Summary
このプロトコルは、溶融温度の上昇を伴う脂質の脂質単層アセンブリおよび液滴界面二重層形成を促進するためのフィードバック温度制御加熱システムの使用、および膜の温度駆動変化を特徴付ける容量測定の詳細を示す。
Abstract
油中の脂質被覆水滴間で脂質二重層(すなわち、DIB)を組み立てる液滴界二重層(DIB)法は、他の方法に対して重要な利点を提供する:DIBは安定しており、しばしば長持ちし、二重層領域は可逆的に調整することができ、リーフレット非対称性は液滴組成物を介して容易に制御され、二重層の組織状ネットワークは、多くの滴を介して容易に制御され、二重層の組織状ネットワークは、多くの滴によって得ることができる。DIBを形成するには、液滴の表面で高密度脂質単層に脂質を自発的に集める必要があります。これは一般的な合成脂質の室温で容易に起こるが、十分な単層または安定な二重層は、いくつかの細胞脂質抽出物を含む室温以上の融点を有する脂質に対して同様の条件で形成できない。この動作は、モデル膜研究におけるDIBの組成(おそらく生物学的関連性)を制限している可能性があります。この問題に対処するために、DIB液滴をホストする油溜層を慎重に加熱し、脂質膜に対する温度の影響を特徴付ける実験プロトコルが提示される。具体的には、このプロトコルは、熱伝導性のアルミニウムフィクスチャと、フィードバックループによって制御される抵抗加熱要素を使用して、より広い脂質タイプの単層アセンブリおよび二層形成を改善する高温を規定する方法を示す。膜の構造的特性は、二重層を含む脂質の熱的な相転移と同様に、DIBの電気容量の変化を測定することによって定量される。この手順を組み合わせることで、多成分脂質混合物の有効な融解温度(TM)の決定を含む、様々な温度にわたってモデル膜の生物物理学的現象を評価するのに役立ちます。この機能は、モデル膜における自然相転移のより緊密な複製を可能にし、細胞の異質性をより良く捕捉するものも含め、より広い範囲の膜構成体からのモデル膜の形成と使用を促進する。
Introduction
細胞膜は、何千もの脂質タイプ1、タンパク質、炭水化物、ステロールから構成され、すべての生きた細胞をカプセル化して細分化する選択的透過性バリアです。その組成がそれらの機能にどのような影響を与えるかを理解し、自然分子と合成分子が細胞膜とどのように相互作用し、接着し、破壊し、トランスポジションするかを明らかにすることは、生物学、医学、化学、物理学、材料工学において広範囲に及ぶ影響を持つ重要な研究分野です。
これらの発見は、合成脂質または天然脂質から組み立てられた脂質二重層を含むモデル膜を組み立て、操作、および研究するための実証済みの技術から直接利益を得ることを目的としています。近年、油脂中の脂質被覆水滴間に平坦な脂質二重層を構築するための液滴界面二重層(DIB)法2、3、4は、5、6、7、8、9、11、1に大きな注目を集めている2,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,およびモデル膜形成のための他のアプローチよりも実用的な利点を示している:DIB法は、実行が簡単である、 洗練された製造や準備を必要としない(例えば、 膜を支える基質の「絵画」)は、一貫して優れた膜を生み出す長寿は、標準的な電気生理学的測定を可能にし、非対称リーフレット組成物3を有するモデル膜の形成を簡素化する。二重層は液滴と各液滴の間に自発的に形成されるため、位置と化粧で調整することができます。 DIB技術は、刺激応答性膜18、24、25、26、27、28、28、バランスのとれた区画化および輸送14、30、31、および組織状材料17、23、32、33、34、35、36を使用して構築する細胞に触発された材料システムの開発にも大きな関心を集めています。
モデル膜に関する公開実験の大半は、DIBを含め、室温(RT、〜20~25°C)および一握りの合成脂質(例えば、DOPC、DPhPCなど)で行われている。この実習では、モデル膜で研究できる生体物理学的な質問の範囲が制限され、観察に基づいて、DIBを組み立てるために使用できる脂質の種類も制限できます。例えば、42°Cの融解温度を有するDPPCのような合成脂質は、密に詰まった単層を組み立てないか、またはRT37でDDBを形成する。室温でのDIB形成は、哺乳類(例えば、脳総脂質抽出物、BTLE)38または細菌(例えば、大腸菌全脂質抽出物、ETLE)37などから生じる天然抽出物に対しても困難であることが証明されている。多様な組成物の研究を可能にすることで、生物学的に関連する条件で膜介在プロセスを理解する機会を提供します。
油の温度を上げることは2つの目的を果たすことができます:それは単層アセンブリの運動学を増加させ、脂質が液体乱れた相に達するために溶融遷移を受ける可能性があります。両方の結果は、単層アセンブリ39、DIBの前提条件を助ける。二重層形成のための加熱に加えて、形成後の膜を冷却して、カロリー測定を用いて検出が困難な天然脂質混合物(例えば、BTLE)内のものを含む単一脂質二重層38における熱的な遷移を同定するために使用することができる。脂質の熱的な遷移を評価する以外に、DIBの温度を正確に変化させることで、膜構造38 の温度誘発変化を研究し、脂質組成および流動性が膜活性種(例えば、気孔形成ペプチドおよび膜貫通タンパク質37)に与える影響を調べることができます。
本明細書において、改変されたDIB油貯留層を組み立て、RTよりも高い温度で単層アセンブリおよび二層形成を可能にするフィードバック温度コントローラを動作させる方法の説明が説明される。以前のプロトコル40とは区別して、オイル貯蔵所のDIBのアセンブリおよび特性評価に平行して温度を測定し、制御するために必要な器械使用の統合に関して明記された詳細が含まれている。したがって、この手順により、ユーザーはさまざまな科学的文脈で温度範囲にわたってDiIbを形成し、研究するためにこの方法を適用することができます。さらに、代表的な結果は、温度が変化するにつれて起こり得る膜構造およびイオン輸送の両方における測定可能な変化の種類についての具体的な例を提供する。これらの技術は、異なる膜組成における膜活性種の運動学の研究を含む、DIBで効果的に設計および実施することができる多くの生物物理学的研究に重要な追加である。
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Protocol
1. 加熱された器具の準備
- 幅と長さで25mm x 40mmにトリミングされた厚さ1mmの絶縁ゴム2個、25mm x 40mmの厚さ6mmのゴム2個、準備されたアルミニウムベースフィクスチャアセンブリ、アルミニウムベースフィクスチャの表示窓に収まるアクリルオイルリザーバー( 図S1、S2、およびS3 を収集して、製作と分解した組み立て図の詳細を参照)。最初に、UV硬化性接着剤でガラスカバースリップ表示窓をフィクスチャの底部に取り付け、フィクスチャの各25 mm x 25 mmサイドフランジの上部に1つの抵抗発熱体を付着させることで、アルミニウムフィクスチャを準備します。
- 細いゴム片を顕微鏡のステージに置き、各片の長いエッジがステージ開口部に接線になるように(図1)。
- アルミベースのフィクスチャを、対物レンズの上に中央に配置したフィクスチャの表示ウィンドウを使用して、絶縁パッドの上に配置します。接続された液滴を撮像するには、適切なアライメントが必要です。
- 各抵抗発熱体の上に厚いゴム片を置き、顕微鏡ステージクリップを使用して所定の位置に保持します。これらの部分は、ステージクリップによって引き起こされる損傷から発熱体を保護し、発熱体とアルミニウム器具と顕微鏡ステージの両方の間の偶発的な電気ショートに対して絶縁します。
- 熱電対の測定端を慎重に曲げて、終わりから~4mmで90°の角度を達成します。
- 熱電対の曲がった先端をアルミニウム製の器具の左下隅に挿入し、ロックねじで静かに固定します。
- アクリル貯留層をアルミニウム製の器具の井戸に入れる。これは、アルミニウム器具のウェル(ステップ1.8)に六方体油を添加する前に行われ、視聴窓とアクリル貯留層の底部との間の気泡をトラップするリスクを最小限に抑え、液滴の視界を妨げる可能性があります。
注:アルミニウム器具の表示室に添加されたオイルは、アクリルのリザーバ内に含まれる液滴のより鮮明な画像化のためにアクリルとガラスの屈折率を一致させるために使用されます。したがって、アルミニウム製のフィクスチャのウェル内の油はアクリル貯留層の内容物に接触せず、アルミニウム製の器具の厳密な洗浄は必要とされないことに注目する価値がある。 - アルミニウム製の器具(アクリル貯留層とアルミニウム製の固定具の壁の間)のウェルにヘキサデカンオイルの約1,000 μLを分配し、過剰充填しないように注意してください。アルミニウム器具のウェル内の油レベルは、熱伝達のための表面積を最大化するために許容される限り高くする必要があり、一方で、油は顕微鏡の段階または対物レンズに器具の端にこぼれないようにする。
- ヘキサデカンオイルの約1,000 μLをアクリル貯蔵所に分配し、オーバーフィルしないように注意してください。
注:アクリル貯留層は、実験の間に常に徹底的に清掃する必要があります。ユーザーは、エチルアルコールと脱イオン水を伴う連続したリンスからなる連隊を採用し、その後12時間以上乾燥器ボウルで乾燥する必要があります。
図1:加熱ステージアセンブリ 画像は、DIB形成のための熱伝導フィクスチャおよびオイルリザーバのアセンブリを示しています。各イメージの下の数字は、プロトコルの対応するステップを識別します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
2. DIBの同時フィードバック温度制御と電気特性評価のための計測
注:このプロトコルは、DIBのフィードバック温度制御と同時電気特性を可能にするための次の機器を統合します:2つの利用可能なユニバーサルシリアルバス(USB)接続を備えたパーソナルコンピュータ(PC)、専用データ集録(DAQ-1)システムにペアリングされたパッチクランプアンプ、波形発生器、電圧出力と温度入力モジュールを備えた2番目のプログラム可能なDAQ(DAQ-2)、電源/アンプ。以下の手順では、DIBの同時電気生理学から温度の測定と制御を分離するために必要なこれらの機器の必要な接続( 図2aに示すように)について説明します。同等の機器の置換は必要に応じて行われる場合があります。
- DAQ-2モジュールへの出力および入力接続を確立します。
- 差動電圧接続用の電圧出力モジュールのネジ端子を 2 組選択し、これらの位置にワイヤを接続します。奇数端子は共通のグラウンド接続であり、偶数端子は(図2c)に示すように、非丸め出力です。これらの2つのリード・ワイヤのペアをそれぞれ別のスクリュー・ターミナルBNCアダプターに接続し、電圧信号を他の機器にルーティングするために使用される別のBNCケーブルに各アダプターを接続します。
注: この設定では、端子 0 と 1 の差動接続が電力増幅器への温度制御出力に割り当てられ、端子 6 と 7 の別の接続ペアがパッチ クランプ アンプを介してドロップレットに送られる電圧出力用に指定されています。 - (図2c)を参照して、熱電対入力モジュール上の熱電対端子のセット(例えば、端子2と3はTC1対として指定されている)を選択し、その熱電対線を接続します。
- 差動電圧接続用の電圧出力モジュールのネジ端子を 2 組選択し、これらの位置にワイヤを接続します。奇数端子は共通のグラウンド接続であり、偶数端子は(図2c)に示すように、非丸め出力です。これらの2つのリード・ワイヤのペアをそれぞれ別のスクリュー・ターミナルBNCアダプターに接続し、電圧信号を他の機器にルーティングするために使用される別のBNCケーブルに各アダプターを接続します。
図2:システム配線接続 システムに必要なデバイスと配線の概略を(a)に示し、DAQ-2 接続の詳細は(b)で示されています。(c)の図は、DIB形成のために油に沈められたヒドロゲル被覆電極上の水性液滴を示している。2つの電極は、パッチクランプアンプのヘッドステージユニット上で、それぞれ接地された(V+)接続に接続されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
- DAQ-2モジュールへの電気接続ができたら、USB接続でDAQ-2シャーシをPCに接続し、電源に接続します。次に、商用ソフトウェアで使用する前に、ドライバとソフトウェアのインストールが成功したことを確認します。
- DAQ-2と抵抗発熱体の間でパワーアンプを構成し、接続します。
- ゲインが10倍の固定ゲイン増幅モードで動作するようにアンプを設定します。
- バナナジャック-BNCアダプタを使用して、電圧出力モジュール(図2b)の端子0と1から発生するBNCケーブルをパワーアンプの入力接続に接続します。
- 追加のBNCアダプタとケーブルを使用して、パワーアンプの出力端子を、相互に平行に配線された両方の発熱体と、使用中に両方の要素が同じ電圧降下を維持するようにアンプに接続します。
- 電気生理機器に必要な接続を確立します。
- 電圧出力モジュール(図2b)の端子6と7から発生するBNCケーブルを、パッチクランプアンプ背面の背面交換外部コマンドBNCコネクタに接続します。
- パッチクランプアンプの背面にある、波形発生器の出力とフロントスイッチ外部コマンド接続の間に2本目のBNCケーブルを接続します。
注:これら2つの接続は、パッチクランプアンプを介して液滴電極に適用される電圧波形を生成するための代替方法を提供します。波形発生器は、膜容量を測定するために使用される三角波形電圧を生成するのに特に有用です。ユーザーは、どちらかの場合、自分のアプリケーションに必要などちらが必要かを決定できます。 - 3本目のBNCケーブルを使用して、パッチクランプアンプの前面パネルにある測定電流の出力を、DAQ-1前面の利用可能なアナログ入力BNCコネクタに接続します。
- 4本目のBNCケーブルを使用して、測定された膜電圧(パッチクランプアンプの背面)の出力をDAQ-1の別のアナログ入力コネクタに接続します。これにより、電極全体に印加される電圧のデジタル化が可能になります。
- ref.40のステップ7-9で説明されているように、2つの液滴電極を準備し、マイクロマニピュレータでサポートすると、電極をパッチクランプヘッドステージに接続します。
注:ヘッドステージの役割は、電極間の電圧を制御し、得られた電流を測定し、パッチクランプアンプによって出力される比例電圧をDAQ-1に変換することです。 - USB接続でDAQ-1をPCに接続し、対応する電源ケーブルをパッチクランプアンプとDAQ-1の両方に接続します。
- すべての測定機器の電源をオンにします。
注: このセットアップで最も重要な詳細は、パワーアンプ出力(mA-A)接続がパッチクランプアンプのヘッドステージユニットから電気的に絶縁されるようにすることです。
3. 液滴界面二重層のフィードバック温度制御
注: フィードバック温度制御システムを操作するための以下の手順は、比例積分 (PI) フィードバック温度制御40,41を実装するために作成されたカスタムグラフィカルユーザーインタフェース(GUI)に基づいています(補足コーディングファイルを参照)。その他のソフトウェアおよび制御アルゴリズムを代わりに使用することができます。このプログラムのコピーは、読者に紙の補足情報を提供しますが、ユーザーは自分の機器やニーズに合わせて設定する責任があります。
- PCでDAQ-2ソフトウェアを起動し、温度管理プログラムファイルを開きます。GUI が開いたら、GUI の左下隅にあるフォルダアイコンをクリックし、温度制御プログラムを選択してプログラムを再度開きます (図 3)。
- 比例制御ゲイン(KP)と積分制御ゲイン (KI) に適切な数値を入力します。
注: KP と KI の値は 0.598 と 0.00445 で、セットアップで適切に動作することが判明しました。これらの値は、測定されたオープンループ加熱応答から得られたパラメータを組み込んだシステムモデルを用いたシミュレーションを通じて反復的に決定された( 図4参照)。 オープンループ加熱時には、所定の加熱電力は測定温度とは無関係です。対照的に、 クローズドループ加熱 は、測定温度を所望の温度に近づけるようにヒーターに適用される電力を継続的に調整することで構成されています。これは、PI制御スキームを用いてここで達成される。 - 温度制御スキームをテストするには、希望の設定点温度(室温以上)を入力し、GUI内でフィードバック温度制御をオンにします。フィードバック(閉ループ)制御下の測定された温度信号を、GUIに数分間表示します。測定された油の温度が目的の温度を大きくオーバーシュートしたり、変化に反応しすぎる場合、または目的の設定点に収束しない場合、ユーザは制御ゲインを調整して、所望の閉ループ性能を達成する必要があります。
注:プログラムは、抵抗発熱体に供給される電力(したがって電圧)の飽和限界を定義します。例えば、ここに報告された2つの要素は、それぞれ最大5Wの電力を消費する。これらを並列に配線すると、総消費電力が10Wを超えないようにします。ユーザーは、デバイスに供給する必要がある電力の最大量を考慮し、この制限がクローズドループシステムが望ましい温度変化に応答する速度に影響を与える可能性があることを知ることをお勧めします。高い電力加熱要素は、より速い加熱と高い設定点温度を可能にしますが、加熱のために高い供給電流を必要とします。 - システムが許容可能な閉ループ性能に調整された状態で、DIB形成に必要な油温をGUIのセットポイントとして入力します。
注:例えば、60°Cの設定点温度は、水滴37中のBTLEリポソームを用いた実験で良好な結果をもたらした。このユーザは、ワイヤ型電極に掛かる液滴と、パッチクランプアンプ、DAQ-1、および電気生理学測定ソフトウェアを用いた電気生理学的機器の構成との間のDIBアセンブリを説明するプロトコルについて、他の2,40と呼ばれています。具体的には、Najem、ら40によるプロトコルは、ステップ13まで密接に従うことができる。そのステップを超えて、単層または二層形成を促進するために加熱を必要とする脂質を使用する場合、わずかに異なるアプローチが単層および二層形成を成功させるために採用される。 - アクリル貯留層の底に近くなるまで、銀/塩化銀(Ag/AgCl)電極の先端を油に下げます。この電極先端の位置決めは、油中の対流電流がヒドロゲル被覆電極から液滴を取り外すのが観察されている加熱された油中の電極上の液滴を保つために極めて重要である(図2c)。
- 2mg/mLのBTLE、100 mM塩化カリウム(KCl)、10mM 3-(Nモルフォリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)を各電極先端に含む水性脂質溶液250nL液滴を各電極先端にインキュベートし、加熱された油中に最低10分間インキュベートさせ、単層形成を促進する。
- ヘッドステージと加熱されたステージフィクスチャを接地したファラデーケージで覆います。
- ゆっくりと液滴を穏やかな接触に持ち込む
電極の水平位置を操作して、ユーザーが接触から液滴が変形するのを見るか、または互いに変位し始め、二重層形成が始まるまで数分待つ。数分後に二重層が形成されない場合、液滴を二重層形成を容易にするためにより一緒に強制することができる。薄くなった界面二重層の形成は、目視検査(図5a)、または10mV、10Hz三角電圧22を出力する波形発生器によって誘導される方形波容量電流の振幅の増加を測定することによって確認することができる。二重層が、初期形成時および初期設定点での後続の特性評価の前に、安定した界面領域に到達するまで、最低10分間平衡化を可能にする。
注:油の種類は、二層間薄化、膜の厚さ、および液滴間接触角度に大きな影響を与える可能性があります。一般に、油分子が小さいほど、脂質アシル鎖によって占める二重層の疎水性コアに留まることが容易である。油保持は、単層と二層の緊張と厚さの両方を増加させ、液滴間の接触の領域と角度を減少させます。これらのメトリックは、接着の弱い状態を意味します。より大きく、よりかさばる分子は逆の効果を発揮する。例えば、スクアレンはヘキサデカンなどのアルカンよりもかさばる分子であり、二重層間の間から容易に排除することを可能にする。このように、スクアレンで形成されたDIBは薄く、接触領域および角度が高く表示され、形成22、42(液滴と滴下接着の尺度)のより高い自由エネルギーを示す。
4. DIBにおける温度依存の挙動の特性
注: DIB ベースのモデル膜では、温度の変化が膜の構造や輸送特性にどのような影響を与えるかなど、多くの物理プロセスを研究できます。以下のステップは、望ましい温度で二重層形成が成功した後に実行されるべきである。
- 膜38中の脂質の熱的な相転移を同定するために二層形成を可能にする設定点から油浴の温度を下げながら、膜の公称容量を測定する。
- GUI の 温度グラフ を右クリックし、表示されたデータをクリアします。これにより、バッファ内の十分な領域が後続の記録に使用できるようになります。
- パッチクランプアンプに接続された波形発生器を使用して、DIB電極に三角電圧波形(例えば、10mV、10Hz)を適用し、二重層を介して誘導電流応答を記録します。
- 設定点温度を5°C刻みで下げ、望ましい温度が達成されるまで温度変化の間の新しい定常状態温度で最低5分待って二重層を冷却します。あるいは、フィードバック制御システムをオフにして二重層を受動的に冷却してみてください。ただし、50~60°Cの受動冷却を実施する実験は、より高い合体率をもたらしたことに注意してください。
- オイルバスと二重層が希望する最低温度まで冷却した後、GUIの温度グラフをもう一度右クリックし、温度データ対時間をスプレッドシートソフトウェアにエクスポートします。現在の記録を停止します。
- 測定電流から、冷却期間中の時間に対する方形波電流応答の公称静電容量を計算します。
- 公称キャパシタンス(C)対温度(T)をプロットして、膜容量がどのように変化したかを観察します。 C と T の非単調な変化を見つけて、 TMを識別します。
注意:公称キャパシタンスは、矩形波電流43(|の振幅から計算することができます。I|)リレーションシップ |の使用私|= C dv/dt、ここで、dv/dt は電圧振幅の4倍の積(|V|)適用された三角電圧の周波数(f)を有する。これらの方程式から、C = |I|/(4|V|f)
- 同様に、オイルバスと二重層領域の温度を連続的に増加させることにより、二重層の準静的特定容量(Cm)を一定温度で評価する。
- GUIを使用して設定点温度を10°C単位で変更し、システムが新しい温度に平衡化できるようにします。
- ステップ 4.1.2 を実行して、容量電流と記録の測定を開始します。
- マイクロマニピュレータを用いて電極の位置を慎重に調整することで二重層面積を変化させる(すなわち、電極を分離すると、二重層面積が減少する)。正方形波電流が定常状態に達し、DIBの画像を収集して、顕微鏡に取り付けられたカメラを使用して顕微鏡ステージの開口から見た二重層を画像化することで、膜面積対時間の計算を可能にします。同時に、現在の記録ソフトウェアにデジタルタグを追加して、画像コレクションの対応するタイムポイントをマークします。
メモ:マイクロマニピュレータは電極の精密な制御を可能にし、液滴間の穏やかな接触を可能にする。液滴の粗い操作は、液滴の合体によって、または電極から滴が落ちるようにすることによって失敗した実験につながることができます。他の22で説明したように、二重層領域は、下側図画像で重なり合う円として現れる液滴間の接触長さから計算される。液滴の位置と寸法、および接触線の長さは、画像処理ソフトウェアまたは他の科学プログラミングツールを使用して計算することができる。 - ステップ 4.2.1.2 を最低 4 回繰り返して、合計 5 つの DIB 画像と二層電流の定常領域を取得します。
- 希望する各温度でステップ 4.2.1 を繰り返します。
- 取得した画像の定常二重層領域に対応するタグ付きタイムポイントで、現在の記録とDIB画像を分析して、各温度の C および A データを抽出します。
- 各温度のプロットC対Aデータを計算し、各温度22における二重層のCmを表す第1次回帰の傾きを計算する。
- ステップ 4.2.4 とTから得られた Cmのプロット値。
- C m対Tデータで非単調な変動を調べて、融解温度TMを特定します。
- GUIを使用して設定点温度を10°C単位で変更し、システムが新しい温度に平衡化できるようにします。
- 二重層全体でDC電圧ステップ入力を生成することにより、電圧依存性イオンチャネル形成のダイナミクスを評価します。
- 初期電圧を希望のステップ値(例:100 mV)に設定します。
- [最終電圧]と[ステップサイズ]を希望のステップより高い値(例えば、110 mVの最終電圧および110 mVステップサイズ)に設定します。
- ステップ入力の所望の持続時間を秒単位(例えば90秒)で設定します。
- ステップ入力に必要な極性(例えば、正数)を選択します。
- パッチクランプアンプをスイッチして、GUI/電圧出力モジュールから発生するコマンド電圧をヘッドステージに送ります。
- 現在の録画を開始します。
- 電圧をオンにして、誘導電流応答を記録し、臨界電圧に対するS字型応答を示す必要があります(例えば、2 mg/mL BTLEで1μg/mL Mzの場合は〜70mV)。
- これとは別に、膜の動的電流電圧関係を所望の温度で得て、イオンチャネルの挙動などの電圧依存関係を明らかにすることができます。
- パッチクランプアンプを切り替えて、波形発生器から発生するコマンド電圧をヘッドステージに送り、電流記録を開始します。
- 波形発生器で、希望の振幅、オフセット、周波数を持つ連続正弦波波形を出力します。
- 1つまたは複数のサイクルにわたって誘導電流応答を記録します。
- 異なる正波振幅、周波数、温度に対して、必要に応じて繰り返します。
図3: 温度制御GUI この図は、オイルバスの温度を制御するためにプログラムのGUIを使用するために必要な重要なステップを強調し、ラベル付けします。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Representative Results
図1は、DIB形成用の顕微鏡ステージ上でアルミニウム製の器具およびアクリルオイル貯留層がどのように調製されているかを示しています。組み立てステップ1.2-1.4は、より効率的な加熱のために、ステージからフィクスチャを熱絶縁するのに役立ちます。ステップ1.5-1.7は、熱電対をフィクスチャに適切に取り付け、オイル貯蔵所を配置する方法を示し、ステップ1.8 -1.9はこれらの部分に油を分配するための推奨場所を示しています。
図 2 は、フィードバック温度制御を確立し、DIB で電気測定を行うコンポーネントの概要を示しています:PC、固定ゲインパワーアンプ、パッチクランプアンプ、DAQシステム(または電圧を印加してpA-nAレベル電流を測定するための同等の機器)、適切なアナログ入力と出力を備えた2番目のDAQ、波形発生器、および取り付けられたレジストヒーター付きアルミニウム製の固定具。DAQ-2は2つのモジュールを利用しています(図2b)。4チャンネル、±10V、16ビットのアナログ電圧出力モジュールを使用して、パワーアンプの入力に供給される独立電圧( 図2aの青色接続)とパッチクランプアンプの外部コマンド入力(グリーン接続)を開始します。電圧出力モジュールは、最大出力電流46mA、最大出力電圧10Vで制限され、一方、この中で使用される各発熱体は最大電圧28Vで5Wの電力(最大180mA max)を消費します。このため、出力電圧を事前に増幅し、アルミニウム器具に取り付けられた(並列で配線された)発熱体に供給するために必要な供給電流を補うために、電源/アンプが含まれていました。4チャンネルの24ビット熱電対入力装置を使用して、DIB近くのオイル貯蔵所からの温度測定値をデジタル化します(黄色の接続)。熱電対入力装置モジュールは最大4つの熱電対を可能にするので、ユーザーは器具の他の位置で温度を監視することを検討するかもしれない。この場合、フィードバックループ内の目的の設定点温度と比較するために、どの信号または信号の組み合わせを使用するかを考慮する必要があります。
これらの出力と測定信号は、2つのソフトウェアを介して制御されます: 1) 温度制御用のカスタム GUI;2)電気生理学の測定ソフトウェア。 図 3 は 、GUI のスクリーンショットを示し、プロトコルの対応するステップへの注釈を示しています。GUIは、主要なパラメータ(設定点温度、PI制御ゲイン、電圧制限)を定義し、測定温度を設定点温度と比較し、アンプと発熱体に供給される制御信号を計算し、温度と印加電圧対時間のデータを記録するために使用されます。このプログラムには、パッチクランプアンプを介してDIB電極(図2c)に印加される電圧を指令する機能も含まれています。これとは別に、測定ソフトウェアは、DIB電極に印加される電圧と脂質二重層を介した誘導電流の両方の測定値を構成するために使用される。DIB電流に比例した電圧はパッチクランプアンプによって出力され、BNCケーブルを介してDAQ-1に送られます(接続は示されていません)。
図 4は、オープンループとクローズドループの両方の加熱シナリオで、ヒーターに送られた温度と絶対電力の変化と時間の変化をプロットしたものです。前者の場合、~5.2Wの電力に対応する任意の入力電圧がヒーターに印加され、その結果、温度が指数関数的に上昇し、その結果、時定数は~125s、初回遅延後にΔT≈4.5°C/Wの定常状態となった。 オープンループシステムのこれらの特性は、比例制御ゲインと積分制御ゲインの値を決定するために使用できるシミュレーションソフトウェア(詳細は図S4を参照)で閉ループシステムのモデルを構築するために使用されました。このように、図4のクローズドループとシミュレーションされたモデル応答は、調整されたPIコントローラの測定応答とシミュレートされた応答を表し、KPとKIの値はそれぞれ0.598と0.00445で、RTよりも20°C高い設定点温度に対して、シミュレーションと測定値の両方が閉ループシステムの応答速度の増加を確認します(時間63)。加熱時間の短縮は、より高い初期適用電力を犠牲にして来る。それでも、所望の設定点温度および測定された油温は、使用に適していると考えられた定常状態で0.6°C以内にとどまった。供給される総電力は、2つのヒーターの10 Wの総電力制限を食い止めないように、クローズドループ制御中のプログラム内で制限されます。
温度制御システムは、BTLE脂質から形成されたDIB中の溶媒の温度依存性と膜容量への影響を示すために使用された(図5)。BTLE脂質は、35〜42°Cの間で起こる脂質相転移のためにDIB形成に加熱が必要であるため、この測定に選択した。本明細書に記載のプロトコルは、60°Cで二層形成を開始するために行った。 膜形成および平衡の後、必要に応じて温度を連続的に下げたり上げたりして、膜の応答を特徴付けることができる。例えば、図5aは、RTから〜60°Cまでの加熱サイクル中の生容量電流(正方形の波形)と温度対時間の代表的な測定値を示しています。 静電容量電流波形の振幅は、膜の疎水性コアへの油の取り込みによって引き起こされる温度が上昇するにつれて半分以上減少することを観察してください。この変更は、インターフェイスを厚くし、二層22、37、38の横張力を変更します。
図5bのデータは、60°Cでの初期二重層形成後の1つの完全な冷却加熱サイクルにわたってC(27°Cでの静電容量によって正規化された)の変化を示しています。 図5aと同様に、温度が上昇すると、容量が低下します。しかし、このプレゼンテーションがより明確に示しているのは、液体順と液体障害熱性熱刺激相の間で脂質混合物が移行する間に、一括融解温度であるTMを表す〜30〜42°Cの間の温度で起こる非単調な変化である。非単調な容量変化が生じる温度は、膜38からの油の排除から二層厚さの変化に相当する。また、加熱サイクルと冷却サイクルの間に示されるヒステリシスは、後続のサイクル間に生じる二重層領域の不可逆的な変化によるものであり、これは通常10分離れて行われたことに注意してください。
同様に、図6a,bは、異なる温度でのC mの準静的測定値を使用してT Mを同定する方法を示しています。ここで、膜の面積は、液滴電極間の距離を手動で増加させることによって連続的に変化する。この実験の間、液滴はまず、電極間の段階的な分離を伴う接触領域の後の減少の前に最大膜面積を促進するために一緒に押される。接触の各レベルでは、二重層の公称キャパシタンスは誘導電流から評価され、その領域は画像解析によって決定される。C対Aをプロットすると線形回帰が可能で、傾斜は図 6aに示すようにCmの値を表します。この手順を複数の温度にわたって繰り返す(図6b)は、CmがTMを超える温度で50%近く減少することを示し、加熱誘導六方体の取り込みによる膜の疎水性厚さの増加を確認する(完全なC対Aデータの図S5を参照)。より高い温度では、膜内の追加溶媒はまた、液滴間の最大接触面積を減少させ、したがって、最大公称キャパシタンスを減少させる。温度を下げると、これらの効果が逆転します。図6cのDIB画像は、温度(25°C)がTMを大きく下回ると、膜が、十分に分離された電極によって引き起こされる伸びた液滴の張力下でも高い接着状態を安定的に採用できることを示しています。これは、二重層から六方板を完全に排除した結果であり、液滴の接着エネルギーを増加させる。この状態では、二重層面積は電極の操作によって確実に変化することができず、特定のキャパシタンスを正確に測定する能力を妨げる(詳細は図S5を参照)。
最後に、図7の代表的なデータは、温度変化がDIBを介してイオン伝導チャネルを作り出す気孔形成種の挙動にどのような影響を与えるかを示しています。モナゾマイシン(Mz)は、十分な膜貫通電位37、44で二層を通して陽膜選択的チャネルを形成する陽性帯電抗生物質であり、この関係を実証するために選ばれた。これらの測定は、BTLEベース(両方の液滴で2mg/mL最終濃度)DIBがMz(両方の液滴で1μg / mL最終濃度)でドープされた上で行われました。図7aに示す電流対電圧トレースは、内膜電圧を印加し、2つの異なる温度で誘導電流を測定することによって得られた。図7aの矢印とその後の数字は、時間に対する中弦波電圧の連続する四分の一を視覚化するのに役立ちます。このタイプの測定は、イオンチャネルを通る電流の電圧依存性を調べるためにしばしば行われます。ここでのデータは、DIBの温度を27°Cから45°Cに上げると、チャンネル形成の閾値が〜|100 mVから上昇することを示している|~|110 mV|まで。この変化は、吸収された油による膜厚の高さによって駆動される可能性が高く、挿入のためのエネルギーバリアが上昇したことを示している。これらの曲線におけるヒステリシスは、メモリ抵抗を意味する−二層領域またはMzチャネル形成および不活性化44の運動論における電圧誘発変化によって引き起こされる可能性がある。
これらの要因をDibで分離するために、DCステップ電圧に応じてイオン電流の過渡変化を測定することができます。 図7b は、同じ電圧レベル(+90mV)と2つの異なる温度(27°Cおよび45°C)で同じMzドープBTLE膜の測定電流密度を示しています。データは、チャネル応答の動態が全く異なっていることを明確に示しています。特に、27°Cでは、膜は、過渡的な崩壊が続く電流のより速く、より大きな増加を示す(後者は、二重層を横切って非アクティブ状態44にトランスバジしたMzチャネルの結果である)。応答は45°Cではるかにミュートされ、電流の S字型の上昇は後続の低下によって進行しない。このような違いは、チャネル応答の運動を評価し、それらが膜の総動的抵抗にどのように寄与するかを理解するのに役立ちます。
図4:オープンループとクローズドループ加熱 パネル(a)は、測定およびシミュレートされた(SI参照)閉ループシステムの時間応答を+20°Cの温度ステップと、固定された印加電力下のオープンループ加熱応答と比較します。パネル(b)は、各システムによって消費電力が消散する電力を表示します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5: 静電容量と温度の変化を測定する。 相転移を受けたBTLE脂質膜上の10mV、10Hzの三角波形入力に対する典型的な方形波形電流応答を(a)に示す。脂質の相転移は、上のパネル(a)に表示される領域測定データにも見られる。27°Cでの初期静電容量によって正規化された静電容量は、加熱および冷却サイクルの温度の関数としてプロットされたパネル(b)に示されている。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:特定の容量測定パネル(a)は、2つの異なる温度の連続した接触領域で得られた公称静電容量対二重層面積を示しています。各セットに対する線形回帰は、それぞれの C Mの値を決定するために使用されます。パネル(b)プロットCM対T、パネル(c)は25°Cでの液滴分離の試み下にある安定した容量性電流波形(左)と接触領域(右)を示しています。
図7:電圧依存性膜抵抗とMzイオンチャネル運動と温度 パネル(a)は 、1μg/ml Mzを含む液滴間で形成されたBTLE DIBの温度と共に電流と電圧の関係がどのように変化するかを示しています。矢印と数字は、適用された正波の連続する部分を表します。これらのトレースの違いは、温度がMz挿入の電圧閾値をどのようにシフトするかを示しており、これは誘導電流が急激に増加する電圧の大きさとして識別されます。同様に、パネル(b)は、DCステップ電圧90mVによって誘導される過渡電流応答に温度が与える影響を示す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図S1:アルミニウム製のフィクスチャ。 この図面は、加熱された段階の基部であるアルミニウム製具の製造に必要な寸法と特徴を示しています。油井に隣接する25.2 mm X 26 mmの平坦なスポットは、フィクスチャと熱伝導のための発熱体との間の表面領域接触の最大量を可能にするように設計されていた。同様に、アルミニウムは、その高い熱伝導性のためにベースの固定材料のために選ばれました。プリントで出されたM3 X 0.5 mmねじ穴はオイル井戸の熱電対をしっかり止め、置くために使用される。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図S2:アクリル基板。 アクリル基板は、プロファイルを除いて、重要な優れた機能を持たない、作製する比較的簡単な部分です。外装プロファイルはPoka -ヨークを念頭に置いて設計されているので、アクリル基板は熱電対が油井戸に収まるように十分なスペースを与えるようにフィクスチャ内でのみ配向することができます。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図S3:加熱ステージアセンブリ。 組み立てられた加熱されたステージの分解図は、初期セットアップ中に実験者を支援するために提供されています。また、これはプロトコルステップ1.8の間にオイルでアルミニウムの据え付け具を満たす理想的な位置であるとして、破線の円によって強調された領域に注意してください。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図 S4: オープンループデータとシムリンクモデリングパネル (a) は、システムの遅延時間 、td、時定数 、τ、オープンループ加熱ゲイン 、αを評価するために使用された、さまざまな DC 電力レベルに対するオープンループ温度応答を示します。遅延時間は、温度が上昇し始める前のタイムラグ(〜20 s)を表します。 τ の値(*、~125 sで示される)は、温度上昇全体の63.2%が発生するのに要する時間として定義されます。パネル (b) は、温度の定常状態変化 (∆T) と適用された電力を示します。(b)でプロットされたデータの傾きを使用して 、供給電力あたりの温度変化の比率を表すαを計算しました。これらのパラメータは、パネル(c)に示すモデルで使用され、PIコントローラを調整して望ましい閉ループ温度制御応答を実現するための補助ファイルとして提供されました。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図 S5: 追加の特定のキャパシタンス データ。図6a,bに示すプロットは、このCMデータ・セットからコンパイルされた。このプロットは、25°C以下の温度で静電容量を正確に測定できないことも示しているため、この測定はデータセットから除外されました。正確なCm測定に必要な面積変化は、マイクロマニピュレータからの液滴に過度の力を加える必要があり、液滴の形状および接触面積の断面積の歪みを引き起こす。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足的なコーディング ファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本明細書に記載されているプロトコルは、Dibを形成するために使用される油および液滴の温度を制御する実験システムを組み立て、操作するための指示を提供する。RT以上の融解温度を有する脂質を用いてDIB形成を可能にする上で特に有益である。さらに、油溜めの温度を正確に変化させることにより、二層温度を操作して、容量、面積、厚さ、熱伝導相変化、膜活性種の運動論、および二層37,38の接着のエネルギーを含む様々な膜特性および特性に対する高温の影響を研究することができる。
プロトコルは、DIB研究で使用する前の3つの部分で構成されています: 1) 加熱ステージ器具の準備とアセンブリ;2)様々な楽器を接続します。3)選択された比例および積分制御の利益と適切な温度制御性能を確認する。パート 2 で最も重要なのは、パワー アンプ(>mA 電流)とパッチ クランプヘッドステージ(pA-nA 電流)の出力間の共有伝導経路を避ける必要があります。不注意なショートは、ヘッドステージに永久的な損傷を引き起こす可能性があります。さらに、PCとすべての機器が共通のAC電源グランドに接続されていることを確認し、ヘッドステージと液滴電極の近くに接地ファラデーケージを使用することで、二重層電流測定のノイズを最小限に抑えることができます。パート2のセットアップが完了した後、ユーザーはまず、発熱体に固定電圧を印加し、その後の温度上昇を記録することによって、オイル貯蔵所のオープンループ加熱応答を評価する必要があります( 図4aに示すように)。このタイプの指数応答を使用して、制御ゲインの値を変更するためのクローズドループシステムの単純なモデルを定義およびシミュレートできます(詳細は 図S4 を参照)。ここに報告された制御ゲインにより、システムは望ましい温度レベルに素早く(〜2分)加熱し、ほとんどオーバーシュートを行い、設定点値を正確に維持することができます。しかし、必要な特定の利益は、発熱体の電力レベルだけでなく、油溜まりを支える器具の形状に依存します。制御ゲインの適切な値が決定され、フィードバック制御システムが望ましいように動作すると、ユーザはDIBを組み立てて特徴付け始める。
このプロトコルは DIB の形成や特性評価のプロセスを変更しませんが、制限と考慮事項があります。油の温度を上げると、単層張力の低下と油密度が低下し、液滴を動かすことができる油の液滴たるみと対流が増加するため、電極に液滴が掛かる方法に影響を与える可能性があります。したがって、このプロトコルは、液滴が支持され、アクリル貯蔵所によってまだ保持されるように、電極の先端を基板の底面付近に下げることを示唆している。ユーザーは、基質が液滴をどの程度歪曲させる可能性があるかを評価し(あまりにも低くした場合)、他の22で議論されているように、DIBの画像から二重層の面積を計算する際にこの歪みを考慮すべきである。
記載されたシステムはオイルバスの加熱に限定されるが、RTより低い温度での試験が必要な場合には、抵抗発熱体の代わりにペルチェ冷却装置を使用することができる。しかし、この場合、ユーザーは油相の凝固点を考慮する必要があります。多くのアルカンは、0°Cの高い温度で凍結します。本明細書に記載のヘキサデカンは18°Cで凍結する。 油が凍ると、液滴は移動しなくなり、液滴間の二重層が不安定になったり破裂したりする可能性があります。
以前にテストされていない脂質組成の場合、重要な未知数は、液滴の表面で十分な単層アセンブリを可能にするために必要なインキュベーション時間および温度です。一般的なルールは、油と水界面45での迅速な横拡散と密閉を可能にする脂質移動性が強化されるTM以上の温度に油を加熱し、油水界面での単層パッキングが高くなるほど長く待つことである。ユーザーは、公開された文献をレビューするか、または適切な時間および温度値を決定するために独自の相補的な測定値を検討することができる:ペンダントドロップゴニオメーター上の界面緊張測定は、単層アセンブリ46に必要な時間を評価するために使用することができ、微分走査熱量測定は、脂質38の熱的遷移を同定するためにしばしば使用される。あるいは、二重層形成が一貫している適切な時間と温度を同定するために反復的なアプローチを追求することができ、膜は数分間以上安定であり、二重層の抵抗は>1GΩである。大腸菌全脂質抽出物(ETLE)37およびBTLE38を用いた最近の研究では、47始温度>50°Cが安定した二重層形成をもたらす。同様に、所定の脂質型に対するDIB後の最小安定温度も、脂質選択の間で変化し得る。例えばETLE DIBは25°C37まで冷却することができるが、一方、単一成分のDPPC DIBは常にTM〜40°C38以下に合体した。BTLE DIBSは、27°Cが安定した二重層を維持するための安全な最低温度であることを示しています。
我々の代表的な結果は、温度の変化が結果として得られるDIBの特性に大きな影響を与える可能性があることを示している。図5のデータは、膜の公称キャパシタンスが温度上昇に伴って減少することを示しています。容量は、Cは二重層面積に正比例し、A、厚さに反比例するため、d
, (1)
Cの減少は、Aの減少、dの増加、またはその両方 (固定誘電率を仮定して、ε) で現れる可能性があります。これらの関係は、C、A、およびC m対温度の変化を評価するために、容量測定とDIB画像の使用を動機づけて、どの効果が有意かを判断します。BTLE DiBsの図5および図6に含まれるデータは、CおよびCm(比ε/dを表す)の両方が、温度が30°Cから60°Cに上昇するにつれて50%近く減少することを示しており、これらは、より高い温度が二層を厚くし、ヘキサデカン48における脂質のアシル鎖の溶解性の増加に起因することを示している。膜内の追加の油はまた、二重層の界面張力および液滴22,38との接触角に影響を及ぼす可能性がある。これらの効果は、冷暖房中の二重層面積と接触角を監視するために、ユーザが指定した時間間隔でDIBの画像を分析することによって定量化することができます。
膜内の油の温度の好感度はまた、脂質の熱伝導性融解温度を評価し、イオンチャネル動態に影響を与えるために使用することができます。脂質混合物の融解温度は、図6のようにC対T関係の非単調変化を見つけることによって定義することができる。図7の電流測定では、温度によって起こされた位相(流動性)と厚さの変化が、Mzのようなイオノフォアの挿入に対する閾値電圧に影響を与える可能性があることをさらに明らかにしています。これらの物理的な関連は、特に体温環境を複製することを目的としたシナリオにおいて、モデル膜におけるイオンチャネルの挙動を理解するために重要である。しかし、それらは、例えば神経形態演算装置47のような用途において二層の導電率を調整するのに有用であり得る例えば、チャネル動態の増加は、脳の速度、機能性、および短期可塑性を模倣する必要がある記憶抵抗性を示すデバイスを製造する際に望ましい特徴である。
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Disclosures
著者は利害の対立を持っていません。
Acknowledgments
国立科学財団グラントCBET-1752197と空軍科学研究研究グラントFA9550-19-1-0213によって財政的支援が提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2) | Any | Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope | |
| 25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2) | Any | Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements. | |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid | Sigma Aldrich | M3183 | Buffering agent for lipid solution |
| Acrylic substrate | Fabricated in house | HTD_STG_2 | ~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation |
| Aluminum fixture | Fabricated in house | HTD_STG_1 | Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements |
| Brain Total Lipid Extract | Avanti | 131101C-100mg | 25 mg/mL porcine lipid extract |
| Compact DAQ Chassis (cDAQ) | National Instruments | cDAQ-9174 | Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules |
| Data Acquisition System (DAQ) | Molecular Devices | Digidata 1440A | High resolution analog to digital converter |
| Fixed gain amplifier/power supply | Hewlitt Packard | HP 6826A | Amplifies DC voltage output from the voltage output module |
| Glass Cover Slip | Corning | CLS284525 | Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer |
| Heating element (x2) | Omega | KHLV-101/5 | 25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit. |
| M3 Stainless Steel Screw | McMaster Carr | 90116A150 | Secures thermocouple to aluminum fixture |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | AxoPatch 200B | Measures current and outputs voltage to the headstage |
| Personal computer | Any | Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P3911 | Electrolyte solution of dissociated ions |
| Temperature input module | National Instruments | NI 9211 | Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis |
| Thermocouple | Omega | JMTSS-020U-6 | U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length |
| UV Curable Adhesive | Loctite | 19739 | Secures glass coverslip to aluminum base fixture |
| Voltage output module | National Instruments | NI 9263 | Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis |
| Waveform generator | Agilent | 33210A | Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform |
References
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