Summary

جيل من الأعضاء الدماغ البشري لنمذجة مرض الميتوكوندريا

Published: June 21, 2021
doi:

Summary

نحن نصف بروتوكول مفصل لتوليد الخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستحثة البشرية المستمدة من أعضاء الدماغ واستخدامها في نمذجة أمراض الميتوكوندريا.

Abstract

أمراض الميتوكوندريا تمثل أكبر فئة من الأخطاء الجنينية في التمثيل الغذائي وغير قابلة للشفاء حاليا. هذه الأمراض تسبب عيوب نمائية عصبية لا تزال آلياتها الأساسية في حالة توضيح. حاجز رئيسي هو عدم وجود نماذج فعالة تلخيص ضعف الخلايا العصبية في وقت مبكر ينظر في المرضى. يتيح التقدم في تكنولوجيا الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) توليد أعضاء دماغية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) يمكن استخدامها للتحقيق في تأثير الأمراض على تطور الجهاز العصبي وتنظيمه. وقد أدخل الباحثون، بما في ذلك هؤلاء المؤلفين، مؤخرا organoids الدماغ البشري لنموذج اضطرابات الميتوكوندريا. هذه الورقة تقارير بروتوكول مفصل للجيل قوية من الأعضاء الدماغ المستمدة من iPSC الإنسان واستخدامها في التنميط الحيوي الميتوكوندريا وتحليلات التصوير. هذه التجارب سوف تسمح باستخدام organoids الدماغ للتحقيق في الاختلالات الأيضية والتنموية، ويمكن أن توفر معلومات حاسمة لتشريح الأمراض العصبية من أمراض الميتوكوندريا.

Introduction

أمراض الميتوكوندريا تمثل أكبر فئة من الأخطاء الجنينية من التمثيل الغذائي1. وهي ناجمة عن الطفرات الوراثية التي تعطل عمليات الميتوكوندريا المختلفة، بما في ذلك الفوسفور التأكسدي (OXPHOS)2، وتجميع سلسلة الجهاز التنفسي، وديناميات الميتوكوندريا، ونسخ الحمض النووي الميتوكوندريا أو النسخ المتماثل3. تتأثر الأنسجة ذات متطلبات الطاقة بشكل خاص بخلل الميتوكوندريا4. وبناء على ذلك، فإن المرضى الذين يعانون من أمراض الميتوكوندريا عادة ما يطورون مظاهر عصبية مبكرة.

لا توجد حاليا علاجات متاحة للأطفال المصابين بأمراض الميتوكوندريا5. عائق رئيسي لتطوير المخدرات من أمراض الميتوكوندريا هو عدم وجود نماذج فعالة تلخيص مسار المرض البشري6. العديد من النماذج الحيوانية التي تمت دراستها حاليا لا تظهر العيوب العصبية الموجودة في المرضى7. وبالتالي ، فإن الآليات الكامنة وراء أمراض الخلايا العصبية لأمراض الميتوكوندريا لا تزال غير مفهومة تماما.

الدراسات الحديثة ولدت iPSCs من المرضى المتضررين من أمراض الميتوكوندريا واستخدمت هذه الخلايا للحصول على خلايا عصبية خاصة بالمرضى. على سبيل المثال، تم العثور على العيوب الوراثية المرتبطة بمرض الميتوكوندريا، متلازمة لي، تسبب انحرافات في الجيوجيات الحيوية الخلوية8،9، تخليق البروتين10، والكالسيوم homeostasis9،11. قدمت هذه التقارير أدلة ميكانيكية مهمة على ضعف الخلايا العصبية التي تحدث في أمراض الميتوكوندريا ، مما يمهد الطريق لاكتشاف الأدوية لهذه الأمراض المستعصية12.

الثقافات ثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد) ، ومع ذلك ، لا تمكن من التحقيق في التعقيد المعماري والتنظيم الإقليمي للأجهزة ثلاثية الأبعاد13. وتحقيقا لهذه الغاية، فإن استخدام الأعضاء العضوية ثلاثية الأبعاد في الدماغ المستمدة من iPSCs14 الخاصة بالمرضى قد يسمح للباحثين بالحصول على معلومات إضافية مهمة وبالتالي المساعدة في تشريح كيفية تأثير أمراض الميتوكوندريا على تطور الجهاز العصبي ووظيفته15. بدأت الدراسات التي تستخدم الأعضاء المشتقة من الدماغ iPSC للتحقيق في أمراض الميتوكوندريا في الكشف عن المكونات العصبية النمائية لأمراض الميتوكوندريا.

أظهرت الأجهزة العضوية في الحبل الشوكي التي تحمل طفرات مرتبطة بمرض الميتوكوندريا واعتلال الدماغ الميتوكوندريا وحمض اللاكتيك ومتلازمة الحلقات الشبيهة بالسكتة الدماغية (MELAS) وجود خلل في تكوين الأعصاب وتمايز الخلايا العصبية الحركية المتأخر16. أظهرت الأجهزة العضوية القشرية المشتقة من المرضى الذين يعانون من مرض الميتوكوندريا ، متلازمة لي ، انخفاضا في الحجم ، وعيوبا في توليد البراعم الظهارية العصبية ، وفقدان العمارة القشرية17. أظهرت أعضاء الدماغ من مرضى متلازمة لي أن عيوب المرض تبدأ على مستوى خلايا السلف العصبية ، والتي لا يمكن أن تلتزم بعملية التمثيل الغذائي للميتوكوندريا ، مما يسبب تفريع الخلايا العصبية الشاذة والمورفوجينيس18. وهكذا، قد تمثل السلف العصبية هدفا علاجيا خلويا لأمراض الميتوكوندريا، وقد تدعم الاستراتيجيات التي تعزز وظيفتها الميتوكوندريا التطور الوظيفي للجهاز العصبي.

قد يساعد استخدام الأعضاء العضوية في الدماغ في الكشف عن المكونات العصبية النمائية لأمراض الميتوكوندريا. تعتبر أمراض الميتوكوندريا بشكل رئيسي تنكس عصبي مبكر5. ومع ذلك ، توجد عيوب نمائية عصبية أيضا في المرضى المتضررين من أمراض الميتوكوندريا ، بما في ذلك تأخر النمو وضعف الإدراك19. قد تساعد الأعضاء العضوية الدماغية الخاصة بمرضى معينين في معالجة هذه الجوانب وتوضيح كيفية تأثير أمراض الميتوكوندريا على نمو الدماغ البشري. يمكن أن يلعب خلل الميتوكوندريا أيضا دورا مسببا للأمراض في الأمراض العصبية الأخرى الأكثر شيوعا ، مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون ومرض هنتنغتون4. وبالتالي ، فإن توضيح تأثير عيوب الميتوكوندريا في النمو العصبي باستخدام أعضاء الدماغ قد يكون مفيدا أيضا لدراسة تلك الأمراض. تصف هذه الورقة بروتوكولا مفصلا لتوليد أعضاء الدماغ القابلة للاستنساخ التي يمكن استخدامها لإجراء نمذجة الأمراض لأمراض الميتوكوندريا.

Protocol

ملاحظة: قد يتطلب استخدام iPSCs البشرية موافقة أخلاقية. استمدت مراكز الرقابة الصحية الدولية المستخدمة في هذه الدراسة من أفراد مكافحة صحيين بعد الموافقة الأخلاقية المحلية (#2019-681). يجب أن يتم تنفيذ جميع إجراءات زراعة الخلايا تحت غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية العقيمة، وتطهير بعناية جميع الكوا?…

Representative Results

البروتوكول الموصوف هنا يسهل توليد قوي من organoids الجولة (الشكل 1A). تحتوي الأجهزة العضوية المتولدة على خلايا عصبية ناضجة يمكن تصورها باستخدام علامات البروتين المحددة للمكونات (SMI312) والتشعبات (البروتين المرتبط بالميكروتبول 2 (MAP2)) (الشكل 1B…

Discussion

تصف هذه الورقة الجيل القابل للاستنساخ من الأعضاء العضوية البشرية المشتقة من الدماغ iPSC واستخدامها لنمذجة أمراض الميتوكوندريا. يتم تعديل البروتوكول الموضح هنا استنادا إلى work20 المنشورة مسبقا. وإحدى المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول هي أنه لا يتطلب التضمين اليدوي لكل عضو عضوي ف…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر ميريام بونينج على الدعم الفني. نعترف بالدعم المقدم من دويتشه فوردشونجسجيمينشافت (DFG) (PR1527/5-1 إلى A.P.) وS spark ومعهد برلين للصحة (BIH) (صناديق التحقق من صحة BIH إلى A.P.) ، ويونايتد مؤسسة أمراض الميتوكوندريا (UMDF) (منحة الاتحاد الدولي لمتلازمة لي ل A.P.)، مستشفى دوسلدورف الجامعي (Forschungskommission UKD إلى A.P.)، ووزارة التعليم والبحوث الاتحادية الألمانية (BMBF) (e: بيو الشباب المحقق منح AZ 031L0211 إلى A.P.). تم دعم العمل في مختبر C.R.R. من قبل DFG (FOR 2795 “نقاط الاشتباك العصبي تحت الضغط”، Ro 2327/13-1).

Materials

2-mercaptoethanol Gibco 31350-010
Affinity Designer Serif (Europe) Ltd Layout software; Vector graphics editor
Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig Sigma Aldrich SAB4600033-250UL 1:300
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse Thermo Fisher Scientific A-31571 1:300
Antimycin A Sigma Aldrich 1397-94-0
Anti-β-Tubulin III (TUJ-1) Sigma Aldrich T8578 1:2000
Argon Laser Melles Griot Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too
Ascorbic acid Sigma A92902
B-27 with Vitamin A Gibco 17504044
Bacto Agar Becton Dickinson 3% in PBS, store solution at -20 °C
BDNF Miltenyi Biotec 130-093-0811
cAMP Sigma D0627
Cell Star cell culture 6 well plate Greiner-Bio-One 657160
Chemically Defined Lipid Concentrate Gibco 11905031
Confocal laser scanning microscope C1 Nikon Microscope Solutions Modular confocal microscope system
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free Corning 356231 Matrix component
CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit Thermo Fisher C7026
DMEM/F12 ThermoFisher 31330038
DMSO Sigma D2660-100ML
Donkey anti-goat Cy3 Merck Millipore AP180C 1:300
Donkey anti-mouse Cy3 Merck Millipore AP192C 1:300
Donkey anti-rabbit Cy3 Merck Millipore AP182C 1:300
DPBS Gibco 14190250
DS-Q1Mc camera Nikon Microscope Solutions
Eclipse 90i upright widefield microscope Nikon Microscope Solutions
Eclipse E 600FN upright microscope Nikon Microscope Solutions
Eclipse Ts2 Inverted Microscope Nikon Microsope Solutions
EZ-C1 Silver Version 3.91 Nikon Microscope Solutions Imaging software for confocal microscope
FCCP Sigma Aldrich 370-86-5
Fetal Bovine Serum Gibco 10270-106
GDNF Miltenyi Biotec 130-096-291
Glasgow MEM Gibco 11710-035
Glass Pasteur pipette Brand 747715 Inverted
Glutamax Gibco 35050-061
Helium-Neon Laser Melles Griot Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too
Heparin Merck H3149-25KU
HERACell 240i CO2 Incubator Thermo Scientific 51026331
Hoechst 33342 Invitrogen H3570 1:2500
Image J 1.53c Wayne Rasband National Institute of Health Image processing Software
Injekt Solo 10 mL/ Luer Braun 4606108V
Knockout Serum Replacement Gibco 10828010
Laser (407 nm) Coherent Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too
Map2 Synaptic Systems No. 188004 1:1000
Maxisafe 2030i
MEM NEAA Gibco 11140-050
mTeSR Plus Stemcell Technology 85850 iPSC medium
Multifuge X3R Centrifuge Thermo Scientific 10325804
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit Lonza # LT07-218
N2 Supplement Gibco 17502-048
Needle for single usage (23G x 1” TW) Neoject 10016
NIS-Elements Aadvanced Research 3.2 Nikon Imaging software
Oligomycin A Sigma Aldrich 75351
Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010 Heidolph 543-12310-00
PAP Pen Sigma Z377821-1EA To draw hydrophobic barrier on slides.
Papain Dissociation System kit Worthington LK003150
Paraformaldehyde Merck 818715 4% in PBS, store solution at -20 °C
Pasteur pipette 7mL VWR 612-1681 Graduated up to 3 mL
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2  ∞/0.17 WD 1.0 Nikon Microscope Solutions Dry Microscope Objective
Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13 Nikon Microscope Solutions Oil Immersion Microscope Objective
Polystyrene Petri dish (100 mm) Greiner Bio-One 664161
Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL) Falcon 352235
Potassium chloride Roth 6781.1
ProLong Glass Antifade Moutant Invitrogen P36980
Qualitative filter paper VWR 516-0813
Rock Inhibitior Merck SCM075
Rotenone Sigma 83-794
S100β Abcam Ab11178 1:600
SB-431542 Cayman Chemical Company 13031
Scalpel blades Heinz Herenz Hamburq 1110918
SMI312 Biolegend 837904 1:500
Sodium bicarbonate Merck/Sigma 31437-1kg-M
Sodium chloride Roth 3957
Sodium dihydrogen phosphate Applichem 131965
Sodium Pyruvate Gibco 11360070
SOX2 Santa Cruz Biotechnology Sc-17320 1:100
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Gibco/StemPro A1110501 Reagent A
Super Glue Gel UHU 63261 adhesive gel
SuperFrost Plus VWR 631-0108
Syringe for single usage (1 mL) BD Plastipak 300015
TB2 Thermoblock Biometra
TC Plate 24 Well Sarstedt 83.3922
TC Plate 6 Well Sarstedt 83.392
TGFbeta3 Miltenyi Biotec 130-094-007
Tissue Culture Hood ThermoFisher 51032711
TOM20 Santa Cruz Biotechnology SC-11415 1:200
Triton-X Merck X100-5ML
UltraPure 0.5M EDTA Invitrogen 15575020
Vibratome Microm HM 650 V Thermo Scientific Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too.
Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade Wilkinson Sword 70517470
Whatman Benchkote Merck/Sigma 28418852
Wnt Antagonist I EMD Millipore Corp 3378738
XF 96 extracellular flux analyser Seahorse Bioscience 100737-101
XF Assay DMEM Medium Seahorse Bioscience 103680-100
XF Calibrant Solution Seahorse Bioscience 100840-000
XFe96 FluxPak (96-well microplate) Seahorse Bioscience 102416-100

References

  1. Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. Monogenic mitochondrial disorders. New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).
  2. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Review Disease Primers. 2, 16080 (2016).
  3. Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
  4. Carelli, V., Chan, D. C. Mitochondrial DNA: impacting central and peripheral nervous systems. Neuron. 84 (6), 1126-1142 (2014).
  5. Russell, O. M., Gorman, G. S., Lightowlers, R. N., Turnbull, D. M. Mitochondrial diseases: hope for the future. Cell. 181 (1), 168-188 (2020).
  6. Weissig, V. Drug development for the therapy of mitochondrial diseases. Trends in Molecular Medicine. 26 (1), 40-57 (2020).
  7. Tyynismaa, H., Suomalainen, A. Mouse models of mitochondrial DNA defects and their relevance for human disease. EMBO Reports. 10 (2), 137-143 (2009).
  8. Ma, H., et al. Metabolic rescue in pluripotent cells from patients with mtDNA disease. Nature. 524 (7564), 234-238 (2015).
  9. Galera-Monge, T., et al. Mitochondrial dysfunction and calcium dysregulation in Leigh syndrome induced pluripotent stem cell derived neurons. International Journal of Molecular Science. 21 (9), 3191 (2020).
  10. Zheng, X., et al. Alleviation of neuronal energy deficiency by mTOR inhibition as a treatment for mitochondria-related neurodegeneration. Elife. 5, 13378 (2016).
  11. Lorenz, C., et al. Human iPSC-derived neural progenitors are an effective drug discovery model for neurological mtDNA disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
  12. Inak, G., et al. Concise review: induced pluripotent stem cell-based drug discovery for mitochondrial disease. Stem Cells. 35 (7), 1655-1662 (2017).
  13. Chiaradia, I., Lancaster, M. A. Brain organoids for the study of human neurobiology at the interface of in vitro and in vivo. Nature Neuroscience. 23 (12), 1496-1508 (2020).
  14. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocol. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  15. Liput, M., et al. Tools and approaches for analyzing the role of mitochondria in health, development and disease using human cerebral organoids. Developmental Neurobiology. , (2021).
  16. Winanto, K. Z. J., Soh, B. S., Fan, Y., Ng, S. Y. Organoid cultures of MELAS neural cells reveal hyperactive Notch signaling that impacts neurodevelopment. Cell Death and Disease. 11 (3), 182 (2020).
  17. Romero-Morales, A. I., et al. Human iPSC-derived cerebral organoids model features of Leigh Syndrome and reveal abnormal corticogenesis. bioRxiv. , (2020).
  18. Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nature Communications. 12 (1), 1929 (2021).
  19. Falk, M. J. Neurodevelopmental manifestations of mitochondrial disease. Journal of Developmental & Behavioral Pediatrics. 31 (7), 610-621 (2010).
  20. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
  21. Pfiffer, V., Prigione, A. Assessing the bioenergetic profile of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 1264, 279-288 (2015).
  22. Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse. STAR Protocols. 2 (1), 100386 (2021).
  23. Menacho, C., Prigione, A. Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids. International Journal of Biochemestry & Cell Biology. 123, 105760 (2020).
  24. Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. Upgrading the physiological relevance of human brain organoids. Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).

Play Video

Cite This Article
Le, S., Petersilie, L., Inak, G., Menacho-Pando, C., Kafitz, K. W., Rybak-Wolf, A., Rajewsky, N., Rose, C. R., Prigione, A. Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling. J. Vis. Exp. (172), e62756, doi:10.3791/62756 (2021).

View Video