Summary
我们描述了产生人类诱导多能干细胞衍生脑类器官及其在线粒体疾病建模的详细方案。
Abstract
线粒体疾病是最大的一类先天性代谢缺陷,目前无法治愈。这些疾病导致神经发育缺陷,其潜在机制仍有待阐明。一个主要障碍是缺乏有效的模型来概括患者中早发性神经元损伤。诱导多能干细胞(iPSCs)技术的进步使三维(3D)脑类器官的产生成为可能,可用于研究疾病对神经系统发育和组织的影响。包括这些作者在内的研究人员最近引入了人脑类器官来模拟线粒体疾病。本文报告了人类iPSC衍生的脑类器官的强大生成及其在线粒体生物能量分析和成像分析中的应用的详细方案。这些实验将允许使用脑类器官来研究代谢和发育功能障碍,并可能为剖析线粒体疾病的神经元病理学提供关键信息。
Introduction
线粒体疾病是最大的一类先天性代谢缺陷1。它们是由破坏不同线粒体过程的基因突变引起的,包括氧化磷酸化(OXPHOS)2,呼吸链组装,线粒体动力学和线粒体DNA转录或复制3。有能量需求的组织尤其受线粒体功能障碍的影响4。因此,患有线粒体疾病的患者通常会出现早发性神经系统表现。
目前尚无针对线粒体疾病患儿的治疗方法5。线粒体疾病药物开发的一个主要障碍是缺乏概括人类疾病过程的有效模型6。目前研究的几种动物模型没有表现出患者中存在的神经缺陷7。因此,线粒体疾病神经元病理学的潜在机制仍未完全清楚。
最近的研究从受线粒体疾病影响的患者中产生了iPSCs,并使用这些细胞来获得患者特异性神经元细胞。例如,已发现与线粒体疾病Leigh综合征相关的遗传缺陷可导致细胞生物能量学8,9,蛋白质合成10和钙稳态9,11的畸变。这些报告为线粒体疾病中发生的神经元损伤提供了重要的机制线索,为这些不治之症的药物发现铺平了道路12。
然而,二维(2D)文化无法调查3D器官的建筑复杂性和区域组织13。为此,使用源自患者特异性iPSCs14 的3D脑类器官可能使研究人员能够获得额外的重要信息,从而有助于剖析线粒体疾病如何影响神经系统的发育和功能15。使用iPSC衍生的脑类器官来研究线粒体疾病的研究开始揭示线粒体疾病的神经发育成分。
脊髓类器官携带与线粒体疾病、线粒体脑病、乳酸性酸中毒和卒中样发作综合征(MELAS)相关的突变,显示神经发生缺陷和运动神经元分化延迟16。来自线粒体疾病Leigh综合征患者的皮质类器官显示尺寸减小,神经上皮芽生成缺陷和皮质结构丧失17。来自Leigh综合征患者的脑类器官表明,疾病缺陷始于神经祖细胞的水平,其不能致力于线粒体代谢,导致异常神经元分支和形态发生18。因此,神经祖细胞可能代表线粒体疾病的细胞治疗靶点,促进其线粒体功能的策略可能支持神经系统的功能发育。
脑类器官的使用可能有助于揭示线粒体疾病的神经发育成分。线粒体疾病主要被认为是早发性神经变性5。然而,受线粒体疾病影响的患者也存在神经发育缺陷,包括发育迟缓和认知障碍19。患者特异性脑类器官可能有助于解决这些方面,并阐明线粒体疾病如何影响人脑发育。线粒体功能障碍也可能在其他更常见的神经系统疾病中起致病作用,例如阿尔茨海默病,帕金森病和亨廷顿病4。因此,使用脑类器官阐明线粒体缺陷对神经发育的影响也可能有助于研究这些疾病。本文描述了一种用于生成可重复脑类器官的详细方案,可用于进行线粒体疾病的疾病建模。
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Protocol
注意:使用人类 iPSC 可能需要获得伦理批准。本研究中使用的iPSCs来自当地伦理批准后的健康对照个体(#2019-681)。所有细胞培养程序必须在无菌细胞培养罩下进行,在转移到罩下之前仔细消毒所有试剂和耗材。用于分化的人类iPSC的传代数应低于50,以避免在广泛培养时可能发生的潜在基因组畸变。细胞的多能状态应在类器官生成之前进行验证,例如,通过监测多能性相关标志物(如NANOG或OCT4)的表达。应每周进行支原体检测,以确保无支原体培养。
1. 脑类器官的产生
- 人类 iPSC 的培养
- 在无饲养层条件下,在iPSC培养基(见 材料表)中,在包衣的6孔板上培养人iPSCs,并将其保存在37°C和5%CO 2的加湿组织培养箱中。
注意:饲养层细胞的残留可能会阻碍类器官分化。在无饲养层条件下至少传代细胞一次。 - 使用无酶分离培养基以80%汇合度通过iPSCs,比例范围为1:4至1:12。为了提高细胞存活率,每次分裂后加入10μM Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂(Y27632)。
- 在无饲养层条件下,在iPSC培养基(见 材料表)中,在包衣的6孔板上培养人iPSCs,并将其保存在37°C和5%CO 2的加湿组织培养箱中。
- 解离 iPSC(80% 汇合度)-第 0 天。
- 准备皮质分化培养基I(CDMI)(表1)。在将CDMI培养基添加到细胞之前,先在室温(22-25°C)下预热CDMI培养基。
- 用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤含有iPSCs的孔以去除死细胞和碎屑。
- 向每个孔中加入500μL预热试剂A(材料表),并在37°C下孵育5分钟。 在显微镜下检查以确保细胞脱离。
- 加入1mL iPSC培养基以稀释试剂A以中和其活性。
- 使用1000μL移液器通过上下移液解离细胞,并将细胞悬浮液转移到15mL离心管中。
- 在室温(22-25°C)下以125× g 轻轻离心iPSCs5分钟。
- 小心地吸出上清液以避免干扰细胞沉淀。
- 用1mL CDMI重悬沉淀以获得单细胞悬浮液,并计数细胞数。
- 在CDMI中每100μL用9,000个iPSCs制备接种培养基,并补充20μM ROCK抑制剂,3μM WNT-连环蛋白抑制剂(IWR1)和5μM SB431542。
- 将每孔100μL接种培养基加入96孔V底板中。
- 将板保持在37°C和5%CO 2的加湿组织培养箱中。
- 神经球生成
- 在第1天,观察具有明确平滑边界的圆形细胞聚集体(神经球)正在形成。注意聚集体周围的死细胞。继续在培养箱中以37°C和5%CO 2培养。
- 在第3天,通过敲击侧面三次以分离死细胞来搅拌板。
- 向每个孔中加入100μLCDMI,补充有20μM ROCK抑制剂,3μM IWR1和5μM SB431542。
- 将板返回37°C和5%CO 2的培养箱。
- 在第6天,小心地从每个孔中取出80μL上清液培养基。避免触摸井底。
- 向每个孔中加入100μLCDMI,辅以3μM IWR1和5μM SB431542。将板返回37°C和5%CO 2的培养箱。
- 每 3 天重复一次步骤 5 和 6,直到第 18 天。
- 神经球的转移
- 在第18天,准备皮质分化培养基II(CDMII)(表1),并将10mL加入100mm超低附着细胞培养板中。
- 使用200μL移液器,尖端被切断,将圆形神经球从96孔板转移到100 mm超低附着细胞培养板。
注意:要轻柔地避免损坏神经球,确保尖端的开口足够宽,并且聚集体不会吸气太快。 - 从含有神经球的板中取出5 mL培养基,并加入5 mL新鲜CDMII。
注意:此过程有助于减少可能从神经球转移中携带的CDMI培养基的量。 - 将板以70rpm的速度放在37°C和5%CO 2的加湿组织培养箱内的轨道振荡器上。
注意:第二天目视检查神经球。如果神经球聚集在一起或附着在板的底部,则增加眼眶振动器的速度。 - 每3天,小心地吸出上清液培养基,并用新鲜的CDMII代替。留下少量培养基,以防止神经球变干。
- 在第35天,准备皮质分化培养基III(CDMIII)(表1)。
注:基质组分应溶解在冷CDMIII中。 - 从板中抽出培养基,加入10 mL冷CDMIII。
注意:使用冷培养基更有效,以便基质组分可以涂覆类器官而不会形成团块。 - 更换培养基后,将板放回轨道振荡器上,在37°C和5%CO 2的加湿组织培养箱内以70rpm的速度放置。
- 根据培养基的颜色所示,每3-5天更换培养基,具体取决于生长速度。
- 在第70天,准备皮质分化培养基IV(CDMIV)(表1)。使用CDMIV培养基,直到达到所需的类器官年龄。在此期间,将板保持在湿化组织培养培养箱(37°C和5%CO 2)内设置为70rpm的轨道振荡器上。
- 根据生长速度,每3-5天更换一次培养基。
2. 脑类器官的免疫染色
- 组织制备
- 准备4%多聚甲醛(PFA)溶液,并将其置于安全罩下。
注意:处理PFA时,请穿戴个人安全设备。 - 收集脑类器官,并用钝头3 mL塑料巴斯德移液管轻轻地将其转移到充满PFA的6孔板中。
注意:使用超过40天的类器官,以允许具有较高细胞复杂性的结构的可视化。 - 将类器官在室温下在PFA溶液中保存1小时。
- 用3 mL塑料巴斯德移液管小心地取出PFA,并使用PBS洗涤固定的类器官三次。
- 将固定的类器官储存在PBS中的4°C,直到进一步使用。
- 准备4%多聚甲醛(PFA)溶液,并将其置于安全罩下。
- 脑类器官切片的制备
- 准备3%琼脂溶液,慢慢加热直到液化。
- 将模具(10 mL注射器的切割端)放在一张吸水滤纸上(光滑的一面朝上)。在上面放一滴琼脂。
- 用刮刀从6孔板中快速取出单个类器官,并用滤纸除去过多的PBS。
注意:注意不要用滤纸直接触摸类器官。 - 将类器官放在琼脂液滴上。
- 用最多三个类器官重复此过程。
注意:在此步骤中,请快速工作以避免琼脂凝固。 - 用琼脂重新填充模具,直到所有类器官被完全覆盖。
- 等到琼脂开始凝固,然后轻轻地将含有类器官的整个模具(包括吸水性滤纸)转移到冷却元件上。
注意:如果没有冷却元件,请将类器官储存在4°C的冰箱中几分钟。 - 同时,准备切片程序:将剃须刀片(用丙酮清洁并用双蒸馏水洗涤)放入振动器的支架中,安装在浴槽上,并用PBS填充。
- 从(固化的)琼脂中取出霉菌,然后用手术刀修剪它以形成立方体。
- 用粘合凝胶将含有类器官的琼脂立方体附着在振动切片机的载板上(见 材料表),并将其置于含有PBS的浴中。
- 调整振动切片机(见 材料表)以切割厚度为150μm的切片。
注意:振动器设置(叶片的适当角度、振幅、频率和速度)可能与用于切割产后早期动物的固定脑组织的设置相似。然而,理想的设置很大程度上取决于振动切片机的类型,并且必须在第一步中确定,以防止在切割时变形甚至撕裂组织。 - 开始切割过程。使用玻璃移液器或刮刀将每个新鲜切割的切片轻轻转移到装满PBS的24孔板中。
- 将含有切片的板储存在4°C(最多几天),直到进一步加工。
- 用玻璃移液器或刮刀将切片从板中移出到显微镜载玻片上。每张幻灯片至少使用 2 片。
- 用注射器小心地去除琼脂和多余的PBS。
- 让切片干燥,直到它们粘附在载玻片上。
注意:虽然显微镜载玻片可以储存在4°C下充满PBS的塑料室中,但在切片程序后应尽快对其进行染色。
- 免疫组化染色
- 准备阻塞溶液(表1)。
- 使用 PAP 笔在载玻片上的切片周围绘制疏水边框,以帮助将所有溶液保留在载玻片上。
- 小心地将封闭溶液加入载玻片上,并在室温(22-25°C)下孵育1小时。为避免破坏组织,请勿将溶液直接添加到切片的顶部。
- 吸出封闭溶液并施加在封闭溶液中稀释的所需一抗。
- 将载玻片在4°C的加湿室中孵育过夜。
- 用 1 次 PBS 冲洗载玻片三次,每次 10 分钟。
- 用稀释在封闭溶液中的特异性二抗孵育切片,并在黑暗中的室温下进行Hoechst染色(1:2,500)1小时。
注意:请记住执行阴性对照,以确认没有非特异性结合或自动荧光。 - 在黑暗中用1x PBS冲洗三次,每次10分钟。
- 在切片中加入一滴安装介质,在液滴的边缘放置盖玻片,然后将盖玻片慢慢朝向切片,以避免气泡。
- 让载玻片在室温下静置过夜。在盖玻片的边框上涂抹指甲油以进一步密封载玻片。对于长期储存,储存在4°C。
- 染色记录
- 要扫描大图像进行拼接,请使用配备高质量物镜(详见 材料表)的 电动立式宽视场显微镜;DAPI滤光片组(例如,激发(EX):340-380纳米,二向色镜(DM):400纳米,势垒滤波器(BA):435-485纳米);荧光素异硫氰酸酯滤光片组(例如,EX:465-495 nm,DM:505 nm,BA:515-555 nm);Alexa594 过滤器集(例如,ET 575/40;T 600 液化铉;HC 623/24);数码相机;高性能采集软件,可实现自动拼接和堆叠操作。
- 对于图像处理,请使用能够生成 8 位 tif 文件、裁剪针迹、调整对比度和亮度、合并通道(例如蓝色、绿色和红色)以及添加比例尺的图像处理程序。
- 要扫描细节,请使用配备高质量物镜的电动共聚焦激光扫描显微镜,紫外激光器(EX:408 nm),氩激光器(EX:488 nm),氦氖激光器(EX:543),共聚焦显微镜成像软件。
- 对于细节的图像处理,使用能够生成共聚焦z-stack的最大强度投影的图像处理程序(例如,每个0.6μm的光学部分),生成8位tif文件,调整对比度和亮度,合并通道(例如,蓝色,绿色和红色),添加比例尺。
- 使用图形编辑器排列图形。
3. 脑类器官的生物能量分析
- 用于生物能量分析的类器官的制备
- 按照制造商的协议准备木瓜蛋白酶和DNA酶溶液。
- 将3-5个类器官转移到6孔板中。用预热的PBS清洗两次。
- 加入2 mL含有DNA酶的预热活化木瓜蛋白酶溶液。使用刀片将类器官切成小块。
- 将板置于细胞培养箱内以27rpm设置的轨道振荡器(在37°C,5%CO 2下),并孵育15-20分钟。
注意:孵育时间取决于类器官阶段。早期类器官可以按原样使用。对于超过3个月的类器官,建议在解离前将类器官切成2-3块,并在37°C下以27rpm的摇摆速度孵育这些片段15-20分钟。 该手术可以帮助去除可能存在于后期类器官中的坏死组织。 - 将消化的组织收集到15mL管中,并加入5mL类器官培养基CDMIV(表1)。
- 用10 mL塑料移液器通过上下移液10-15次来研磨组织。让未解离的组织沉降到管的底部。
- 小心地将细胞悬浮液转移到15 mL管中,避免任何未解离的组织。通过40μm细胞过滤器过滤溶液(例如,带有细胞过滤器盖的聚苯乙烯圆底管)。
- 通过在室温下以300× g 离心5分钟来沉淀细胞。
- 使用台盼蓝评估细胞数量和质量。
- 将所需数量的细胞(约20,000 /孔)接种到包衣的96孔微孔板上。接种后6-8小时更换培养基至神经元培养基(表1)。
- 将包被的96孔微孔板在CO2 培养箱(37°C,5%CO 2)中孵育4天。
- 生物能量分析
- 在重新接种解离细胞后的第3天,将200μL校准溶液加入96孔微孔板底部的每个孔中,并将顶部绿色传感器盒置于水合微孔板上。
注:将传感器盒以正确的方向放在微孔板的顶部,并确保校准液覆盖所有传感器。 - 将水合的96孔微孔板在37°C的非CO2 培养箱中孵育过夜。
- 打开分析仪,让仪器在37°C下稳定过夜。
- 在重镀后的第4天,在显微镜下检查96孔微孔板上解离的类器官培养物,以确保细胞显示为汇合单层。
- 制备测定培养基(表1)。
- 用移液器从所有孔中取出神经元培养基,而不接触孔的底部,以防止细胞损伤。或者,小心地倒置整个盘子,然后在干净的纸上干燥。快速工作以避免细胞死亡。
- 用预热的200μL测定培养基洗涤细胞两次。将测定培养基加入每孔180μL的最终体积中。将96孔微孔板在37°C的非CO2 培养箱中孵育1小时。
- 在测定培养基中制备10μM线粒体抑制剂溶液。请注意,注射后的终浓度为1μM。
- 将放置在水合微孔板中的传感器盒与10x线粒体抑制剂溶液一起加载。
- 将18μL线粒体抑制剂1加入端口A中。
- 将19.8μL线粒体抑制剂2加入端口B中。
- 将21.6μL线粒体抑制剂2加入端口C中。
- 将23.4μL线粒体抑制剂3加入端口D中。
- 将加载的墨盒置于37°C的非CO2 培养箱中的水合微孔板中,直到测定开始。
- 在仪器的软件中设置运行协议(表2)。
- 按 开始。从非CO2 培养箱中取出装载的墨盒,并将其放入分析仪进行校准。
注:确保板以正确的方向插入,并且没有盖子。 - 校准步骤结束后,取出校准板。从非CO2 培养箱中取出96孔微孔板,并将其放入分析仪中。单击" 继续 "开始测量。
- 运行完成后,从分析仪中取出96孔细胞培养微孔板,并从所有孔中收集培养基,而不会干扰细胞。
注意:培养基可以储存在-20°C,稍后使用适当的乳酸测定试剂盒测量培养基中细胞释放的乳酸量。 - 在每个孔中用200μL1x PBS洗涤细胞。
- 取出PBS后,将板冷冻在-20°C。
注意:冷冻板可用于定量微孔中每个孔中的细胞,蛋白质或DNA。需要这种定量来使获得的生物能量速率正常化。遵循制造商的细胞、蛋白质或 DNA 定量分析说明。
- 在重新接种解离细胞后的第3天,将200μL校准溶液加入96孔微孔板底部的每个孔中,并将顶部绿色传感器盒置于水合微孔板上。
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Representative Results
这里描述的协议有助于圆类器官的稳健生成(图1A)。生成的类器官包含成熟的神经元,可以使用轴突(SMI312)和树突(微管相关蛋白2(MAP2))特异性的蛋白质标记物进行可视化(图1B) )。成熟的类器官不仅含有神经元细胞(MAP2阳性),还含有神经胶质细胞(例如,星形胶质细胞标志物S100钙结合蛋白B(S100ß)阳性)(图1B)。
通过使用共聚焦显微镜分析切片的脑类器官,可以识别和监测不同细胞类型和细胞结构的详细分布和组织。这可以为线粒体疾病如何影响神经系统发育提供新的见解。例如,可以监测神经元轴突(SMI312阳性)和树突(MAP2阳性) (图2A) 或神经元细胞(MAP2阳性)和神经胶质细胞(S100ß阳性)的相互发生 (图2A)。共聚焦图像还可能有助于更详细地研究神经祖细胞((性别决定区Y)box-2(SOX2)阳性)相对于神经元(β-III微管蛋白(TUJ1)阳性)的分布和组织 (图2B))。最后,可以染色脑类器官的线粒体特异性标志物(例如外线粒体膜蛋白,外膜转座酶20 kDa亚基(TOM20)) (图2C))。
所描述的方案使研究人员能够对脑类器官进行生物能量分析。使用该程序,可以使用耗氧率(OCR)测量线粒体代谢 (图2D) 和使用细胞外酸化速率(ECAR)测量糖酵解代谢 (图2E)。生物能量分析允许监测细胞如何修改其OCR和ECAR谱以响应线粒体抑制剂的顺序给药。
首先,可以应用ATP合成酶抑制剂寡霉素。寡霉素导致OCR谱下降(图2D),因此确定了ATP生产所需的OCR。在寡霉素治疗后,ECAR也可能有代偿性增加(图2E),表明细胞可以上调糖酵解以防止由线粒体代谢减少引起的代谢应激。随后的质子离子载体羰基氰化物-对三氟甲氧基苯肼(FCCP)的双重应用导致线粒体膜电位的损失。由于氧分子现在可以自由移动,这导致OCR迅速增加(图2D)。
OCR图谱中的这些变化确定了细胞的最大呼吸能力。鱼藤酮加抗霉素A的最终给药引起电子传递阻断,因此,OCR急剧下降(图2D)。ECAR在用FCCP和鱼藤酮加抗霉素A处理后可能显示波动(图2E),这取决于细胞的残留糖酵解能力。OCR和ECAR谱可能在来自线粒体患者的脑类器官中发生显着变化。
图1:从人类iPSCs生成脑类器官(A)用于产生具有相应传输图像的脑类器官的协议示意图。第0天对应于iPSCs的解离和接种在96孔板中,使用CDMI补充ROCK抑制剂,WNT抑制剂和SB431542。在第18天,神经球从96孔板转移到100mm细胞培养皿中,CDMII补充N2。从这一点开始,文化被放置在轨道振动器上。在第35天,培养基从CDMII切换到CDMIII,CDMIII还含有溶解的基质组分(表1)。从第70天开始,CDMIII切换到补充B27的CDMIV。在第12天使用具有10倍放大倍率的显微镜相机拍摄具有代表性的神经球图像。第22天使用显微镜相机以4倍放大倍率拍摄早期类器官图像。在第40天使用具有4倍放大倍率的显微镜相机拍摄成熟的类器官图像。(B)脑类器官的整体结构和细胞组织可以使用宽视场显微镜进行可视化。显示具有代表性的拼接宽场图像,以可视化树突(MAP2阳性)和轴突(SMI312阳性)以及神经元细胞(MAP2阳性)和推测的星形胶质细胞(S100ß阳性)之间的关系。用Hoechst对细胞进行复染以揭示细胞核。所有图像都是使用78天大的脑类器官拍摄的。右列显示三个通道(合并)的叠加。比例尺 = 500 μm。缩写:iPSC =诱导多能干细胞;CDM = 皮质分化培养基;ROCK = Rho 激酶;MAP2 =微管相关蛋白2;S100ß= S100钙结合蛋白B.请点击此处查看此图的放大版本。
图2:用于线粒体疾病建模的脑类器官的可视化和生物能量分析。 类器官的详细组织和结构可以使用共聚焦显微镜进行分析。所有图像都是使用78天大的脑类器官拍摄的,并用Hoechst反染以揭示细胞核。右列显示三个通道(合并)的叠加。比例尺 = 50 μm. (A) 代表性的扩展聚焦投影(44-48 个光学平面,每个 0.6 μm),解决了树突(MAP2 阳性,箭头)和轴突(SMI312 阳性,箭头)之间以及神经元细胞(MAP2 阳性,箭头)和假定的星形胶质细胞(S100ß 阳性,箭头)之间的相互作用。(B)代表性的扩展焦点投影(14-31个光学平面,每个0.6μm),显示神经元(TUJ1阳性,箭头)相对于神经祖细胞的分布(SOX2阳性,箭头)。(C)代表性的扩展焦点投影(20个光学平面,每个0.6μm)显示线粒体神经元(TUJ1阳性,箭头)内的分布(使用针对外线粒体膜蛋白TOM20的抗体可视化,箭头)。(D)在连续施用不同的线粒体抑制剂后,可以根据OCR的谱来监测脑类器官的线粒体呼吸(有关详细信息,请参阅文本)。(E)在连续施用线粒体抑制剂时,可以基于ECAR监测脑类器官的糖酵解活性(详见文本)。对于生物能量分析,解离大约10-15个脑类器官以获得足够的细胞以重新接种到96孔微孔板上。条形表示基于两个独立实验中获得的结果的SEM。缩写:MAP2 = 微管相关蛋白2;S100ß = S100钙结合蛋白B;TUJ1 = β-III 微管蛋白;SOX2 = (性别决定区域 Y) 框-2;TOM20 = 外膜20 kDa亚基的转座酶;OCR = 耗氧率;ECAR =细胞外酸化速率;寡核苷酸。=寡霉素;FCCP = 羰基氰化物-对三氟甲氧基苯肼;R = 鱼藤酮;AntA = 抗霉素 A;SEM = 均值的标准误差。 请点击此处查看此图的放大版本。
媒体构成 | |||
CDMI(第0-18天) | 最后的结局。 | ||
格拉斯哥-梅姆 | 吉布科 | 11710-035 | [1:1] |
敲除血清替代疗法 | 吉布科 | 10828010 | 20% |
MEM-NEAA(MEM非必需氨基酸溶液) | 吉布科 | 11140-050 | 0.1 毫米 |
丙酮酸钠 | 吉布科 | 11360070 | 1 毫米 |
2-巯基乙醇 | 吉布科 | 31350-010 | 0.1 毫米 |
青霉素和链霉素 | 吉布科 | 15140-122 | 100 U/mL 和 100 μg/mL |
CDMII(第18-35天) | 最后的结局。 | ||
DMEM/F12 | 吉布科 | 31330038 | [1:1] |
谷氨酰胺 | 吉布科 | 35050-061 | 2 兆米 |
N-2 补充剂 (100x) | 吉布科 | 17502-048 | 1% |
化学定义的脂质浓缩物 | 吉布科 | 11905031 | 1% |
青霉素和链霉素 | 吉布科 | 15140-122 | 100 U/mL 和 100 μg/mL |
CDMIII(第35-70天) | 最后的结局。 | ||
DMEM/F12 | 吉布科 | 31330038 | [1:1] |
谷氨酰胺 | 吉布科 | 35050-061 | 2 兆米 |
N-2 补充剂 (100x) | 吉布科 | 17502-048 | 1% |
化学定义的脂质浓缩物 | 吉布科 | 11905031 | 1% |
青霉素和链霉素 | 吉布科 | 15140-122 | 100 U/mL 和 100 μg/mL |
胎牛血清 | 吉布科 | 10270-106 | 10% |
肝素 | 默 克 | H3149-25KU | 5 微克/毫升 |
基质胶 | 康宁 | 356231 | 1% |
CDMIV(第70天+) | 最后的结局。 | ||
DMEM/F12 | 吉布科 | 31330038 | [1:1] |
谷氨酰胺 | 吉布科 | 35050-061 | 2 兆米 |
N-2 补充剂 (100x) | 吉布科 | 17502-048 | 1% |
化学定义的脂质浓缩物 | 吉布科 | 11905031 | 1% |
青霉素和链霉素 | 吉布科 | 15140-122 | 100 U/mL 和 100 μg/mL |
胎牛血清 | 吉布科 | 10270-106 | 10% |
肝素 | 默 克 | H3149-25KU | 5 微克/毫升 |
基质胶 | 康宁 | 356231 | 2% |
B-27补充剂含维生素A 50x | 吉布科 | 17504044 | 2% |
神经元培养基 | 最后的结局。 | ||
DMEM/F12 | 吉布科 | 31330038 | [1:1] |
N-2 补充剂 | 吉布科 | 17502048 | [1 倍] |
B-27补充剂含维生素A 50x | 吉布科 | 17504044 | [1 倍] |
L-抗坏血酸 | 西格玛·奥尔德里奇 | A92902 | [200微米] |
db-cAMP(二丁酰环磷酸腺苷) | 西格玛·奥尔德里奇 | D0626 | 500 微米 |
BDNF(脑源性中性粒细胞因子) | 麦克斯米尔泰尼 | 130-093-811 | [10纳克/毫升] |
GDNF(神经胶质细胞系衍生的神经营养因子) | 麦克斯米尔泰尼 | 130-096-290 | [10纳克/毫升] |
人TGF-β3(转化生长因子-β3) | 麦克斯米尔泰尼 | 130-094-007 | [1 纳克/毫升] |
检测培养基 | 最后的结局。 | ||
海马 XF DMEM 介质 | 海马生物科学 | 103680-100 | 500 毫升 |
丙酮酸钠 | 吉布科 | 11360070 | 1 毫米 |
L-谷氨酰胺 | 龙沙 | BEBP17-605E | 2 兆米 |
葡萄糖 | 西格玛·奥尔德里奇 | 50-99-7 | 10 毫米 |
拦截解决方案 | 最后的结局。 | ||
美国公共广播公司补间 | [1:1] 0.1% 吐温 | ||
驴血清 | 西格玛·奥尔德里奇 | D9662 | 10% |
海卫一-X | 默 克 | X100-5毫升 | 1% |
表1:用于类器官生成的培养基和溶液的详细信息。
初始化 | 基线 (X3) | 寡霉素注射液(X3) | 氟氯化碳注射液 (X3) | 氟氯化碳注射液 (X3) | 抗A+腐烂注射(X3) |
校准 | 混合 | 混合 | 混合 | 混合 | 混合 |
(04:00) | (04:00) | (04:00) | (04:00) | (04:00) | |
平衡 (12:00) | 等 | 等 | 等 | 等 | 等 |
(02:00) | (02:00) | (02:00) | (02:00) | (02:00) | |
测量 (03:00) | 测量 (03:00) | 测量 (03:00) | 量 | 测量 (03:00) | |
(03:00) |
表2:生物能量分析的方案设置。 使用Seahorse Wave Desktop软件描述步骤及其长度(以分钟为单位)。缩写: FCCP = 羰基氰化物-对三氟甲氧基苯肼;腐烂=鱼藤酮;抗霉素A=抗霉素A。
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Discussion
本文描述了人类iPSC衍生的脑类器官的可重复生成及其在线粒体疾病建模中的应用。此处描述的协议是根据以前发表的 work20 进行修改的。本方案的一个主要优点是它不需要手动将每个类器官嵌入到支架基质中。实际上,基质溶液只是简单地溶解到细胞培养基中。此外,无需使用昂贵的生物反应器,因为类器官可以在标准组织培养物中培养6孔板,放置在培养箱内的轨道振荡器上。该程序还能够并行培养包含来自不同单个品系的不同类器官的多个板,从而增加实验的通量,并允许监测不同类器官生长曲线中出现的潜在差异。我们使用来自健康对照组和受线粒体疾病影响个体的不同iPSCs测试了该协议,并取得了一致的结果。
对于线粒体疾病建模,必须使用不同的标记来可视化线粒体网络的形态和组织。该程序可以研究线粒体数量,形态学或分布是否可能改变来自线粒体疾病患者的脑类器官。脑类器官中神经祖细胞的存在和组织对于模拟线粒体疾病可能至关重要。我们最近发现,导致线粒体疾病Leigh综合征的突变破坏了患者衍生的脑类器官内神经祖细胞的细胞结构和分布18。
为了进行生物能量分析,我们采用了一种先前描述的方法,用于评估多能干细胞的生物能量学21。最近的一项方案描述了如何对来自小鼠小肠,人结肠和结直肠肿瘤的类器官进行生物能量分析22。然而,与脑类器官相比,这些类器官非常小,因此,脑类器官需要不同的方案,例如这里报道的协议。我们最近采用该协议来评估携带导致严重线粒体疾病Leigh综合征18的表面位点蛋白1基因(SURF1)突变的人脑类器官的生物能量谱。我们发现,OCR谱在Leigh综合征类器官中尤其受影响,如基础OCR水平,ATP产生率和最大呼吸速率的显着降低所显示的那样18。
总之,我们在这里提出了一个详细的人脑类器官生成方案,并描述了如何进行实验,这对于研究线粒体疾病背后的疾病机制非常重要。人脑类器官对于阐明人脑中的线粒体多样性及其在人类健康和疾病中的作用也可能至关重要23。重要的是要澄清,使用当前可用的协议(包括此处描述的协议)产生的脑类器官仍然具有局限性。例如,这些包括缺乏血管形成和缺乏小胶质细胞群24。为了正确解释结果,需要考虑这些方面。
例如,缺乏脉管系统和小胶质细胞可能会限制 体内可能存在的代偿机制。因此,患者来源的脑类器官可能表现出比在患者中观察到的缺陷更强的缺陷17,18。此外,尽管该协议具有一般的可重复性20,但可以观察到线对线异质性。为此,在进行疾病建模研究时,通过评估形态模式(大小,层)和分子标志物在不同类器官上的分布来系统地量化对照组和患者类器官的均匀性始终很重要。
最后,不可能从单个iPSC产生脑类器官,限制了使用CRISPR / Cas9进行大规模遗传筛选的可行性。鉴于研究的步伐,这里描述的协议的一些当前局限性可能很快就会被克服。优化的协议将变得可用。这些线粒体疾病的3D模型有望最终发现可实施的线粒体疾病疗法,这些疾病是有害的,并且用于具有高度未满足的医疗需求的不治之症。
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Disclosures
作者声明没有竞争性的财务或非财务利益。
Acknowledgments
我们感谢Miriam Bünning的技术支持。我们感谢德国联邦医疗协会(DFG)(PR1527/5-1至AP)、Spark和柏林卫生研究院(BIH)(BIH验证基金至AP)、联合线粒体疾病基金会(UMDF)(利综合征国际财团资助AP)、杜塞尔多夫大学医院(Forschungskommission UKD至AP)和德国联邦教育与研究部(BMBF)(e:生物年轻研究员向AP授予AZ 031L0211)。C.R.R.实验室的工作得到了DFG的支持(FOR 2795"压力下的突触",Ro 2327/13-1)。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
Affinity Designer | Serif (Europe) Ltd | Layout software; Vector graphics editor | |
Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig | Sigma Aldrich | SAB4600033-250UL | 1:300 |
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | 1:300 |
Antimycin A | Sigma Aldrich | 1397-94-0 | |
Anti-β-Tubulin III (TUJ-1) | Sigma Aldrich | T8578 | 1:2000 |
Argon Laser | Melles Griot | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too | |
Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
B-27 with Vitamin A | Gibco | 17504044 | |
Bacto Agar | Becton Dickinson | 3% in PBS, store solution at -20 °C | |
BDNF | Miltenyi Biotec | 130-093-0811 | |
cAMP | Sigma | D0627 | |
Cell Star cell culture 6 well plate | Greiner-Bio-One | 657160 | |
Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | |
Confocal laser scanning microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system | |
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | Matrix component |
CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit | Thermo Fisher | C7026 | |
DMEM/F12 | ThermoFisher | 31330038 | |
DMSO | Sigma | D2660-100ML | |
Donkey anti-goat Cy3 | Merck Millipore | AP180C | 1:300 |
Donkey anti-mouse Cy3 | Merck Millipore | AP192C | 1:300 |
Donkey anti-rabbit Cy3 | Merck Millipore | AP182C | 1:300 |
DPBS | Gibco | 14190250 | |
DS-Q1Mc camera | Nikon Microscope Solutions | ||
Eclipse 90i upright widefield microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
Eclipse Ts2 Inverted Microscope | Nikon Microsope Solutions | ||
EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
FCCP | Sigma Aldrich | 370-86-5 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-291 | |
Glasgow MEM | Gibco | 11710-035 | |
Glass Pasteur pipette | Brand | 747715 | Inverted |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
Helium-Neon Laser | Melles Griot | Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too | |
Heparin | Merck | H3149-25KU | |
HERACell 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026331 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:2500 |
Image J 1.53c | Wayne Rasband National Institute of Health | Image processing Software | |
Injekt Solo 10 mL/ Luer | Braun | 4606108V | |
Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
Laser (407 nm) | Coherent | Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too | |
Map2 | Synaptic Systems | No. 188004 | 1:1000 |
Maxisafe 2030i | |||
MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | |
mTeSR Plus | Stemcell Technology | 85850 | iPSC medium |
Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 10325804 | |
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | # LT07-218 | |
N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
Needle for single usage (23G x 1” TW) | Neoject | 10016 | |
NIS-Elements Aadvanced Research 3.2 | Nikon | Imaging software | |
Oligomycin A | Sigma Aldrich | 75351 | |
Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010 | Heidolph | 543-12310-00 | |
PAP Pen | Sigma | Z377821-1EA | To draw hydrophobic barrier on slides. |
Papain Dissociation System kit | Worthington | LK003150 | |
Paraformaldehyde | Merck | 818715 | 4% in PBS, store solution at -20 °C |
Pasteur pipette 7mL | VWR | 612-1681 | Graduated up to 3 mL |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2 ∞/0.17 WD 1.0 | Nikon Microscope Solutions | Dry Microscope Objective | |
Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13 | Nikon Microscope Solutions | Oil Immersion Microscope Objective | |
Polystyrene Petri dish (100 mm) | Greiner Bio-One | 664161 | |
Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL) | Falcon | 352235 | |
Potassium chloride | Roth | 6781.1 | |
ProLong Glass Antifade Moutant | Invitrogen | P36980 | |
Qualitative filter paper | VWR | 516-0813 | |
Rock Inhibitior | Merck | SCM075 | |
Rotenone | Sigma | 83-794 | |
S100β | Abcam | Ab11178 | 1:600 |
SB-431542 | Cayman Chemical Company | 13031 | |
Scalpel blades | Heinz Herenz Hamburq | 1110918 | |
SMI312 | Biolegend | 837904 | 1:500 |
Sodium bicarbonate | Merck/Sigma | 31437-1kg-M | |
Sodium chloride | Roth | 3957 | |
Sodium dihydrogen phosphate | Applichem | 131965 | |
Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-17320 | 1:100 |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco/StemPro | A1110501 | Reagent A |
Super Glue Gel | UHU | 63261 | adhesive gel |
SuperFrost Plus | VWR | 631-0108 | |
Syringe for single usage (1 mL) | BD Plastipak | 300015 | |
TB2 Thermoblock | Biometra | ||
TC Plate 24 Well | Sarstedt | 83.3922 | |
TC Plate 6 Well | Sarstedt | 83.392 | |
TGFbeta3 | Miltenyi Biotec | 130-094-007 | |
Tissue Culture Hood | ThermoFisher | 51032711 | |
TOM20 | Santa Cruz Biotechnology | SC-11415 | 1:200 |
Triton-X | Merck | X100-5ML | |
UltraPure 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
Vibratome Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too. | |
Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade | Wilkinson Sword | 70517470 | |
Whatman Benchkote | Merck/Sigma | 28418852 | |
Wnt Antagonist I | EMD Millipore Corp | 3378738 | |
XF 96 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | |
XF Assay DMEM Medium | Seahorse Bioscience | 103680-100 | |
XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
XFe96 FluxPak (96-well microplate) | Seahorse Bioscience | 102416-100 |
References
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