Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Damlacık Arayüzü Bilayer'in Sıcaklık Kontrollü Montajı ve Karakterizasyonu

Published: April 19, 2021 doi: 10.3791/62362
Automatic Translation
1, 1
1Department of Mechanical, Aerospace and Biomedical Engineering, University of Tennessee

Summary

Bu protokol, yüksek erime sıcaklıklarına sahip lipitler için lipid monolayer montajını ve damlacık arayüzü bilayer oluşumunu teşvik etmek için geri bildirim sıcaklığı kontrollü bir ısıtma sisteminin kullanımını ve membrandaki sıcaklık odaklı değişiklikleri karakterize etmek için kapasitans ölçümlerini detaylandırıyor.

Abstract

Lipid bilayerlerin montajı için damlacık arayüzü bilayer (DIB) yöntemi (örn. DİB'ler) yağdaki lipid kaplı sulu damlacıklar arasında diğer yöntemlere göre önemli faydalar sunar: DİB'ler kararlı ve genellikle uzun ömürlüdür, bilayer alanı ters yönde ayarlanabilir, broşür asimetrisi damlacık bileşimleri ile kolayca kontrol edilebilir ve doku benzeri çift katman ağları birçok damlacığın bitişik olmasıyla elde edilebilir. DiB'lerin oluşturulması, lipitlerin damlacıkların yüzeylerinde yüksek yoğunluklu lipid monolayerlere kendiliğinden bir şekilde bireyi gerektirmektedir. Bu, yaygın sentetik lipitler için oda sıcaklığında kolayca meydana gelse de, bazı hücresel lipit özleri de dahil olmak üzere oda sıcaklığının üzerinde erime noktalarına sahip lipitler için benzer koşullarda yeterli bir monolayer veya stabil iki katmanlı oluşmaz. Bu davranış, model membran çalışmalarındaKI DDB'lerin bileşimlerini ve belki de biyolojik alaka düzeyini sınırlamıştır. Bu sorunu gidermek için, DIB damlacıklarını barındıran yağ rezervuarını dikkatlice ısıtmak ve sıcaklığın lipid zarı üzerindeki etkilerini karakterize etmek için deneysel bir protokol sunulmaktadır. Özellikle, bu protokol, daha geniş bir lipit tipi kümesi için monolayer montajını ve bilayer oluşumunu iyileştiren yüksek sıcaklıkları reçete etmek için bir geri bildirim döngüsü tarafından kontrol edilen termal iletken alüminyum fikstürün ve dirençli ısıtma elemanlarının nasıl kullanılacağını göstermektedir. Zarın yapısal özellikleri ve bilayerden oluşan lipitlerin termotropik faz geçişleri, DIB'nin elektrik kapasitansındaki değişiklikler ölçülerek ölçülür. Birlikte, bu prosedür, çok bileşenli lipit karışımları için etkili bir erime sıcaklığı(TM)belirlemek de dahil olmak üzere çeşitli sıcaklıklarda model membranlarındaki biyofiziksel olayların değerlendirilmesinde yardımcı olabilir. Bu özellik, model membranlarında doğal faz geçişlerinin daha yakın bir şekilde çoğaltilmesine izin verecek ve hücresel meslektaşlarının heterojenliğini daha iyi yakalayanlar da dahil olmak üzere daha geniş bir membran bileşenlerinden model membranların oluşumunu ve kullanımını teşvik edecektir.

Introduction

Hücresel zarlar, tüm canlı hücreleri kapsülleyen ve alt bölümlere ayıran binlerce lipit tip1,protein, karbonhidrat ve sterolden oluşan seçici geçirgen bariyerlerdir. Kompozisyonlarının işlevlerini nasıl etkilediğini anlamak ve doğal ve sentetik moleküllerin hücresel zarlarla nasıl etkileşime girdiğini, bunlara nasıl yapıştığını, bozulduğunu ve yer değiştirmesini, bu nedenle biyoloji, tıp, kimya, fizik ve malzeme mühendisliğinde geniş kapsamlı etkileri olan önemli araştırma alanlarıdır.

Bunlar, hücresel karşılıklarının bileşimini, yapısını ve taşıma özelliklerini taklit eden sentetik veya doğal olarak oluşan lipitlerden birleştirilmiş lipid bilayerleri de dahil olmak üzere model membranlarının montajı, manipüle edilmesi ve incelenmesi için kanıtlanmış tekniklerden doğrudan yararlanmayı amaçlamaktadır. Son yıllarda, yağdaki lipid kaplı su damlacıkları arasında düzlemsal lipid bilayer inşa etmek için damlacık arayüzü bilayer (DIB) yöntemi2,3,4 önemli ilgi gördü5,6,7,8 ,9,10,11 ,1112,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23, ve model membran oluşumu için diğer yaklaşımlara göre pratik avantajlar göstermiştir: DIB yönteminin gerçekleştirilmesi kolaydır, sofistike bir imalat veya hazırlık gerektirmez (örn. "boyama") membranını desteklemek için bir substratın, sürekli olarak üstün membranlar verir uzun ömürlülük, standart elektrofizyoloji ölçümlerine izin verir ve asimetrik broşür bileşimleri ile model membranlarının oluşumunu kolaylaştırır3. Bilayer damlacıklar arasında kendiliğinden oluştuğundan ve her damlacık pozisyon ve makyajda uyarlanabildiğinden, DIB tekniği, uyaranlara duyarlı membranlar 18 , 24 , 25 ,26,27,28'inkullanımı üzerine inşa edilen hücreden ilham alan malzeme sistemleri geliştirmeye de büyük ilgi çekmiştir. ,29, dengeli bölmeleme ve taşıma14,30,31ve doku benzeri malzemeler17,23,32,33,34,35,36.

DDB'li olanlar da dahil olmak üzere model membranlar üzerinde yayınlanan deneylerin çoğu oda sıcaklığında (RT, ~20-25 °C) ve bir avuç sentetik lipitle (örneğin, DOPC, DPhPC, vb.) gerçeklenmiştir. Bu uygulama, model zarlarında çalışılabilen biyofiziksel soruların kapsamını sınırlar ve gözleme dayanarak, DIB'leri birleştirmek için kullanılabilecek lipit türlerini de kısıtlayabilir. Örneğin, 42 °C erime sıcaklığına sahip DPPC gibi sentetik bir lipit, sıkıca paketlenmiş monolayerleri bir araya getirmez veya RT37'deDIB oluşturmaz. Oda sıcaklığında DIB oluşumu, memelilerden (örneğin, beyin toplam lipid özü, BTLE)38 veya bakteriler (örneğin, Escherichia coli total lipid özü, ETLE)37, birçok farklı lipit türü içeren ve yüksek sıcaklıklarda (37 °C) bulunan hücrelerden kaynaklanan doğal özler için de zor olmuştur. Böylece çeşitli bileşimlerin incelenmesini sağlamak, membran aracılı süreçleri biyolojik olarak ilgili koşullarda anlama fırsatları sağlar.

Yağın sıcaklığını yükseltmek iki amaca hizmet edebilir: monolayer montajın kinetiğini arttırır ve lipitlerin sıvı düzensiz bir faza ulaşmak için erime geçişine neden olabilir. Her iki sonuç da dib için bir ön koşul olan monolayer derleme39'ayardımcı olur. Bilayer oluşumu için ısıtmaya ek olarak, oluşumdan sonra zarın soğutulmasının soğutulmasının tek lipid bilayerlerinde termotropik geçişleri tanımlamak için kullanılabilir38Kalorimetre kullanarak tespit edilmesi zor olabilecek doğal lipit karışımlarındakiler (örneğin BTLE) dahil. Lipitlerin termotropik geçişlerini değerlendirmenin yanı sıra, DIB'nin sıcaklığını kesin olarak değiştirmek, membran yapısı38'deki sıcaklık kaynaklı değişiklikleri incelemek ve lipid bileşiminin ve akışkanlığının, fizyolojik olarak ilgili bir sıcaklıkta (37 °C) memeli ve bakteriyel model zarları da dahil olmak üzere membran aktif türlerin (örneğin, gözenek oluşturan peptitler ve transmembran proteinleri37)kinetiğini nasıl etkilediğini incelemek için kullanılabilir.

Burada, rt'den daha yüksek sıcaklıklarda monolayer montajı ve çift katmanlı oluşumu etkinleştirmek için modifiye edilmiş bir DIB yağ rezervuarının nasıl monte edileceğinin ve geri bildirim sıcaklığı denetleyicisinin nasıl çalıştırılacağının açıklaması açıklanacaktır. Önceki bir protokolden ayırtedilen 40, dib'nin yağ rezervuarındaki montajına ve karakterizasyonuna paralel olarak sıcaklığı ölçmek ve kontrol etmek için gereken enstrümantasyonun entegrasyonu ile ilgili açık ayrıntı dahildir. Bu nedenle prosedür, bir kullanıcının çeşitli bilimsel bağlamlarda çeşitli sıcaklıklarda DIB'leri oluşturmak ve incelemek için bu yöntemi uygulamasına olanak sağlayacaktır. Ayrıca, temsili sonuçlar, sıcaklık çeşitli olduğunda ortaya çıkabilecek hem membran yapısında hem de iyon taşınımında ölçülebilir değişiklik türleri için özel örnekler sağlar. Bu teknikler, farklı membran bileşimlerinde membran aktif türlerin kinetiğini incelemek de dahil olmak üzere DBS'lerde etkili bir şekilde tasarlanabilecek ve gerçekleştirilebilecek birçok biyofiziksel çalışmaya önemli eklemelerdir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Isıtmalı fikstür hazırlığı

  1. Genişlik ve uzunluk olarak 25 mm x 40 mm'ye kesilmiş 1 mm kalınlığında 2 adet yalıtımlı kauçuk toplayın, sırasıyla, 25 mm x 40 mm olan 6 mm kalınlığında bir kauçuğun 2 parçası, hazırlanmış bir alüminyum taban fikstür tertibatı ve alüminyum taban fikstürünün görüntüleme penceresine sığan akrilik bir yağ haznesi (imalat ve patlayan montaj görünümü hakkında ayrıntılar için S1, S2 ve S3 şekillerine bakın). Alüminyum fikstürü ilk olarak fikstürün altına UV kürlenebilir yapıştırıcılı bir cam kapaklı görüntüleme penceresi takarak ve fikstürün her 25 mm x 25 mm yan flanşının üstüne 1 dirençli ısıtma elemanı yapıştırarak hazırlayın.
  2. Daha ince kauçuk parçaları mikroskop aşamasına yerleştirin, böyle şekilde her parçanın uzun kenarı gösterildiği gibi sahne açıklığı için teğettir (Şekil 1).
  3. Alüminyum taban fikstürünü, fikstürün görüntüleme penceresi objektif lensin üzerinde ortalanmış olacak şekilde yalıtımlı pedlerin üzerine yerleştirin. Bağlı damlacıkların görüntülenmesi için uygun hizalama gereklidir.
  4. Her dirençli ısıtma elemanının üzerine daha kalın bir kauçuk parçası yerleştirin ve yerinde tutmak için bir mikroskop sahne klipsi kullanın. Bu parçalar, ısıtma elemanlarını sahne klipslerinin neden olduğu hasarlardan korur ve ısıtma elemanları ile hem alüminyum fikstür hem de mikroskop aşaması arasındaki yanlışlıkla elektriksel kısa devreye karşı yalıtılır.
  5. Uçtan ~4 mm'de 90° açı elde etmek için bir termokuplün ölçüm ucunun ölçüm ucunun dikkatlice bükülmesi.
  6. Termokuplün bükülmüş ucunu alüminyum fikstürün sol alt köşesine yerleştirin ve kilitleme vidasıyla hafifçe sabitleyin.
  7. Akrilik hazneyi alüminyum fikstürün kuyusuna yerleştirin. Bu, damlacıkların görüşünü engelleyebilecek görüntüleme penceresi ile akrilik rezervuarın tabanı arasındaki hava kabarcıklarını hapsetme riskini en aza indirmek için alüminyum fikstürünün kuyusuna (adım 1.8) altıgen yağı eklemeden önce yapılır.
    NOT: Alüminyum fikstürün görüntüleme bölmesine eklenen yağ, akrilik rezervuarda bulunan damlacıkların daha net görüntülenmesi için akrilik ve camın kırılma endeksleriyle eşleşmek için kullanılır. Bu nedenle, alüminyum fikstürün kuyusundaki yağın akrilik rezervuarın içeriğiyle temas etmediğini ve alüminyum fikstürün titiz bir şekilde temizlenmesinin gerekli olmadığını belirtmek gerekir.
  8. Aşırı doldurmamaya dikkat ederek alüminyum fikstürü kuyusuna (yani akrilik rezervuarın duvarları ile alüminyum armatür arasında) ~1.000 μL heksadecane yağı dağıtın. Alüminyum fikstürün kuyusundaki yağ seviyesi, ısı transferi için yüzey alanını en üst düzeye çıkarmak için izin verilemez kadar yüksek olmalı, ancak yağın fikstürün kenarlarından mikroskop aşamasına veya objektif lense dökülmesine izin vermemelidir.
  9. Akrilik rezervuara ~1.000 μL heksadecane yağı dağıtın, aşırı doldurmamaya dikkat edin.
    NOT: Akrilik rezervuar deneyler arasında her zaman iyice temizlenmelidir. Kullanıcı, etil-alkol ve deiyonize su ile ardışık durulamalardan oluşan bir alay ve ardından 12 saatin üzerinde bir kurutucu kabında kurutma kullanmalıdır.

Figure 1
Şekil 1: Isıtmalı sahne montajı. Görüntüler, DIB oluşumu için termal iletken fikstürün ve yağ rezervuarının montajını göstermektedir; her görüntünün altındaki sayılar iletişim kuralının karşılık gelen adımını tanımlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Eşzamanlı geri bildirim sıcaklık kontrolü ve bir DIB'nin elektriksel karakterizasyonu için enstrümantasyon

NOT: Bu protokol, bir DIB'nin geri bildirim sıcaklık kontrolünü ve eşzamanlı elektriksel karakterizasyonunu etkinleştirmek için aşağıdaki araçları entegre eder: iki mevcut evrensel seri veri yolu (USB) bağlantısına sahip kişisel bir bilgisayar (PC), özel bir veri toplama (DAQ-1) sistemiyle eşleştirilmiş bir yama kelepçesi amplifikatörü, bir dalga biçimi jeneratörü, voltaj çıkışı ve sıcaklık giriş modüllerine sahip ikinci bir programlanabilir DAQ (DAQ-2) ve bir güç kaynağı / amplifikatörü. Aşağıdaki adımlarda, bir DIB'nin eşzamanlı elektrofizyolojisinden sıcaklığın ölçülması ve kontrolü için gereken bu aletlerin gerekli bağlantıları (Şekil 2a'dagösterildiği gibi) açıklanmaktadır. Eşdeğer enstrümanlar için ikameler gerektiği gibi yapılabilir.

  1. DAQ-2 modüllerine çıkış ve giriş bağlantıları kurun.
    1. Diferansiyel gerilim bağlantıları için gerilim çıkış modülünde iki çift vida terminali seçin ve bu konumlara tel uçları takın. Tek sayı terminalleri ortak yer bağlantılarıdır ve çift sayı terminalleri gösterildiği gibi topraklanmamış çıkışlardır (Şekil 2c). Bu iki çift kurşun kablonun her birini vidalı terminal-BNC adaptörlerine bağlayın ve ardından her adaptörü voltaj sinyallerini diğer cihazlara yönlendirmek için kullanılan ayrı bir BNC kablosuna bağlayın.
      NOT: Bu kurulumda, güç amplifikatörüne sıcaklık kontrol çıkışı için 0 ve 1 terminallerindeki diferansiyel bağlantılar atanırken, 6 ve 7 terminallerindeki başka bir bağlantı çifti, yama kelepçesi amplifikatörü aracılığıyla damlacıklara gönderilecek voltaj çıkışı için belirlenmiştir.
    2. (Şekil 2c) atıfta bulunarak, termokuple giriş modülünde bir termokuple terminali seti seçin (örneğin, terminal 2 ve 3 TC1 çifti olarak belirlenmiştir) ve termokuple kablolarını bağlayın.

Figure 2
Şekil 2: Sistem kablolama bağlantıları. Sistem için gerekli cihazların ve kablolamanın şeması (a) içinde gösterilirken, (b) içinde DAQ-2 bağlantılarına ayrıntılı bir bakış sağlanır. (c)resimlerinde DIB oluşumu için yağa batırılmış hidrojel kaplı elektrotlar üzerindeki sulu damlacıklar gösterilmektedir. İki elektrot, yama kelepçesi amplifikatörünün baş kulis ünitesinde sırasıyla topraklanmış ve topraklanmamış (V+) bağlantılara bağlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. DAQ-2 modüllerine elektrik bağlantıları yapıldıktan sonra, DAQ-2 şasisini bir USB bağlantısı üzerinden bir PC'ye bağlayın ve bir elektrik güç kaynağına bağlanın. Ardından, ticari bir yazılımla kullanmadan önce başarılı sürücü ve yazılım yüklemesini onaylayın.
  2. DAQ-2 ve dirençli ısıtma elemanları arasında bir güç amplifikatörü yapılandırın ve bağlayın.
    1. Amplifikatörü 10X kazançla sabit kazançlı amplifikasyon modunda çalışacak şekilde yapılandırın.
    2. Muz jakı-BNC adaptörü kullanarak, voltaj çıkış modülündeki(Şekil 2b)0 ve 1 terminallerinden kaynaklanan BNC kablosunu güç amplifikatöründeki giriş bağlantılarına bağlayın.
    3. Ek BNC adaptörleri ve kablolama kullanarak, güç amplifikatörünün çıkış terminallerini, her iki elemanın da kullanım sırasında aynı voltaj düşüşünü sürdürmesini sağlamak için birbirine paralel olarak kablolu ısıtma elemanları setine ve amplifikatöre bağlayın.
  3. Elektrofizyoloji ekipmanı için gerekli bağlantıları kurun.
    1. Gerilim çıkış modülündeki(Şekil 2b)6 ve 7 terminallerinden kaynaklanan bir BNC kablosunu yama kelepçesi amplifikatörünün arkasındaki Arka Anahtarlı Dış Komuta BNC konektörlerine bağlayın.
    2. Dalga biçimi üreteci çıkışı ile yama kelepçesi amplifikatörünün arkasındaki Ön Anahtar Harici Komut bağlantısı arasında ikinci bir BNC kablosu bağlayın.
      NOT: Bu iki bağlantı, yama kelepçesi amplifikatörü aracılığıyla damlacık elektrotlarına uygulanan voltaj dalga formlarını üretmek için alternatif yöntemler sağlar. Dalga biçimi üreteci özellikle membran kapasitansını ölçmek için kullanılan üçgen dalga biçimi voltajları üretmek için kullanışlıdır. Kullanıcı, kendi uygulaması için hangisinin gerekli olduğuna karar verebilir.
    3. Üçüncü bir BNC kablosuyla, yama kelepçesi amplifikatörünün ön panelinde bulunan ölçülen akımın çıkışını DAQ-1'in ön tarafında bulunan mevcut bir analog giriş BNC konektörüne bağlayın.
    4. Dördüncü bir BNC kablosuyla, ölçülen membran voltajının çıkışını (yama kelepçesi amplifikatörünün arkasında) DAQ-1'deki ayrı bir analog giriş konektörüne bağlayın. Bu, elektrotlar boyunca uygulanan voltajın dijitalleştirilmesini sağlar.
    5. Ref. 40'ta7-9. basamaklarda açıklandığı gibi mikromanipülatörler üzerinde hazırlanan ve desteklenen iki damlacık elektrot ile elektrot uçlarını yama kelepçesi amplifikatörüne kablo ile bağlanan yama kelepçesi başlığına bağlayın.
      NOT: Baş sahnenin rolü, elektrotlar arasındaki voltajı kontrol etmek ve elde edilen akımı ölçmektir, bu da yama kelepçesi amplifikatörü tarafından DAQ-1'e çıkış alan orantılı bir voltaja dönüştürülür.
    6. DAQ-1'i bir USB bağlantısıyla bir PC'ye bağlayın ve ilgili güç kaynağı kablolarını hem yama kelepçesi amplifikatörüne hem de DAQ-1'e bağlayın.
  4. Tüm ölçüm ekipmanlarının gücü.
    NOT: Bu kurulumdaki belki de en önemli ayrıntı, güç amplifikatörü çıkışının (mA-A) bağlantılarının, bir DIB'deki pA-nA seviyesi akımlarını ölçmek için hassas bir devre kullanan yama kelepçesi amplifikatörunun başmüfhane ünitesinden elektriksel olarak izole edildiklerinden emin olmaktır.

3. Damlacık arayüzü bilayerlerinin geri bildirim sıcaklık kontrolü

NOT: Geri bildirim sıcaklık kontrol sisteminin çalıştırılabilirliği için aşağıdaki adımlar, orantılı integral (PI) geri bildirim sıcaklık kontrolü40 , 41(bkz. Tamamlayıcı Kodlama Dosyaları)uygulamak için oluşturulan özel bir grafik kullanıcı arabirimine(GUI) dayanmaktadır. Bunun yerine başka yazılım ve kontrol algoritmaları kullanılabilir. Bu programın bir kopyası, okuyucuya makalenin ek bilgileriyle sağlanır, ancak kullanıcı kendi ekipmanı ve ihtiyaçları için yapılandırmakla sorumludur.

  1. PC'de DAQ-2 yazılımını başlatın ve sıcaklık kontrol programı dosyasını açın. GUI açıldıktan sonra, GUI'nin sol alt köşesindeki klasör simgesine tıklayarak ve sıcaklık kontrol programını seçerek programı tekrar açın (Şekil 3).
  2. Oransal kontrol kazancı (KP) ve integral kontrol kazancı ( KI) için uygun sayısal değerleri girin.
    NOT: Sırasıyla 0.598 ve 0.00445 K P ve KI değerlerinin kurulumda iyi çalıştığı bulunmuştur. Bu değerler, ölçülen açık döngü ısıtma yanıtlarından elde edilen parametreleri içeren bir sistem modeli kullanılarak simülasyon yoluyla yinelemeli olarak belirlenmiştir (bkz. Şekil 4). Açık döngü ısıtmasırasında, öngörülen ısıtma gücü ölçülen sıcaklıklardan bağımsızdır. Buna karşılık, kapalı döngü ısıtma, uygulanan gücün ısıtıcılara, ölçülen sıcaklığı istenen sıcaklığa yaklaştırmaya yardımcı olacak şekilde sürekli olarak ayarlanmasıdır. Bu, burada bir PI kontrol şeması kullanılarak elde edilir.
  3. Sıcaklık kontrol şemasını test etmek için, istediğiniz ayar noktası sıcaklığını (oda sıcaklığının üzerinde) girin ve ardından GUI içindeki geri bildirim sıcaklık kontrolünü açın. Önümüzdeki birkaç dakika boyunca GUI'de görüntülenen geri bildirim (kapalı döngü) kontrolü altında ölçülen sıcaklık sinyalini gözlemleyin. Yağın ölçülen sıcaklığı istenen sıcaklığı büyük ölçüde alarsa, değişikliklere çok yavaş tepki verirse veya istenen ayar noktasına yakınsamazsa, kullanıcının istenen kapalı döngü performansını elde etmek için kontrol kazanımlarını ayarlaması gerekir.
    NOT: Program, dirençli ısıtma elemanlarına verilen güç (ve dolayısıyla voltaj) için bir doygunluk sınırı tanımlar. Örneğin, burada bildirilen iki öğe her biri 5 W'a kadar güç tüketir. Bunları paralel olarak kablolama, toplam güç tüketiminin 10 W'ı geçmemesi gerektiği anlamına gelir. Kullanıcının cihazlara sağlanması gereken maksimum güç miktarını göz önünde bulundurması ve bu sınırın kapalı döngü sisteminin istenen sıcaklık değişikliklerine yanıt verme hızını etkileyebileceğini bilmesi önerilir. Daha yüksek güç ısıtma elemanları daha hızlı ısıtma ve daha yüksek ayar noktası sıcaklıkları sağlar, ancak ısıtma için daha yüksek tedarik edilen akımlar gerektirir.
  4. Sistem kabul edilebilir kapalı döngü performansına ayarlanmışken, GUI'de ayarlanan nokta olarak DIB oluşumu için istenen yağ sıcaklığını girin.
    NOT: Örneğin, 60 °C'lik bir ayar noktası sıcaklığı, sulu damlacıklarda BTLE lipozomları ile yapılan deneylerde iyi sonuçlar verdi37. Kullanıcı, tel tipi elektrotlarda asılı damlacıklar arasındaki DIB montajını açıklayan protokoller ve yama kelepçesi amplifikatörü, DAQ-1 ve elektrofizyoloji ölçüm yazılımı kullanılarak elektrofizyoloji ekipmanının yapılandırılmasıiçin başkabiryere yönlendirilir. Özellikle, Najem ve ark.40'ın protokolü 13. Bu adımın ötesinde, monolayer veya çift katmanlı oluşumu teşvik etmek için ısıtma gerektiren lipitler kullanılırken başarılı monolayer ve bilayer oluşumu için biraz farklı bir yaklaşım kullanılır.
  5. Gümüş/gümüş klorür (Ag/AgCl) elektrotlarının uçlarını, akrilik rezervuarın dibine neredeyse temas edene kadar yağa küçümseyin. Elektrot uçlarının bu şekilde konumlandırılması, elektrot üzerindeki damlacığın, yağdaki konvektif akımların damlacıkları hidrojel kaplı elektrotlardan ayırdığı gözlenen ısıtılmış yağda tutmak için çok önemlidir (Şekil 2c).
  6. Pipet, her elektrot ucuna 2 mg / mL BTLE, 100 mM potasyum klorür (KCl) ve 10 mM 3 -(N-morpholino) propansülfyonik asit (MOPS) içeren sulu lipid çözeltisinin 250 nL damlacığını ve monolayer oluşumunu teşvik etmek için ısıtılmış yağda en az 10 dakika kuluçkaya yatmalarını sağlar.
  7. Sahne başlığını ve ısıtmalı sahne fikstürünü topraklanmış bir Faraday kafesi ile örtün.
  8. Damlacıkları yavaşça hafif temasa getirin
    kullanıcı damlacıkların temastan deforme olduğunu görene veya birbirini yerinden etmeye başlayana ve ikiyer oluşumu başlayana kadar birkaç dakika bekleyene kadar elektrotların yatay konumlarını manipüle eder. Birkaç dakika sonra bir bilayer oluşmadıysa, damlacıklar bilayer oluşumunu kolaylaştırmak için daha fazla bir araya getirilebilir. İnceltilmiş bir interfacial bilayer oluşumu görsel muayene ile doğrulanabilir (Şekil 5a) veya 10 mV, 10 Hz üçgen voltaj22çıkış yapan bir dalga formu jeneratörü tarafından indüklenen kare dalga biçimi kapasitif akımının genliğindeki artış ölçülerek. İlk oluşumda ve ilk belirlenen noktada sonraki karakterizasyondan önce, iki arada bir alana ulaşmak için iki katın en az 10 dakika boyunca dengelenmesine izin verin.
    NOT: Yağ türü bilayer inceltme, membran kalınlığı ve damlacıklar arası temas açısı üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Genel olarak, yağ molekülü ne kadar küçük olursa, lipid akil zincirleri tarafından işgal edilen bilayer'in hidrofobik çekirdeğinde o kadar kolay kalabilir. Yağ tutma hem monolayer hem de bilayer gerilimini ve kalınlığını arttırır ve damlacıklar arasındaki alanı ve temas açısını azaltır. Bu ölçümler daha zayıf bir yapışıklık durumunu ifade eder. Daha büyük, daha hacimli moleküller tam tersi bir etki uygular. Örneğin, squalene, bilayer inceltme sırasında monolayerler arasında kolayca dışlanmasını sağlayan altıgen gibi alkanlardan daha hacimli bir moleküldür. Bu nedenle, squalene'de oluşan DDB'ler daha incedir, daha yüksek temas alanları ve açılar gösterirler ve22,42 (damlacık damlacık yapıştırma ölçüsü) daha yüksek serbest oluşum enerjileri sergilerler.

4. DiB'lerde sıcaklığa bağlı davranışların karakterizasyonu

NOT: Dib tabanlı model membranlarında sıcaklıktaki değişikliklerin membranın yapısını ve taşıma özelliklerini nasıl etkilediği de dahil olmak üzere birçok fiziksel süreç incelenebilir. İstenilen sıcaklıkta başarılı çiftyapı oluşumundan sonra aşağıdaki adımlar yapılmalıdır.

  1. Membrandaki lipitlerin termotropik faz geçişlerini tanımlamak için bilayer oluşumuna izin veren bir noktadan yağ banyosunun sıcaklığını düşürürken membranın nominal kapasitansını ölçün38.
    1. GUI'deki sıcaklık grafiğini sağ tıklatın ve görüntülenen verileri temizleyin. Bu, sonraki kayıtlar için arabellekte yeterli alan olmasını sağlar.
    2. Yama kelepçesi amplifikatörüne bağlı dalga formu jeneratörünü kullanarak, DIB elektrotları boyunca üçgen voltaj dalga formu (örneğin, 10 mV, 10 Hz) uygulayın ve indüklenen akım yanıtını ikiyerden kaydedin.
    3. Ayarlanan nokta sıcaklığını 5 °C'lik artışlarla azaltarak ve istenen sıcaklık elde edilene kadar sıcaklık değişimleri arasındaki yeni sabit durum sıcaklığında minimum 5 dakika bekleyerek bilayer'i soğutun. Alternatif olarak, geri bildirim kontrol sistemini kapatarak bilayer'i pasif olarak soğutmayı deneyin. Bununla birlikte, 50-60 ° C'den pasif soğutma uygulayan deneylerin daha yüksek birleşme oranlarına neden olduğunu unutmayın.
    4. Yağ banyosu ve bilayer istenen minimum sıcaklığa soğuduktan sonra, GUI'deki sıcaklık grafiğini tekrar sağ tıklayın ve sıcaklık verilerini zamana karşı bir elektronik tablo yazılımına dışa aktarın. Geçerli kaydı durdurun.
    5. Ölçülen akımdan, kare dalga akımı tepkisinin nominal kapasitansını, soğutma süresi boyunca zamana göre hesaplayın.
    6. Membran kapasitansı nasıl değiştiğini gözlemlemek için nominal kapasitansı(C)ve sıcaklığı(T)çizin. TM'yitanımlamak için C ve T'deki nonmonotonic değişiklikleri bulun.
      NOT: Nominal kapasitans kare dalga akım genliğinden hesaplanabilir43 (| I|) ilişki | kullanma Ben| = Dv/dt'nin voltaj genliğinin dört katına eşit olduğu C dv/dt (| V|) ve uygulanan üçgen gerilimin frekansı (f) . Bu denklemlerden C = | I|/(4| V|f).
  2. Benzer şekilde, yağ banyosunun ve bilayer alanının sıcaklığını art arda artırarak, bilayer'in yarı statik spesifik kapasitansını (Cm) sabit sıcaklıklarda değerlendirin.
    1. GUI'yi kullanarak ayarlanan nokta sıcaklığını 10 °C'lik artışlarla değiştirin ve sistemin yeni sıcaklığa dengelenmesine izin verin.
      1. Kapasitif akım ve kayıt ölçümünü başlatmak için Adım 4.1.2'yi gerçekleştirin.
      2. Mikro manipülatörleri kullanarak elektrotların konumlarını dikkatlice ayarlayarak bilayer alanını değiştirin (yani, elektrotların ayrılması bilayer alanını azaltır). Kare dalga akımının sabit bir durum genliğine ulaşmasına izin verin ve mikroskop aşamasının açıklığından görüldüğü gibi bilayer'i görüntülemek için mikroskopa monte edilmiş bir kamera kullanarak memb alanının zamana karşı hesaplanmasını sağlamak için DIB'nin görüntülerini toplayın. Aynı zamanda, görüntü toplama için karşılık gelen zaman noktasını işaretlemek için geçerli kayıt yazılımına dijital bir etiket ekleyin.
        NOT: Mikro manipülatörler elektrotların hassas kontrolünü ve böylece damlacıklar arasında hafif temas sağlar. Damlacıkların kaba manipülasyonu, damlacıkların birleşerek veya bir damlacığın elektrottan düşmesine neden olarak başarısız bir deneye yol açabilir. Başka bir yerde tartışıldığı gibi22, iki katlı alan, alt görünüm görüntüsünde çakışan daireler olarak görünen damlacıklar arasındaki temas uzunluğundan hesaplanır. Damlacıkların konumları ve boyutları ve temas hattının uzunluğu, bir görüntü işleme yazılımı kullanılarak veya diğer bilimsel programlama araçlarıyla hesaplanabilir.
      3. Toplam 5 DIB görüntü ve iki katlı akımın sabit durum bölgelerini elde etmek için Adım 4.2.1.2'yi en az 4 kez yineleyin.
    2. İstediğiniz her sıcaklıkta Adım 4.2.1'i tekrarlayın.
    3. Elde edilen görüntüler için sabit durum bilayer alanlarına karşılık gelen etiketli zaman noktalarında, her sıcaklık için C ve A verilerini ayıklamak için mevcut kayıtları ve DIB görüntülerini analiz edin.
    4. Her sıcaklık için C ve A verilerini çizin ve her sıcaklıkta iki katlı C m'yi temsil eden birinci sınıf bir gerileme eğimini hesaplayın22.
    5. Adım 4.2.4 ile Tarasında elde edilen Cm'nin çizim değerleri.
    6. Erime sıcaklıklarını tanımlamak için monoton olmayan varyasyonlar için Cm ve T verilerini inceleyin, TM.
  3. İkiyer boyunca bir dc voltaj adım girişi oluşturarak gerilime bağlı iyon kanalı oluşumunun dinamiklerini değerlendirin.
    1. İlk Gerilimi mV'de istediğiniz adım değerine ayarlayın (örneğin, 100 mV).
    2. Son Gerilim ve Adım Boyutunu istenen adımdan daha yüksek bir değere ayarlayın (örneğin, 110 mV son gerilim ve 110 mV adım boyutu).
    3. Adım girişi için istediğiniz süreyi saniye cinsinden ayarlayın (ör. 90 s).
    4. Adım girişi için istediğiniz polariteyi seçin (örneğin, pozitif).
    5. GUI/voltaj çıkış modülünden kaynaklanan komut voltajını baş kulise göndermek için yama kelepçesi amplifikatörünü değiştirin.
    6. Geçerli kayıtları başlatın.
    7. Voltajı açın ve kritik bir voltaja S şeklinde bir yanıt sergilemesi gereken indüklenmiş akım tepkisini kaydedin (örneğin, 2 mg/ mL BTLE'de 1 μg / mL Mz için ~ 70 mV).
  4. Ayrı olarak, bir membran için dinamik akım-gerilim ilişkileri, iyon kanalı davranışları gibi voltaja bağlı ilişkileri ortaya çıkarmak için istenen sıcaklıklarda elde edilebilir.
    1. Dalga biçimi üretecinden kaynaklanan komut voltajını baş kulise göndermek için yama kelepçesi amplifikatörünü değiştirin ve mevcut kayıtları başlatın.
    2. Dalga biçimi üretecinde, istenen genlik, ofset ve frekans ile sürekli bir sinüzoidal dalga formu çıkışı.
    3. İndüklenen geçerli yanıtı bir veya birden çok döngü boyunca kaydedin.
    4. Farklı sinüs dalgası genlikleri, frekansları ve sıcaklıkları için istediğiniz gibi tekrarlayın.

Figure 3
Şekil 3: Sıcaklık kontrolü GUI' si. Bu şekil, yağ banyosunun sıcaklığını kontrol etmek için programın GUI'sini kullanmak için gereken kritik adımları vurgular ve etiketler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 1, dib oluşumu için mikroskop aşamasında alüminyum fikstürün ve akrilik yağ rezervuarın nasıl hazırlandığını göstermektedir. Montaj adımları 1.2-1.4, fikstürü daha verimli ısıtma için sahneden termal olarak yalıtmaya yarar. 1.5-1.7 arası adımlar termokuplün fikstüre nasıl düzgün bir şekilde takılacağını ve yağ haznesinin nasıl konumlandırılacağını gösterir ve 1.8 -1.9 adımları bu parçalara yağ dağıtmak için önerilen yerleri gösterir.

Şekil 2, geri besleme sıcaklığı kontrolü kurmak ve bir DIB üzerinde elektrik ölçümleri yapmak için kullanılan bileşenleri özetlemektedir: bir PC, sabit kazançlı güç amplifikatörü, bir yama kelepçesi amplifikatörü ve bir DAQ sistemi (veya pA-nA seviyesi akımlarını uygulamak ve ölçmek için eşdeğer bir cihaz), uygun analog giriş ve çıkışlara sahip ikinci bir DAQ, bir dalga formu jeneratörü ve ekli dirençli ısıtıcılara sahip monte edilmiş alüminyum fikstürü. DAQ-2 iki modülden yararlanır (Şekil 2b). Güç amplifikatörü (Şekil 2a'dakimavi bağlantı) girişine sağlanan bağımsız voltajları ve yama kelepçesi amplifikatöründeki (yeşil bağlantı) harici bir Komut girişini başlatmak için 4 kanallı, ±10 V, 16 bit analog voltaj çıkış modülü kullanılır. Gerilim çıkış modülü maksimum 46 mA çıkış akımı ve maksimum 10 V çıkış voltajı ile sınırlıdır, burada kullanılan her ısıtma elemanı maksimum 28 V voltajda 5 W (~180 mA maks. Bu nedenle, güç kaynağı/ amplifikatör, çıkış voltajını önceden yükseltmek ve alüminyum fikstüre bağlı ısıtma elemanlarını (paralel olarak kablolu) güçlendirmek için gereken tedarik edilen akımı desteklemek için dahil edildi. DIB (sarı bağlantı) yakınındaki yağ rezervuarından sıcaklık ölçümlerini dijitalleştirmek için 4 kanallı, 24 bit termokuple giriş cihazı kullanılır. Termokuple giriş cihazı modülü 4 termokuplaya kadar izin verdiğinden, kullanıcı fikstürdeki diğer yerlerdeki sıcaklıkları izlemeyi düşünebilir. Yapılırsa, geri bildirim döngüsünde istenen ayarlanan nokta sıcaklığına kıyasla hangi sinyal veya sinyal kombinasyonunun kullanıldığını da düşünmeleri gerekir.

Bu çıkışlar ve ölçülen sinyaller iki yazılımla kontrol edilir: 1) sıcaklık kontrolü için özel GUI; ve 2) elektrofizyoloji ölçüm yazılımı. Şekil 3, GUI'nin ekran görüntüsünü gösterir ve protokoldeki ilgili adımlara ek açıklamalar içerir. GUI, anahtar parametreleri tanımlamak (Nokta sıcaklığını ayarla, PI kontrol kazançları, voltaj limitleri), ölçülen sıcaklığı ayarlanan nokta sıcaklığıyla karşılaştırmak ve amplifikatöre ve ardından ısıtma elemanlarına verilen kontrol sinyalini hesaplamak ve sıcaklığın ve uygulanan voltajın verilerini zamana karşı kaydetmek için kullanılır. Bu program ayrıca, yama kelepçesi amplifikatörü aracılığıyla DIB elektrotlarına (Şekil 2c) uygulanan voltajı komuta etme yeteneğini de içerir. Ayrı olarak, ölçüm yazılımı hem DIB elektrotlarına uygulanan voltajın hem de lipid bilayer yoluyla indüklenen akımın ölçümlerini yapılandırmak için kullanılır. DIB akımı ile orantılı bir voltaj, yama kelepçesi amplifikatörü ile çıkış yapılır ve BNC kablosuyla DAQ-1'e gönderilir (bağlantı gösterilmez).

Şekil 4, hem açık döngü hem de kapalı döngü ısıtma senaryoları altında zamana karşı ısıtıcılara gönderilen sıcaklık ve mutlak elektrik gücündeki değişimi çizer. İlki için, ısıtıcılara ~ 5.2 W güce karşılık gelen rastgele bir giriş voltajı uygulandı, bu da ~ 125 s zaman sabiti ve ~ 20 s'lik bir ilk gecikmeden sonra 4.5 ° C / W'≈ sabit bir durum ΔT ile sıcaklıkta üstel bir artışa neden oldu. Açık döngü sisteminin bu özellikleri, orantılı ve integral kontrol kazanımları için değerleri belirlemek için kullanılabilecek bir simülasyon yazılımında (ayrıntılar için Şekil S4'e bakınız) kapalı döngü sisteminin bir modelini oluşturmak için kullanılmıştır. Şekil 4'teki kapalı döngü ve simüle edilmiş model yanıtları, böylece ayarlanmış PI denetleyicisinin ölçülen ve simüle edilmiş yanıtlarını temsil eder, sırasıyla 0.598 ve 0.00445 KP ve K I değerleriyle RT'den 20 °C daha yüksek bir ayar noktası sıcaklığına. Isıtma süresindeki azalma, daha yüksek ilk uygulanan güç pahasına gelir. Yine de, istenen ayarlanan nokta sıcaklığı ve ölçülen yağ sıcaklığı, kullanım için uygun görülen sabit durumda 0,6 °C'de kaldı. İki ısıtıcı için 10 W toplam güç sınırını gölgede bırakmamak için kapalı döngü kontrolü sırasında program dahilinde sağlanan toplam güç sınırlıdır.

Sıcaklık kontrol sistemi, BTLE lipitlerinden oluşan bir DIB'de çözücünün sıcaklık bağımlılığını ve membran kapasitansı üzerindeki etkisini sergilemek için kullanılmıştır (Şekil 5). 35-42 °C38arasında gerçekleşen lipid faz geçişi nedeniyle DIB oluşumu için ısıtma gerektiğinden bu ölçüm için BTLE lipitleri seçilmiştir. Burada açıklanan protokol 60 °C'de bilayer oluşumunu başlatmak için gerçeklenmiştir. Membran oluşumu ve dengeyi takiben, sıcaklık, zarın yanıtını karakterize etmek için gerektiğinde art arda düşürülebilir veya yükseltilebilir. Örneğin, Şekil 5a, RT'den ~60 °C'ye kadar bir ısıtma döngüsü sırasında ham kapasitif akım (kare şeklindeki dalga formu) ve sıcaklığın zaman ile temsili ölçümlerini gösterir. Kapasitif akım dalga biçiminin genliğinin, sıcaklığın artmasıyla yarıdan fazla azaldığını ve bunun da yağın zarın hidrofobik çekirdeğine alınmasından kaynaklandığını gözlemleyin. Bu değişiklik arayüzü kalınlaştırır ve bilayer22,37,38'in yanal gerilimini değiştirir.

Şekil 5b belgesindeki veriler, 60 °C'deki ilk ikiyer oluşumundan sonra tam bir soğutma-ısıtma döngüsü boyunca C (27 °C'deki kapasitans ile normalleştirilmiş) ve T'de değişir. Şekil 5a'daolduğu gibi sıcaklık arttıkça kapasitans düşer. Bununla birlikte, bu sunumun daha net gösterdiği şey, toplu erime sıcaklığını temsil eden ~30-42 ° C arasındaki sıcaklıklarda meydana gelen nonmonotonic değişikliklerdir, TM, lipid karışımının sıvı sıralı ve sıvı düzensiz bir termotropik faz arasında geçiş yaptığı. Kapasitanstaki nonmonotonik değişimin meydana geldiği sıcaklık, bilayer kalınlığında yağın membrandan dışlanmasından kaynaklanan bir değişikliğe karşılık gelir38. Ayrıca, ısıtma döngüsü ile soğutma döngüsü arasında gösterilen histenezin, bilayer alanında tipik olarak 10 dakika arayla gerçekleştirilen sonraki döngüler arasında meydana gelen geri dönüşü olmayan değişikliklerden kaynaklandığını unutmayın.

Benzer şekilde, Şekil 6a,b, farklı sıcaklıklarda Cm'nin yarı statik ölçümlerinin TM'yitanımlamak için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Burada, damlacık elektrotları arasındaki mesafe manuel olarak artırılarak membranın alanı art arda değişir. Bu deney sırasında, damlacıklar ilk olarak elektrotlar arasındaki adım adım ayrımlarla temas alanında daha sonra azalmalardan önce maksimum membran alanını teşvik etmek için birlikte itilir. Her temas seviyesinde, bilayer'in nominal kapasitansı indüklenen akımdan değerlendirilir ve alanı görüntü analizi ile belirlenir. C'ye karşı A'yı çizmek, eğimin Şekil 6a'dagösterildiği gibi Cm değerini temsil ettiği doğrusal bir gerileme sağlar. Bu prosedürün birden fazla sıcaklıkta tekrarlanması (Şekil 6b) Cm'nin TM'ninüzerindeki sıcaklıklarda yaklaşık% 50 azaldığını gösterir , ısıtma kaynaklı altıgen alımı nedeniyle zarın hidrofobik kalınlığında bir artış olduğunu doğrular (tam C ve A verileri için Şekil S5'e bakın). Daha yüksek sıcaklıklarda, membrandaki ek çözücü, damlacıklar arasındaki maksimum temas alanını ve dolayısıyla maksimum nominal kapasitansı da azaltır. Sıcaklığı azaltmak bu etkileri tersine çevirir. Şekil 6c'deki DIB görüntüsü, sıcaklık (25 °C) TM'ninçok altında olduğunda, zarın, iyi ayrılmış elektrotların neden olduğu gerilmiş damlacıkların gerginliği altında bile, son derece yapışkan bir durumu bıçaklayabileceğini göstermektedir. Bu, heksadecane'in bilayerden tamamen dışlanmasının sonucudur, bu da damlacıkların yapışıklık enerjisini arttırır. Bu durumda, elektrotların manipülasyonu yoluyla ikiyer alan güvenilir bir şekilde değiştirilemez ve belirli kapasitansı doğru bir şekilde ölçme yeteneğini engeller (daha fazla ayrıntı için Şekil S5'e bakın).

Son olarak, Şekil 7'deki temsili veriler, sıcaklık değişimlerinin bir DIB aracılığıyla iyon iletim kanalları oluşturan gözenek oluşturan türlerin davranışlarını nasıl etkileyebileceğini göstermektedir. Bu ilişkiyi göstermek için yeterli transmembran potansiyeli37,44'te bilayer yoluyla katyon seçici kanallar oluşturan pozitif yüklü bir antibiyotikolanMonazomycin (Mz) seçildi. Bu ölçümler BTLE tabanlı (her iki damlacıkta da 2 mg/mL son konsantrasyon) Mz (her iki damlacıkta 1 μg/mL son konsantrasyon) ile dopdaklı bir DIB üzerinde yapılmıştır. Şekil 7a'da gösterilen akım ile gerilim izleri sinüzoidal membran gerilimleri uygulanarak ve indüklenen akım iki farklı sıcaklıkta ölçülerek elde edilmiştir; Şekil 7a'daki oklar ve sonraki sayılar, sinüzoidal voltajın ardışık çeyreklerini zamana göre görselleştirmeye yardımcı oluyor. Bu tür ölçümler genellikle akımın iyon kanallarından gerilim bağımlılığını incelemek için gerçekleştirilir. Buradaki veriler, DIB'nin sıcaklığının 27 °C'den 45 °C'ye yükseltilmesinin kanal oluşumu eşiğinin ~|100 mV'den yükselmesine neden olduğunu göstermektedir| ~|110 mV|.'ye kadar. Emilen yağ nedeniyle muhtemelen daha yüksek membran kalınlığından kaynaklanan bu değişiklik, yerleştirme için enerji bariyerinin yükseldiğini göstermektedir. Bellek direncini gösteren bu eğrilerdeki histegenez, bilayer alanındaki voltaj kaynaklı değişikliklerden veya Mz kanal oluşumu ve inaktivasyonunun kinetiğinden kaynaklanabilir44.

DBS'deki bu faktörlerin ayrılmasına yardımcı olmak için, dc adım gerilimine yanıt olarak iyon akımındaki geçici değişiklikler ölçülebilir. Şekil 7b, aynı Mz-doped BTLE membran için ölçülen akım yoğunluğunu aynı voltaj seviyesinde (+90 mV) ve iki farklı sıcaklıkta (27 °C ve 45 °C) göstermektedir. Veriler, kanal yanıtlarının kinetiğinin oldukça farklı olduğunu açıkça göstermektedir. Özellikle, 27 ° C'de, membran akımda daha hızlı, daha büyük bir artış sergiler ve ardından geçici bir çürüme (ikincisi, iki kat boyunca aktif olmayan bir duruma geçen Mz kanallarının bir sonucudur44). Tepki, akımdaki Sşeklindeki yükselişin sonraki bir düşüşle ilerlemediği 45 °C'de çok daha sessizdir. Bu gibi farklılıklar, kanal yanıtlarının kinetiğini değerlendirmek ve bunların zarın toplam dinamik direncine nasıl katkıda bulunabileceğini anlamak için yararlıdır.

Figure 4
Şekil 4: Açık döngü ve kapalı devre ısıtma. Panel (a) ölçülen ve benzetimli (Bkz. SI) kapalı döngü sistemi için zaman yanıtlarını +20 °C sıcaklık adımıyla sabit uygulamalı güç altında açık döngü ısıtma tepkisiyle karşılaştırır. Panel (b) her sistem tarafından dağılan gücü görüntüler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Kapasitansı ve değişen sıcaklığı ölçmek. Faz geçişi yapılan bir BTLE lipid zarındaki 10 mV, 10 Hz üçgen dalga formu girişine tipik kare dalga biçimi akım tepkisi (a) içinde gösterilmiştir. Lipitlerin faz geçişi, panelin(a)üzerinde görüntülenen alan ölçüm verilerinde de görülebilir. 27 °C'de ilk kapasitans ile normalleştirilen kapasitans, ısıtma ve soğutma döngüsü için sıcaklığın bir işlevi olarak çizilen panelde (b)gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Özel kapasitans ölçümleri Panel (a) iki farklı sıcaklık için ardışık temas alanlarında elde edilen nominal kapasitans ve bilayer alanını gösterir. Her kümeye doğrusal regresyonlar, C M'nin ilgili değerlerini belirlemek için kullanılır. Panel (b) CM'ye karşı T'yiçizerken, panel (c) 25 °C'de damlacık ayırma girişimi altında kararlı kapasitif akım dalga biçimini (solda) ve temas alanını (sağda) gösterir.

Figure 7
Şekil 7: Gerilime bağımlı membran direnci ve Mz iyon kanal kinetiği ile sıcaklık karşıtları. Panel (a)   1 μg/ ml Mz içeren damlacıklar arasında oluşan BTLE DIB'leri için akım voltajı ilişkisinin sıcaklıkla nasıl değiştiğini gösterir. Oklar ve sayılar uygulanan sinüs dalgasının art arda gelen kısımlarını temsil eder. Bu izlerdeki farklılıklar, sıcaklığın, indüklenen akımın keskin bir şekilde arttığı voltajın büyüklüğü olarak tanımlanan Mz yerleştirme için voltaj eşiğini nasıl değiştirdiğini göstermektedir. Aynı şekilde, panel (b) 90 mV'lık bir DC adım voltajı tarafından indüklenen geçici akım tepkisi üzerindeki etki sıcaklığını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil S1: Alüminyum fikstür. Bu çizim, ısıtılmış sahnenin tabanı olan alüminyum fikstürün imalatı için gerekli boyutları ve özellikleri gösterir. Yağ kuyusuna bitişik 25,2 mm X 26 mm düz noktalar, fikstürün ve ısı iletimi için ısıtma elemanları arasında maksimum miktarda yüzey alanı temasına izin vermek için tasarlanmıştır. Aynı şekilde, yüksek ısı iletkenliği nedeniyle taban fikstür malzemesi için alüminyum seçilmiştir. Baskıda çağrılan M3 X 0,5 mm vida deliği, termokupl yağ kuyusunda sabitlemek ve konumlandırmak için kullanılır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Şekil S2: Akrilik substrat. Akrilik substrat, profil dışında kritik olağanüstü özelliklere sahip olmayan, üretimi nispeten basit bir parçadır. Dış profil Poka -boyunduruk düşünülerek tasarlanmıştır, böylece akrilik substrat sadece termokupl için yağ kuyusuna sığması için geniş bir alan sağlayacak şekilde fikstüre yönlendirilebilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Şekil S3: Isıtmalı sahne montajı. İlk kurulum sırasında deneyciye yardımcı olmak için monte edilmiş ısıtmalı sahnenin patlatılmış bir görünümü sağlanmıştır. Ayrıca, kesikli daire tarafından vurgulanan alanı not edin, çünkü bu protokol adımı 1.8 sırasında alüminyum fikstürü yağ ile doldurmak için ideal bir konumdur. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Şekil S4: Döngü verilerini ve Simulink modelleme panelini açın. (a) sistemin gecikme süresini, td, zaman sabitini, δve açık döngü ısıtma kazancını, αdeğerlendirmek için kullanılan değişen DC güç seviyelerine açık döngü sıcaklık tepkilerini gösterir. Gecikme süresi, sıcaklık yükselmeye başlamadan önceki zaman gecikmesini temsil eder (~20 s). Her bir değer (*, ~125 s ile işaretlenmiştir), sıcaklıktaki toplam artışın %63,2'sinin gerçekleşmesi için gereken süre olarak tanımlanır. Panel (b) uygulanan güce karşı sıcaklıktaki (∆T)sabit durum değişimini gösterir. (b) içinde çizilen verilerin eğimi αhesaplamak için kullanıldı , bu da sağlanan güç başına sıcaklık değişimi oranını temsil eder. Bu parametreler panelde (c) gösterilen modelde kullanıldı ve pi denetleyicisini istenen kapalı döngü sıcaklık kontrol yanıtını elde etmek için ayarlamak için ek bir dosya olarak sağlandı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Şekil S5: Ek özel kapasitans verileri. Şekil 6a,b'de gösterilen çizimler bu CM veri kümesinden derlenmiştir. Bu çizim ayrıca 25 °C ve altındaki sıcaklıklarda kapasitansı doğru bir şekilde ölçememe olduğunu da gözler önüne seriyor, bu nedenle bu ölçüm veri kümesinden çıkarıldı. Doğru bir Cm ölçümü için gerekli alan değişiklikleri, mikromanipülatörlerden damlacıklara aşırı kuvvet uygulanmasını gerektirir, bu da damlacık şeklinin ve temas alanının kopmasına neden olur. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tamamlayıcı Kodlama Dosyaları. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada açıklanan protokol, DIB oluşturmak için kullanılan yağ ve damlacıkların sıcaklığını kontrol etmek için deneysel bir sistemin montajı ve işletilme talimatları sağlar. Özellikle RT'nin üzerinde erime sıcaklıklarına sahip lipitler kullanılarak DIB oluşumunu sağlamak için faydalıdır. Ayrıca, yağ rezervuarının sıcaklığını tam olarak değiştirerek, bilayer sıcaklığı, yüksek sıcaklıkların kapasitans, alan, kalınlık, indüklenmiş termotropik faz değişiklikleri, membran aktif türlerin kinetiği ve iki katlı arayüzün yapışma enerjileri dahil olmak üzere çeşitli membran özellikleri ve özellikleri üzerindeki etkilerini incelemek için manipüle edilebilir37,38.

Protokol, bir DIB çalışmasında kullanılmadan önce üç bölümden oluşur: 1) ısıtmalı sahne fikstürünün hazırlanması ve montajı; 2) çeşitli enstrümanları bağlamak; ve 3) seçilen oransal ve integral kontrol kazanımları ile uygun sıcaklık kontrol performansını onaylamak. Bölüm 2'de en önemlisi, kullanıcı güç amplifikatörü (>mA akımları) çıkışı ile yama kelepçesi başlığı (pA-nA akımları) arasındaki paylaşılan iletim yollarından kaçındığından emin olmalıdır. İstemeden bir kısa, başörtüde kalıcı hasara neden olabilir. Ek olarak, PC'nin ve tüm cihazların ortak bir AC güç zeminine bağlı olmasını sağlamak ve başpöğretme ve damlacık elektrotlarının yakınında topraklanmış bir Faraday kafesinin kullanılması, çift katmanlı akım ölçümlerinde gürültüyü en aza indirmeye yardımcı olur. Bölüm 2'deki kurulum tamamlandıktan sonra, kullanıcı önce ısıtma elemanlarına sabit bir voltaj uygulayarak ve daha sonraki sıcaklık artışını kaydederek yağ rezervuarının açık döngülü ısıtma tepkisini değerlendirmelidir (Şekil 4a'dagösterildiği gibi). Bu tür üstel yanıt, değişen denetim kazançları değerleri için kapalı döngü sisteminin basit bir modelini tanımlamak ve benzetim etmek için kullanılabilir (ayrıntılar için Şekil S4'e bakın). Burada bildirilen kontrol kazançları, sistemin istenen sıcaklık seviyesine hızlı bir şekilde (~ 2 dakika) ve az fazla çekimle ısınmasına ve ayarlanan nokta değerini doğru bir şekilde korumasına izin verir. Ancak gerekli özel kazanımlar, ısıtma elemanlarının güç seviyesine ve petrol rezervuarını destekleyen fikstürün geometrisine bağlı olacaktır. Uygun kontrol kazanımları değerleri belirlendikten ve geri bildirim kontrol sistemi istenildiği gibi çalıştığında, kullanıcı daha sonra bir DIB'yi birleştirmeye ve karakterize etmeye başlayabilir.

Protokol, DIB oluşturma veya niteleme sürecini değiştirmez, ancak sınırlamalar ve dikkat edilmesi gereken noktalar vardır. Yağın sıcaklığının yükseltilmesi, tek katmanlı gerilimdeki azalmalar ve damlacık sarkmasını artıran yağ yoğunluğu ve damlacıkları hareket ettirebilen yağdaki konvektif akımlar nedeniyle damlacıkların elektrotlara nasıl tutunduğu etkileyebilir. Bu nedenle, protokol elektrotların uçlarının alt tabakanın alt yüzeyine yakın bir yere indirilmesini önerir, böylece damlacıklar akrilik rezervuar tarafından desteklenir ve hareketsiz tutulur. Kullanıcı, alt tabakanın damlacıkları ne kadar bozduğunu değerlendirmeli (çok alçalmışsa) ve başka bir yerde tartışıldığı gibi DB'lerin görüntülerinden bilayer alanını hesaplarken bu bozulmayı göz önünde bulundurmalıdır22.

Açıklanan sistem yağ banyosunun ısıtılmasıyla sınırlı olsa da, RT'nin altındaki sıcaklıklarda test edilmesi gerekiyorsa, dirençli ısıtma elemanlarının yerine bir Peltier soğutma cihazı kullanılabilir. Ancak bu durumda, kullanıcının yağ fazının donma noktasını göz önünde bulundurması gerekecektir. Birçok alkan 0 °C'den yüksek sıcaklıklarda donar; burada açıklanan heksadecane 18 °C'de donar. Yağ donarsa, damlacıklar artık hareket ettirilemez ve damlacıklar arasındaki bir çiftlik kararsız hale gelebilir veya yırtılabilir.

Daha önce test edilmemiş bir lipit bileşimi için, temel bilinmeyenler, damlacıkların yüzeylerinde yeterli monolayer montajı sağlamak için gereken kuluçka süresi ve sıcaklıktır. Genel kural, yağı TM'ninüzerinde bir sıcaklığa ısıtmak Lipid hareketliliğinin artırıldığı yağ-su arayüzü45'tedaha hızlı yanal difüzyon ve daha sıkı paketleme için geliştirilmiştir ve yağ-su arayüzünde monolayer ambalajlamanın yüksek olduğu kadar uzun süre bekleyin. Kullanıcı, yayınlanan literatürü gözden geçirebilir veya uygun zaman ve sıcaklık değerlerini belirlemek için kendi tamamlayıcı ölçümlerini düşünebilir: tek katmanlı montaj46 için gereken süreyi değerlendirmek için bir kolye damlası goniometresinde interfacial gerilim ölçümleri kullanılabilir ve diferansiyel tarama kalorimetresi genellikle lipitlerin termotropik geçişlerini tanımlamak için kullanılır38. Ya da bilayer oluşumunun tutarlı olduğu, zarın birkaç dakikadan fazla stabil olduğu ve bilayer direncinin >1 GΩ olduğu uygun zaman ve sıcaklığı belirlemek için yinelemeli bir yaklaşım izlenebilir. E. coli total lipid özü (ETLE)37 ve BTLE38,47 başlangıç sıcaklığı >50 °C ile yapılan son çalışmalarda sürekli olarak stabil çiftyağlı oluşuma yol açmaktadır. Benzer şekilde, belirli bir lipit tipi için DIB'den sonraki minimum kararlı sıcaklık da lipit seçimleri arasında değişebilir. Örneğin ETLE DIB'leri 25 °C37'ye soğutulabilirken, tek bileşenli DPPC DIB'ler her zaman TM~40 °C38'in altında birleşir. Gözlem, BTLE DİBS'in 27 °C'nin istikrarlı bir çiftyapı korumak için güvenli bir minimum sıcaklık olduğunu gösterdiğini göstermiştir.

Temsili sonuçlarımız, sıcaklıktaki değişikliklerin ortaya çıkan DIB'nin özelliklerini büyük ölçüde etkileyebileceğini göstermektedir. Şekil 5'teki veriler, sıcaklık arttıkça membrandaki nominal kapasitansının azaldığını göstermektedir. Çünkü kapasitans, C, çift taraflı alan, Ave kalınlıkla ters orantılıdır, d, tarafından verildiği gibi

Equation 1, (1)

C'deki bir azalma, A, dveya her ikisinde de bir artış (sabit bir dielektrik izinlilik varsayarak, ε) bir azalma ile kendini gösterebilir. Bu ilişkiler, hangi efektlerin önemli olduğunu belirlemek için C, Ave C m'deki değişiklikleri ve sıcaklıktaki değişiklikleri değerlendirmek için kapasitans ölçümlerinin ve DIB görüntülerinin kullanımını motive eder. BTLE DIBs için Şekil 5 ve Şekil 6'da yer alan veriler, sıcaklık 30 C'den 60 C'ye yükseldikçe hem C hem de C m'nin (ε/ doranını temsil eden) yaklaşık% 50 azaldığını göstermektedir. Membrandaki ek yağ, bilayer'in interfacial gerginliğini ve damlacıklar arasındaki temas açısını da etkileyebilir22,38. Bu efektler, ısıtma ve soğutma sırasında bilayer alanını ve temas açısını izlemek için kullanıcı tarafından belirtilen zaman aralıklarında bir DIB'nin görüntülerini analiz ederek ölçülebilir.

Membrandaki yağın sıcaklık kayırılabilirliği, lipitlerin termotropik erime sıcaklıklarını değerlendirmek ve iyon kanalı kinetiğini etkilemek için de kullanılabilir. Lipid karışımı için erime sıcaklığı, Şekil 6'daolduğu gibi C ve T ilişkilerindeki nonmonotonik değişikliklerin bulunmasıyla tanımlanabilir. Şekil 7'deki mevcut ölçümler, faz (yani akışkanlık) ve kalınlıktaki sıcaklık kaynaklı değişikliklerin Mz gibi iyonoforların yerleştirilmesi için eşik voltajını etkileyebileceğini daha da ortaya koymaktadır. Bu fiziksel ilişkiler, özellikle vücut ısısı ortamlarını çoğaltmaya yönelik senaryolarda, model zarlarındaki iyon kanalı davranışlarını anlamak için önemlidir. Bununla birlikte, nöromorfik bilgi işlem cihazları gibi uygulamalarda bilayer iletkenliğini ayarlamak için de yararlı olabilirler47 Örneğin, beynin hızını, işlevselliğini ve kısa süreli plastisitesini taklit etmesi gereken bellek direnci gösteren cihazlar üretilirken artan kanal kinetiği arzu edilen bir özelliktir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

Ulusal Bilim Vakfı Hibe CBET-1752197 ve Hava Kuvvetleri Bilimsel Araştırma Ofisi Hibe FA9550-19-1-0213 tarafından finansal destek sağlanmıştır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2) Any Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope
25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2) Any Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements.
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid  Sigma Aldrich M3183 Buffering agent for lipid solution
Acrylic substrate Fabricated in house HTD_STG_2 ~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation
Aluminum fixture Fabricated in house HTD_STG_1 Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements 
Brain Total Lipid Extract Avanti 131101C-100mg 25 mg/mL porcine lipid extract 
Compact DAQ Chassis (cDAQ) National Instruments  cDAQ-9174  Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules
Data Acquisition System (DAQ) Molecular Devices  Digidata 1440A  High resolution analog to digital converter
Fixed gain amplifier/power supply Hewlitt Packard HP 6826A Amplifies DC voltage output from the voltage output module
Glass Cover Slip Corning CLS284525 Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer
Heating element (x2) Omega KHLV-101/5 25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit. 
M3 Stainless Steel Screw McMaster Carr 90116A150 Secures thermocouple to aluminum fixture
Patch clamp amplifier Molecular Devices  AxoPatch 200B  Measures current and outputs voltage to the headstage
Personal computer Any Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram
Potassium Chloride Sigma Aldrich P3911 Electrolyte solution of dissociated ions
Temperature input module National Instruments  NI 9211 Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis
Thermocouple Omega JMTSS-020U-6  U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length
UV Curable Adhesive Loctite 19739 Secures glass coverslip to aluminum base fixture
Voltage output module National Instruments  NI 9263 Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis
Waveform generator Agilent 33210A  Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Meer, G., de Kroon, A. I. P. M. Lipid map of the mammalian cell. Journal of Cell Science. 124 (1), 5-8 (2011).
  2. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  3. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130 (18), 5878-5879 (2008).
  4. Holden, M. A., Needham, D., Bayley, H. Functional bionetworks from nanoliter water droplets. Journal of the American Chemical Society. 129 (27), 8650-8655 (2007).
  5. Sarles, S. A., Leo, D. J. Physical encapsulation of droplet interface bilayers for durable, portable biomolecular networks. Lab on a Chip. 10 (6), 710-717 (2010).
  6. Stanley, C. E., et al. A microfluidic approach for high-throughput droplet interface bilayer (DIB) formation. Chemical Communications. 46 (10), 1620-1622 (2010).
  7. Gross, L. C. M., Heron, A. J., Baca, S. C., Wallace, M. I. Determining membrane capacitance by dynamic control of droplet interface bilayer area. Langmuir. 27 (23), 14335-14342 (2011).
  8. Huang, J., Lein, M., Gunderson, C., Holden, M. A. Direct quantitation of peptide-mediated protein transport across a droplet, interface bilayer. Journal of the American Chemical Society. 133 (40), 15818-15821 (2011).
  9. Leptihn, S., Thompson, J. R., Ellory, J. C., Tucker, S. J., Wallace, M. I. In vitro reconstitution of eukaryotic ion channels using droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 133 (24), 9370-9375 (2011).
  10. Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3134-3138 (2012).
  11. Dixit, S. S., Pincus, A., Guo, B., Faris, G. W. Droplet shape analysis and permeability studies in droplet lipid bilayers. Langmuir. 28 (19), 7442-7451 (2012).
  12. Elani, Y., deMello, A. J., Niu, X., Ces, O. Novel technologies for the formation of 2-D and 3-D droplet interface bilayer networks. Lab on a Chip. 12 (18), 3514-3520 (2012).
  13. Michalak, Z., Fartash, D., Haque, N., Lee, S. Tunable crystallization via osmosis-driven transport across a droplet interface bilayer. CrystEngComm. 14 (23), 7865-7868 (2012).
  14. Punnamaraju, S., You, H., Steckl, A. J. Triggered release of molecules across droplet interface bilayer lipid membranes using photopolymerizable lipids. Langmuir. 28 (20), 7657-7664 (2012).
  15. Boreyko, J. B., Mruetusatorn, P., Sarles, S. A., Retterer, S. T., Collier, C. P. Evaporation-induced buckling and fission of microscale droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 135 (15), 5545-5548 (2013).
  16. Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
  17. Villar, G., Graham, A. D., Bayley, H. A Tissue-like printed material. Science. 340 (6128), 48-52 (2013).
  18. Barriga, H. M. G., et al. Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli. Journal of The Royal Society Interface. 11 (98), (2014).
  19. Boreyko, J. B., Polizos, G., Datskos, P. G., Sarles, S. A., Collier, C. P. Air-stable droplet interface bilayers on oil-infused surfaces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (21), 7588-7593 (2014).
  20. Mruetusatorn, P., et al. Dynamic morphologies of microscale droplet interface bilayers. Soft Matter. 10 (15), 2530-2538 (2014).
  21. Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. The gating mechanism of mechanosensitive channels in droplet interface bilayers. MRS Proceedings. , Cambridge University Press. 1755 (2015).
  22. Taylor, G. J., Venkatesan, G. A., Collier, C. P., Sarles, S. A. Direct in situ measurement of specific capacitance, monolayer tension, and bilayer tension in a droplet interface bilayer. Soft Matter. 11 (38), 7592-7605 (2015).
  23. Bayley, H., Cazimoglu, I., Hoskin, C. E. G. Synthetic tissues. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (5), 615-622 (2019).
  24. Oliver, A. E., et al. Protecting, patterning, and scaffolding supported lipid membranes using carbohydrate glasses. Lab on a Chip. 8 (6), 892-897 (2008).
  25. Maglia, G., et al. Droplet networks with incorporated protein diodes show collective properties. Nature Nanotechnology. 4 (7), 437-440 (2009).
  26. Najem, J. S., et al. Activation of bacterial channel MscL in mechanically stimulated droplet interface bilayers. Scientific Reports. 5, 13726 (2015).
  27. Freeman, E. C., Najem, J. S., Sukharev, S., Philen, M. K., Leo, D. J. The mechanoelectrical response of droplet interface bilayer membranes. Soft Matter. 12 (12), 3021-3031 (2016).
  28. Tamaddoni, N., Sarles, S. A. Toward cell-inspired materials that feel: measurements and modeling of mechanotransduction in droplet-based, multi-membrane arrays. Bioinspiration & Biomimetics. 11 (3), 036008 (2016).
  29. Restrepo Schild, V., et al. Light-patterned current generation in a droplet bilayer array. Scientific Reports. 7, 46585 (2017).
  30. Milianta, P. J., Muzzio, M., Denver, J., Cawley, G., Lee, S. Water permeability across symmetric and asymmetric droplet interface bilayers: Interaction of cholesterol sulfate with DPhPC. Langmuir. 31 (44), 12187-12196 (2015).
  31. Mruetusatorn, P., et al. Control of membrane permeability in air-stable droplet interface bilayers. Langmuir. 31 (14), 4224-4231 (2015).
  32. Wauer, T., et al. Construction and manipulation of functional three-dimensional droplet networks. ACS Nano. 8 (1), 771-779 (2013).
  33. Bayley, H. Building blocks for cells and tissues: Beyond a game. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (5), 433-434 (2019).
  34. Booth, M., Restrepo Schild, V., Downs, F., Bayley, J. Droplet network, from lipid bilayer to synthetic tissues. Encyclopedia of Biophysics. , Springer. (2019).
  35. Booth, M. J., Cazimoglu, I., Bayley, H. Controlled deprotection and release of a small molecule from a compartmented synthetic tissue module. Communications Chemistry. 2 (1), 142 (2019).
  36. Gobbo, P., et al. Programmed assembly of synthetic protocells into thermoresponsive prototissues. Nature Materials. 17 (12), 1145-1153 (2018).
  37. Taylor, G. J., Sarles, S. A. Heating-enabled formation of droplet interface bilayers using escherichia coli total lipid extract. Langmuir. 31 (1), 325-337 (2015).
  38. Taylor, G. J., et al. Capacitive detection of low-enthalpy, higher-order phase transitions in synthetic and natural composition lipid membranes. Langmuir. 33 (38), 10016-10026 (2017).
  39. Lee, S., Kim, D. H., Needham, D. Equilibrium and dynamic interfacial tension measurements at microscopic interfaces using a micropipet technique. 2. Dynamics of phospholipid monolayer formation and equilibrium tensions at the water-air interface. Langmuir. 17 (18), 5544-5550 (2001).
  40. Najem, J. S., et al. Assembly and characterization of biomolecular memristors consisting of ion channel-doped lipid membranes. Journal of Visualized Experiments. (145), e58998 (2019).
  41. Wang, Y. G., Shao, H. H. Optimal tuning for PI controller. Automatica. 36 (1), 147-152 (2000).
  42. Needham, D., Haydon, D. A. Tensions and free energies of formation of "solventless" lipid bilayers. Measurement of high contact angles. Biophysical Journal. 41 (3), 251-257 (1983).
  43. Sarles, S. A., Leo, D. J. Physical Encapsulation of Interface Bilayers for durable portable biolayer network. Lab on a Chip. 10 (6), 710-717 (2010).
  44. Muller, R. U., Peskin, C. S. The kinetics of monazomycin-induced voltage-dependent conductance. II. Theory and a demonstration of a form of memory. The Journal of General Physiology. 78 (2), 201-229 (1981).
  45. Nenninger, A., et al. Independent mobility of proteins and lipids in the plasma membrane of Escherichia coli. Molecular Microbiology. 92 (5), 1142-1153 (2014).
  46. Venkatesan, G. A., et al. Adsorption kinetics dictate monolayer self-assembly for both lipid-in and lipid-out approaches to droplet interface bilayer formation. Langmuir. 31 (47), 12883-12893 (2015).
  47. Najem, J. S., et al. Memristive ion channel-doped biomembranes as synaptic mimics. ACS Nano. 12 (5), 4702-4711 (2018).
  48. Tamaddoni, N., Taylor, G., Hepburn, T., Michael Kilbey, S., Sarles, S. A. Reversible, voltage-activated formation of biomimetic membranes between triblock copolymer-coated aqueous droplets in good solvents. Soft Matter. 12, 5096-5109 (2016).

Tags

Biyomühendislik Sayı 170 mühendislik biyomühendislik lipid bilayer damlacık arayüzü ikiyer geri bildirim sıcaklık kontrolü kapasitans ölçümleri iyon kanalı yaşam bilimleri
Damlacık Arayüzü Bilayer'in Sıcaklık Kontrollü Montajı ve Karakterizasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ringley, J. D., Sarles, S. A.… More

Ringley, J. D., Sarles, S. A. Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer. J. Vis. Exp. (170), e62362, doi:10.3791/62362 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter