thermoelements im Ölbrunnen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Abbildung S2: Acrylsubstrat. Das Acrylsubstrat ist relativ einfach stückweise herzustellen, ohne kritische herausragende Eigenschaften, mit Ausnahme des Profils. Das Außenprofil wurde unter Berücksichtigung von Poka-Joch entworfen, so dass das Acrylsubstrat nur so in der Leuchte ausgerichtet werden kann, dass dem Thermoelement genügend Platz zum Einpassen in den Ölbrunnen bleibt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Abbildung S3: Beheizte Bühnenbaugruppe. Eine explosionsende Ansicht der montierten beheizten Bühne wurde zur Verfügung gestellt, um den Experimentator während der Ersteinrichtung zu unterstützen. Beachten Sie auch den Bereich, der durch den gestrichelten Kreis hervorgehoben wird, da dies die ideale Position ist, um die Aluminiumhalterung während des Protokollschritts 1.8 mit Öl zu füllen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Abbildung S4: Open Loop Data und Simulink-Modellierungspanel. (a) zeigt die offenen Temperaturreaktionen auf unterschiedliche DC-Leistungsstufen, die verwendet wurden, um die Verzögerungszeit, td, die Zeitkonstante, die, und die Offene-Schleifen-Heizverstärkung, α, des Systems zu bewerten. Die Verzögerungszeit stellt die Zeitverzögerung dar, bevor die Temperatur ansteigt (ca. 20 s). Jeder Wert von n (gekennzeichnet mit *, 125 s) ist definiert als die Zeit, die für 63,2 % des gesamten Temperaturanstiegs erforderlich ist. Panel (b) zeigt die stetige Temperaturänderung (∆T) im Vergleich zur angewendeten Leistung an. Die Steigung der in (b) dargestellten Daten wurde verwendet, um die αzu berechnen, die das Verhältnis der Temperaturänderung pro gelieferter Leistung darstellt. Diese Parameter wurden in dem im Panel (c) gezeigten Modell verwendet und als Zusatzdatei zur Abstimmung des PI-Controllers bereitgestellt, um eine gewünschte Temperaturregelungsantwort mit geschlossener Schleife zu erzielen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Abbildung S5: Zusätzliche spezifische Kapazitätsdaten. Die in Abbildung 6adargestellten Plotswurden aus diesem CM-Datensatz kompiliert. Dieses Diagramm zeigt auch die Unfähigkeit, die Kapazität bei Temperaturen von 25 °C und darunter genau zu messen, daher wurde diese Messung aus dem Datensatz ausgeschlossen. Die für eine genaue Cm-Messung erforderlichen Flächenänderungen erfordern eine übermäßige Kraft auf die Tröpfchen der Mikromanipulatoren, was zu einer Verzerrung der Tröpfchenform und des Kontaktbereichs führt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Codierungsdateien. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Das hier beschriebene Protokoll enthält Anweisungen für die Montage und den Betrieb eines experimentellen Systems zur Steuerung der Temperatur des Öls und der Tröpfchen, die zur Bildung von DIBs verwendet werden. Es ist besonders vorteilhaft für die Aktivierung der DIB-Bildung mit Lipiden, die Schmelztemperaturen über RT haben. Darüber hinaus kann durch präzise Variation der Temperatur des Ölreservoirs die Doppelschichttemperatur manipuliert werden, um die Auswirkungen erhöhter Temperaturen auf verschiedene Membraneigenschaften und -eigenschaften zu untersuchen, einschließlich Kapazität, Fläche, Dicke, induzierte thermotrope Phasenveränderungen, Kinetik membranaktiver Arten und die Energetik der Adhäsion der Zweischichtschnittstelle37,38.

Das Protokoll besteht aus drei Teilen vor der Verwendung in einer DIB-Studie: 1) Vorbereitung und Montage der beheizten Bühnenleuchte; 2) Anschluss der verschiedenen Instrumente; und 3) Bestätigung der geeigneten Temperaturregelungsleistung mit den gewählten proportionalen und integralen Kontrollgewinnen. Am wichtigsten in Teil 2, muss der Benutzer sicherstellen, dass gemeinsame Leitungswege zwischen dem Ausgang des Leistungsverstärkers (>mA Ströme) und der Patchklemme Kopfbühne (pA-nA Ströme) zu vermeiden. Ein unbeabsichtigter Kurzteil kann zu bleibenden Schäden an der Kopfbühne führen. Darüber hinaus trägt die Sicherstellung, dass der PC und alle Instrumente mit einem gemeinsamen Wechselstromboden verbunden sind, und die Verwendung eines geerdeten Faraday-Käfigs in der Nähe der Kopfbühne und der Tröpfchenelektroden dazu bei, Das Rauschen bei Bilayer-Strommessungen zu minimieren. Nach Abschluss der Einrichtung in Teil 2 muss der Anwender zunächst die offene Heizreaktion des Ölreservoirs bewerten, indem er eine feste Spannung auf die Heizelemente anwendet und den anschließenden Temperaturanstieg aufzeichnet (wie in Abbildung 4adargestellt). Diese Art der exponentiellen Reaktion kann verwendet werden, um ein einfaches Modell des Closed-Loop-Systems für unterschiedliche Werte von Steuergewinnen zu definieren und zu simulieren (Details siehe Abbildung S4). Die hierin gemeldeten Kontrollgewinne ermöglichen es dem System, schnell auf ein gewünschtes Temperaturniveau zu erhitzen (ca. 2 Minuten) und mit wenig Überschreitung und halten den Sollwert genau. Die spezifischen Gewinne hängen jedoch vom Leistungsniveau der Heizelemente sowie von der Geometrie der Vorrichtung ab, die das Ölreservoir unterstützt. Sobald geeignete Werte der Steuergewinne ermittelt sind und die Rückkopplungssteuerung wie gewünscht funktioniert, kann der Anwender damit beginnen, ein DIB zu montieren und zu charakterisieren.

Das Protokoll ändert nichts am Prozess der DIB-Bildung oder -Charakterisierung, es gibt jedoch Einschränkungen und Überlegungen. Die Erhöhung der Temperatur des Öls kann beeinflussen, wie Tröpfchen an den Elektroden hängen, aufgrund der Verringerung der Monolayer-Spannung und Öldichte, die Tröpfchen absacken und konvektive Ströme im Öl erhöhen, die die Tröpfchen bewegen können. Daher schlägt das Protokoll vor, die Spitzen der Elektroden auf die Bodenoberfläche des Substrats zu senken, so dass Tröpfchen vom Acrylreservoir gestützt und still gehalten werden. Der Benutzer sollte beurteilen, wie stark das Substrat die Tröpfchen verzerren kann (wenn es zu weit abgesenkt wird), und diese Verzerrung bei der Berechnung der Fläche des Doppelschichten aus Bildern von DIBs berücksichtigen, wie an anderer Stelle diskutiert22.

Während das beschriebene System auf die Erwärmung des Ölbades beschränkt ist, könnte anstelle der resistiven Heizelemente ein Peltier-Kühlgerät verwendet werden, wenn Tests bei Temperaturen unter RT erforderlich sind. In diesem Fall muss der Anwender jedoch den Gefrierpunkt der Ölphase berücksichtigen. Viele Alkane gefrieren bei Temperaturen über 0 °C; Hexadecan, das hier beschrieben wird, gefriert bei 18 °C. Wenn das Öl gefriert, sind Tröpfchen nicht mehr beweglich und ein Bilayer zwischen Tröpfchen kann instabil werden oder brechen.

Für eine bisher ungetestete Lipidzusammensetzung sind wichtige Unbekannte die Inkubationszeit und -temperatur, die erforderlich ist, um eine ausreichende Monolayer-Montage an den Oberflächen der Tröpfchen zu ermöglichen. Die allgemeine Regel ist, das Öl auf eine Temperatur über TMzu erwärmen, wo die Lipidmobilität verbessert wird, was eine schnellere seitliche Diffusion und eine engere Verpackung an der Öl-Wasser-Schnittstelle45ermöglicht, und lange genug warten, so dass die Monolayer-Verpackung an der Öl-Wasser-Schnittstelle hoch ist. Der Benutzer kann veröffentlichte Literatur überprüfen oder ihre eigenen ergänzenden Messungen in Betracht ziehen, um geeignete Zeit- und Temperaturwerte zu bestimmen: Grenzflächenspannungsmessungen auf einem Pendeltropfengoniometer können verwendet werden, um die Zeit zu bewerten, die für die Monolayer-Montage46 benötigt wird, und Differential-Scanning-Kalorimetrie wird häufig verwendet, um thermotrope Übergänge von Lipiden38zu identifizieren. Oder ein iterativer Ansatz verfolgt werden, um geeignete Zeit und Temperatur zu identifizieren, wo die Bilayer-Bildung konsistent ist, die Membran für mehr als ein paar Minuten stabil ist und der Widerstand der Bilayer >1 G" beträgt. In neueren Studien mit E. coli Total LipidExtrakt (ETLE)37 und BTLE38führteine Ausgangstemperatur >50 °C konstant zu einer stabilen Bilayerbildung. In ähnlicher Weise kann die minimale stabile Temperatur nach DIB für einen bestimmten Lipidtyp auch zwischen lipidselektionen variieren. Zum Beispiel können ETLE DIBs auf 25 °C37gekühlt werden, während einkomponentige DPPC DIBs immer unter TMbei 40 °C38zusammengeschlossen sind. Die Beobachtung hat gezeigt, dass BTLE DIBS zeigen, dass 27 °C eine sichere Mindesttemperatur für die Aufrechterhaltung einer stabilen Bilayer ist.

Unsere repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass Temperaturänderungen die Eigenschaften des resultierenden DIB stark beeinflussen können. Die Daten in Abbildung 5 zeigen, dass die Nennkapazität der Membran mit steigender Temperatur abnimmt. Da Die Kapazität, C, direkt proportional zur Doppelschichtfläche, Aund umgekehrt proportional zur Dicke, d,

Equation 1, (1)

eine Abnahme in C kann sich durch eine Abnahme von A, einer Zunahme von doder beidem manifestieren (unter der Annahme einer festen dielektrischen Permittivität, ε). Diese Beziehungen motivieren die Verwendung von Kapazitätsmessungen und DIB-Bildern, um Veränderungen in C, Aund Cm im Vergleich zur Temperatur zu bewerten, um zu bestimmen, welche Effekte signifikant sind. Die in Abbildung 5 und Abbildung 6 für BTLE DIBs enthaltenen Daten zeigen, dass sowohl C als auch Cm (was das Verhältnisε/d) darstellt, um fast 50 % abnehmen, wenn die Temperatur von 30 C auf 60 C ansteigt. Zusammen deuten diese darauf hin, dass eine höhere Temperatur die Bilayer verdickt, aufgrund einer erhöhten Löslichkeit der Acylketten der Lipide in Hexadecan48. Das zusätzliche Öl in der Membran kann auch die Grenzflächenspannung der Bilayer und den Kontaktwinkel zwischen tröpfelnden22,38beeinflussen. Diese Effekte können quantifiziert werden, indem Bilder eines DIB in benutzerdefinierten Zeitintervallen analysiert werden, um den Bilayer-Bereich und den Kontaktwinkel während des Erhitzens und Kühlens zu überwachen.

Die Temperaturgünstigung von Öl in der Membran kann auch verwendet werden, um thermotrope Schmelztemperaturen der Lipide zu bewerten und die Ionkanalkinetik zu beeinflussen. Die Schmelztemperatur für ein Lipidgemisch kann definiert werden, indem nichtmonotone Veränderungen in C- und T-Beziehungen wie in Abbildung 6lokalisiert werden. Die aktuellen Messungen in Abbildung 7 zeigen ferner, dass temperaturinduzierte Veränderungen in Phase (d. h. Fließfähigkeit) und Dicke die Schwellenspannung für das Einsetzen von Ionophoren wie Mz beeinflussen können. Diese physikalischen Assoziationen sind wichtig für das Verständnis des Ionenkanalverhaltens in Modellmembranen, insbesondere in Szenarien, die auf die Replikation von Körpertemperaturumgebungen abzielen. Sie können jedoch auch nützlich sein, um die Leitfähigkeit der Bilayer in Anwendungen wie neuromorphen Rechengeräten zu optimieren47 Zum Beispiel ist eine erhöhte Kanalkinetik ein wünschenswertes Feature bei der Herstellung von Geräten, die Speicherwiderstand aufweisen, die die Geschwindigkeit, Funktionalität und kurzfristige Plastizität des Gehirns imitieren müssen.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Finanzielle Unterstützung wurde durch den National Science Foundation Grant CBET-1752197 und das Air Force Office of Scientific Research Grant FA9550-19-1-0213 gewährt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2) Any Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope
25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2) Any Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements.
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid  Sigma Aldrich M3183 Buffering agent for lipid solution
Acrylic substrate Fabricated in house HTD_STG_2 ~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation
Aluminum fixture Fabricated in house HTD_STG_1 Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements 
Brain Total Lipid Extract Avanti 131101C-100mg 25 mg/mL porcine lipid extract 
Compact DAQ Chassis (cDAQ) National Instruments  cDAQ-9174  Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules
Data Acquisition System (DAQ) Molecular Devices  Digidata 1440A  High resolution analog to digital converter
Fixed gain amplifier/power supply Hewlitt Packard HP 6826A Amplifies DC voltage output from the voltage output module
Glass Cover Slip Corning CLS284525 Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer
Heating element (x2) Omega KHLV-101/5 25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit. 
M3 Stainless Steel Screw McMaster Carr 90116A150 Secures thermocouple to aluminum fixture
Patch clamp amplifier Molecular Devices  AxoPatch 200B  Measures current and outputs voltage to the headstage
Personal computer Any Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram
Potassium Chloride Sigma Aldrich P3911 Electrolyte solution of dissociated ions
Temperature input module National Instruments  NI 9211 Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis
Thermocouple Omega JMTSS-020U-6  U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length
UV Curable Adhesive Loctite 19739 Secures glass coverslip to aluminum base fixture
Voltage output module National Instruments  NI 9263 Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis
Waveform generator Agilent 33210A  Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Temperaturgesteuerte Montage und Charakterisierung eines Droplet Interface Bilayers
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Ringley, J. D., Sarles, S. A.… More

Ringley, J. D., Sarles, S. A. Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer. J. Vis. Exp. (170), e62362, doi:10.3791/62362 (2021).

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